PRACTICA N 4 FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS I. INTRODUCCION .

Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, qumicamente son protenas . Como catalizadores, los enzimas actan en pequea cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aceleran su consecucin. Se puede decir tambin que son catalizadores de naturaleza protenica que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiolgicos, producidos por los organismos vivos. En consecuencia, las deficiencias en la funcin enzimtica causan patologas. Las enzimas, en los sistemas biolgicos constituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que caracterizan los fenmenos vitales. La fijacin de la energa solar y la sntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por los vegetales dependen de las enzimas presentes en las plantas. Los animales, a su vez, estn dotados de las enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con fines energticos o estructurales; las funciones del metabolismo interno y de la vida de relacin, como la locomocin, la excitabilidad, la irritabilidad, la divisin celular, la reproduccin, etc. Estn regidas por la actividad de innumerables enzimas responsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el individuo, sin liberaciones bruscas de energa a temperaturas fijas en un medio de pH, concentracin salina, etc.; prcticamente constante. La accin Cataltica enzimtica se caracteriza por la formacin de un complejo que representa el estado de transicin. El sustrato se une al enzima a travs de numerosas interacciones dbiles como son: puentes de hidrgeno, electrostticos, hidrfobos, etc, en un lugar especfico, el centro activo El modo de accin de una enzima, por s misma, no puede llevar a cabo una reaccin, su funcin es modificar la velocidad de la reaccin, entendindose como tal la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. La especificad de la enzimas son las molculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominado sitio activo, donde tiene lugar la catlisis.

Accin Cataltica La accin Cataltica enzimtica se caracteriza por la formacin de un complejo que representa el estado de transicin. El sustrato se une a la enzima a travs de numerosas interacciones dbiles como son: puentes de hidrgeno, electrostticos, hidrfobos, etc, en un lugar especfico, el centro activo. Este centro es una pequea porcin del enzima, constituido por una serie de aminocidos que interaccionan con el sustrato. Con su accin, regulan la velocidad de muchas reacciones qumicas implicadas en este proceso. Modo de Accin: Una enzima, por s misma, no puede llevar a cabo una reaccin, su funcin es modificar la velocidad de la reaccin, entendindose como tal la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Tal variacin se debe a la disminucin de la energa de activacin Ea; en una reaccin qumica, la Ea es la energa necesaria para convertir los reactivos en formas moleculares inestables denominadas especies en estado de transicin, que poseen mayor energa libre que los reactivos y los productos. Especificidad Las molculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominado sitio activo, donde tiene lugar la catlisis. Laestructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus ismeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. Factores que incluyen las reacciones enzimticas

Cambios en el pH Cambios en la temperatura Presencia de cofactores Las concentraciones del sustrato y de los productos finales Activacin / Presencia de Inhibidores Costes Disponibilidad Temperatura PH

Temperatura

La elevacin de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas. Al principio la velocidad de reaccin aumenta cuando la temperatura se eleva debido al incremento de la energa cintica de la energa de las molculas reactantes. Sin embargo, al final, la energa cintica de la enzima excede a la barrera energtica para romper los enlaces dbiles de hidrogeno que conservan su estructura secundaria y terciaria. A esta temperatura predomina la desnaturalizacin con prdida precipitada de la actividad cataltica. Por tanto las enzimas muestran una temperatura ptima de accin. Los limites de actividad para la mayor parte de las enzimas tiene lugar entre los 10C y 50C; la temperatura optima para las enzimas en el cuerpo se hall alrededor de 37C. El factor por el cual un proceso biolgico aumenta para un incremento de temperatura de 10C es el coeficiente de temperatura o Q10. El Q10 para la mayor parte de las enzimas vara entre 1.5 y 3.

