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Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing

Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2719217/?tool=pubmed#!po=73.0769

Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + /

GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) .


Recentemente, mtodo (Seegene de genotipagem, foi Inc., desenvolvido Seoul, o HPV Korea). um 4romance eElectrophoresis Em PCR contraste de deteco com Auto-capilar outros de HPV mtodos baseado (ACE)de de em teste PCR e

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.

Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + /

GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ). O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS
Populao de estudo e coleta de amostras
Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem

PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida PreservCyt amostras A fina Cervex-Brush (Cytyc). do (Cytyc, colo O(Rovers slide uterino. Boxborough, ThinPrep Dispositivos A escova MA, foifoi ento EUA). Mdicos, imediatamente de fixado O frasco Oss, em etanol Holanda) foi lavado colocado e corados em foium no utilizada processador frasco com colorao para de soluo obter Prep

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O

teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em

cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ). O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS
Populao de estudo e coleta de amostras
Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco

simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante.
Resumidamente, foram 40 30 ul iniciador, ciclos, de seg DNA como foram a 60 com e isolado se 10 separados , desnaturao segue: e mL aextenso PCR a de partir desnaturao 2 foi em realizada de Master de gel durante 1esfregao min de agarose Mix 30 durante num 30 (Seegene seg segundos cervical, ou volume a a 2% 15 72 minutos corado Inc.). 4 de .a Os mL 94 reaco produtos As de com a,condies 94 5 recozimento x brometo final 4 ;de de amplificao de HPV PCR de 20 de amplificao durante ACE amplificados ul, etdio contendo mistura durante 1 min 3

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos,

as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV.

Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ). O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS

Populao de estudo e coleta de amostras


Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os

hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reaco final de 20 ul, contendo 3 ul de DNA isolado a partir de esfregao cervical, 4 mL de 5 x 4 de HPV ACE mistura iniciador, e 10 mL de 2 Master Mix (Seegene Inc.). As condies de amplificao foram como se segue: desnaturao durante 15 minutos a 94 ; amplificao durante 40 ciclos, com desnaturao durante 30 segundos a 94 , recozimento durante 1 min 30 seg a 60 , e extenso de 1 min 30 seg a 72 . Os produtos de PCR amplificados foram separados em gel de agarose a 2% corado com brometo de etdio ou ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, Reino Unido). Resumidamente, aps PCR, 2 uL do produto de amplificao foi misturado com 6 uL de tampo de carregamento (Lab901) num tubo de PCR de 0,2 mL. Insira o bloco de amostra para o TapeStation (Lab901) e coloque o tubo de 0,2 mL PCR contendo a amostra. Anlise amplicon foi ento realizada no Sistema ScreenTape com a Viso software Seegene.Sistema de eletroforese capilar de Seegene fornecer o software de deteco que leia automaticamente o produto de PCR e analisar a intensidade amplicon enquanto o manual convencional eletroforese capilar necessidade do usurio lido do pico com olhos nus aps a mistura do produto da PCR com SYBR verde ou cito-9 corante.

PCR HPV teste Set Typing


O DNA foi extrado de zaragatoa em esfregaos usando um Micro QIAamp DNA Kit (Qiagen, Inc.) de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de ADN foi medida utilizando um espectrofotmetro (DU 530, Beckman, Fullerton, CA, EUA), e a qualidade de ADN foi confirmada em gel de agarose. Foi utilizado o mtodo de PCR utilizando o Conjunto de dactilografia de HPV. O subtipo de HPV foi determinada utilizando o Typing Set HPV (Takara Bio., Shiga, Japo), um conjunto de primers para PCR projetado especificamente para identificar gentipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em ADN genmico. O iniciador HPVpU-31B foi utilizado para amplificar o DNA de HPV 6 e 11 (LR gentipos de HPV) e HPVpU-1M foi usada para amplificar o ADN do HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 (AR HPV gentipos). O mtodo de dactilografia Conjunto de HPV por PCR foi utilizada de acordo com as instrues do fabricante. Este conjunto inclui modelos de controlo, tanto malignas e benignas para verificao da reaco de PCR utilizando os pares de primers fornecidos no conjunto. A sua expresso foi normalizado, utilizando o modelo de controlo fornecido como uma referncia endgena. Digesto com enzimas de restrio dos produtos de PCR tambm pode ser confirmado, porque os produtos de PCR reconheceu os stios de Ava II, AfaI, Bgl II, Acc I e Ava I e pequenos tamanhos de fragmentos de DNA so geradas por digesto de enzimas de restrio. Os fragmentos de ADN foram confirmadas em gis de agarose e identificados os gentipos de HPV.

A anlise estatstica Para conjunto comparar PCR a preciso digitao clnica para detectar do HCfoi ensaio leses2, cervicais o 4 teste de ACE altoHPV grau, eo tambm HPV teste

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais

Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV

cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH.

Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ). O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS
Populao de estudo e coleta de amostras
Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais

sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reaco final de 20 ul, contendo 3 ul de DNA isolado a partir de esfregao cervical, 4 mL de 5 x 4 de HPV ACE mistura iniciador, e 10 mL de 2 Master Mix (Seegene Inc.). As condies de amplificao foram como se segue: desnaturao durante 15 minutos a 94 ; amplificao durante 40 ciclos, com desnaturao durante 30

segundos a 94 , recozimento durante 1 min 30 seg a 60 , e extenso de 1 min 30 seg a 72 . Os produtos de PCR amplificados foram separados em gel de agarose a 2% corado com brometo de etdio ou ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, Reino Unido). Resumidamente, aps PCR, 2 uL do produto de amplificao foi misturado com 6 uL de tampo de carregamento (Lab901) num tubo de PCR de 0,2 mL. Insira o bloco de amostra para o TapeStation (Lab901) e coloque o tubo de 0,2 mL PCR contendo a amostra. Anlise amplicon foi ento realizada no Sistema ScreenTape com a Viso software Seegene.Sistema de eletroforese capilar de Seegene fornecer o software de deteco que leia automaticamente o produto de PCR e analisar a intensidade amplicon enquanto o manual convencional eletroforese capilar necessidade do usurio lido do pico com olhos nus aps a mistura do produto da PCR com SYBR verde ou cito-9 corante.

PCR HPV teste Set Typing


O DNA foi extrado de zaragatoa em esfregaos usando um Micro QIAamp DNA Kit (Qiagen, Inc.) de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de ADN foi medida utilizando um espectrofotmetro (DU 530, Beckman, Fullerton, CA, EUA), e a qualidade de ADN foi confirmada em gel de agarose. Foi utilizado o mtodo de PCR utilizando o Conjunto de dactilografia de HPV. O subtipo de HPV foi determinada utilizando o Typing Set HPV (Takara Bio., Shiga, Japo), um conjunto de primers para PCR projetado especificamente para identificar gentipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em ADN genmico. O iniciador HPVpU-31B foi utilizado para amplificar o DNA de HPV 6 e 11 (LR gentipos de HPV) e HPVpU-1M foi usada para amplificar o ADN do HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 (AR HPV gentipos). O mtodo de dactilografia Conjunto de HPV por PCR foi utilizada de acordo com as instrues do fabricante. Este conjunto inclui modelos de controlo, tanto malignas e benignas para verificao da reaco de PCR utilizando os pares de primers fornecidos no conjunto. A sua expresso foi normalizado, utilizando o modelo de controlo fornecido como uma referncia endgena. Digesto com enzimas de restrio dos produtos de PCR tambm pode ser confirmado, porque os produtos de PCR reconheceu os stios de Ava II, AfaI, Bgl II, Acc I e Ava I e

pequenos tamanhos de fragmentos de DNA so geradas por digesto de enzimas de restrio. Os fragmentos de ADN foram confirmadas em gis de agarose e identificados os gentipos de HPV.

A anlise estatstica
Para comparar a preciso clnica do HC ensaio 2, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste conjunto PCR digitao para detectar leses cervicais de alto grau, tambm foi calculada a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo valor (VAL), a sensibilidade e especificidade dos trs ensaios foram comparados pelo teste da proporo emparelhado. Acordo entre os ensaios de HPV foi avaliada pelo coeficiente kappa de Cohen, com valores de 0,00-,20 indicando baixa concordncia, 0,21-0,40 acordo justo, 0,41-0,60 concordncia moderada, 0,61-0,80 acordo substancial, e 0,81-1,00 concordncia quase perfeita. Anlise de qui-quadrado de McNemar para dados par combinado foi realizada para analisar as tabelas de contingncia comparando testes de HPV. As anlises estatsticas foram realizadas com o SPSS, verso 12.0, software estatstico (Chicago, IL, EUA). Todos os testes foram em frente e verso, e P <0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS deteco para foram Os Typing 60,7% todos clinicamente foram estavam positividade normais negativo, positivos 48,7% discordantes resultados includo grupo testes. clulas identificadas de os para PCR 31,4%, de (97/199) trs 52,3% disponveis citolgico Papanicolau; A HPV por e escamosas o ( RH 4 12 testes baixo P citolgicas, importante no teste 37,3% parte = entre (104/199) eram HR gentipos grupo 0,143 pelo pelo mostraram grau ACE de de do o HC e para atpicas HPV 100% ensaio 33,3%, alto e de 5 teste 2 de HPV P 2-negativo bem amostras para ensaio pelo citologia de 199 = leso grau teste 0,585, foi de HPV de no como para a de ensaio pacientes. taxas HPV observada sua de HC, HC intraepitelial Set significado mostraram (HPV eram normal o leso respectivamente). todos tendncia e de e Typing HPV grupo Set HC HPV 2positividade a RH 16/18, amostras Typing intra-epitelial Os 2, 4 os 4 o a 4 de normal, 54,3% teste PCR RH grupo partir trs ECA indeterminado diferena escamosa HPV para 16/33/58, PCR. taxas resultados ( ACE, -positivo. de Tabela (108/199) do de progredir em citologia, idnticas HC Em cncer ensaio No de e amostras escamosa significativa (LSIL), PCR deteco 2-positivos entanto, 1 16/31, contraste, ). De de (ASCUS), HC cervical pela As 65,5%, HPV para (87,5%), teste 12 respectivamente. taxas e 2 de (HSIL), 4 amostras, 52), do houve o eo teste teste ensaio de em cancro no 61,8% e por HPV de 82,1%, HPV e que ADN RH Set uma houve ACE 17 RH todos oem teste de foram e que cervical, amostras Typing 4 HPV quatro de 58,2% HPVtaxa ACE82,1% ACE HPV, geral os HPV, Set No trs de e e

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato

O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na

populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ).

O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS
Populao de estudo e coleta de amostras
Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reaco final de 20 ul, contendo 3 ul de DNA isolado a partir de esfregao cervical, 4 mL de 5 x 4 de HPV ACE mistura iniciador, e 10 mL de 2 Master Mix (Seegene Inc.). As condies de amplificao foram como se segue: desnaturao durante 15 minutos a 94 ; amplificao durante 40 ciclos, com desnaturao durante 30 segundos a 94 , recozimento durante 1 min 30 seg a 60 , e extenso de 1 min 30 seg a 72 . Os produtos de PCR amplificados foram separados em gel de agarose a 2% corado com brometo de etdio ou ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, Reino Unido). Resumidamente, aps PCR, 2 uL do produto de amplificao foi misturado com 6 uL de tampo de carregamento (Lab901) num tubo de PCR de 0,2 mL. Insira o bloco de amostra para o

TapeStation (Lab901) e coloque o tubo de 0,2 mL PCR contendo a amostra. Anlise amplicon foi ento realizada no Sistema ScreenTape com a Viso software Seegene.Sistema de eletroforese capilar de Seegene fornecer o software de deteco que leia automaticamente o produto de PCR e analisar a intensidade amplicon enquanto o manual convencional eletroforese capilar necessidade do usurio lido do pico com olhos nus aps a mistura do produto da PCR com SYBR verde ou cito-9 corante.

PCR HPV teste Set Typing


O DNA foi extrado de zaragatoa em esfregaos usando um Micro QIAamp DNA Kit (Qiagen, Inc.) de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de ADN foi medida utilizando um espectrofotmetro (DU 530, Beckman, Fullerton, CA, EUA), e a qualidade de ADN foi confirmada em gel de agarose. Foi utilizado o mtodo de PCR utilizando o Conjunto de dactilografia de HPV. O subtipo de HPV foi determinada utilizando o Typing Set HPV (Takara Bio., Shiga, Japo), um conjunto de primers para PCR projetado especificamente para identificar gentipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em ADN genmico. O iniciador HPVpU-31B foi utilizado para amplificar o DNA de HPV 6 e 11 (LR gentipos de HPV) e HPVpU-1M foi usada para amplificar o ADN do HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 (AR HPV gentipos). O mtodo de dactilografia Conjunto de HPV por PCR foi utilizada de acordo com as instrues do fabricante. Este conjunto inclui modelos de controlo, tanto malignas e benignas para verificao da reaco de PCR utilizando os pares de primers fornecidos no conjunto. A sua expresso foi normalizado, utilizando o modelo de controlo fornecido como uma referncia endgena. Digesto com enzimas de restrio dos produtos de PCR tambm pode ser confirmado, porque os produtos de PCR reconheceu os stios de Ava II, AfaI, Bgl II, Acc I e Ava I e pequenos tamanhos de fragmentos de DNA so geradas por digesto de enzimas de restrio. Os fragmentos de ADN foram confirmadas em gis de agarose e identificados os gentipos de HPV.

A anlise estatstica
Para comparar a preciso clnica do HC ensaio 2, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste conjunto PCR digitao para detectar leses cervicais de alto grau, tambm foi calculada a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo valor (VAL), a sensibilidade e especificidade dos trs ensaios foram comparados pelo teste da proporo emparelhado. Acordo entre os ensaios de HPV foi avaliada pelo coeficiente kappa de Cohen, com valores de 0,00-,20 indicando baixa concordncia, 0,21-0,40 acordo justo, 0,41-0,60 concordncia moderada, 0,61-0,80 acordo substancial, e 0,81-1,00 concordncia quase perfeita. Anlise de qui-quadrado de McNemar para dados par combinado foi realizada para analisar as tabelas de contingncia comparando testes de HPV. As anlises estatsticas foram realizadas com o SPSS, verso 12.0, software estatstico (Chicago, IL, EUA). Todos os testes foram em frente e verso, e P <0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS
Os resultados citolgicas, bem como todos os trs resultados de teste de ADN de HPV, estavam disponveis para 199 pacientes. Os RH taxas de deteco do HPV em geral foram de 52,3% (104/199) pelo ensaio HC 2, 54,3% (108/199) pela 4 teste ACE HPV, e 48,7% (97/199) pelo HPV teste Set Typing PCR ( Tabela 1 ). As taxas de RH HPV-positivos por parte do 2 ensaio HC, HPV 4 teste ACE, e PCR HPV teste Set Typing foram 31,4%, 37,3% e 33,3%, para o grupo normal, citologia, 65,5%, 61,8% e 58,2% para clulas escamosas atpicas de significado indeterminado (ASCUS), 82,1%, 82,1% e 60,7% para o baixo grau de leso intraepitelial escamosa (LSIL), respectivamente. No grupo citolgico de alto grau de leso intra-epitelial escamosa (HSIL), o que clinicamente importante para a sua tendncia para progredir para o cancro cervical, todos os trs testes mostraram taxas de positividade idnticas (87,5%), e uma taxa de deteco de HPV HR de 100% foi observada o grupo de cncer cervical por todos os trs testes. A 4 teste ACE HPV no mostraram diferena significativa em RH HPV positividade no grupo de citologia normal a partir do ensaio HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR ( P = 0,143 e P = 0,585, respectivamente). No entanto, houve 17

amostras discordantes entre o ensaio de HC e 2 a 4 de HPV em amostras de ensaio de ACE normais Papanicolau; 5 amostras eram amostras de HC 2positivos e HPV 4 ACE-negativo, e 12 eram HC 2-negativo e HPV 4 ECA positivo. De 12 amostras, quatro includo RH gentipos de HPV (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, e 52), que foram identificadas pelo teste de HPV Set Typing PCR. Em contraste, no houve RH gentipos identificados nas cinco amostras anteriores. Em citolgico ASCUS, a taxa de deteco do teste do HPV 4 ACE para HR HPV tambm no foi significativamente diferente do ensaio HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR, mas o ensaio de HC 2 mostrou uma taxa significativamente mais elevada para a deteco de HPV de AR do que a PCR HPV Typing Test Set ( P = 0,02). Com o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV, uma porcentagem significativamente maior de amostras de Papanicolau LSIL testou positivo para HPV HR do que com o HPV Typing Test Set PCR (82,1% vs 60,7%, P = 0,03). Em mulheres com HSIL citolgica, a 4 de teste de HPV ACE apresentaram uma taxa de deteco de 87,5% para o HPV de AR, o que era o mesmo nvel que, tanto no ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR.

Tabela 1 Teste de DNA HPV resultados de acordo com diagnstico citolgico

A concordncia para RH deteco do HPV entre o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV foi de 85,4%, mostrando concordncia substancial (coeficiente kappa = 0,71; Tabela 2 ). Em contraste, a concordncia entre o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR foi de 72,4%, mostrando concordncia moderada (coeficiente kappa = 0,45). Para a deteco de HPV 16 e HPV 18, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste Set Typing PCR mostrou concordncia significativa (89,9%, coeficiente kappa = 0,65). No entanto, 20 casos (10,1%) apresentaram

resultados discordantes, especificamente, oito casos foram positivos pelo 4 teste ACE HPV, mas a negativa por parte do HPV teste Set Typing PCR, enquanto que 12 amostras foram PCR HPV Typing Set teste positivo, mas HPV 4 ACEnegativo ( Tabela 3 ).

Tabela 2 Concordncia entre HC 2 ensaio, HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste conjunto de digitao

Tabela 3 Viso geral de amostras discordantes entre HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste Set Typing A Tabela 4 mostra o HR HPV citolgicos. detecoA relacionado com resultados

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato

O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na

populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ).

O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS
Populao de estudo e coleta de amostras
Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reaco final de 20 ul, contendo 3 ul de DNA isolado a partir de esfregao cervical, 4 mL de 5 x 4 de HPV ACE mistura iniciador, e 10 mL de 2 Master Mix (Seegene Inc.). As condies de amplificao foram como se segue: desnaturao durante 15 minutos a 94 ; amplificao durante 40 ciclos, com desnaturao durante 30 segundos a 94 , recozimento durante 1 min 30 seg a 60 , e extenso de 1 min 30 seg a 72 . Os produtos de PCR amplificados foram separados em gel de agarose a 2% corado com brometo de etdio ou ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, Reino Unido). Resumidamente, aps PCR, 2 uL do produto de amplificao foi misturado com 6 uL de tampo de carregamento (Lab901) num tubo de PCR de 0,2 mL. Insira o bloco de amostra para o

TapeStation (Lab901) e coloque o tubo de 0,2 mL PCR contendo a amostra. Anlise amplicon foi ento realizada no Sistema ScreenTape com a Viso software Seegene.Sistema de eletroforese capilar de Seegene fornecer o software de deteco que leia automaticamente o produto de PCR e analisar a intensidade amplicon enquanto o manual convencional eletroforese capilar necessidade do usurio lido do pico com olhos nus aps a mistura do produto da PCR com SYBR verde ou cito-9 corante.

PCR HPV teste Set Typing


O DNA foi extrado de zaragatoa em esfregaos usando um Micro QIAamp DNA Kit (Qiagen, Inc.) de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de ADN foi medida utilizando um espectrofotmetro (DU 530, Beckman, Fullerton, CA, EUA), e a qualidade de ADN foi confirmada em gel de agarose. Foi utilizado o mtodo de PCR utilizando o Conjunto de dactilografia de HPV. O subtipo de HPV foi determinada utilizando o Typing Set HPV (Takara Bio., Shiga, Japo), um conjunto de primers para PCR projetado especificamente para identificar gentipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em ADN genmico. O iniciador HPVpU-31B foi utilizado para amplificar o DNA de HPV 6 e 11 (LR gentipos de HPV) e HPVpU-1M foi usada para amplificar o ADN do HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 (AR HPV gentipos). O mtodo de dactilografia Conjunto de HPV por PCR foi utilizada de acordo com as instrues do fabricante. Este conjunto inclui modelos de controlo, tanto malignas e benignas para verificao da reaco de PCR utilizando os pares de primers fornecidos no conjunto. A sua expresso foi normalizado, utilizando o modelo de controlo fornecido como uma referncia endgena. Digesto com enzimas de restrio dos produtos de PCR tambm pode ser confirmado, porque os produtos de PCR reconheceu os stios de Ava II, AfaI, Bgl II, Acc I e Ava I e pequenos tamanhos de fragmentos de DNA so geradas por digesto de enzimas de restrio. Os fragmentos de ADN foram confirmadas em gis de agarose e identificados os gentipos de HPV.