pH

La intensidad mxima de la actividad de la enzima, ocurre en el pH ptimo, con rpida disminucin de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad ptima generalmente se observa entre los valores de 5 y 9. El pH ptimo de una enzima puede guardar relacin con cierta carga elctrica de la superficie, o con condiciones optimas para la fijacin de la enzima a su sustrato. Cuando hay un exceso de iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus molculas y ante un dficit los ceden. Este cambio tiene una doble consecuencia sobre la molcula. Como todas las protenas, las enzimas desempean su funcin por los residuos de aminocidos; algunos confieren a su superficie una distribucin de cargas elctricas. Cuando la concentracin de iones hidrogeno es muy baja en comparacin con la concentracin optima, la molcula los cede desapareciendo cargas positivas o apareciendo cargas negativas en su superficie. Ante una concentracin elevada de iones hidrogeno, algunos se fijan a la molcula desapareciendo cargas (-) o poniendo cargas (+) que no existan. As mismo al cambiar las cargas elctricas en los residuos de aminocidos se alteran los lazos de unin dentro de la molcula variando su acomodo tridimensional con recuperacin de la actividad de la enzima.

Presencia de cofactores Sobre los cofactores hay que recordar que los enzimas para su actividad requieren de sustancias no proteicas que pueden ser de naturaleza orgnica (coenzimas) o inorgnicas (minerales) los que cumplen funciones especificas como la de coordinar entre el centro activo del enzima con el sustrato antes de la transformacin de ste a producto.

Enzimas Intracelulares y Extracelulares Intracelulares: Son los responsables de los procesos de degradacin celular. En estos procesos se obtienen nutrientes elementales a partir de los materiales estructurales propios de las clulas cuando el aporte mediante la dieta se interrumpe (por ejemplo, durante el ayuno), o cuando la clula no puede utilizar los nutrientes de la sangre. Extracelulares. Son aquellas que se activan por fuera de la membrana plasmtica o pared celular de clulas, muchas de ellas cumplen procesos metablicos catalticos destinados a la degradacin de la materia en energa qumica, un ejemplo notorio de estas enzimas son las que por exocitosis ( adherencia de membrana entre el lisosoma y la membrana plasmtica de la clula) en forma de una vacuola excretora libera el contenido enzimtico para degradar la materia orgnica o bien para realizar la fagocitosis por fuera de la clula( digestin extracelular) en el caso de que los virus puedan ingresar a la clula husped, este es el principal mecanismo de defensa, la liberacin de enzimas lisosmicas. Funciones de las Enzimas: En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o ms cadenas poli peptdicas, que aportan un pequeo grupo de aminocidos para formar el sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reaccin. Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud. Este hecho asegura que la enzima no participa en reacciones equivocadas. La enzima misma no se ve afectada por la reaccin. Cuando los productos se liberan, la enzima vuelve a unirse con un nuevo sustrato. Hay medicamentos que actan como competidores de las vitaminas las que son coenzimas y por lo tanto bloquean la accin de los enzimas o lo que es ms inhiben la sntesis de los enzimas especficas, por ejemplo el metrotexato (MTX), empleado para el tratamiento de la leucemia y artritis reumatoide que libera al folato de la enzima hidrofolato reductasa. Los enzimas se clasifican por su accin en seis clases; tambin toman el nombre genrico segn el sustrato por ejemplo los enzimas proteolticos como la pepsina, quimotripsina, tripsina, etc En esta sesin de laboratorio vamos a comprobar la sensibilidad de los enzimas por su estructura proteica frente a factores fsicos y qumicos.

II. OBJETIVO GENERAL Demostrar el efecto de los factores: Concentracin de Sustrato, Concentracin de Enzima, pH y Temperatura sobre la actividad enzimtica de la amilasa, en presencia de almidn. ACTIVIDAD EXPERIMENTAL: III.- MATERIALES Y REACTIVOS. Materiales : Vaso de precipitacin. Pipetas Termmetro. Bureta. Tubos de ensayo Gradilla. Pizeta. bao maria cronmetro

Reactivos:

Solucin del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyndolo hasta 20 ml con agua destilada. Disolucin de almidn al 0,5 %. Disolucin de Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 ml de agua destilada. Disoluciones tampn de pH 5,0; 6,8 y 8,0.