A anlise estatstica
Para comparar a preciso clnica do HC ensaio 2, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste conjunto PCR digitao para detectar leses cervicais de alto grau, tambm foi calculada a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo valor (VAL), a sensibilidade e especificidade dos trs ensaios foram comparados pelo teste da proporo emparelhado. Acordo entre os ensaios de HPV foi avaliada pelo coeficiente kappa de Cohen, com valores de 0,00-,20 indicando baixa concordncia, 0,21-0,40 acordo justo, 0,41-0,60 concordncia moderada, 0,61-0,80 acordo substancial, e 0,81-1,00 concordncia quase perfeita. Anlise de qui-quadrado de McNemar para dados par combinado foi realizada para analisar as tabelas de contingncia comparando testes de HPV. As anlises estatsticas foram realizadas com o SPSS, verso 12.0, software estatstico (Chicago, IL, EUA). Todos os testes foram em frente e verso, e P <0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS
Os resultados citolgicas, bem como todos os trs resultados de teste de ADN de HPV, estavam disponveis para 199 pacientes. Os RH taxas de deteco do HPV em geral foram de 52,3% (104/199) pelo ensaio HC 2, 54,3% (108/199) pela 4 teste ACE HPV, e 48,7% (97/199) pelo HPV teste Set Typing PCR ( Tabela 1 ). As taxas de RH HPV-positivos por parte do 2 ensaio HC, HPV 4 teste ACE, e PCR HPV teste Set Typing foram 31,4%, 37,3% e 33,3%, para o grupo normal, citologia, 65,5%, 61,8% e 58,2% para clulas escamosas atpicas de significado indeterminado (ASCUS), 82,1%, 82,1% e 60,7% para o baixo grau de leso intraepitelial escamosa (LSIL), respectivamente. No grupo citolgico de alto grau de leso intra-epitelial escamosa (HSIL), o que clinicamente importante para a sua tendncia para progredir para o cancro cervical, todos os trs testes mostraram taxas de positividade idnticas (87,5%), e uma taxa de deteco de HPV HR de 100% foi observada o grupo de cncer cervical por todos os trs testes. A 4 teste ACE HPV no mostraram diferena significativa em RH HPV positividade no grupo de citologia normal a partir do ensaio HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR ( P = 0,143 e P = 0,585, respectivamente). No entanto, houve 17

amostras discordantes entre o ensaio de HC e 2 a 4 de HPV em amostras de ensaio de ACE normais Papanicolau; 5 amostras eram amostras de HC 2positivos e HPV 4 ACE-negativo, e 12 eram HC 2-negativo e HPV 4 ECA positivo. De 12 amostras, quatro includo RH gentipos de HPV (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, e 52), que foram identificadas pelo teste de HPV Set Typing PCR. Em contraste, no houve RH gentipos identificados nas cinco amostras anteriores. Em citolgico ASCUS, a taxa de deteco do teste do HPV 4 ACE para HR HPV tambm no foi significativamente diferente do ensaio HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR, mas o ensaio de HC 2 mostrou uma taxa significativamente mais elevada para a deteco de HPV de AR do que a PCR HPV Typing Test Set ( P = 0,02). Com o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV, uma porcentagem significativamente maior de amostras de Papanicolau LSIL testou positivo para HPV HR do que com o HPV Typing Test Set PCR (82,1% vs 60,7%, P = 0,03). Em mulheres com HSIL citolgica, a 4 de teste de HPV ACE apresentaram uma taxa de deteco de 87,5% para o HPV de AR, o que era o mesmo nvel que, tanto no ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR.

Tabela 1 Teste de DNA HPV resultados de acordo com diagnstico citolgico

A concordncia para RH deteco do HPV entre o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV foi de 85,4%, mostrando concordncia substancial (coeficiente kappa = 0,71; Tabela 2 ). Em contraste, a concordncia entre o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR foi de 72,4%, mostrando concordncia moderada (coeficiente kappa = 0,45). Para a deteco de HPV 16 e HPV 18, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste Set Typing PCR mostrou concordncia significativa (89,9%, coeficiente kappa = 0,65). No entanto, 20 casos (10,1%) apresentaram

resultados discordantes, especificamente, oito casos foram positivos pelo 4 teste ACE HPV, mas a negativa por parte do HPV teste Set Typing PCR, enquanto que 12 amostras foram PCR HPV Typing Set teste positivo, mas HPV 4 ACEnegativo ( Tabela 3 ).

Tabela 2 Concordncia entre HC 2 ensaio, HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste conjunto de digitao

Tabela 3 Viso geral de amostras discordantes entre HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste Set Typing

A Tabela 4 mostra o HR HPV deteco relacionado com resultados citolgicos. A prevalncia global de RH HPV aumentaram em paralelo com o aumento da gravidade do resultado do exame de Papanicolaou. Quando um teste de Papanicolau anormal foi definido como ASCUS ou superior, a sensibilidade e especificidade do teste 4 ACE HPV no foram inferiores aos de ensaio 2 HC (72,2% vs 74,2% [ P = 0,40], e 61,8% vs 68,6% [ P = 0,27], respectivamente, Tabela 4 ). Alm disso, a sensibilidade e a especificidade do teste 4 ACE HPV tambm foram comparveis ao ensaio de HPV Conjunto de tipagem PCR ( P = 0,27 e 0,36, respectivamente).

Tabela 4 Viso geral da acurcia diagnstica de cada teste de DNA do HPV

Quando o teste de Papanicolau anormal foi definido como LSIL ou superior, todos os trs testes de ADN de HPV realizados de modo semelhante para a deteco de ADN de HPV RH (dados no mostrados). Alm disso, com respeito ao citolgico HSIL ou cancro cervical, todos os trs testes tinha o mesmo nvel de sensibilidade (92,9%) e um nvel de especificidade semelhante ( Tabela 4 ).

DISCUSSO
O objetivo deste estudo foi analisar o desempenho da novela HPV 4 teste ACE para a deteco de HPV HR e HPV 16 e 18 gentipos, em comparao com o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR. Desde a aprovao pela FDA dos EUA, o ensaio HC 2 foi usado como padro para a avaliao da eficcia dos novos mtodos de deteco de HPV diferentes de ADN ( 21 - 24 ). Alm disso, o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR tem sido amplamente utilizado para a deteco de HPV em diversos estudos ( 17- 20 ).
18 comercialmente, uma ensaio gentipos de gentipos alto Tendo verso de risco. e deteco 18 de em atualizada na com HPV Por conta progresso no deteco este entre de que existe HPV. do aspecto, 13 oensaio teste para nenhum simultnea de O alto teste o leses 4HC romance ACE risco 4 estudo 2. ACE cervicais HPV de Por eser pode 11 HPV para causa s outros recentemente detectar de podem 4 comparar da teste alto HPVs enorme grau, ACE identificar a presena de este pode alto importncia a se genotipagem com tornou risco ser ode outros HPV chamado outros parece disponvel 16 do mtodos do e HPV 11 HPV HPV como HPVs 16 18 de 16 e

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan

Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de

todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de

iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ). O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS
Populao de estudo e coleta de amostras
Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados

dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reaco final de 20 ul, contendo 3 ul de DNA isolado a partir de esfregao cervical, 4 mL de 5 x 4 de HPV ACE mistura iniciador, e 10 mL de 2 Master Mix (Seegene Inc.). As condies de amplificao foram como se segue: desnaturao durante 15 minutos a 94 ; amplificao durante 40 ciclos, com desnaturao durante 30 segundos a 94 , recozimento durante 1 min 30 seg a 60 , e extenso de 1 min 30 seg a 72 . Os produtos de PCR amplificados foram separados em gel de

agarose a 2% corado com brometo de etdio ou ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, Reino Unido). Resumidamente, aps PCR, 2 uL do produto de amplificao foi misturado com 6 uL de tampo de carregamento (Lab901) num tubo de PCR de 0,2 mL. Insira o bloco de amostra para o TapeStation (Lab901) e coloque o tubo de 0,2 mL PCR contendo a amostra. Anlise amplicon foi ento realizada no Sistema ScreenTape com a Viso software Seegene.Sistema de eletroforese capilar de Seegene fornecer o software de deteco que leia automaticamente o produto de PCR e analisar a intensidade amplicon enquanto o manual convencional eletroforese capilar necessidade do usurio lido do pico com olhos nus aps a mistura do produto da PCR com SYBR verde ou cito-9 corante.

PCR HPV teste Set Typing


O DNA foi extrado de zaragatoa em esfregaos usando um Micro QIAamp DNA Kit (Qiagen, Inc.) de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de ADN foi medida utilizando um espectrofotmetro (DU 530, Beckman, Fullerton, CA, EUA), e a qualidade de ADN foi confirmada em gel de agarose. Foi utilizado o mtodo de PCR utilizando o Conjunto de dactilografia de HPV. O subtipo de HPV foi determinada utilizando o Typing Set HPV (Takara Bio., Shiga, Japo), um conjunto de primers para PCR projetado especificamente para identificar gentipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em ADN genmico. O iniciador HPVpU-31B foi utilizado para amplificar o DNA de HPV 6 e 11 (LR gentipos de HPV) e HPVpU-1M foi usada para amplificar o ADN do HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 (AR HPV gentipos). O mtodo de dactilografia Conjunto de HPV por PCR foi utilizada de acordo com as instrues do fabricante. Este conjunto inclui modelos de controlo, tanto malignas e benignas para verificao da reaco de PCR utilizando os pares de primers fornecidos no conjunto. A sua expresso foi normalizado, utilizando o modelo de controlo fornecido como uma referncia endgena. Digesto com enzimas de restrio dos produtos de PCR tambm pode ser confirmado, porque os produtos de PCR reconheceu os stios de Ava II, AfaI, Bgl II, Acc I e Ava I e pequenos tamanhos de fragmentos de DNA so geradas por digesto de enzimas

de restrio. Os fragmentos de ADN foram confirmadas em gis de agarose e identificados os gentipos de HPV.

A anlise estatstica
Para comparar a preciso clnica do HC ensaio 2, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste conjunto PCR digitao para detectar leses cervicais de alto grau, tambm foi calculada a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo valor (VAL), a sensibilidade e especificidade dos trs ensaios foram comparados pelo teste da proporo emparelhado. Acordo entre os ensaios de HPV foi avaliada pelo coeficiente kappa de Cohen, com valores de 0,00-,20 indicando baixa concordncia, 0,21-0,40 acordo justo, 0,41-0,60 concordncia moderada, 0,61-0,80 acordo substancial, e 0,81-1,00 concordncia quase perfeita. Anlise de qui-quadrado de McNemar para dados par combinado foi realizada para analisar as tabelas de contingncia comparando testes de HPV. As anlises estatsticas foram realizadas com o SPSS, verso 12.0, software estatstico (Chicago, IL, EUA). Todos os testes foram em frente e verso, e P <0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS
Os resultados citolgicas, bem como todos os trs resultados de teste de ADN de HPV, estavam disponveis para 199 pacientes. Os RH taxas de deteco do HPV em geral foram de 52,3% (104/199) pelo ensaio HC 2, 54,3% (108/199) pela 4 teste ACE HPV, e 48,7% (97/199) pelo HPV teste Set Typing PCR ( Tabela 1 ). As taxas de RH HPV-positivos por parte do 2 ensaio HC, HPV 4 teste ACE, e PCR HPV teste Set Typing foram 31,4%, 37,3% e 33,3%, para o grupo normal, citologia, 65,5%, 61,8% e 58,2% para clulas escamosas atpicas de significado indeterminado (ASCUS), 82,1%, 82,1% e 60,7% para o baixo grau de leso intraepitelial escamosa (LSIL), respectivamente. No grupo citolgico de alto grau de leso intra-epitelial escamosa (HSIL), o que clinicamente importante para a sua tendncia para progredir para o cancro cervical, todos os trs testes mostraram taxas de positividade idnticas (87,5%), e uma taxa de deteco de HPV HR de 100% foi observada o grupo de cncer cervical por todos os trs

testes. A 4 teste ACE HPV no mostraram diferena significativa em RH HPV positividade no grupo de citologia normal a partir do ensaio HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR ( P = 0,143 e P = 0,585, respectivamente). No entanto, houve 17 amostras discordantes entre o ensaio de HC e 2 a 4 de HPV em amostras de ensaio de ACE normais Papanicolau; 5 amostras eram amostras de HC 2positivos e HPV 4 ACE-negativo, e 12 eram HC 2-negativo e HPV 4 ECA positivo. De 12 amostras, quatro includo RH gentipos de HPV (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, e 52), que foram identificadas pelo teste de HPV Set Typing PCR. Em contraste, no houve RH gentipos identificados nas cinco amostras anteriores. Em citolgico ASCUS, a taxa de deteco do teste do HPV 4 ACE para HR HPV tambm no foi significativamente diferente do ensaio HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR, mas o ensaio de HC 2 mostrou uma taxa significativamente mais elevada para a deteco de HPV de AR do que a PCR HPV Typing Test Set ( P = 0,02). Com o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV, uma porcentagem significativamente maior de amostras de Papanicolau LSIL testou positivo para HPV HR do que com o HPV Typing Test Set PCR (82,1% vs 60,7%, P = 0,03). Em mulheres com HSIL citolgica, a 4 de teste de HPV ACE apresentaram uma taxa de deteco de 87,5% para o HPV de AR, o que era o mesmo nvel que, tanto no ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR.

Tabela 1 Teste de DNA HPV resultados de acordo com diagnstico citolgico

A concordncia para RH deteco do HPV entre o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV foi de 85,4%, mostrando concordncia substancial (coeficiente kappa = 0,71; Tabela 2 ). Em contraste, a concordncia entre o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR foi de 72,4%, mostrando concordncia moderada

(coeficiente kappa = 0,45). Para a deteco de HPV 16 e HPV 18, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste Set Typing PCR mostrou concordncia significativa (89,9%, coeficiente kappa = 0,65). No entanto, 20 casos (10,1%) apresentaram resultados discordantes, especificamente, oito casos foram positivos pelo 4 teste ACE HPV, mas a negativa por parte do HPV teste Set Typing PCR, enquanto que 12 amostras foram PCR HPV Typing Set teste positivo, mas HPV 4 ACEnegativo ( Tabela 3 ).

Tabela 2 Concordncia entre HC 2 ensaio, HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste conjunto de digitao

Tabela 3 Viso geral de amostras discordantes entre HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste Set Typing

A Tabela 4 mostra o HR HPV deteco relacionado com resultados citolgicos. A prevalncia global de RH HPV aumentaram em paralelo com o aumento da gravidade do resultado do exame de Papanicolaou. Quando um teste de Papanicolau anormal foi definido como ASCUS ou superior, a sensibilidade e especificidade do teste 4 ACE HPV no foram inferiores aos de ensaio 2 HC (72,2% vs 74,2% [ P = 0,40], e 61,8% vs 68,6% [ P = 0,27], respectivamente, Tabela 4 ). Alm disso, a sensibilidade e a especificidade do teste 4 ACE HPV tambm foram comparveis ao ensaio de HPV Conjunto de tipagem PCR ( P = 0,27 e 0,36, respectivamente).

Tabela 4 Viso geral da acurcia diagnstica de cada teste de DNA do HPV

Quando o teste de Papanicolau anormal foi definido como LSIL ou superior, todos os trs testes de ADN de HPV realizados de modo semelhante para a deteco de ADN de HPV RH (dados no mostrados). Alm disso, com respeito ao citolgico HSIL ou cancro cervical, todos os trs testes tinha o mesmo nvel de sensibilidade (92,9%) e um nvel de especificidade semelhante ( Tabela 4 ).

DISCUSSO
O objetivo deste estudo foi analisar o desempenho da novela HPV 4 teste ACE para a deteco de HPV HR e HPV 16 e 18 gentipos, em comparao com o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR. Desde a aprovao pela FDA dos EUA, o ensaio HC 2 foi usado como padro para a avaliao da eficcia dos novos mtodos de deteco de HPV diferentes de ADN ( 21 - 24 ). Alm disso, o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR tem sido amplamente utilizado para a deteco de HPV em diversos estudos ( 17- 20 ). Tendo em conta que o teste 4 ACE HPV s recentemente se tornou disponvel comercialmente, no existe nenhum estudo para comparar este com outros mtodos de ensaio de deteco de HPV. O teste 4 ACE HPV podem identificar o HPV 16 e HPV 18 gentipos de HPV entre 13 de alto risco e pode detectar a presena de outros 11 HPVs de alto risco. Por este aspecto, o romance HPV 4 teste ACE pode ser chamado como uma verso atualizada do ensaio HC 2. Por causa da enorme importncia do HPV 16 e 18 gentipos na progresso para leses cervicais de alto grau, a genotipagem do HPV 16 e 18 com deteco simultnea de 11 outros HPVs de alto risco parece ser muito eficaz, em comparao com outros PCR mtodos de genotipagem baseadas ou chip de

DNA HPV. 4 O teste de HPV ECA utiliza um sistema dual oligonucletido escorva (DPO), estruturalmente e funcionalmente diferente do sistema iniciador actualmente em uso generalizado. O sistema de condicionamento convencional baseia-se um evento de iniciao nico entre o iniciador e molde, o que muitas vezes conduz extenso de produtos no especficos. Em contraste, o sistema possui dois segmentos RPD iniciadores separados (um segmento de 18 5'-25nt de comprimento e um segmento 3 '-6-12nt de comprimento). Esta distribuio desigual de nucletidos conduz a diferentes preferncias de recozimento para cada segmento. 5'-O segmento mais preferencialmente se liga ao ADN e inicia recozimento estvel, ao passo que o segmento curto 3 'se liga selectivamente ao seu local alvo e bloqueia o recozimento no especfica ( 25 ). No presente estudo, o teste 4 ACE HPV mostraram os mesmos nveis comparveis ou da taxa de deteco de HPV RH, em comparao com o ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR. Alm disso, o teste de 4 ACE HPV revelou substancial acordo com o ensaio de HC 2 para a deteco de HPV 13 de RH. Em contraste, o teste do HPV Conjunto tipagem PCR mostrou um nvel de concordncia inferior de 4 de teste de HPV com o ACE 2 ensaio de HC, o que pode ser parcialmente atribudo a diferenas no nmero de tipos de HPV de RH que pode ser detectado por ambos os testes. O HPV teste Set Typing PCR pode detectar apenas 7 HPVs de RH, enquanto que 13 tipos podem ser detectados pelo ensaio HC 2. Alm disso, em termos de genotipagem do HPV, particularmente os HPV 16 e HPV 18 gentipos, o 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR.Tal como mostrado na Tabela 3 , 20 amostras foram discordantes entre o teste 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR. Embora o 4 teste ACE HPV no conseguiram detectar o HPV 16 ou HPV 18 em 12 de 20 amostras, havia apenas duas amostras negativas para qualquer HPV HR. Alm disso, estes dois processos foram mostrados para ser um normal e um ASCUS na citologia, no leses intraepiteliais escamosas.
base ensaio Um semelhante na estudo Amplicor PCR. DNA recente ao Em teste HC seu foirelatado 2 maior de estudo, para HPV do a por o deteco 4 que HR ACE Sandri o HPV Papanicolaou, 2 em ensaio de et termos taxa HPV al. do HC ( 13 21 de teste em de ) mtodos em RH. amostras de relao HPV O teste de AMPLICOR normais ao deteco de teste HPV do de de AMPLCOR HPV deteco HPV com com de o

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm

estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de

teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ). O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS
Populao de estudo e coleta de amostras
Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA,

EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reaco final de 20 ul, contendo 3 ul de DNA isolado a partir de esfregao cervical, 4 mL de 5 x 4 de HPV ACE mistura iniciador, e 10 mL de 2 Master Mix (Seegene Inc.). As condies de amplificao foram como se segue: desnaturao durante 15 minutos a 94 ; amplificao durante 40 ciclos, com desnaturao durante 30 segundos a 94 , recozimento durante 1 min 30 seg a 60 , e extenso de 1 min 30 seg a 72 . Os produtos de PCR amplificados foram separados em gel de agarose a 2% corado com brometo de etdio ou ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, Reino Unido). Resumidamente, aps PCR, 2 uL do produto de amplificao foi misturado com 6 uL de tampo de carregamento (Lab901) num tubo de PCR de 0,2 mL. Insira o bloco de amostra para o TapeStation (Lab901) e coloque o tubo de 0,2 mL PCR contendo a amostra. Anlise amplicon foi ento realizada no Sistema ScreenTape com a Viso software Seegene.Sistema de eletroforese capilar de Seegene fornecer o software de deteco que leia automaticamente o produto de PCR e analisar a intensidade amplicon enquanto o manual convencional eletroforese capilar necessidade do usurio lido do pico com olhos nus aps a mistura do produto da PCR com SYBR verde ou cito-9 corante.

PCR HPV teste Set Typing


O DNA foi extrado de zaragatoa em esfregaos usando um Micro QIAamp DNA Kit (Qiagen, Inc.) de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de ADN foi medida utilizando um espectrofotmetro (DU 530, Beckman, Fullerton, CA, EUA), e a qualidade de ADN foi confirmada em gel de agarose. Foi utilizado o mtodo de PCR utilizando o Conjunto de dactilografia de HPV. O subtipo de HPV foi determinada utilizando o Typing Set HPV (Takara Bio., Shiga, Japo), um conjunto de primers para PCR projetado especificamente para identificar gentipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em ADN genmico. O iniciador HPVpU-31B foi utilizado para amplificar o DNA de HPV 6 e 11 (LR gentipos de HPV) e HPVpU-1M foi usada para

amplificar o ADN do HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 (AR HPV gentipos). O mtodo de dactilografia Conjunto de HPV por PCR foi utilizada de acordo com as instrues do fabricante. Este conjunto inclui modelos de controlo, tanto malignas e benignas para verificao da reaco de PCR utilizando os pares de primers fornecidos no conjunto. A sua expresso foi normalizado, utilizando o modelo de controlo fornecido como uma referncia endgena. Digesto com enzimas de restrio dos produtos de PCR tambm pode ser confirmado, porque os produtos de PCR reconheceu os stios de Ava II, AfaI, Bgl II, Acc I e Ava I e pequenos tamanhos de fragmentos de DNA so geradas por digesto de enzimas de restrio. Os fragmentos de ADN foram confirmadas em gis de agarose e identificados os gentipos de HPV.

A anlise estatstica
Para comparar a preciso clnica do HC ensaio 2, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste conjunto PCR digitao para detectar leses cervicais de alto grau, tambm foi calculada a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo valor (VAL), a sensibilidade e especificidade dos trs ensaios foram comparados pelo teste da proporo emparelhado. Acordo entre os ensaios de HPV foi avaliada pelo coeficiente kappa de Cohen, com valores de 0,00-,20 indicando baixa concordncia, 0,21-0,40 acordo justo, 0,41-0,60 concordncia moderada, 0,61-0,80 acordo substancial, e 0,81-1,00 concordncia quase perfeita. Anlise de qui-quadrado de McNemar para dados par combinado foi realizada para analisar as tabelas de contingncia comparando testes de HPV. As anlises estatsticas foram realizadas com o SPSS, verso 12.0, software estatstico (Chicago, IL, EUA). Todos os testes foram em frente e verso, e P <0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS
Os resultados citolgicas, bem como todos os trs resultados de teste de ADN de HPV, estavam disponveis para 199 pacientes. Os RH taxas de deteco do HPV em geral foram de 52,3% (104/199) pelo ensaio HC 2, 54,3% (108/199) pela 4 teste ACE HPV, e 48,7% (97/199) pelo HPV teste Set Typing PCR ( Tabela 1 ). As

taxas de RH HPV-positivos por parte do 2 ensaio HC, HPV 4 teste ACE, e PCR HPV teste Set Typing foram 31,4%, 37,3% e 33,3%, para o grupo normal, citologia, 65,5%, 61,8% e 58,2% para clulas escamosas atpicas de significado indeterminado (ASCUS), 82,1%, 82,1% e 60,7% para o baixo grau de leso intraepitelial escamosa (LSIL), respectivamente. No grupo citolgico de alto grau de leso intra-epitelial escamosa (HSIL), o que clinicamente importante para a sua tendncia para progredir para o cancro cervical, todos os trs testes mostraram taxas de positividade idnticas (87,5%), e uma taxa de deteco de HPV HR de 100% foi observada o grupo de cncer cervical por todos os trs testes. A 4 teste ACE HPV no mostraram diferena significativa em RH HPV positividade no grupo de citologia normal a partir do ensaio HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR ( P = 0,143 e P = 0,585, respectivamente). No entanto, houve 17 amostras discordantes entre o ensaio de HC e 2 a 4 de HPV em amostras de ensaio de ACE normais Papanicolau; 5 amostras eram amostras de HC 2positivos e HPV 4 ACE-negativo, e 12 eram HC 2-negativo e HPV 4 ECA positivo. De 12 amostras, quatro includo RH gentipos de HPV (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, e 52), que foram identificadas pelo teste de HPV Set Typing PCR. Em contraste, no houve RH gentipos identificados nas cinco amostras anteriores. Em citolgico ASCUS, a taxa de deteco do teste do HPV 4 ACE para HR HPV tambm no foi significativamente diferente do ensaio HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR, mas o ensaio de HC 2 mostrou uma taxa significativamente mais elevada para a deteco de HPV de AR do que a PCR HPV Typing Test Set ( P = 0,02). Com o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV, uma porcentagem significativamente maior de amostras de Papanicolau LSIL testou positivo para HPV HR do que com o HPV Typing Test Set PCR (82,1% vs 60,7%, P = 0,03). Em mulheres com HSIL citolgica, a 4 de teste de HPV ACE apresentaram uma taxa de deteco de 87,5% para o HPV de AR, o que era o mesmo nvel que, tanto no ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR.

Tabela 1 Teste de DNA HPV resultados de acordo com diagnstico citolgico

A concordncia para RH deteco do HPV entre o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV foi de 85,4%, mostrando concordncia substancial (coeficiente kappa = 0,71; Tabela 2 ). Em contraste, a concordncia entre o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR foi de 72,4%, mostrando concordncia moderada (coeficiente kappa = 0,45). Para a deteco de HPV 16 e HPV 18, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste Set Typing PCR mostrou concordncia significativa (89,9%, coeficiente kappa = 0,65). No entanto, 20 casos (10,1%) apresentaram resultados discordantes, especificamente, oito casos foram positivos pelo 4 teste ACE HPV, mas a negativa por parte do HPV teste Set Typing PCR, enquanto que 12 amostras foram PCR HPV Typing Set teste positivo, mas HPV 4 ACEnegativo ( Tabela 3 ).

Tabela 2 Concordncia entre HC 2 ensaio, HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste conjunto de digitao

Tabela 3 Viso geral de amostras discordantes entre HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste Set Typing

A Tabela 4 mostra o HR HPV deteco relacionado com resultados citolgicos. A prevalncia global de RH HPV aumentaram em paralelo com o aumento da gravidade do resultado do exame de Papanicolaou. Quando um teste de Papanicolau anormal foi definido como ASCUS ou superior, a sensibilidade e especificidade do teste 4 ACE HPV no foram inferiores aos de ensaio 2 HC (72,2% vs 74,2% [ P = 0,40], e 61,8% vs 68,6% [ P = 0,27], respectivamente, Tabela 4 ). Alm disso, a sensibilidade e a especificidade do teste 4 ACE HPV tambm foram comparveis ao ensaio de HPV Conjunto de tipagem PCR ( P = 0,27 e 0,36, respectivamente).

Tabela 4 Viso geral da acurcia diagnstica de cada teste de DNA do HPV

Quando o teste de Papanicolau anormal foi definido como LSIL ou superior, todos os trs testes de ADN de HPV realizados de modo semelhante para a deteco de ADN de HPV RH (dados no mostrados). Alm disso, com respeito ao citolgico HSIL ou cancro cervical, todos os trs testes tinha o mesmo nvel de sensibilidade (92,9%) e um nvel de especificidade semelhante ( Tabela 4 ).

DISCUSSO
O objetivo deste estudo foi analisar o desempenho da novela HPV 4 teste ACE para a deteco de HPV HR e HPV 16 e 18 gentipos, em comparao com o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR. Desde a aprovao pela FDA dos EUA, o ensaio HC 2 foi usado como padro para a avaliao da eficcia dos novos mtodos de deteco de HPV diferentes de ADN ( 21 - 24 ). Alm disso, o

teste de HPV Conjunto de tipagem PCR tem sido amplamente utilizado para a deteco de HPV em diversos estudos ( 17- 20 ). Tendo em conta que o teste 4 ACE HPV s recentemente se tornou disponvel comercialmente, no existe nenhum estudo para comparar este com outros mtodos de ensaio de deteco de HPV. O teste 4 ACE HPV podem identificar o HPV 16 e HPV 18 gentipos de HPV entre 13 de alto risco e pode detectar a presena de outros 11 HPVs de alto risco. Por este aspecto, o romance HPV 4 teste ACE pode ser chamado como uma verso atualizada do ensaio HC 2. Por causa da enorme importncia do HPV 16 e 18 gentipos na progresso para leses cervicais de alto grau, a genotipagem do HPV 16 e 18 com deteco simultnea de 11 outros HPVs de alto risco parece ser muito eficaz, em comparao com outros PCR mtodos de genotipagem baseadas ou chip de DNA HPV. 4 O teste de HPV ECA utiliza um sistema dual oligonucletido escorva (DPO), estruturalmente e funcionalmente diferente do sistema iniciador actualmente em uso generalizado. O sistema de condicionamento convencional baseia-se um evento de iniciao nico entre o iniciador e molde, o que muitas vezes conduz extenso de produtos no especficos. Em contraste, o sistema possui dois segmentos RPD iniciadores separados (um segmento de 18 5'-25nt de comprimento e um segmento 3 '-6-12nt de comprimento). Esta distribuio desigual de nucletidos conduz a diferentes preferncias de recozimento para cada segmento. 5'-O segmento mais preferencialmente se liga ao ADN e inicia recozimento estvel, ao passo que o segmento curto 3 'se liga selectivamente ao seu local alvo e bloqueia o recozimento no especfica ( 25 ). No presente estudo, o teste 4 ACE HPV mostraram os mesmos nveis comparveis ou da taxa de deteco de HPV RH, em comparao com o ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR. Alm disso, o teste de 4 ACE HPV revelou substancial acordo com o ensaio de HC 2 para a deteco de HPV 13 de RH. Em contraste, o teste do HPV Conjunto tipagem PCR mostrou um nvel de concordncia inferior de 4 de teste de HPV com o ACE 2 ensaio de HC, o que pode ser parcialmente atribudo a diferenas no nmero de tipos de HPV de RH que pode ser detectado por ambos os testes. O HPV teste Set Typing PCR pode detectar apenas 7 HPVs de RH, enquanto que 13 tipos podem ser

detectados pelo ensaio HC 2. Alm disso, em termos de genotipagem do HPV, particularmente os HPV 16 e HPV 18 gentipos, o 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR.Tal como mostrado na Tabela 3 , 20 amostras foram discordantes entre o teste 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR. Embora o 4 teste ACE HPV no conseguiram detectar o HPV 16 ou HPV 18 em 12 de 20 amostras, havia apenas duas amostras negativas para qualquer HPV HR. Alm disso, estes dois processos foram mostrados para ser um normal e um ASCUS na citologia, no leses intraepiteliais escamosas. Um estudo recente relatado por Sandri et al. ( 21 ) em relao ao teste do HPV com o ensaio Amplicor HC 2 para a deteco de HPV 13 de RH. O teste de HPV AMPLCOR semelhante ao teste de HPV 4 ACE em termos de mtodos de deteco de HPV com base na PCR. Em seu estudo, o HR HPV taxa do teste de HPV AMPLICOR deteco de DNA foi maior do que o 2 ensaio HC em amostras normais de Papanicolaou, enquanto os dois testes realizados de forma semelhante nos resultados de Papanicolau anormais. Por outro lado, nosso estudo no mostrou diferena significativa entre os dois testes para HR HPV DNA positividade, independentemente dos resultados citolgicos. Outro estudo realizado por Stevens et ai. ( 22 ) foi avaliado o desempenho do ensaio HC 2 e o teste de HPV AMPLICOR acordo com os resultados citolgicos. Em citolgico HSIL ou superior, a sensibilidade do ensaio de HC 2 eo teste de HPV AMPLICOR eram 87,4% e 95,2%, respectivamente, o que foi semelhante aos nossos resultados.Quando comparado com um outro mtodo de deteco de ADN de HPV baseada em PCR, j em utilizao, tal como o ensaio Amplicor, o novo teste de HPV 4 ACE apresentaram sensibilidade comparvel para a deteco de HPV de AR. Com relao ao teste de HPV Set Typing PCR, Fujinaga et al. ( 18 ) avaliaram o desempenho deste teste em 39 amostras de tecido de carcinoma cervical. De acordo com seu relatrio, a prevalncia global de RH HPV foi de 84,6%, dos quais havia 19 amostras HPV 16 positivas e cinco HPV 18 amostras positivas. Em nosso estudo, embora avaliada em amostras de citologia, a taxa de

deteco de HPV HR foi de 100% em seis tipos de cncer do colo do tero. Entre as seis amostras, 4-positivo de HPV 16 e HPV 18 1 amostras positivas foram identificadas. Nosso estudo teve algumas limitaes. Primeiro, o nmero de amostras de LSIL citolgica ou superior no foram suficientes para concluir os nossos resultados. Em segundo lugar, no podemos avaliar o desempenho dos testes de DNA do HPV, utilizando amostras de tecido, devido perda de follow-up. Por esse motivo, avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos trs testes de HPV utilizando amostras de citologia em trs condies diferentes, que a "doena" foi definido como: 1) ASC-US ou pior, 2) LSIL ou pior, e 3) HSIL ou pior.
No tipos cerca ACE vrios pode entanto, HPV de de dar testes HPV 70% abasicamente nosso informao de 11 decncer alto HPVs DNA estudo risco. de do de sobre o mostrou alto HPV colo Mas mesmo risco, a de j apresena diferena em tero. que teste mas uso, ocomo Portanto, romance tambm 18, particularmente de entre HPV HC2 os o HPV 16 no ensaio gentipo dois e 18 podemos 4testes teste gentipos, em o ensaio de termos ACE HPV que apenas podem de que o 16 de HPV HC e detectar deteco representam 2. substituir 4O teste teste outros de ACE 4 13 os

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco

(85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no

permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ). O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS

Populao de estudo e coleta de amostras


Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os

hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reaco final de 20 ul, contendo 3 ul de DNA isolado a partir de esfregao cervical, 4 mL de 5 x 4 de HPV ACE mistura iniciador, e 10 mL de 2 Master Mix (Seegene Inc.). As condies de amplificao foram como se segue: desnaturao durante 15 minutos a 94 ; amplificao durante 40 ciclos, com desnaturao durante 30 segundos a 94 , recozimento durante 1 min 30 seg a 60 , e extenso de 1 min 30 seg a 72 . Os produtos de PCR amplificados foram separados em gel de agarose a 2% corado com brometo de etdio ou ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, Reino Unido). Resumidamente, aps PCR, 2 uL do produto de amplificao foi misturado com 6 uL de tampo de carregamento (Lab901) num tubo de PCR de 0,2 mL. Insira o bloco de amostra para o TapeStation (Lab901) e coloque o tubo de 0,2 mL PCR contendo a amostra. Anlise amplicon foi ento realizada no Sistema ScreenTape com a Viso software Seegene.Sistema de eletroforese capilar de Seegene fornecer o software de deteco que leia automaticamente o produto de PCR e analisar a intensidade amplicon enquanto o manual convencional eletroforese capilar necessidade do usurio lido do pico com olhos nus aps a mistura do produto da PCR com SYBR verde ou cito-9 corante.

PCR HPV teste Set Typing


O DNA foi extrado de zaragatoa em esfregaos usando um Micro QIAamp DNA Kit (Qiagen, Inc.) de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de ADN foi medida utilizando um espectrofotmetro (DU 530, Beckman, Fullerton, CA, EUA), e a qualidade de ADN foi confirmada em gel de agarose. Foi utilizado o mtodo de PCR utilizando o Conjunto de dactilografia de HPV. O subtipo de HPV foi determinada utilizando o Typing Set HPV (Takara Bio., Shiga, Japo), um conjunto de primers para PCR projetado especificamente para identificar gentipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em ADN genmico. O iniciador HPVpU-31B foi utilizado para amplificar o DNA de HPV 6 e 11 (LR gentipos de HPV) e HPVpU-1M foi usada para amplificar o ADN do HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 (AR HPV gentipos). O mtodo de dactilografia Conjunto de HPV por PCR foi utilizada de acordo com as instrues do fabricante. Este conjunto inclui modelos de controlo, tanto malignas e benignas para verificao da reaco de PCR utilizando os pares de primers fornecidos no conjunto. A sua expresso foi normalizado, utilizando o modelo de controlo fornecido como uma referncia endgena. Digesto com enzimas de restrio dos produtos de PCR tambm pode ser confirmado, porque os produtos de PCR reconheceu os stios de Ava II, AfaI, Bgl II, Acc I e Ava I e pequenos tamanhos de fragmentos de DNA so geradas por digesto de enzimas de restrio. Os fragmentos de ADN foram confirmadas em gis de agarose e identificados os gentipos de HPV.

A anlise estatstica
Para comparar a preciso clnica do HC ensaio 2, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste conjunto PCR digitao para detectar leses cervicais de alto grau, tambm foi calculada a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo valor (VAL), a sensibilidade e especificidade dos trs ensaios foram comparados pelo teste da proporo emparelhado. Acordo entre os ensaios de HPV foi avaliada pelo coeficiente kappa de Cohen, com valores de 0,00-,20 indicando baixa concordncia, 0,21-0,40 acordo justo, 0,41-0,60 concordncia moderada, 0,61-0,80 acordo substancial, e 0,81-1,00

concordncia quase perfeita. Anlise de qui-quadrado de McNemar para dados par combinado foi realizada para analisar as tabelas de contingncia comparando testes de HPV. As anlises estatsticas foram realizadas com o SPSS, verso 12.0, software estatstico (Chicago, IL, EUA). Todos os testes foram em frente e verso, e P <0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS
Os resultados citolgicas, bem como todos os trs resultados de teste de ADN de HPV, estavam disponveis para 199 pacientes. Os RH taxas de deteco do HPV em geral foram de 52,3% (104/199) pelo ensaio HC 2, 54,3% (108/199) pela 4 teste ACE HPV, e 48,7% (97/199) pelo HPV teste Set Typing PCR ( Tabela 1 ). As taxas de RH HPV-positivos por parte do 2 ensaio HC, HPV 4 teste ACE, e PCR HPV teste Set Typing foram 31,4%, 37,3% e 33,3%, para o grupo normal, citologia, 65,5%, 61,8% e 58,2% para clulas escamosas atpicas de significado indeterminado (ASCUS), 82,1%, 82,1% e 60,7% para o baixo grau de leso intraepitelial escamosa (LSIL), respectivamente. No grupo citolgico de alto grau de leso intra-epitelial escamosa (HSIL), o que clinicamente importante para a sua tendncia para progredir para o cancro cervical, todos os trs testes mostraram taxas de positividade idnticas (87,5%), e uma taxa de deteco de HPV HR de 100% foi observada o grupo de cncer cervical por todos os trs testes. A 4 teste ACE HPV no mostraram diferena significativa em RH HPV positividade no grupo de citologia normal a partir do ensaio HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR ( P = 0,143 e P = 0,585, respectivamente). No entanto, houve 17 amostras discordantes entre o ensaio de HC e 2 a 4 de HPV em amostras de ensaio de ACE normais Papanicolau; 5 amostras eram amostras de HC 2positivos e HPV 4 ACE-negativo, e 12 eram HC 2-negativo e HPV 4 ECA positivo. De 12 amostras, quatro includo RH gentipos de HPV (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, e 52), que foram identificadas pelo teste de HPV Set Typing PCR. Em contraste, no houve RH gentipos identificados nas cinco amostras anteriores. Em citolgico ASCUS, a taxa de deteco do teste do HPV 4 ACE para HR HPV tambm no foi significativamente diferente do ensaio HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR, mas o ensaio de HC 2 mostrou uma taxa significativamente mais elevada para a deteco de HPV de AR do que a

PCR HPV Typing Test Set ( P = 0,02). Com o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV, uma porcentagem significativamente maior de amostras de Papanicolau LSIL testou positivo para HPV HR do que com o HPV Typing Test Set PCR (82,1% vs 60,7%, P = 0,03). Em mulheres com HSIL citolgica, a 4 de teste de HPV ACE apresentaram uma taxa de deteco de 87,5% para o HPV de AR, o que era o mesmo nvel que, tanto no ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR.