EXPERIMENTO # 1: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA. PROCEDIMIENTO:

Tubos N 1 2 3 4 ml. Almidn 0,5% 2,0 2.0 2,0 2,0 ml. agua 0,4 0,3 0,2 0,1 ml. de enzima 0,1 0,2 0,3 0,4 amilasa

Inmediatamente despus de adicionar la solucin del enzima al ltimo tubo ponga en marcha el cronmetro y comience a medir el tiempo del experimento. En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa la reaccin de la solucin experimental con el Lugol: para ello slo tiene que extraer con el gotero pequeas cantidades de cada tubo de ensayo en reaccin de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reaccin alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solucin de control. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla: TUBOS 1 2 3 4 Volumen de enzima (ml) Tiempo total de reaccin (min) Velocidad de la reaccin (1/t) 6. Con estos datos construya un grfico de c(E) en el eje ordenada contra velocidad de reaccin (1/t) en el eje de abscisas.

EXPERIMENTO # 2: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL pH. PROCEDIMIENTO: Tubos / reactivos ml. Sol buffer pH 5 ml. Sol buffer pH 6,8 ml. Sol buffer pH 8 5 1 2,0 2 2,0 2,0 3

Aada a cada tubo 2 ml de la solucin del almidn al 0,5% y 2 ml de la solucin del enzima. Incube a 40 grados Centgrados y ensaye la reaccin con el Lugol segn se indica en el trabajo experimental # 1 Con los datos obtenidos extraiga las conclusiones sobre el rango de pH en el cual el enzima muestra su actividad ptima.

EXPERIMENTO # 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO (S). PROCEDIMIENTO:

Tubos N 1 ml. Almidn 0,5% 0,5 ml. agua 1,5 ml. de enzima 0,5 amilasa Incubar a 40 Celsius

2 1,0 1,0 0,5 1,5 1,5 0,5

3 2,0 0,5

1. Adicione a cada tubo 0,5 ml de disolucin del enzima Alfa amilasa e incbelos a 40 grados Celsius. 2. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidn mediante la reaccin con Lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental # 1. TUBOS 1 2 3 4 Volumen de sustrato (ml) Tiempo total de reaccin (min) Velocidad de reaccin (volumen / tiempo) 3. Con los datos obtenidos construya una tabla : 4. Con los datos de la tabla construya un grfico de velocidad de reaccin (volumen / tiempo) en el eje ordenada contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentracin de sustrato creciente en nuestro experimento). EXPERIMENTO # 4: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERA TURA. PROCEDIMIENTO: Tubos/Reactivos 1 2 3 4 5

ml. Almidn 5 5 5 5 5 0,5% ml. de enzima 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 amilasa Hierva durante 5 min y reponga el volumen de agua perdida por evaporacin en uno de los tubos. Incbelo a 40 grados Celsius y ensaye de la forma estudiada la presencia de almidn en l a diferentes intervalos de tiempo. 1. Incube un segundo tubo a 40 grados Celsius y un tercero a 50 C, y ensaye en ellos la reaccin con Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el tiempo que se demora en desaparecer la coloracin azul. 2. Un cuarto tupo incbelo en un bao de hielo y ensaye tambin la reaccin con Lugol. 3. El ltimo tubo djelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la desaparicin de la reaccin positiva en intervalos de 1 minuto.

4. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla, y extraiga sus conclusiones: Color observado a diferentes tiempos (min) 5 Tubos 1 2 3 4 5 IV.- RESULTADOS V.- INTERPRETACION VI.- CUESTIONARIO 1.- Explique el resultado de la influencia de la concentracin del enzima. VALENTINA 2.- Describa qu caractersticas estructurales del almidn permiten su identificacin mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidn.YOSSY 3.- Anexe la tabla y el grfico de velocidad de reaccin contra c(E), tomando como concentracin del enzima el volumen de la solucin utilizado en cada tubo. Por qu se puede tomar como velocidad de reaccin el inverso del tiempo? MOLLY 4.-. Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados del experimento. Haciendo el experimento con los tubos con lugol: en la primera observacin del tubo n 1 nos dimos cuenta que tiene un 0% de actividad pero obtuvo el color azul. En la segunda observacin del tubo n2 al igual nos dimos cuenta que tiene un 100% teniendo la mejor actividad pero teniendo un color amarillo. En la tercera observacin del tubo n3 y 4 nos dimos cuenta que esos dos tubos tienen el mismo resultado pero al igual tienen un 10% pero no tienen ninguna actividad, teniendo el pH que no es el ideal con un color azul. En la cuarta observacin del tubo n5 observamos que tiene un 30% de actividad, teniendo una inactiva con mayor concentracin y las enzimas muy bajas. puesto con un color azul. En la quinta observacin del tubo n6 observamos que tiene ms sustratos que en los dems tubos que hemos estado observando, teniendo un color al igual que los otros tubos de color azul. 10 15 20 25 30

 En la sexta observacin del tubo n7 vimos que tiene un 60% de actividad, que un buen porcentaje a su nivel de actividad teniendo un color amarillo como al tubo n2. En la ltima observacin que vimos sobre los dos ltimos tubos del n8 y 9 su actividad fue de 0% y el color asido de azul. observando de cada uno de ellos eso fueron los resultados de actividad. En cada uno de ellos hemos observado pocas actividades al igual como puede pasar que buenas actividades enzima, por cada anlisis que se ha dado y observado. Tambin encontramos que hay mayor concentracin de sustrato eso es debido al experimento que hemos hecho.

5. Resuma las dificultades encontradas en el ensayo.

TUBO 1*
Observamos un color Azul oscuro . Lo cual nos indica que no se ha hidrolizado de almidn ,ya que este tubo no se coloco la enzima amilasa.

TUBO 2*
Tiene un color amarillo La mejor actividad 100 %.

TUBO 3*
Tiene un color azul claro. Este color se debe a que la enzima acta muy lento ya que el pH en este tubo es superior al ideal (pH 9 > pH 6,8).

TUBO 4 *
Observamos un color Azul oscuro . Tiene este color porque la enzima no acta sobre el almidn ,por su pH menor al pH ideal (pH 2,5 < pH 6,8).

TUBO 5*
Tiene un color azul. Por su baja concentracin de enzima, la amilasa acta muy lento 30% de actividad .

TUBO 6*
Tiene un color azul Este color se debe a que la enzima esta actuado relativamemte rpido a pesar de la alta concentracin de sustrato.

TUBO 7*
Observamos un color amrillo . tiene60% de actividad.

TUBO 8*
Tiene un color azul. La enzima no acta por que la temperatura (0) es inferior a la temperatura ideal para la actividad enzimtica (37> 0).La enzima esta inactiva.

TUBO 9*
Tiene un color azul . La temperatura en este tubo es superior(100)a la temperatura ideal para la actividad enzimtica (100 > 37). La enzima se desnaturaliza porque parte de su estructura es una protena.

Experimento # 2: Estudio de la influencia del pH. 1. Describa lo observado al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de reaccin del enzima alfa-Amilasa. A qu conclusin llega acerca del pH ptimo de este enzima?MOLLY 2. Qu efecto tendra la utilizacin del medio con pH muy cido o muy bsico en la realizacin de este ensayo?YOSSY

Experimento # 3: Estudio de la influencia de la concentracin del sustrato. 1. Anexe la tabla y el grfico elaborados segn las indicaciones del trabajo prctico, tomando como valor de c(S) el del volumen del mismo medido en cada tubo. Por qu en este caso para calcular la velocidad de la reaccin es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo?

N DE TUBOS

CONCENTRACION DE SUSTRATO
(ALMIDON 1%)

TIEMPO

VELOCIDAD DE REACCION
C(S)/T

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 1 1 1 1 1,5 1 1 1

5 5 5 5 5 5 5 5 5

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 0,2

(S) 100

50 --

TIEMPO

2. Analice el grfico y plantee las conclusiones a que puede llegaren este caso.ELY 3. Describa las dificultades presentadas en este ensayo.KASANDRA Experimento # 4: Estudio de la influencia de la temperatura. 1. Anexe la tabla resumen de los resultados del experimento segn las indicaciones del trabajo prctico.