Tabela 1 Teste de DNA HPV resultados de acordo com diagnstico citolgico

A concordncia para RH deteco do HPV entre o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV foi de 85,4%, mostrando concordncia substancial (coeficiente kappa = 0,71; Tabela 2 ). Em contraste, a concordncia entre o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR foi de 72,4%, mostrando concordncia moderada (coeficiente kappa = 0,45). Para a deteco de HPV 16 e HPV 18, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste Set Typing PCR mostrou concordncia significativa (89,9%, coeficiente kappa = 0,65). No entanto, 20 casos (10,1%) apresentaram resultados discordantes, especificamente, oito casos foram positivos pelo 4 teste ACE HPV, mas a negativa por parte do HPV teste Set Typing PCR, enquanto que 12 amostras foram PCR HPV Typing Set teste positivo, mas HPV 4 ACEnegativo ( Tabela 3 ).

Tabela 2

Concordncia entre HC 2 ensaio, HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste conjunto de digitao

Tabela 3 Viso geral de amostras discordantes entre HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste Set Typing

A Tabela 4 mostra o HR HPV deteco relacionado com resultados citolgicos. A prevalncia global de RH HPV aumentaram em paralelo com o aumento da gravidade do resultado do exame de Papanicolaou. Quando um teste de Papanicolau anormal foi definido como ASCUS ou superior, a sensibilidade e especificidade do teste 4 ACE HPV no foram inferiores aos de ensaio 2 HC (72,2% vs 74,2% [ P = 0,40], e 61,8% vs 68,6% [ P = 0,27], respectivamente, Tabela 4 ). Alm disso, a sensibilidade e a especificidade do teste 4 ACE HPV tambm foram comparveis ao ensaio de HPV Conjunto de tipagem PCR ( P = 0,27 e 0,36, respectivamente).

Tabela 4 Viso geral da acurcia diagnstica de cada teste de DNA do HPV

Quando o teste de Papanicolau anormal foi definido como LSIL ou superior, todos os trs testes de ADN de HPV realizados de modo semelhante para a deteco de ADN de HPV RH (dados no mostrados). Alm disso, com respeito ao citolgico HSIL ou cancro cervical, todos os trs testes tinha o mesmo nvel de sensibilidade (92,9%) e um nvel de especificidade semelhante ( Tabela 4 ).

DISCUSSO
O objetivo deste estudo foi analisar o desempenho da novela HPV 4 teste ACE para a deteco de HPV HR e HPV 16 e 18 gentipos, em comparao com o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR. Desde a aprovao pela FDA dos EUA, o ensaio HC 2 foi usado como padro para a avaliao da eficcia dos novos mtodos de deteco de HPV diferentes de ADN ( 21 - 24 ). Alm disso, o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR tem sido amplamente utilizado para a deteco de HPV em diversos estudos ( 17- 20 ). Tendo em conta que o teste 4 ACE HPV s recentemente se tornou disponvel comercialmente, no existe nenhum estudo para comparar este com outros mtodos de ensaio de deteco de HPV. O teste 4 ACE HPV podem identificar o HPV 16 e HPV 18 gentipos de HPV entre 13 de alto risco e pode detectar a presena de outros 11 HPVs de alto risco. Por este aspecto, o romance HPV 4 teste ACE pode ser chamado como uma verso atualizada do ensaio HC 2. Por causa da enorme importncia do HPV 16 e 18 gentipos na progresso para leses cervicais de alto grau, a genotipagem do HPV 16 e 18 com deteco simultnea de 11 outros HPVs de alto risco parece ser muito eficaz, em comparao com outros PCR mtodos de genotipagem baseadas ou chip de DNA HPV. 4 O teste de HPV ECA utiliza um sistema dual oligonucletido escorva (DPO), estruturalmente e funcionalmente diferente do sistema iniciador actualmente em uso generalizado. O sistema de condicionamento convencional baseia-se um evento de iniciao nico entre o iniciador e molde, o que muitas vezes conduz extenso de produtos no especficos. Em contraste, o sistema possui dois segmentos RPD iniciadores separados (um segmento de 18 5'-25nt de comprimento e um segmento 3 '-6-12nt de comprimento). Esta distribuio desigual de nucletidos conduz a diferentes preferncias de recozimento para cada segmento. 5'-O segmento mais preferencialmente se liga ao ADN e inicia recozimento estvel, ao passo que o segmento curto 3 'se liga selectivamente ao seu local alvo e bloqueia o recozimento no especfica ( 25 ). No presente estudo, o teste 4 ACE HPV mostraram os mesmos nveis comparveis ou da taxa de deteco de HPV RH, em comparao com o ensaio

de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR. Alm disso, o teste de 4 ACE HPV revelou substancial acordo com o ensaio de HC 2 para a deteco de HPV 13 de RH. Em contraste, o teste do HPV Conjunto tipagem PCR mostrou um nvel de concordncia inferior de 4 de teste de HPV com o ACE 2 ensaio de HC, o que pode ser parcialmente atribudo a diferenas no nmero de tipos de HPV de RH que pode ser detectado por ambos os testes. O HPV teste Set Typing PCR pode detectar apenas 7 HPVs de RH, enquanto que 13 tipos podem ser detectados pelo ensaio HC 2. Alm disso, em termos de genotipagem do HPV, particularmente os HPV 16 e HPV 18 gentipos, o 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR.Tal como mostrado na Tabela 3 , 20 amostras foram discordantes entre o teste 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR. Embora o 4 teste ACE HPV no conseguiram detectar o HPV 16 ou HPV 18 em 12 de 20 amostras, havia apenas duas amostras negativas para qualquer HPV HR. Alm disso, estes dois processos foram mostrados para ser um normal e um ASCUS na citologia, no leses intraepiteliais escamosas. Um estudo recente relatado por Sandri et al. ( 21 ) em relao ao teste do HPV com o ensaio Amplicor HC 2 para a deteco de HPV 13 de RH. O teste de HPV AMPLCOR semelhante ao teste de HPV 4 ACE em termos de mtodos de deteco de HPV com base na PCR. Em seu estudo, o HR HPV taxa do teste de HPV AMPLICOR deteco de DNA foi maior do que o 2 ensaio HC em amostras normais de Papanicolaou, enquanto os dois testes realizados de forma semelhante nos resultados de Papanicolau anormais. Por outro lado, nosso estudo no mostrou diferena significativa entre os dois testes para HR HPV DNA positividade, independentemente dos resultados citolgicos. Outro estudo realizado por Stevens et ai. ( 22 ) foi avaliado o desempenho do ensaio HC 2 e o teste de HPV AMPLICOR acordo com os resultados citolgicos. Em citolgico HSIL ou superior, a sensibilidade do ensaio de HC 2 eo teste de HPV AMPLICOR eram 87,4% e 95,2%, respectivamente, o que foi semelhante aos nossos resultados.Quando comparado com um outro mtodo de deteco de ADN de HPV baseada em PCR, j em utilizao, tal como o ensaio

Amplicor, o novo teste de HPV 4 ACE apresentaram sensibilidade comparvel para a deteco de HPV de AR. Com relao ao teste de HPV Set Typing PCR, Fujinaga et al. ( 18 ) avaliaram o desempenho deste teste em 39 amostras de tecido de carcinoma cervical. De acordo com seu relatrio, a prevalncia global de RH HPV foi de 84,6%, dos quais havia 19 amostras HPV 16 positivas e cinco HPV 18 amostras positivas. Em nosso estudo, embora avaliada em amostras de citologia, a taxa de deteco de HPV HR foi de 100% em seis tipos de cncer do colo do tero. Entre as seis amostras, 4-positivo de HPV 16 e HPV 18 1 amostras positivas foram identificadas. Nosso estudo teve algumas limitaes. Primeiro, o nmero de amostras de LSIL citolgica ou superior no foram suficientes para concluir os nossos resultados. Em segundo lugar, no podemos avaliar o desempenho dos testes de DNA do HPV, utilizando amostras de tecido, devido perda de follow-up. Por esse motivo, avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos trs testes de HPV utilizando amostras de citologia em trs condies diferentes, que a "doena" foi definido como: 1) ASC-US ou pior, 2) LSIL ou pior, e 3) HSIL ou pior. No entanto, nosso estudo mostrou que o romance HPV 4 teste ACE podem substituir os vrios testes de DNA do HPV j em uso, particularmente o ensaio de HC 2. O teste 4 ACE HPV basicamente o mesmo teste como HC2 ensaio em termos de deteco de 13 tipos de HPV de alto risco. Mas a diferena entre os dois testes que o HPV 4 teste ACE pode dar a informao sobre a presena de HPV 16 e 18 gentipos, que representam cerca de 70% de cncer de colo de tero. Portanto, no podemos apenas detectar outros 11 HPVs de alto risco, mas tambm o gentipo de HPV 16 e 18, simultaneamente, atravs da realizao do teste 4 ACE HPV. Esta diferena muito importante na medida em que o conhecimento sobre a presena de HPV 16 e 18 seria til para a triagem dos pacientes que so necessrios para obter o acompanhamento freqente ou no. Alm disso, na poca da vacinao contra o HPV, informaes sobre os gentipos HPV cancergenas especficas identificadas por testes de DNA do HPV, como o 2 ensaio HC em mulheres positivas para HPV HR, seria til para

mulheres exigentes com doenas clinicamente relevantes que so mais propensos a o progresso de pessoas com doenas que regridem espontaneamente. Alm disso, a infeco persistente com RH gentipos de HPV, tais como o HPV 16 e HPV 18, conhecida como uma condio necessria para o desenvolvimento de neoplasia cervical intra-epitelial de alto grau e de doena invasiva ( 26 ). Portanto, seletiva HPV genotipagem para RH gentipos de HPV seria crucial para diferenciar mulheres que esto em alto risco de progresso daqueles que so susceptveis de regredir. Assim, o teste de 4 ACE HPV tem a capacidade de detectar a presena de tipos de HPV 13 HR e tambm para identificar o HPV 16 e HPV 18 gentipos simultaneamente em alto grau de concordncia com o ensaio HC 2. Para tornar esta ferramenta de diagnstico novela mais credvel, necessrio mais estudos com amostras maiores e comparao com outros mtodos de genotipagem de DNA de HPV.

Informaes Artigo
J Med Sci-coreano. agosto 2009, 24 (4) : 579-584. Publicado on-line 2009 29 de julho. doi: 10.3346/jkms.2009.24.4.579 PMCID: PMC2719217 Hong Jin Hwa , um Seung Hun Cano , uma Jong Kee Kim , 2 Hyun Jeong Han , 2 e Jae Lee Kwan Departamento de Obstetrcia e Ginecologia do Hospital Guro, Faculdade de Medicina da Universidade da Coreia, Seul, Coria.
1 2 1

Seegene Instituto de Cincias da Vida, Seul, Coria. Autor para correspondncia.

Endereo para correspondncia: Jae Lee Kwan, MD Departamento de Obstetrcia e Ginecologia do Hospital Guro, Faculdade de Medicina da Universidade da Coreia, 80 Guro-dong, Guro-gu, Seoul 152-703, Coria. Tel: +82.2-2626-3142, Fax: +82.2-838-1560,Email: jklee38/at/korea.ac.kr Recebida em 24 de dezembro de 2008; Aceito 14 de maro de 2009.

Comparao da Novel Papilomavrus Humano 4 Auto-Teste de eletroforese capilar com a Captura Hbrida 2 Ensaio e

com a PCR HPV Typing Test Set na deteco de HPV de alto risco, incluindo o HPV 16 e 18 gentipos em amostras cervicais
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], e Jae Lee Kwan
Informaes do artigo adicional

Abstrato
O objetivo deste estudo foi comparar o novo mtodo de deteco de papilomavrus humano (HPV), o HPV 4 Eletroforese Auto-capilar (ACE) com o teste de captura hbrida (HC) 2 ensaio para a deteco de HPV de alto risco. Alm disso, comparou-se a 4 de teste de HPV ACE com a reaco de ensaio de HPV conjunto de escrita em cadeia de polimerase para a deteco de HPV 16 e HPV 18 gentipos. Um e noventa e nove amostras de swab cervical obtidas de mulheres com exames de Papanicolau anormais anteriores foram submetidos a testes com os trs testes de HPV. A 4 teste ACE HPV eo ensaio HC 2 mostrou concordncia substancial para a deteco de HPV de alto risco (85,4%, kappa = 0,71). A 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR na deteco de HPV 16 e HP V 18 gentipos (89,9%, kappa = 0,65). Em correlao com os resultados citolgicos, as sensibilidades e as especificidades do HPV 4 ACE teste e ensaio HC 2 foram 92,9% contra 92,9% e 48,1% versus 50,8%, respectivamente, quando as leses intra-epiteliais de alto grau foram considerados como citologias anormais. O teste do HPV 4 ACE romance uma ferramenta valiosa para a deteco de tipos de HPV de alto risco e para a genotipagem de HPV 16 e HPV 18.
Palavras-chave: mtodos de tipagem de HPV, ACE, HC2, HPV Typing Test set

INTRODUO
Cncer de colo uterino representa o segundo mais comum ginecolgicas malignidade mundial. Vrios molecular e estudos epidemiolgicos tm estabelecido uma forte associao entre alto risco (HR) de papilomavrus (HPV) gentipos humanos eo desenvolvimento de cncer do colo do tero e de suas

leses precursoras, neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) 2 ou 3 ( 1 - 5 ). A maioria dos casos de cancro do colo do tero causada pela infeco com pelo menos um dos 13 tipos de HPV de RH cancergenas aceite (isto , os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , e 68) (1 , 3 , 5 ). Entre os tipos de HPV cancergeno, HPV 16 e HPV 18 so responsveis por aproximadamente 70% de todos os cnceres cervicais ( 6 ). Consequentemente, foi proposto que os mtodos de deteco do HPV altamente sensveis, tais como o teste do ADN de HPV, pode melhorar a eficcia dos programas de rastreio baseados na populao, quer como um instrumento de rastreio nico ou como adjuvante da corrente de rastreio citolgico cervical. Recentemente, a deteco da infeco pelo HPV depende quase inteiramente em metodologias moleculares, das quais a Captura Hbrida (HC) 2 ensaio (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA), o teste de DNA HPV s comercial aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA ) ( 7 , 8 ). O ensaio HC 2 tambm foi aprovado em os EUA como um complemento para o teste de Papanicolaou para o rastreio do cancro do colo do tero para as mulheres com idade superior a 30 anos. Enquanto o ensaio pode detectar HC 2 RH 13 gentipos de HPV, que no permite a identificao de gentipos especficos, nem fornece qualquer informao sobre a mltiplas infeces de HPV. Estudos recentes tm fornecido evidncias de uma diferena de potencial oncognico entre os gentipos de HPV de RH, destacando a importncia da genotipagem do HPV, principalmente o HPV 16 e HPV 18 ( 9 ). H reao em cadeia da polimerase numerosos (PCR) com base em mtodos de genotipagem do HPV em uso generalizado. Os mtodos de genotipagem de HPV com base na PCR comercialmente disponveis incluem os conjuntos de iniciadores, GP5 + / GP6 + ( 10 , 11 ) e MY09/11, e seus derivados, posteriormente modificado PGMY09/11 ( 12 , 13 ) e o sistema SPF10 ( 14 - 16 ) . Recentemente, foi desenvolvido um romance de deteco de HPV baseado em PCR e mtodo de genotipagem, o HPV 4 eElectrophoresis Auto-capilar (ACE) de teste (Seegene Inc., Seoul, Korea). Em contraste com outros mtodos de PCR comercialmente disponveis, o teste 4 ACE HPV utiliza um sistema

recentemente desenvolvido oligonucletido escorva dupla (DPO), a fim de minimizar o risco de iniciao no especfica. Este teste tem a capacidade de identificar o HPV 16 e 18 gentipos e pode detectar outros 11 HPVs de RH. Em contraste, o teste de PCR de HPV Typing Conjunto (Takara Bio., Shiga, Japo), que est disponvel comercialmente, utiliza dois conjuntos de iniciadores que permitem detectar a 7 RH (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58 ) e 2 LR gentipos do HPV (HPV-6 e 11) ( 17 - 20 ). O objectivo deste estudo foi avaliar a eficcia do ensaio 4 ACE HPV, em comparao com o ensaio de HC 2 eo teste de PCR de HPV conjunto de escrita para a deteco de ADN de HPV de RH em amostras de esfregao cervical. Alm disso, foram comparados os 4 teste ACE HPV com a PCR HPV teste Set Typing para a deteco de HPV 16 e HPV 18. Por fim, avaliou-se a sensibilidade e especificidade destes testes de DNA do HPV em correlao com os resultados citolgicos.

MATERIAIS E MTODOS
Populao de estudo e coleta de amostras
Cento e noventa e nove mulheres que foram encaminhados para a Clnica de Colposcopia do Hospital Guro da Universidade da Coreia para citologia anormal entre abril e junho de 2008 foram registrados prospectivamente. Uma amostra cervical para citologia em meio lquido, juntamente com HPV deteco simultnea do DNA pelo ensaio HC 2, foi coletado de cada mulher. O ADN genmico foi extrado de cada amostra, e os testes de DNA de HPV foram realizadas tanto pelo ensaio 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR na mesma amostra. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Guro Universidade da Coreia, e ao consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Citologia em base lquida


A Cervex-Brush (Rovers Dispositivos Mdicos, Oss, Holanda) foi utilizada para obter amostras do colo uterino. A escova foi imediatamente lavado em um

frasco de soluo PreservCyt (Cytyc, Boxborough, MA, EUA). O frasco foi colocado no processador Prep fina (Cytyc). O slide ThinPrep foi ento fixado em etanol e corados com colorao de Papanicolaou. O nmero de clulas epiteliais sobre estas lminas foi estimado a partir do nmero de clulas contidas dentro de coordenadas computador derivado por 50 campos aleatrios localizados dentro de uma rea circular de dimetro de 20 mm, onde as clulas foram depositadas. Os diagnsticos foram feitos utilizando o Sistema de Bethesda 2001 para citologia cervical.

Ensaio HC 2
O teste de HPV DNA pelo ensaio HC 2 foi realizada com o sistema de ensaio de 2 HC acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). As amostras foram desnaturadas a 65 durante 45 min e hibridados sob condies de alto rigor com uma mistura de sondas de ARN que detecta 13 tipos diferentes de HPV oncognico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 e 68. Os hbridos de ADN-ARN resultantes foram capturados sobre a superfcie dos poos da placa de microtitulao revestidos com um anticorpo anti-hbrido de ADN-ARN. Os hbridos imobilizados foram ento feitos reagir com um anticorpo monoclonal anti-hbrido conjugado com fosfatase alcalina. A intensidade da luz foi medida com um luminmetro. O limiar de positividade recomendada de 1 pg / ml foi utilizado como um ponto de corte, e todas as amostras com uma unidade de controlo / rcio de luz relativa (RLU / CO) 1,0 foram considerados positivos.

HPV 4 teste ACE


A clula residual na soluo PreservCyt foram centrifugadas a 13.000 x g durante 15 min, e as pelotas de clulas foram ressuspensas em 200 ul de soluo salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de clulas ressuspensas foram adicionados a uma coluna de purificao de ADN (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A extraco do ADN total foi realizado de acordo com as instrues do fabricante. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reaco final de 20 ul, contendo 3 ul de DNA isolado a partir de esfregao cervical, 4 mL de 5 x 4 de

HPV ACE mistura iniciador, e 10 mL de 2 Master Mix (Seegene Inc.). As condies de amplificao foram como se segue: desnaturao durante 15 minutos a 94 ; amplificao durante 40 ciclos, com desnaturao durante 30 segundos a 94 , recozimento durante 1 min 30 seg a 60 , e extenso de 1 min 30 seg a 72 . Os produtos de PCR amplificados foram separados em gel de agarose a 2% corado com brometo de etdio ou ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, Reino Unido). Resumidamente, aps PCR, 2 uL do produto de amplificao foi misturado com 6 uL de tampo de carregamento (Lab901) num tubo de PCR de 0,2 mL. Insira o bloco de amostra para o TapeStation (Lab901) e coloque o tubo de 0,2 mL PCR contendo a amostra. Anlise amplicon foi ento realizada no Sistema ScreenTape com a Viso software Seegene.Sistema de eletroforese capilar de Seegene fornecer o software de deteco que leia automaticamente o produto de PCR e analisar a intensidade amplicon enquanto o manual convencional eletroforese capilar necessidade do usurio lido do pico com olhos nus aps a mistura do produto da PCR com SYBR verde ou cito-9 corante.

PCR HPV teste Set Typing


O DNA foi extrado de zaragatoa em esfregaos usando um Micro QIAamp DNA Kit (Qiagen, Inc.) de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de ADN foi medida utilizando um espectrofotmetro (DU 530, Beckman, Fullerton, CA, EUA), e a qualidade de ADN foi confirmada em gel de agarose. Foi utilizado o mtodo de PCR utilizando o Conjunto de dactilografia de HPV. O subtipo de HPV foi determinada utilizando o Typing Set HPV (Takara Bio., Shiga, Japo), um conjunto de primers para PCR projetado especificamente para identificar gentipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em ADN genmico. O iniciador HPVpU-31B foi utilizado para amplificar o DNA de HPV 6 e 11 (LR gentipos de HPV) e HPVpU-1M foi usada para amplificar o ADN do HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 (AR HPV gentipos). O mtodo de dactilografia Conjunto de HPV por PCR foi utilizada de acordo com as instrues do fabricante. Este conjunto inclui modelos de controlo, tanto malignas e benignas para verificao da reaco de PCR utilizando os pares de primers fornecidos no conjunto. A sua expresso foi normalizado, utilizando o

modelo de controlo fornecido como uma referncia endgena. Digesto com enzimas de restrio dos produtos de PCR tambm pode ser confirmado, porque os produtos de PCR reconheceu os stios de Ava II, AfaI, Bgl II, Acc I e Ava I e pequenos tamanhos de fragmentos de DNA so geradas por digesto de enzimas de restrio. Os fragmentos de ADN foram confirmadas em gis de agarose e identificados os gentipos de HPV.

A anlise estatstica
Para comparar a preciso clnica do HC ensaio 2, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste conjunto PCR digitao para detectar leses cervicais de alto grau, tambm foi calculada a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo valor (VAL), a sensibilidade e especificidade dos trs ensaios foram comparados pelo teste da proporo emparelhado. Acordo entre os ensaios de HPV foi avaliada pelo coeficiente kappa de Cohen, com valores de 0,00-,20 indicando baixa concordncia, 0,21-0,40 acordo justo, 0,41-0,60 concordncia moderada, 0,61-0,80 acordo substancial, e 0,81-1,00 concordncia quase perfeita. Anlise de qui-quadrado de McNemar para dados par combinado foi realizada para analisar as tabelas de contingncia comparando testes de HPV. As anlises estatsticas foram realizadas com o SPSS, verso 12.0, software estatstico (Chicago, IL, EUA). Todos os testes foram em frente e verso, e P <0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS
Os resultados citolgicas, bem como todos os trs resultados de teste de ADN de HPV, estavam disponveis para 199 pacientes. Os RH taxas de deteco do HPV em geral foram de 52,3% (104/199) pelo ensaio HC 2, 54,3% (108/199) pela 4 teste ACE HPV, e 48,7% (97/199) pelo HPV teste Set Typing PCR ( Tabela 1 ). As taxas de RH HPV-positivos por parte do 2 ensaio HC, HPV 4 teste ACE, e PCR HPV teste Set Typing foram 31,4%, 37,3% e 33,3%, para o grupo normal, citologia, 65,5%, 61,8% e 58,2% para clulas escamosas atpicas de significado indeterminado (ASCUS), 82,1%, 82,1% e 60,7% para o baixo grau de leso intraepitelial escamosa (LSIL), respectivamente. No grupo citolgico de alto

grau de leso intra-epitelial escamosa (HSIL), o que clinicamente importante para a sua tendncia para progredir para o cancro cervical, todos os trs testes mostraram taxas de positividade idnticas (87,5%), e uma taxa de deteco de HPV HR de 100% foi observada o grupo de cncer cervical por todos os trs testes. A 4 teste ACE HPV no mostraram diferena significativa em RH HPV positividade no grupo de citologia normal a partir do ensaio HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR ( P = 0,143 e P = 0,585, respectivamente). No entanto, houve 17 amostras discordantes entre o ensaio de HC e 2 a 4 de HPV em amostras de ensaio de ACE normais Papanicolau; 5 amostras eram amostras de HC 2positivos e HPV 4 ACE-negativo, e 12 eram HC 2-negativo e HPV 4 ECA positivo. De 12 amostras, quatro includo RH gentipos de HPV (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, e 52), que foram identificadas pelo teste de HPV Set Typing PCR. Em contraste, no houve RH gentipos identificados nas cinco amostras anteriores. Em citolgico ASCUS, a taxa de deteco do teste do HPV 4 ACE para HR HPV tambm no foi significativamente diferente do ensaio HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR, mas o ensaio de HC 2 mostrou uma taxa significativamente mais elevada para a deteco de HPV de AR do que a PCR HPV Typing Test Set ( P = 0,02). Com o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV, uma porcentagem significativamente maior de amostras de Papanicolau LSIL testou positivo para HPV HR do que com o HPV Typing Test Set PCR (82,1% vs 60,7%, P = 0,03). Em mulheres com HSIL citolgica, a 4 de teste de HPV ACE apresentaram uma taxa de deteco de 87,5% para o HPV de AR, o que era o mesmo nvel que, tanto no ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR.

Tabela 1 Teste de DNA HPV resultados de acordo com diagnstico citolgico

A concordncia para RH deteco do HPV entre o ensaio de HC 2 e os 4 teste ACE HPV foi de 85,4%, mostrando concordncia substancial (coeficiente kappa = 0,71; Tabela 2 ). Em contraste, a concordncia entre o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR foi de 72,4%, mostrando concordncia moderada (coeficiente kappa = 0,45). Para a deteco de HPV 16 e HPV 18, o 4 teste ACE HPV eo HPV teste Set Typing PCR mostrou concordncia significativa (89,9%, coeficiente kappa = 0,65). No entanto, 20 casos (10,1%) apresentaram resultados discordantes, especificamente, oito casos foram positivos pelo 4 teste ACE HPV, mas a negativa por parte do HPV teste Set Typing PCR, enquanto que 12 amostras foram PCR HPV Typing Set teste positivo, mas HPV 4 ACEnegativo ( Tabela 3 ).

Tabela 2 Concordncia entre HC 2 ensaio, HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste conjunto de digitao

Tabela 3 Viso geral de amostras discordantes entre HPV 4 ACE teste e PCR HPV teste Set Typing

A Tabela 4 mostra o HR HPV deteco relacionado com resultados citolgicos. A prevalncia global de RH HPV aumentaram em paralelo com o aumento da gravidade do resultado do exame de Papanicolaou. Quando um teste de Papanicolau anormal foi definido como ASCUS ou superior, a sensibilidade e especificidade do teste 4 ACE HPV no foram inferiores aos de

ensaio 2 HC (72,2% vs 74,2% [ P = 0,40], e 61,8% vs 68,6% [ P = 0,27], respectivamente, Tabela 4 ). Alm disso, a sensibilidade e a especificidade do teste 4 ACE HPV tambm foram comparveis ao ensaio de HPV Conjunto de tipagem PCR ( P = 0,27 e 0,36, respectivamente).

Tabela 4 Viso geral da acurcia diagnstica de cada teste de DNA do HPV

Quando o teste de Papanicolau anormal foi definido como LSIL ou superior, todos os trs testes de ADN de HPV realizados de modo semelhante para a deteco de ADN de HPV RH (dados no mostrados). Alm disso, com respeito ao citolgico HSIL ou cancro cervical, todos os trs testes tinha o mesmo nvel de sensibilidade (92,9%) e um nvel de especificidade semelhante ( Tabela 4 ).

DISCUSSO
O objetivo deste estudo foi analisar o desempenho da novela HPV 4 teste ACE para a deteco de HPV HR e HPV 16 e 18 gentipos, em comparao com o ensaio de HC 2 eo HPV teste Set Typing PCR. Desde a aprovao pela FDA dos EUA, o ensaio HC 2 foi usado como padro para a avaliao da eficcia dos novos mtodos de deteco de HPV diferentes de ADN ( 21 - 24 ). Alm disso, o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR tem sido amplamente utilizado para a deteco de HPV em diversos estudos ( 17- 20 ). Tendo em conta que o teste 4 ACE HPV s recentemente se tornou disponvel comercialmente, no existe nenhum estudo para comparar este com outros mtodos de ensaio de deteco de HPV. O teste 4 ACE HPV podem identificar o HPV 16 e HPV 18 gentipos de HPV entre 13 de alto risco e pode detectar a presena de outros 11 HPVs de alto risco. Por este aspecto, o romance HPV 4 teste ACE pode ser chamado como uma verso atualizada do ensaio HC 2. Por

causa da enorme importncia do HPV 16 e 18 gentipos na progresso para leses cervicais de alto grau, a genotipagem do HPV 16 e 18 com deteco simultnea de 11 outros HPVs de alto risco parece ser muito eficaz, em comparao com outros PCR mtodos de genotipagem baseadas ou chip de DNA HPV. 4 O teste de HPV ECA utiliza um sistema dual oligonucletido escorva (DPO), estruturalmente e funcionalmente diferente do sistema iniciador actualmente em uso generalizado. O sistema de condicionamento convencional baseia-se um evento de iniciao nico entre o iniciador e molde, o que muitas vezes conduz extenso de produtos no especficos. Em contraste, o sistema possui dois segmentos RPD iniciadores separados (um segmento de 18 5'-25nt de comprimento e um segmento 3 '-6-12nt de comprimento). Esta distribuio desigual de nucletidos conduz a diferentes preferncias de recozimento para cada segmento. 5'-O segmento mais preferencialmente se liga ao ADN e inicia recozimento estvel, ao passo que o segmento curto 3 'se liga selectivamente ao seu local alvo e bloqueia o recozimento no especfica ( 25 ). No presente estudo, o teste 4 ACE HPV mostraram os mesmos nveis comparveis ou da taxa de deteco de HPV RH, em comparao com o ensaio de HC 2 e o teste de HPV Conjunto de tipagem PCR. Alm disso, o teste de 4 ACE HPV revelou substancial acordo com o ensaio de HC 2 para a deteco de HPV 13 de RH. Em contraste, o teste do HPV Conjunto tipagem PCR mostrou um nvel de concordncia inferior de 4 de teste de HPV com o ACE 2 ensaio de HC, o que pode ser parcialmente atribudo a diferenas no nmero de tipos de HPV de RH que pode ser detectado por ambos os testes. O HPV teste Set Typing PCR pode detectar apenas 7 HPVs de RH, enquanto que 13 tipos podem ser detectados pelo ensaio HC 2. Alm disso, em termos de genotipagem do HPV, particularmente os HPV 16 e HPV 18 gentipos, o 4 teste ACE HPV tambm mostraram concordncia substancial com o HPV teste Set Typing PCR.Tal como mostrado na Tabela 3 , 20 amostras foram discordantes entre o teste 4 ACE HPV e do teste do HPV Conjunto de tipagem PCR. Embora o 4 teste ACE HPV no conseguiram detectar o HPV 16 ou HPV 18 em 12 de 20 amostras, havia apenas duas amostras negativas para qualquer HPV HR. Alm disso, estes dois

processos foram mostrados para ser um normal e um ASCUS na citologia, no leses intraepiteliais escamosas. Um estudo recente relatado por Sandri et al. ( 21 ) em relao ao teste do HPV com o ensaio Amplicor HC 2 para a deteco de HPV 13 de RH. O teste de HPV AMPLCOR semelhante ao teste de HPV 4 ACE em termos de mtodos de deteco de HPV com base na PCR. Em seu estudo, o HR HPV taxa do teste de HPV AMPLICOR deteco de DNA foi maior do que o 2 ensaio HC em amostras normais de Papanicolaou, enquanto os dois testes realizados de forma semelhante nos resultados de Papanicolau anormais. Por outro lado, nosso estudo no mostrou diferena significativa entre os dois testes para HR HPV DNA positividade, independentemente dos resultados citolgicos. Outro estudo realizado por Stevens et ai. ( 22 ) foi avaliado o desempenho do ensaio HC 2 e o teste de HPV AMPLICOR acordo com os resultados citolgicos. Em citolgico HSIL ou superior, a sensibilidade do ensaio de HC 2 eo teste de HPV AMPLICOR eram 87,4% e 95,2%, respectivamente, o que foi semelhante aos nossos resultados.Quando comparado com um outro mtodo de deteco de ADN de HPV baseada em PCR, j em utilizao, tal como o ensaio Amplicor, o novo teste de HPV 4 ACE apresentaram sensibilidade comparvel para a deteco de HPV de AR. Com relao ao teste de HPV Set Typing PCR, Fujinaga et al. ( 18 ) avaliaram o desempenho deste teste em 39 amostras de tecido de carcinoma cervical. De acordo com seu relatrio, a prevalncia global de RH HPV foi de 84,6%, dos quais havia 19 amostras HPV 16 positivas e cinco HPV 18 amostras positivas. Em nosso estudo, embora avaliada em amostras de citologia, a taxa de deteco de HPV HR foi de 100% em seis tipos de cncer do colo do tero. Entre as seis amostras, 4-positivo de HPV 16 e HPV 18 1 amostras positivas foram identificadas. Nosso estudo teve algumas limitaes. Primeiro, o nmero de amostras de LSIL citolgica ou superior no foram suficientes para concluir os nossos resultados. Em segundo lugar, no podemos avaliar o desempenho dos testes de DNA do HPV, utilizando amostras de tecido, devido perda de follow-up. Por

esse motivo, avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos trs testes de HPV utilizando amostras de citologia em trs condies diferentes, que a "doena" foi definido como: 1) ASC-US ou pior, 2) LSIL ou pior, e 3) HSIL ou pior. No entanto, nosso estudo mostrou que o romance HPV 4 teste ACE podem substituir os vrios testes de DNA do HPV j em uso, particularmente o ensaio de HC 2. O teste 4 ACE HPV basicamente o mesmo teste como HC2 ensaio em termos de deteco de 13 tipos de HPV de alto risco. Mas a diferena entre os dois testes que o HPV 4 teste ACE pode dar a informao sobre a presena de HPV 16 e 18 gentipos, que representam cerca de 70% de cncer de colo de tero. Portanto, no podemos apenas detectar outros 11 HPVs de alto risco, mas tambm o gentipo de HPV 16 e 18, simultaneamente, atravs da realizao do teste 4 ACE HPV. Esta diferena muito importante na medida em que o conhecimento sobre a presena de HPV 16 e 18 seria til para a triagem dos pacientes que so necessrios para obter o acompanhamento freqente ou no. Alm disso, na poca da vacinao contra o HPV, informaes sobre os gentipos HPV cancergenas especficas identificadas por testes de DNA do HPV, como o 2 ensaio HC em mulheres positivas para HPV HR, seria til para mulheres exigentes com doenas clinicamente relevantes que so mais propensos a o progresso de pessoas com doenas que regridem espontaneamente. Alm disso, a infeco persistente com RH gentipos de HPV, tais como o HPV 16 e HPV 18, conhecida como uma condio necessria para o desenvolvimento de neoplasia cervical intra-epitelial de alto grau e de doena invasiva ( 26 ). Portanto, seletiva HPV genotipagem para RH gentipos de HPV seria crucial para diferenciar mulheres que esto em alto risco de progresso daqueles que so susceptveis de regredir. Assim, o teste de 4 ACE HPV tem a capacidade de detectar a presena de tipos de HPV 13 HR e tambm para identificar o HPV 16 e HPV 18 gentipos simultaneamente em alto grau de concordncia com o ensaio HC 2. Para tornar esta ferramenta de diagnstico novela mais credvel, necessrio mais estudos com amostras maiores e comparao com outros mtodos de genotipagem de DNA de HPV.

Informaes Artigo
J Med Sci-coreano. agosto 2009, 24 (4) : 579-584. Publicado on-line 2009 29 de julho. doi: 10.3346/jkms.2009.24.4.579 PMCID: PMC2719217 Hong Jin Hwa , um Seung Hun Cano , uma Jong Kee Kim , 2 Hyun Jeong Han , 2 e Jae Lee Kwan Departamento de Obstetrcia e Ginecologia do Hospital Guro, Faculdade de Medicina da Universidade da Coreia, Seul, Coria.
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Seegene Instituto de Cincias da Vida, Seul, Coria. Autor para correspondncia.