ANLISIS DE RESULTADOS:

TUBOS Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9

COLOR DE LA MUESTRA Azul oscuro amarillo Azul claro Azul Azul Azul amarillo Azul Azul

2. Explique qu le sucede al enzima del tubo que se hierve antes de incubarlo a 40 C.VALENTINA

3. Plantee las conclusiones a que pudo arribar en este ensayo. Por qu no se debe emplear el trmino de temperatura ptima? Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad enzimtica, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar a una prdida de actividad. Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. La temperatura ptima para la mayora de las reacciones enzimticas est, con pocas excepciones, entre 30C y 40C, en que la actividad es mxima. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin. Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por desnaturalizacin trmica. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica extensiva est muy prxima de la temperatura ptima. Las enzimas muestran, a menudo, una marcada fragilidad trmica. Cuando se calientan a temperaturas superiores a los 50C la mayora de las enzimas, pero no todas, se denaturan, y unas pocas muestran desnaturalizacin cuando se enfran aproximadamente a 5C. A temperaturas bajas, aunque la actividad enzimtica procede muy lentamente, ella no se detiene del todo, hecho que debe tenerse en cuenta en la industria congeladora de alimentos. A menos que se inactiven previamente las enzimas objetables, la mayora de los alimentos congelados experimentan un considerable deterioro despus de un almacenamiento prolongado, porque a temperaturas tan bajas como -18C algunas reacciones enzimticas siguen teniendo lugar. Habitualmente la desnaturalizacin a alta temperatura es irreversible, debido a que se rompen las fuerzas dbiles de enlace al aumentar la vibracin trmica de los tomos componentes, fenmeno que daa la estructura tridimensional. La mayora de las enzimas son, pues, muy termolbiles y habitualmente es suficiente aplicar una temperatura de 40 a 80C por 2 a 5 minutos, a fin de destruir su actividad. Es este hecho de inactivacin completa de las enzimas el que se utiliza ampliamente en la industria alimentara. En la mayor parte de los casos de preservacin de alimentos, es deseable que no haya continuacin alguna de actividad enzimtica. Las enzimas difieren ampliamente en su resistencia a la inactivacin trmica. Las peroxidasas vegetales son particularmente estables (120C por unos minutos no son suficientes para destruirlas del todo). La velocidad de inactivacin trmica depende tambin del pH, fuerza inica y del estado fsico de la enzima en el material alimentario: si la enzima est igualmente bien distribuida por todo el producto o adsorbida sobre partculas slidas (como ocurre con las enzimas pectinolticas y las fenolasas, las cuales estn adsorbidas en la pulpa de varios jugos de frutas). Existen situaciones en la tecnologa de alimentos en las que algunas enzimas, a pesar de haber sido inactivadas, se "regeneran" y su actividad se renueva despus de cierto tiempo. Este tipo de regeneracin enzimtica ha sido observada en los casos de peroxidasas (leche, verduras); catalasa (verduras); lipasa (productos de la leche) y enzimas pectinolticas (jugos ctricos). La regeneracin seria el resultado de una reorganizacin, al menos parcial, de la molcula proteica, restablecindose las estructuras de los sitios activos que haban sido alterados por la desnaturalizacin.

VII.- BIBLIOGRAFIA

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuti cas/schmidth02/parte02/02.html
Rodwel. et all . Bioqumica de Harper, 13 ed., s.d. Laguna, Jose Bioquimica, 2 ed., Facultad de Medicina, UNAM, Mxico D.F., Fournier S.A., 1969.

http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima

http://www.monografias.com/trabajos71/enzimas/enzimas.shtml http://html.rincondelvago.com/enzimas_11.html
http://www.buenastareas.com/materias/conclusion-sobre-las-enzimas/80 http://www.buenastareas.com/ensayos/Enzimas/412751.html http://www.dclmexico.com/espa%F1ol/amilasa_sl.pdf