Endereo para correspondncia: Jae Lee Kwan, MD Departamento de Obstetrcia e Ginecologia do Hospital Guro, Faculdade de Medicina da Universidade da Coreia, 80 Guro-dong, Guro-gu, Seoul 152-703, Coria. Tel: +82.2-2626-3142, Fax: +82.2-838-1560,Email: jklee38/at/korea.ac.kr Recebida em 24 de dezembro de 2008; Aceito 14 de maro de 2009. Direitos de autor 2009 A Academia de Cincias Mdicas da Coreia Este um artigo de acesso aberto distribudo sob os termos da Licena Creative Commons Attribution Non-Commercial ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0 ), que permite uso irrestrito no-comercial, distribuio e reproduo em qualquer meio, desde que a obra original devidamente citado. Este artigo foi citado por outros artigos em PMC. Artigos da Revista de Cincias Mdicas coreano so fornecidas aqui cortesia da Academia Coreana de Cincias Mdicas

References
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Comparison of the Novel Human Papillomavirus 4 Autocapillary Electrophoresis Test with the Hybrid Capture 2 Assay and with the PCR HPV Typing Set Test in the Detection of High-Risk HPV Including HPV 16 and 18 Genotypes in Cervical Specimens
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], and Jae Kwan Lee
Additional article information

Abstract
The aim of this study was to compare the novel human papillomavirus (HPV) detection method, the HPV 4 Auto-capillary Electrophoresis (ACE) test with the hybrid capture (HC) 2 assay for the detection of high-risk HPVs. In addition, we compared the HPV 4 ACE test with the polymerase chain reaction HPV Typing Set test for the detection of HPV 16 and HPV 18 genotypes. One hundred ninetynine cervical swab samples obtained from women with previous abnormal Pap smears were subjected to testing with the three HPV tests. The HPV 4 ACE test and the HC 2 assay showed substantial agreement for detection of high-risk HPVs (85.4%, kappa=0.71). The HPV 4 ACE test also showed substantial agreement with the PCR HPV Typing Set test in the detection of HPV 16 and HP V 18 genotypes (89.9%, kappa=0.65). In correlation with cytologic results, the sensitivities and specificities of the HPV 4 ACE test and HC 2 assay were 92.9%

vs. 92.9% and 48.1% vs. 50.8%, respectively, when high-grade squamous intraepithelial lesions were regarded as abnormal cytologies. The novel HPV 4 ACE test is a valuable tool for the detection of high-risk HPVs and for genotyping of HPV 16 and HPV 18.
Keywords: HPV Typing Methods, ACE, HC2, HPV Typing Set Test

INTRODUCTION
Cervical cancer represents the second most common gynecologic malignancy worldwide. Various molecular and epidemiologic studies have established a strong association between high-risk (HR) human papillomavirus (HPV) genotypes and the development of cervical cancer and its precursor lesions, cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 or 3 (1-5). The majority of cases of cervical cancer is caused by infection with at least 1 of the 13 accepted HR carcinogenic HPV types (i.e., types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, and 68) (1, 3, 5). Among the carcinogenic HPV types, HPV 16 and HPV 18 account for approximately 70% of all cervical cancers (6). Consequently, it has been proposed that highly sensitive HPV detection methods, such as the HPV DNA test, could enhance the efficacy of population-based screening programs, either as a sole screening tool or as an adjunct to current cervical cytologic screening. Recently, the detection of HPV infection depends almost entirely on molecular methodologies, of which the Hybrid Capture (HC) 2 assay (Qiagen, Gaithersburg, MD, U.S.A.) is the only commercial HPV DNA test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) (7, 8). The HC 2 assay has also been approved in the U.S. as an adjunct to the Papanicolaou test for cervical cancer screening for women aged over 30. While the HC 2 assay can detect 13 HR HPV genotypes, it neither allows the identification of specific genotypes nor provides any information about multiple HPV infections. Recent studies have provided evidence for a difference in oncogenic potential among the HR HPV genotypes, highlighting the importance of HPV genotyping, particularly HPV 16 and HPV 18 (9). There are numerous polymerase chain

reaction (PCR)-based HPV genotyping methods in widespread use. The commercially available PCR-based HPV genotyping methods have included the primer sets, GP5+/GP6+ (10, 11) and MY09/11, and their subsequently modified derivatives PGMY09/11 (12, 13) and the SPF10 system (14-16). Recently, a novel PCR-based HPV detection and genotyping method has been developed, the HPV 4 Auto-capillary eElectrophoresis (ACE) test (Seegene Inc., Seoul, Korea). In contrast to other commercially available PCR methods, the HPV 4 ACE test uses a newly-developed dual priming oligonucleotide (DPO) system in order to minimize the risk of non-specific priming. This test has the ability to identify HPV 16 and 18 genotypes and can detect 11 other HR HPVs. In contrast, the PCR HPV Typing Set test (Takara Bio., Shiga, Japan), which is commercially available, uses two primer sets which can detect 7 HR (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) and 2 LR HPV genotypes (HPV-6 and 11) (17-20). The purpose of this study was to evaluate the efficacy of the HPV 4 ACE test, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test for the detection of HR HPV DNA in cervical swab samples. In addition, we compared the HPV 4 ACE test with the PCR HPV Typing Set test for the detection of HPV 16 and HPV 18. Finally, we evaluated the sensitivity and specificity of these HPV DNA tests in correlation with cytologic results.

MATERIALS AND METHODS


Study population and specimen collection
One hundred ninety-nine women who were referred to the Colposcopy Clinic in Guro Hospital of Korea University for abnormal cytology between April and June 2008 were prospectively enrolled. A cervical specimen for liquid-based cytology, along with simultaneous HPV DNA detection by the HC 2 assay, was collected from each woman. Genomic DNA was extracted from each sample and the HPV DNA tests were performed by both the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test on the same specimen. The study protocol was approved by the Institutional Review Board for Research on Human Subjects at the Korea

University Guro Hospital, and written informed consent was obtained from the patients.

Liquid-based cytology
A Cervex-Brush (Rovers Medical Devices, Oss, The Netherlands) was used to obtain samples from the uterine cervix. The brush was immediately rinsed in a vial of PreservCyt solution (Cytyc, Boxborough, MA, U.S.A.). The vial was placed in the Thin Prep Processor (Cytyc). The ThinPrep slide was then fixed in ethanol and stained with Papanicolaou's stain. The number of epithelial cells on these slides was estimated from the number of cells contained within computerderived coordinates for 50 random fields located within a 20-mm diameter circular area where the cells were deposited. The diagnoses were made using the 2001 Bethesda System for cervical cytology.

HC 2 assay
HPV DNA testing by the HC 2 assay was performed with the HC 2 assay system according to the manufacturer's protocol (Qiagen). The specimens were denatured at 65 for 45 min and hybridized under high-stringency conditions with a mixture of RNA probes that detects 13 different oncogenic HPV types: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, and 68. The resultant DNA-RNA hybrids were captured on the surface of the microtiter plate wells coated with an antiDNA-RNA hybrid antibody. The immobilized hybrids were then reacted with an alkaline phosphatase-conjugated anti-hybrid monoclonal antibody. Light intensity was measured with a luminometer. The recommended positivity threshold of 1 pg/mL was used as a cutoff, and all specimens with a relative light unit/control (RLU/CO) ratio of 1.0 were considered positive.

HPV 4 ACE test


The residual cell in the PreservCyt solution were centrifuged at 13,000g for 15 min, and the cell pellets were resuspended in 200 L of phosphate-buffered saline. The resuspended cell pellets were added to a DNA purification column

(Qiagen, Inc., Valencia, CA, U.S.A.). The extraction of total DNA was performed according to the manufacturer's instructions. Briefly, PCR was conducted in a final reaction volume of 20 L containing 3 L of isolated DNA from cervical swab, 4 L of 5HPV 4 ACE primer mixture, and 10 L of 2Master Mix (Seegene Inc.). The cycling conditions were as follows: denaturation for 15 min at 94; amplification for 40 cycles, with denaturation for 30 sec at 94; annealing for 1 min 30 sec at 60; and extension for 1 min 30 sec at 72. The amplified PCR products were separated in 2% agarose gel stained with ethidium bromide or ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, U.K.). Briefly, following PCR, 2 L of the amplification product was mixed with 6 L loading buffer (Lab901) in a 0.2 mL PCR Tube. Insert the sample block into the TapeStation (Lab901) and place the 0.2 mL PCR tube containing the sample. Amplicon analysis was then performed on the ScreenTape System with the Seegene View software. Seegene's capillary electrophoresis system provide the detection software which automatically read the PCR product and analyze the amplicon intensity while conventional capillary electrophoresis need user's manual read of the peak with naked eyes after mixing the PCR product with SYBR green or Cyto-9 dye.

PCR HPV Typing Set test


The DNA of swab was extracted from swabs using a QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Inc.) according to the manufacturer's instructions. The concentration of DNA was measured using a spectrophotometer (DU530; Beckman, Fullerton, CA, U.S.A.), and the DNA quality was confirmed on agarose gels. The PCR method using the HPV Typing Set was used. The HPV subtype was determined using the HPV Typing Set (Takara Bio., Shiga, Japan), a primer set for PCR specifically designed to identify HPV genotypes 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58 in genomic DNA. The primer HPVpU-31B was used to amplify the DNA of HPV 6 and 11 (LR HPV genotypes) and HPVpU-1M was used to amplify the DNA of HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58 (HR HPV genotypes). The PCR HPV Typing Set method was used according to the manufacturer's instructions. This set includes both malignant and benign control templates for verification of

the PCR reaction by using the primer pairs provided in the set. Their expression was normalized using the supplied control template as an endogenous reference. Restriction enzyme digestion of PCR products can also be confirmed because PCR products recognized the sites of Ava II, Afa I, Bgl II, Acc I, and Ava I and small sizes of DNA fragments are yielded by digestion of restriction enzymes. The DNA fragments were confirmed on agarose gels and identified the HPV genotypes.

Statistical analysis
To compare the clinical accuracy of the HC 2 assay, the HPV 4 ACE test, and the PCR HPV typing set test to detect high-grade cervical lesions, we also calculated the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV); the sensitivity and specificity of the three tests were compared by the paired proportion test. Agreement between the HPV assays was assessed by Cohen's kappa statistic, with values of 0.00-0.20 indicating poor agreement, 0.21-0.40 fair agreement, 0.41-0.60 moderate agreement, 0.61-0.80 substantial agreement, and 0.81-1.00 almost perfect agreement. McNemar's chi-square analysis for matched pair data was performed to analyze contingency tables comparing HPV tests. Statistical analyses were performed with SPSS, version 12.0, statistical software (Chicago, IL, U.S.A.). All tests were two-sided, and a P value <0.05 was considered significant.

RESULTS
The cytologic findings, as well as all three HPV DNA test results, were available for 199 patients. The overall HR HPV detection rates were 52.3% (104/199) by the HC 2 assay, 54.3% (108/199) by the HPV 4 ACE test, and 48.7% (97/199) by the PCR HPV Typing Set test (Table 1). The HR HPV-positive rates by the HC 2 assay, HPV 4 ACE test, and PCR HPV Typing Set test were 31.4%, 37.3%, and 33.3%, for the normal cytology group, 65.5%, 61.8%, and 58.2% for atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), 82.1%, 82.1%, and 60.7% for low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL), respectively. In the

cytologic high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) group, which is clinically important for its tendency to progress to cervical cancer, all 3 tests showed identical positivity rates (87.5%), and a 100% HR HPV detection rate was observed in the cervical cancer group by all 3 tests. The HPV 4 ACE test did not show any significant difference in HR HPV positivity in the normal cytology group from the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test (P=0.143 and P=0.585, respectively). However, there were 17 discordant samples between the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test in normal Pap smear samples; 5 samples were HC 2-positive and HPV 4 ACE-negative, and 12 samples were HC 2-negative and HPV 4 ACE-positive. Of 12 samples, 4 included HR HPV genotypes (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, and 52), which were identified by the PCR HPV Typing Set test. In contrast, there were no HR genotypes identified in the former 5 samples. In cytologic ASCUS, the detection rate of the HPV 4 ACE test for HR HPV was also not significantly different from the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test, but the HC 2 assay showed a significantly higher detection rate for HR HPV than PCR HPV Typing Set test (P=0.02). With the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test, a significantly higher percentage of LSIL Pap smear samples tested positive for HR HPV than with the PCR HPV Typing Set test (82.1% vs. 60.7%, P=0.03). In women with cytologic HSIL, the HPV 4 ACE test showed a detection rate of 87.5% for HR HPV, which was the same level as that of both the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test.

Table 1 HPV DNA test results according to cytological diagnosis

The concordance for HR HPV detection between the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test was 85.4%, showing substantial agreement (kappa coefficient=0.71; Table 2). In contrast, the concordance between the HC 2 assay

and the PCR HPV Typing Set test was 72.4%, showing moderate agreement (kappa coefficient=0.45). For the detection of HPV 16 and HPV 18, the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test showed substantial agreement (89.9%, kappa coefficient=0.65). However, 20 cases (10.1%) gave discordant results; specifically, 8 cases were positive by the HPV 4 ACE test, but negative by the PCR HPV Typing Set test, whereas 12 samples were PCR HPV Typing Set test-positive, but HPV 4 ACE-negative (Table 3).

Table 2 Concordance among HC 2 assay, HPV 4 ACE test and PCR HPV typing set test

Table 3 Overview of discordant samples between HPV 4 ACE test and PCR HPV Typing Set test

Table 4 shows the HR HPV detection related to cytologic results. The overall HR HPV prevalence increased in parallel with the increasing severity of the Pap smear result. When an abnormal Pap test was defined as ASCUS or higher, the sensitivity and specificity of the HPV 4 ACE test were not inferior to the HC 2 assay (72.2% vs. 74.2% [P=0.40], and 61.8% vs. 68.6% [P=0.27], respectively; Table 4). In addition, the sensitivity and the specificity of the HPV 4 ACE test were also comparable to the PCR HPV Typing Set test (P=0.27 and 0.36, respectively).

Table 4 Overview of diagnostic accuracy of each HPV DNA tests

When the abnormal Pap test was defined as LSIL or higher, all three HPV DNA tests performed similarly for the detection of HR HPV DNA (data not shown). Furthermore, with respect to cytologic HSIL or cervical cancer, all 3 tests had the same level of sensitivity (92.9%) and a similar level of specificity (Table 4).

DISCUSSION
The purpose of this study was to examine the performance of the novel HPV 4 ACE test for the detection of HR HPV and HPV 16 and 18 genotypes, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test. Since the approval by the U.S. FDA, the HC 2 assay has been used as a gold standard when evaluating the efficacy of the various novel HPV DNA detection methods (21-24). In addition, the PCR HPV Typing Set test has been widely used for the detection of HPV in a number of studies (17-20). Given that the HPV 4 ACE test has only recently become commercially available, there is no study to compare this test with other HPV detection methods. The HPV 4 ACE test can identify HPV 16 and HPV 18 genotypes among 13 high-risk HPVs and can detect the presence of other 11 high-risk HPVs. For this aspect, the novel HPV 4 ACE test can be called as an upgraded version of the HC 2 assay. Because of the overwhelming importance of the HPV 16 and 18 genotypes in the progression to high-grade cervical lesions, genotyping of the HPV 16 and 18 with simultaneous detection of 11 other high-risk HPVs seem to be very efficacious, as compared to other PCR-based genotyping methods or HPV DNA chip. The HPV 4 ACE test uses a dual priming oligonucleotide (DPO) system that is structurally and functionally different from the primer system currently

in widespread use. The conventional priming system is based on a single priming event between the primer and template, which often leads to extension of non-specific products. In contrast, the DPO system has two separate primer segments (a 5'-segment 18-25nt in length and a 3'-segment 6-12nt in length). This unequal distribution of nucleotides leads to different annealing preferences for each segment. The longer 5'-segment preferentially binds to the template DNA and initiates stable annealing, whereas the short 3'-segment selectively binds to its target site and blocks non-specific annealing (25). In the present study, the HPV 4 ACE test showed the same or comparable levels of the HR HPV detection rate, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test. In addition, the HPV 4 ACE test revealed substantial agreement with the HC 2 assay for the detection of 13 HR HPVs. In contrast, the PCR HPV Typing Set test showed a lower concordance level than the HPV 4 ACE test with the HC 2 assay, which might be partially attributed to the differences in the number of HR HPVs that could be detected by both tests. The PCR HPV Typing Set test can only detect 7 HR HPVs, whereas 13 types can be detected by the HC 2 assay. Furthermore, in terms of HPV genotyping, particularly the HPV 16 and HPV 18 genotypes, the HPV 4 ACE test also showed substantial agreement with the PCR HPV Typing Set test. As shown in Table 3, 20 samples were discordant between the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test. Although the HPV 4 ACE test failed to detect HPV 16 or HPV 18 in 12 of 20 samples, there were only 2 samples negative for any HR HPV. Furthermore, these two cases were shown to be 1 normal and 1 ASCUS in cytology, not squamous intraepithelial lesions. A recent study reported by Sandri et al. (21) compared the AMPLICOR HPV test with the HC 2 assay for the detection of 13 HR HPVs. The AMPLCOR HPV test is similar to the HPV 4 ACE test in terms of PCR-based HPV detection methods. In their study, the HR HPV DNA detection rate of the AMPLICOR HPV test was higher than the HC 2 assay in normal Pap smear samples, whereas the two tests performed similarly on abnormal Pap smear results. In contrast, our study showed no significant difference between the two tests for HR HPV DNA positivity, regardless of cytologic results.

Another study performed by Stevens et al. (22) evaluated the performance of the HC 2 assay and the AMPLICOR HPV test according to cytologic results. In cytologic HSIL or higher, the sensitivity of the HC 2 assay and the AMPLICOR HPV test were 87.4% and 95.2%, respectively, which was similar to our results. When compared to another PCR-based HPV DNA detection method already in use, such as the AMPLICOR test, the novel HPV 4 ACE test showed comparable sensitivity for the detection of HR HPV. With respect to the PCR HPV Typing Set test, Fujinaga et al. (18) evaluated the performance of this test in 39 cervical carcinoma tissue specimens. According to their report, the overall prevalence of HR HPV was 84.6%, of which there were 19 HPV 16-positive specimens and 5 HPV 18-positive specimens. In our study, although evaluated in cytology samples, the HR HPV detection rate was 100% in 6 cervical cancers. Among 6 samples, 4 HPV 16-positive and 1 HPV 18-positive samples were identified. Our study had some limitations. First, the number of samples with cytologic LSIL or higher were not sufficient to conclude our results. Second, we could not evaluate the performance of HPV DNA tests using tissue samples due to loss of follow-up. For that reason, we evaluated the sensitivity and specificity of the three HPV tests using cytology specimens in three different conditions, that is the "disease" was defined as; 1) ASC-US or worse, 2) LSIL or worse, and 3) HSIL or worse. Nevertheless, our study showed that the novel HPV 4 ACE test can substitute for the various HPV DNA tests already in use, particularly the HC 2 assay. The HPV 4 ACE test is basically the same test as HC2 assay in terms of detecting 13 highrisk HPVs. But the difference between the two tests is that HPV 4 ACE test can give the information about the presence of HPV 16 and 18 genotypes, which account for about 70% of cervical cancer. So we can not only detect other 11 high-risk HPVs but also genotype the HPV 16 and 18 simultaneously by performing the HPV 4 ACE test. This is very important difference in that knowledge about the presence of HPV 16 and 18 would be helpful to triage the patients who are needed to get frequent follow-up or not. Furthermore, in the

era of HPV vaccination, information regarding specific carcinogenic HPV genotypes identified by HPV DNA tests, such as the HC 2 assay in women positive for HR HPV, would be helpful for discriminating women with clinicallyrelevant diseases that are most likely to progress from those with diseases that regress spontaneously. In addition, persistent infection with HR HPV genotypes, such as HPV 16 and HPV 18, is known to be a necessary condition for the development of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and invasive disease (26). Therefore, selective HPV genotyping for HR HPV genotypes would be crucial for distinguishing women who are at high risk for progression from those who are likely to regress. Thus, the HPV 4 ACE test has the ability to detect the presence of 13 HR HPVs and also to identify HPV 16 and HPV 18 genotypes simultaneously in high concordance with the HC 2 assay. To make this novel diagnostic tool more credible, further studies with larger samples and comparison with other various HPV DNA genotyping methods is needed.

Article information
J Korean Med Sci. 2009 August; 24(4): 579584. Published online 2009 July 29. doi: 10.3346/jkms.2009.24.4.579 PMCID: PMC2719217 Jin Hwa Hong,1 Seung Hun Song,1 Jong Kee Kim,2 Jeong Hyun Han,2 and Jae Kwan Lee
1 1

Department of Obstetrics and Gynecology, Guro Hospital, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea.
2

Seegene Institute of Life Science, Seoul, Korea. Corresponding author.

Address for correspondence: Jae Kwan Lee, M.D. Department of Obstetrics and Gynecology, Guro Hospital, College of Medicine, Korea University, 80 Guro-dong, Guro-gu, Seoul 152-703, Korea. Tel: +82.2-2626-3142, Fax: +82.2-838-1560, Email: jklee38/at/korea.ac.kr Received December 24, 2008; Accepted March 14, 2009. Copyright 2009 The Korean Academy of Medical Sciences This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution NonCommercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-

commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. This article has been cited by other articles in PMC. Articles from Journal of Korean Medical Science are provided here courtesy of Korean Academy of Medical Sciences

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Comparison of the Novel Human Papillomavirus 4 Autocapillary Electrophoresis Test with the Hybrid Capture 2 Assay and with the PCR HPV Typing Set Test in the Detection of High-Risk HPV Including HPV 16 and 18 Genotypes in Cervical Specimens
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], and Jae Kwan Lee
Additional article information

Abstract
The aim of this study was to compare the novel human papillomavirus (HPV) detection method, the HPV 4 Auto-capillary Electrophoresis (ACE) test with the hybrid capture (HC) 2 assay for the detection of high-risk HPVs. In addition, we compared the HPV 4 ACE test with the polymerase chain reaction HPV Typing Set test for the detection of HPV 16 and HPV 18 genotypes. One hundred ninetynine cervical swab samples obtained from women with previous abnormal Pap smears were subjected to testing with the three HPV tests. The HPV 4 ACE test and the HC 2 assay showed substantial agreement for detection of high-risk HPVs (85.4%, kappa=0.71). The HPV 4 ACE test also showed substantial

agreement with the PCR HPV Typing Set test in the detection of HPV 16 and HP V 18 genotypes (89.9%, kappa=0.65). In correlation with cytologic results, the sensitivities and specificities of the HPV 4 ACE test and HC 2 assay were 92.9% vs. 92.9% and 48.1% vs. 50.8%, respectively, when high-grade squamous intraepithelial lesions were regarded as abnormal cytologies. The novel HPV 4 ACE test is a valuable tool for the detection of high-risk HPVs and for genotyping of HPV 16 and HPV 18.
Keywords: HPV Typing Methods, ACE, HC2, HPV Typing Set Test

INTRODUCTION
Cervical cancer represents the second most common gynecologic malignancy worldwide. Various molecular and epidemiologic studies have established a strong association between high-risk (HR) human papillomavirus (HPV) genotypes and the development of cervical cancer and its precursor lesions, cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 or 3 (1-5). The majority of cases of cervical cancer is caused by infection with at least 1 of the 13 accepted HR carcinogenic HPV types (i.e., types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, and 68) (1, 3, 5). Among the carcinogenic HPV types, HPV 16 and HPV 18 account for approximately 70% of all cervical cancers (6). Consequently, it has been proposed that highly sensitive HPV detection methods, such as the HPV DNA test, could enhance the efficacy of population-based screening programs, either as a sole screening tool or as an adjunct to current cervical cytologic screening. Recently, the detection of HPV infection depends almost entirely on molecular methodologies, of which the Hybrid Capture (HC) 2 assay (Qiagen, Gaithersburg, MD, U.S.A.) is the only commercial HPV DNA test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) (7, 8). The HC 2 assay has also been approved in the U.S. as an adjunct to the Papanicolaou test for cervical cancer screening for women aged over 30. While the HC 2 assay can detect 13 HR HPV genotypes, it neither allows the identification of specific genotypes nor provides any information about multiple HPV infections.

Recent studies have provided evidence for a difference in oncogenic potential among the HR HPV genotypes, highlighting the importance of HPV genotyping, particularly HPV 16 and HPV 18 (9). There are numerous polymerase chain reaction (PCR)-based HPV genotyping methods in widespread use. The commercially available PCR-based HPV genotyping methods have included the primer sets, GP5+/GP6+ (10, 11) and MY09/11, and their subsequently modified derivatives PGMY09/11 (12, 13) and the SPF10 system (14-16). Recently, a novel PCR-based HPV detection and genotyping method has been developed, the HPV 4 Auto-capillary eElectrophoresis (ACE) test (Seegene Inc., Seoul, Korea). In contrast to other commercially available PCR methods, the HPV 4 ACE test uses a newly-developed dual priming oligonucleotide (DPO) system in order to minimize the risk of non-specific priming. This test has the ability to identify HPV 16 and 18 genotypes and can detect 11 other HR HPVs. In contrast, the PCR HPV Typing Set test (Takara Bio., Shiga, Japan), which is commercially available, uses two primer sets which can detect 7 HR (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) and 2 LR HPV genotypes (HPV-6 and 11) (17-20). The purpose of this study was to evaluate the efficacy of the HPV 4 ACE test, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test for the detection of HR HPV DNA in cervical swab samples. In addition, we compared the HPV 4 ACE test with the PCR HPV Typing Set test for the detection of HPV 16 and HPV 18. Finally, we evaluated the sensitivity and specificity of these HPV DNA tests in correlation with cytologic results.

MATERIALS AND METHODS


Study population and specimen collection
One hundred ninety-nine women who were referred to the Colposcopy Clinic in Guro Hospital of Korea University for abnormal cytology between April and June 2008 were prospectively enrolled. A cervical specimen for liquid-based cytology, along with simultaneous HPV DNA detection by the HC 2 assay, was collected from each woman. Genomic DNA was extracted from each sample and

the HPV DNA tests were performed by both the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test on the same specimen. The study protocol was approved by the Institutional Review Board for Research on Human Subjects at the Korea University Guro Hospital, and written informed consent was obtained from the patients.

Liquid-based cytology
A Cervex-Brush (Rovers Medical Devices, Oss, The Netherlands) was used to obtain samples from the uterine cervix. The brush was immediately rinsed in a vial of PreservCyt solution (Cytyc, Boxborough, MA, U.S.A.). The vial was placed in the Thin Prep Processor (Cytyc). The ThinPrep slide was then fixed in ethanol and stained with Papanicolaou's stain. The number of epithelial cells on these slides was estimated from the number of cells contained within computerderived coordinates for 50 random fields located within a 20-mm diameter circular area where the cells were deposited. The diagnoses were made using the 2001 Bethesda System for cervical cytology.

HC 2 assay
HPV DNA testing by the HC 2 assay was performed with the HC 2 assay system according to the manufacturer's protocol (Qiagen). The specimens were denatured at 65 for 45 min and hybridized under high-stringency conditions with a mixture of RNA probes that detects 13 different oncogenic HPV types: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, and 68. The resultant DNA-RNA hybrids were captured on the surface of the microtiter plate wells coated with an antiDNA-RNA hybrid antibody. The immobilized hybrids were then reacted with an alkaline phosphatase-conjugated anti-hybrid monoclonal antibody. Light intensity was measured with a luminometer. The recommended positivity threshold of 1 pg/mL was used as a cutoff, and all specimens with a relative light unit/control (RLU/CO) ratio of 1.0 were considered positive.

HPV 4 ACE test


The residual cell in the PreservCyt solution were centrifuged at 13,000g for 15 min, and the cell pellets were resuspended in 200 L of phosphate-buffered saline. The resuspended cell pellets were added to a DNA purification column (Qiagen, Inc., Valencia, CA, U.S.A.). The extraction of total DNA was performed according to the manufacturer's instructions. Briefly, PCR was conducted in a final reaction volume of 20 L containing 3 L of isolated DNA from cervical swab, 4 L of 5HPV 4 ACE primer mixture, and 10 L of 2Master Mix (Seegene Inc.). The cycling conditions were as follows: denaturation for 15 min at 94; amplification for 40 cycles, with denaturation for 30 sec at 94; annealing for 1 min 30 sec at 60; and extension for 1 min 30 sec at 72. The amplified PCR products were separated in 2% agarose gel stained with ethidium bromide or ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, U.K.). Briefly, following PCR, 2 L of the amplification product was mixed with 6 L loading buffer (Lab901) in a 0.2 mL PCR Tube. Insert the sample block into the TapeStation (Lab901) and place the 0.2 mL PCR tube containing the sample. Amplicon analysis was then performed on the ScreenTape System with the Seegene View software. Seegene's capillary electrophoresis system provide the detection software which automatically read the PCR product and analyze the amplicon intensity while conventional capillary electrophoresis need user's manual read of the peak with naked eyes after mixing the PCR product with SYBR green or Cyto-9 dye.

PCR HPV Typing Set test


The DNA of swab was extracted from swabs using a QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Inc.) according to the manufacturer's instructions. The concentration of DNA was measured using a spectrophotometer (DU530; Beckman, Fullerton, CA, U.S.A.), and the DNA quality was confirmed on agarose gels. The PCR method using the HPV Typing Set was used. The HPV subtype was determined using the HPV Typing Set (Takara Bio., Shiga, Japan), a primer set for PCR specifically designed to identify HPV genotypes 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58 in genomic DNA. The primer HPVpU-31B was used to amplify the

DNA of HPV 6 and 11 (LR HPV genotypes) and HPVpU-1M was used to amplify the DNA of HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58 (HR HPV genotypes). The PCR HPV Typing Set method was used according to the manufacturer's instructions. This set includes both malignant and benign control templates for verification of the PCR reaction by using the primer pairs provided in the set. Their expression was normalized using the supplied control template as an endogenous reference. Restriction enzyme digestion of PCR products can also be confirmed because PCR products recognized the sites of Ava II, Afa I, Bgl II, Acc I, and Ava I and small sizes of DNA fragments are yielded by digestion of restriction enzymes. The DNA fragments were confirmed on agarose gels and identified the HPV genotypes.

Statistical analysis
To compare the clinical accuracy of the HC 2 assay, the HPV 4 ACE test, and the PCR HPV typing set test to detect high-grade cervical lesions, we also calculated the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV); the sensitivity and specificity of the three tests were compared by the paired proportion test. Agreement between the HPV assays was assessed by Cohen's kappa statistic, with values of 0.00-0.20 indicating poor agreement, 0.21-0.40 fair agreement, 0.41-0.60 moderate agreement, 0.61-0.80 substantial agreement, and 0.81-1.00 almost perfect agreement. McNemar's chi-square analysis for matched pair data was performed to analyze contingency tables comparing HPV tests. Statistical analyses were performed with SPSS, version 12.0, statistical software (Chicago, IL, U.S.A.). All tests were two-sided, and a P value <0.05 was considered significant.

RESULTS
The cytologic findings, as well as all three HPV DNA test results, were available for 199 patients. The overall HR HPV detection rates were 52.3% (104/199) by the HC 2 assay, 54.3% (108/199) by the HPV 4 ACE test, and 48.7% (97/199) by the PCR HPV Typing Set test (Table 1). The HR HPV-positive rates by the HC 2

assay, HPV 4 ACE test, and PCR HPV Typing Set test were 31.4%, 37.3%, and 33.3%, for the normal cytology group, 65.5%, 61.8%, and 58.2% for atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), 82.1%, 82.1%, and 60.7% for low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL), respectively. In the cytologic high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) group, which is clinically important for its tendency to progress to cervical cancer, all 3 tests showed identical positivity rates (87.5%), and a 100% HR HPV detection rate was observed in the cervical cancer group by all 3 tests. The HPV 4 ACE test did not show any significant difference in HR HPV positivity in the normal cytology group from the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test (P=0.143 and P=0.585, respectively). However, there were 17 discordant samples between the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test in normal Pap smear samples; 5 samples were HC 2-positive and HPV 4 ACE-negative, and 12 samples were HC 2-negative and HPV 4 ACE-positive. Of 12 samples, 4 included HR HPV genotypes (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, and 52), which were identified by the PCR HPV Typing Set test. In contrast, there were no HR genotypes identified in the former 5 samples. In cytologic ASCUS, the detection rate of the HPV 4 ACE test for HR HPV was also not significantly different from the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test, but the HC 2 assay showed a significantly higher detection rate for HR HPV than PCR HPV Typing Set test (P=0.02). With the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test, a significantly higher percentage of LSIL Pap smear samples tested positive for HR HPV than with the PCR HPV Typing Set test (82.1% vs. 60.7%, P=0.03). In women with cytologic HSIL, the HPV 4 ACE test showed a detection rate of 87.5% for HR HPV, which was the same level as that of both the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test.

Table 1 HPV DNA test results according to cytological diagnosis

The concordance for HR HPV detection between the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test was 85.4%, showing substantial agreement (kappa coefficient=0.71; Table 2). In contrast, the concordance between the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test was 72.4%, showing moderate agreement (kappa coefficient=0.45). For the detection of HPV 16 and HPV 18, the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test showed substantial agreement (89.9%, kappa coefficient=0.65). However, 20 cases (10.1%) gave discordant results; specifically, 8 cases were positive by the HPV 4 ACE test, but negative by the PCR HPV Typing Set test, whereas 12 samples were PCR HPV Typing Set test-positive, but HPV 4 ACE-negative (Table 3).

Table 2 Concordance among HC 2 assay, HPV 4 ACE test and PCR HPV typing set test

Table 3 Overview of discordant samples between HPV 4 ACE test and PCR HPV Typing Set test

Table 4 shows the HR HPV detection related to cytologic results. The overall HR HPV prevalence increased in parallel with the increasing severity of the Pap smear result. When an abnormal Pap test was defined as ASCUS or higher, the sensitivity and specificity of the HPV 4 ACE test were not inferior to the HC 2 assay (72.2% vs. 74.2% [P=0.40], and 61.8% vs. 68.6% [P=0.27], respectively; Table 4). In addition, the sensitivity and the specificity of the HPV

4 ACE test were also comparable to the PCR HPV Typing Set test (P=0.27 and 0.36, respectively).

Table 4 Overview of diagnostic accuracy of each HPV DNA tests

When the abnormal Pap test was defined as LSIL or higher, all three HPV DNA tests performed similarly for the detection of HR HPV DNA (data not shown). Furthermore, with respect to cytologic HSIL or cervical cancer, all 3 tests had the same level of sensitivity (92.9%) and a similar level of specificity (Table 4).

DISCUSSION
The purpose of this study was to examine the performance of the novel HPV 4 ACE test for the detection of HR HPV and HPV 16 and 18 genotypes, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test. Since the approval by the U.S. FDA, the HC 2 assay has been used as a gold standard when evaluating the efficacy of the various novel HPV DNA detection methods (21-24). In addition, the PCR HPV Typing Set test has been widely used for the detection of HPV in a number of studies (17-20). Given that the HPV 4 ACE test has only recently become commercially available, there is no study to compare this test with other HPV detection methods. The HPV 4 ACE test can identify HPV 16 and HPV 18 genotypes among 13 high-risk HPVs and can detect the presence of other 11 high-risk HPVs. For this aspect, the novel HPV 4 ACE test can be called as an upgraded version of the HC 2 assay. Because of the overwhelming importance of the HPV 16 and 18 genotypes in the progression to high-grade cervical lesions, genotyping of the HPV 16 and 18 with simultaneous detection of 11 other high-risk HPVs seem to be very efficacious, as compared to other PCR-based genotyping methods or HPV DNA

chip. The HPV 4 ACE test uses a dual priming oligonucleotide (DPO) system that is structurally and functionally different from the primer system currently in widespread use. The conventional priming system is based on a single priming event between the primer and template, which often leads to extension of non-specific products. In contrast, the DPO system has two separate primer segments (a 5'-segment 18-25nt in length and a 3'-segment 6-12nt in length). This unequal distribution of nucleotides leads to different annealing preferences for each segment. The longer 5'-segment preferentially binds to the template DNA and initiates stable annealing, whereas the short 3'-segment selectively binds to its target site and blocks non-specific annealing (25). In the present study, the HPV 4 ACE test showed the same or comparable levels of the HR HPV detection rate, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test. In addition, the HPV 4 ACE test revealed substantial agreement with the HC 2 assay for the detection of 13 HR HPVs. In contrast, the PCR HPV Typing Set test showed a lower concordance level than the HPV 4 ACE test with the HC 2 assay, which might be partially attributed to the differences in the number of HR HPVs that could be detected by both tests. The PCR HPV Typing Set test can only detect 7 HR HPVs, whereas 13 types can be detected by the HC 2 assay. Furthermore, in terms of HPV genotyping, particularly the HPV 16 and HPV 18 genotypes, the HPV 4 ACE test also showed substantial agreement with the PCR HPV Typing Set test. As shown in Table 3, 20 samples were discordant between the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test. Although the HPV 4 ACE test failed to detect HPV 16 or HPV 18 in 12 of 20 samples, there were only 2 samples negative for any HR HPV. Furthermore, these two cases were shown to be 1 normal and 1 ASCUS in cytology, not squamous intraepithelial lesions. A recent study reported by Sandri et al. (21) compared the AMPLICOR HPV test with the HC 2 assay for the detection of 13 HR HPVs. The AMPLCOR HPV test is similar to the HPV 4 ACE test in terms of PCR-based HPV detection methods. In their study, the HR HPV DNA detection rate of the AMPLICOR HPV test was higher than the HC 2 assay in normal Pap smear samples, whereas the two tests performed similarly on abnormal Pap smear results. In contrast, our study

showed no significant difference between the two tests for HR HPV DNA positivity, regardless of cytologic results. Another study performed by Stevens et al. (22) evaluated the performance of the HC 2 assay and the AMPLICOR HPV test according to cytologic results. In cytologic HSIL or higher, the sensitivity of the HC 2 assay and the AMPLICOR HPV test were 87.4% and 95.2%, respectively, which was similar to our results. When compared to another PCR-based HPV DNA detection method already in use, such as the AMPLICOR test, the novel HPV 4 ACE test showed comparable sensitivity for the detection of HR HPV. With respect to the PCR HPV Typing Set test, Fujinaga et al. (18) evaluated the performance of this test in 39 cervical carcinoma tissue specimens. According to their report, the overall prevalence of HR HPV was 84.6%, of which there were 19 HPV 16-positive specimens and 5 HPV 18-positive specimens. In our study, although evaluated in cytology samples, the HR HPV detection rate was 100% in 6 cervical cancers. Among 6 samples, 4 HPV 16-positive and 1 HPV 18-positive samples were identified. Our study had some limitations. First, the number of samples with cytologic LSIL or higher were not sufficient to conclude our results. Second, we could not evaluate the performance of HPV DNA tests using tissue samples due to loss of follow-up. For that reason, we evaluated the sensitivity and specificity of the three HPV tests using cytology specimens in three different conditions, that is the "disease" was defined as; 1) ASC-US or worse, 2) LSIL or worse, and 3) HSIL or worse. Nevertheless, our study showed that the novel HPV 4 ACE test can substitute for the various HPV DNA tests already in use, particularly the HC 2 assay. The HPV 4 ACE test is basically the same test as HC2 assay in terms of detecting 13 highrisk HPVs. But the difference between the two tests is that HPV 4 ACE test can give the information about the presence of HPV 16 and 18 genotypes, which account for about 70% of cervical cancer. So we can not only detect other 11 high-risk HPVs but also genotype the HPV 16 and 18 simultaneously by performing the HPV 4 ACE test. This is very important difference in that

knowledge about the presence of HPV 16 and 18 would be helpful to triage the patients who are needed to get frequent follow-up or not. Furthermore, in the era of HPV vaccination, information regarding specific carcinogenic HPV genotypes identified by HPV DNA tests, such as the HC 2 assay in women positive for HR HPV, would be helpful for discriminating women with clinicallyrelevant diseases that are most likely to progress from those with diseases that regress spontaneously. In addition, persistent infection with HR HPV genotypes, such as HPV 16 and HPV 18, is known to be a necessary condition for the development of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and invasive disease (26). Therefore, selective HPV genotyping for HR HPV genotypes would be crucial for distinguishing women who are at high risk for progression from those who are likely to regress. Thus, the HPV 4 ACE test has the ability to detect the presence of 13 HR HPVs and also to identify HPV 16 and HPV 18 genotypes simultaneously in high concordance with the HC 2 assay. To make this novel diagnostic tool more credible, further studies with larger samples and comparison with other various HPV DNA genotyping methods is needed.

Article information
J Korean Med Sci. 2009 August; 24(4): 579584. Published online 2009 July 29. doi: 10.3346/jkms.2009.24.4.579 PMCID: PMC2719217 Jin Hwa Hong,1 Seung Hun Song,1 Jong Kee Kim,2 Jeong Hyun Han,2 and Jae Kwan Lee
1 1

Department of Obstetrics and Gynecology, Guro Hospital, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea.
2

Seegene Institute of Life Science, Seoul, Korea. Corresponding author.

Address for correspondence: Jae Kwan Lee, M.D. Department of Obstetrics and Gynecology, Guro Hospital, College of Medicine, Korea University, 80 Guro-dong, Guro-gu, Seoul 152-703, Korea. Tel: +82.2-2626-3142, Fax: +82.2-838-1560, Email: jklee38/at/korea.ac.kr Received December 24, 2008; Accepted March 14, 2009. Copyright 2009 The Korean Academy of Medical Sciences

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Comparison of the Novel Human Papillomavirus 4 Autocapillary Electrophoresis Test with the Hybrid Capture 2 Assay and with the PCR HPV Typing Set Test in the Detection of High-Risk HPV Including HPV 16 and 18 Genotypes in Cervical Specimens
Jin Hwa Hong, Seung Hun Song, [...], and Jae Kwan Lee
Additional article information

Abstract
The aim of this study was to compare the novel human papillomavirus (HPV) detection method, the HPV 4 Auto-capillary Electrophoresis (ACE) test with the hybrid capture (HC) 2 assay for the detection of high-risk HPVs. In addition, we compared the HPV 4 ACE test with the polymerase chain reaction HPV Typing Set test for the detection of HPV 16 and HPV 18 genotypes. One hundred ninetynine cervical swab samples obtained from women with previous abnormal Pap smears were subjected to testing with the three HPV tests. The HPV 4 ACE test and the HC 2 assay showed substantial agreement for detection of high-risk HPVs (85.4%, kappa=0.71). The HPV 4 ACE test also showed substantial agreement with the PCR HPV Typing Set test in the detection of HPV 16 and HP V 18 genotypes (89.9%, kappa=0.65). In correlation with cytologic results, the sensitivities and specificities of the HPV 4 ACE test and HC 2 assay were 92.9% vs. 92.9% and 48.1% vs. 50.8%, respectively, when high-grade squamous

intraepithelial lesions were regarded as abnormal cytologies. The novel HPV 4 ACE test is a valuable tool for the detection of high-risk HPVs and for genotyping of HPV 16 and HPV 18.
Keywords: HPV Typing Methods, ACE, HC2, HPV Typing Set Test

INTRODUCTION
Cervical cancer represents the second most common gynecologic malignancy worldwide. Various molecular and epidemiologic studies have established a strong association between high-risk (HR) human papillomavirus (HPV) genotypes and the development of cervical cancer and its precursor lesions, cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 or 3 (1-5). The majority of cases of cervical cancer is caused by infection with at least 1 of the 13 accepted HR carcinogenic HPV types (i.e., types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, and 68) (1, 3, 5). Among the carcinogenic HPV types, HPV 16 and HPV 18 account for approximately 70% of all cervical cancers (6). Consequently, it has been proposed that highly sensitive HPV detection methods, such as the HPV DNA test, could enhance the efficacy of population-based screening programs, either as a sole screening tool or as an adjunct to current cervical cytologic screening. Recently, the detection of HPV infection depends almost entirely on molecular methodologies, of which the Hybrid Capture (HC) 2 assay (Qiagen, Gaithersburg, MD, U.S.A.) is the only commercial HPV DNA test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) (7, 8). The HC 2 assay has also been approved in the U.S. as an adjunct to the Papanicolaou test for cervical cancer screening for women aged over 30. While the HC 2 assay can detect 13 HR HPV genotypes, it neither allows the identification of specific genotypes nor provides any information about multiple HPV infections. Recent studies have provided evidence for a difference in oncogenic potential among the HR HPV genotypes, highlighting the importance of HPV genotyping, particularly HPV 16 and HPV 18 (9). There are numerous polymerase chain reaction (PCR)-based HPV genotyping methods in widespread use. The

commercially available PCR-based HPV genotyping methods have included the primer sets, GP5+/GP6+ (10, 11) and MY09/11, and their subsequently modified derivatives PGMY09/11 (12, 13) and the SPF10 system (14-16). Recently, a novel PCR-based HPV detection and genotyping method has been developed, the HPV 4 Auto-capillary eElectrophoresis (ACE) test (Seegene Inc., Seoul, Korea). In contrast to other commercially available PCR methods, the HPV 4 ACE test uses a newly-developed dual priming oligonucleotide (DPO) system in order to minimize the risk of non-specific priming. This test has the ability to identify HPV 16 and 18 genotypes and can detect 11 other HR HPVs. In contrast, the PCR HPV Typing Set test (Takara Bio., Shiga, Japan), which is commercially available, uses two primer sets which can detect 7 HR (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) and 2 LR HPV genotypes (HPV-6 and 11) (17-20). The purpose of this study was to evaluate the efficacy of the HPV 4 ACE test, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test for the detection of HR HPV DNA in cervical swab samples. In addition, we compared the HPV 4 ACE test with the PCR HPV Typing Set test for the detection of HPV 16 and HPV 18. Finally, we evaluated the sensitivity and specificity of these HPV DNA tests in correlation with cytologic results.

MATERIALS AND METHODS


Study population and specimen collection
One hundred ninety-nine women who were referred to the Colposcopy Clinic in Guro Hospital of Korea University for abnormal cytology between April and June 2008 were prospectively enrolled. A cervical specimen for liquid-based cytology, along with simultaneous HPV DNA detection by the HC 2 assay, was collected from each woman. Genomic DNA was extracted from each sample and the HPV DNA tests were performed by both the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test on the same specimen. The study protocol was approved by the Institutional Review Board for Research on Human Subjects at the Korea

University Guro Hospital, and written informed consent was obtained from the patients.

Liquid-based cytology
A Cervex-Brush (Rovers Medical Devices, Oss, The Netherlands) was used to obtain samples from the uterine cervix. The brush was immediately rinsed in a vial of PreservCyt solution (Cytyc, Boxborough, MA, U.S.A.). The vial was placed in the Thin Prep Processor (Cytyc). The ThinPrep slide was then fixed in ethanol and stained with Papanicolaou's stain. The number of epithelial cells on these slides was estimated from the number of cells contained within computerderived coordinates for 50 random fields located within a 20-mm diameter circular area where the cells were deposited. The diagnoses were made using the 2001 Bethesda System for cervical cytology.

HC 2 assay
HPV DNA testing by the HC 2 assay was performed with the HC 2 assay system according to the manufacturer's protocol (Qiagen). The specimens were denatured at 65 for 45 min and hybridized under high-stringency conditions with a mixture of RNA probes that detects 13 different oncogenic HPV types: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, and 68. The resultant DNA-RNA hybrids were captured on the surface of the microtiter plate wells coated with an antiDNA-RNA hybrid antibody. The immobilized hybrids were then reacted with an alkaline phosphatase-conjugated anti-hybrid monoclonal antibody. Light intensity was measured with a luminometer. The recommended positivity threshold of 1 pg/mL was used as a cutoff, and all specimens with a relative light unit/control (RLU/CO) ratio of 1.0 were considered positive.

HPV 4 ACE test


The residual cell in the PreservCyt solution were centrifuged at 13,000g for 15 min, and the cell pellets were resuspended in 200 L of phosphate-buffered saline. The resuspended cell pellets were added to a DNA purification column

(Qiagen, Inc., Valencia, CA, U.S.A.). The extraction of total DNA was performed according to the manufacturer's instructions. Briefly, PCR was conducted in a final reaction volume of 20 L containing 3 L of isolated DNA from cervical swab, 4 L of 5HPV 4 ACE primer mixture, and 10 L of 2Master Mix (Seegene Inc.). The cycling conditions were as follows: denaturation for 15 min at 94; amplification for 40 cycles, with denaturation for 30 sec at 94; annealing for 1 min 30 sec at 60; and extension for 1 min 30 sec at 72. The amplified PCR products were separated in 2% agarose gel stained with ethidium bromide or ScreeningTape System (Lab901 Ltd., Edingurgh, U.K.). Briefly, following PCR, 2 L of the amplification product was mixed with 6 L loading buffer (Lab901) in a 0.2 mL PCR Tube. Insert the sample block into the TapeStation (Lab901) and place the 0.2 mL PCR tube containing the sample. Amplicon analysis was then performed on the ScreenTape System with the Seegene View software. Seegene's capillary electrophoresis system provide the detection software which automatically read the PCR product and analyze the amplicon intensity while conventional capillary electrophoresis need user's manual read of the peak with naked eyes after mixing the PCR product with SYBR green or Cyto-9 dye.

PCR HPV Typing Set test


The DNA of swab was extracted from swabs using a QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Inc.) according to the manufacturer's instructions. The concentration of DNA was measured using a spectrophotometer (DU530; Beckman, Fullerton, CA, U.S.A.), and the DNA quality was confirmed on agarose gels. The PCR method using the HPV Typing Set was used. The HPV subtype was determined using the HPV Typing Set (Takara Bio., Shiga, Japan), a primer set for PCR specifically designed to identify HPV genotypes 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58 in genomic DNA. The primer HPVpU-31B was used to amplify the DNA of HPV 6 and 11 (LR HPV genotypes) and HPVpU-1M was used to amplify the DNA of HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58 (HR HPV genotypes). The PCR HPV Typing Set method was used according to the manufacturer's instructions. This set includes both malignant and benign control templates for verification of

the PCR reaction by using the primer pairs provided in the set. Their expression was normalized using the supplied control template as an endogenous reference. Restriction enzyme digestion of PCR products can also be confirmed because PCR products recognized the sites of Ava II, Afa I, Bgl II, Acc I, and Ava I and small sizes of DNA fragments are yielded by digestion of restriction enzymes. The DNA fragments were confirmed on agarose gels and identified the HPV genotypes.

Statistical analysis
To compare the clinical accuracy of the HC 2 assay, the HPV 4 ACE test, and the PCR HPV typing set test to detect high-grade cervical lesions, we also calculated the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV); the sensitivity and specificity of the three tests were compared by the paired proportion test. Agreement between the HPV assays was assessed by Cohen's kappa statistic, with values of 0.00-0.20 indicating poor agreement, 0.21-0.40 fair agreement, 0.41-0.60 moderate agreement, 0.61-0.80 substantial agreement, and 0.81-1.00 almost perfect agreement. McNemar's chi-square analysis for matched pair data was performed to analyze contingency tables comparing HPV tests. Statistical analyses were performed with SPSS, version 12.0, statistical software (Chicago, IL, U.S.A.). All tests were two-sided, and a P value <0.05 was considered significant.

RESULTS
The cytologic findings, as well as all three HPV DNA test results, were available for 199 patients. The overall HR HPV detection rates were 52.3% (104/199) by the HC 2 assay, 54.3% (108/199) by the HPV 4 ACE test, and 48.7% (97/199) by the PCR HPV Typing Set test (Table 1). The HR HPV-positive rates by the HC 2 assay, HPV 4 ACE test, and PCR HPV Typing Set test were 31.4%, 37.3%, and 33.3%, for the normal cytology group, 65.5%, 61.8%, and 58.2% for atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), 82.1%, 82.1%, and 60.7% for low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL), respectively. In the

cytologic high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) group, which is clinically important for its tendency to progress to cervical cancer, all 3 tests showed identical positivity rates (87.5%), and a 100% HR HPV detection rate was observed in the cervical cancer group by all 3 tests. The HPV 4 ACE test did not show any significant difference in HR HPV positivity in the normal cytology group from the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test (P=0.143 and P=0.585, respectively). However, there were 17 discordant samples between the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test in normal Pap smear samples; 5 samples were HC 2-positive and HPV 4 ACE-negative, and 12 samples were HC 2-negative and HPV 4 ACE-positive. Of 12 samples, 4 included HR HPV genotypes (HPV 16/18, 16/33/58, 16/31, and 52), which were identified by the PCR HPV Typing Set test. In contrast, there were no HR genotypes identified in the former 5 samples. In cytologic ASCUS, the detection rate of the HPV 4 ACE test for HR HPV was also not significantly different from the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test, but the HC 2 assay showed a significantly higher detection rate for HR HPV than PCR HPV Typing Set test (P=0.02). With the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test, a significantly higher percentage of LSIL Pap smear samples tested positive for HR HPV than with the PCR HPV Typing Set test (82.1% vs. 60.7%, P=0.03). In women with cytologic HSIL, the HPV 4 ACE test showed a detection rate of 87.5% for HR HPV, which was the same level as that of both the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test.

Table 1 HPV DNA test results according to cytological diagnosis

The concordance for HR HPV detection between the HC 2 assay and the HPV 4 ACE test was 85.4%, showing substantial agreement (kappa coefficient=0.71; Table 2). In contrast, the concordance between the HC 2 assay

and the PCR HPV Typing Set test was 72.4%, showing moderate agreement (kappa coefficient=0.45). For the detection of HPV 16 and HPV 18, the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test showed substantial agreement (89.9%, kappa coefficient=0.65). However, 20 cases (10.1%) gave discordant results; specifically, 8 cases were positive by the HPV 4 ACE test, but negative by the PCR HPV Typing Set test, whereas 12 samples were PCR HPV Typing Set test-positive, but HPV 4 ACE-negative (Table 3).

Table 2 Concordance among HC 2 assay, HPV 4 ACE test and PCR HPV typing set test

Table 3 Overview of discordant samples between HPV 4 ACE test and PCR HPV Typing Set test

Table 4 shows the HR HPV detection related to cytologic results. The overall HR HPV prevalence increased in parallel with the increasing severity of the Pap smear result. When an abnormal Pap test was defined as ASCUS or higher, the sensitivity and specificity of the HPV 4 ACE test were not inferior to the HC 2 assay (72.2% vs. 74.2% [P=0.40], and 61.8% vs. 68.6% [P=0.27], respectively; Table 4). In addition, the sensitivity and the specificity of the HPV 4 ACE test were also comparable to the PCR HPV Typing Set test (P=0.27 and 0.36, respectively).

Table 4 Overview of diagnostic accuracy of each HPV DNA tests

When the abnormal Pap test was defined as LSIL or higher, all three HPV DNA tests performed similarly for the detection of HR HPV DNA (data not shown). Furthermore, with respect to cytologic HSIL or cervical cancer, all 3 tests had the same level of sensitivity (92.9%) and a similar level of specificity (Table 4).

DISCUSSION
The purpose of this study was to examine the performance of the novel HPV 4 ACE test for the detection of HR HPV and HPV 16 and 18 genotypes, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test. Since the approval by the U.S. FDA, the HC 2 assay has been used as a gold standard when evaluating the efficacy of the various novel HPV DNA detection methods (21-24). In addition, the PCR HPV Typing Set test has been widely used for the detection of HPV in a number of studies (17-20). Given that the HPV 4 ACE test has only recently become commercially available, there is no study to compare this test with other HPV detection methods. The HPV 4 ACE test can identify HPV 16 and HPV 18 genotypes among 13 high-risk HPVs and can detect the presence of other 11 high-risk HPVs. For this aspect, the novel HPV 4 ACE test can be called as an upgraded version of the HC 2 assay. Because of the overwhelming importance of the HPV 16 and 18 genotypes in the progression to high-grade cervical lesions, genotyping of the HPV 16 and 18 with simultaneous detection of 11 other high-risk HPVs seem to be very efficacious, as compared to other PCR-based genotyping methods or HPV DNA chip. The HPV 4 ACE test uses a dual priming oligonucleotide (DPO) system that is structurally and functionally different from the primer system currently

in widespread use. The conventional priming system is based on a single priming event between the primer and template, which often leads to extension of non-specific products. In contrast, the DPO system has two separate primer segments (a 5'-segment 18-25nt in length and a 3'-segment 6-12nt in length). This unequal distribution of nucleotides leads to different annealing preferences for each segment. The longer 5'-segment preferentially binds to the template DNA and initiates stable annealing, whereas the short 3'-segment selectively binds to its target site and blocks non-specific annealing (25). In the present study, the HPV 4 ACE test showed the same or comparable levels of the HR HPV detection rate, as compared to the HC 2 assay and the PCR HPV Typing Set test. In addition, the HPV 4 ACE test revealed substantial agreement with the HC 2 assay for the detection of 13 HR HPVs. In contrast, the PCR HPV Typing Set test showed a lower concordance level than the HPV 4 ACE test with the HC 2 assay, which might be partially attributed to the differences in the number of HR HPVs that could be detected by both tests. The PCR HPV Typing Set test can only detect 7 HR HPVs, whereas 13 types can be detected by the HC 2 assay. Furthermore, in terms of HPV genotyping, particularly the HPV 16 and HPV 18 genotypes, the HPV 4 ACE test also showed substantial agreement with the PCR HPV Typing Set test. As shown in Table 3, 20 samples were discordant between the HPV 4 ACE test and the PCR HPV Typing Set test. Although the HPV 4 ACE test failed to detect HPV 16 or HPV 18 in 12 of 20 samples, there were only 2 samples negative for any HR HPV. Furthermore, these two cases were shown to be 1 normal and 1 ASCUS in cytology, not squamous intraepithelial lesions. A recent study reported by Sandri et al. (21) compared the AMPLICOR HPV test with the HC 2 assay for the detection of 13 HR HPVs. The AMPLCOR HPV test is similar to the HPV 4 ACE test in terms of PCR-based HPV detection methods. In their study, the HR HPV DNA detection rate of the AMPLICOR HPV test was higher than the HC 2 assay in normal Pap smear samples, whereas the two tests performed similarly on abnormal Pap smear results. In contrast, our study showed no significant difference between the two tests for HR HPV DNA positivity, regardless of cytologic results.

Another study performed by Stevens et al. (22) evaluated the performance of the HC 2 assay and the AMPLICOR HPV test according to cytologic results. In cytologic HSIL or higher, the sensitivity of the HC 2 assay and the AMPLICOR HPV test were 87.4% and 95.2%, respectively, which was similar to our results. When compared to another PCR-based HPV DNA detection method already in use, such as the AMPLICOR test, the novel HPV 4 ACE test showed comparable sensitivity for the detection of HR HPV. With respect to the PCR HPV Typing Set test, Fujinaga et al. (18) evaluated the performance of this test in 39 cervical carcinoma tissue specimens. According to their report, the overall prevalence of HR HPV was 84.6%, of which there were 19 HPV 16-positive specimens and 5 HPV 18-positive specimens. In our study, although evaluated in cytology samples, the HR HPV detection rate was 100% in 6 cervical cancers. Among 6 samples, 4 HPV 16-positive and 1 HPV 18-positive samples were identified. Our study had some limitations. First, the number of samples with cytologic LSIL or higher were not sufficient to conclude our results. Second, we could not evaluate the performance of HPV DNA tests using tissue samples due to loss of follow-up. For that reason, we evaluated the sensitivity and specificity of the three HPV tests using cytology specimens in three different conditions, that is the "disease" was defined as; 1) ASC-US or worse, 2) LSIL or worse, and 3) HSIL or worse. Nevertheless, our study showed that the novel HPV 4 ACE test can substitute for the various HPV DNA tests already in use, particularly the HC 2 assay. The HPV 4 ACE test is basically the same test as HC2 assay in terms of detecting 13 highrisk HPVs. But the difference between the two tests is that HPV 4 ACE test can give the information about the presence of HPV 16 and 18 genotypes, which account for about 70% of cervical cancer. So we can not only detect other 11 high-risk HPVs but also genotype the HPV 16 and 18 simultaneously by performing the HPV 4 ACE test. This is very important difference in that knowledge about the presence of HPV 16 and 18 would be helpful to triage the patients who are needed to get frequent follow-up or not. Furthermore, in the

era of HPV vaccination, information regarding specific carcinogenic HPV genotypes identified by HPV DNA tests, such as the HC 2 assay in women positive for HR HPV, would be helpful for discriminating women with clinicallyrelevant diseases that are most likely to progress from those with diseases that regress spontaneously. In addition, persistent infection with HR HPV genotypes, such as HPV 16 and HPV 18, is known to be a necessary condition for the development of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and invasive disease (26). Therefore, selective HPV genotyping for HR HPV genotypes would be crucial for distinguishing women who are at high risk for progression from those who are likely to regress. Thus, the HPV 4 ACE test has the ability to detect the presence of 13 HR HPVs and also to identify HPV 16 and HPV 18 genotypes simultaneously in high concordance with the HC 2 assay. To make this novel diagnostic tool more credible, further studies with larger samples and comparison with other various HPV DNA genotyping methods is needed.

Article information
J Korean Med Sci. 2009 August; 24(4): 579584. Published online 2009 July 29. doi: 10.3346/jkms.2009.24.4.579 PMCID: PMC2719217 Jin Hwa Hong,1 Seung Hun Song,1 Jong Kee Kim,2 Jeong Hyun Han,2 and Jae Kwan Lee
1 1

Department of Obstetrics and Gynecology, Guro Hospital, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea.
2

Seegene Institute of Life Science, Seoul, Korea. Corresponding author.

Address for correspondence: Jae Kwan Lee, M.D. Department of Obstetrics and Gynecology, Guro Hospital, College of Medicine, Korea University, 80 Guro-dong, Guro-gu, Seoul 152-703, Korea. Tel: +82.2-2626-3142, Fax: +82.2-838-1560, Email: jklee38/at/korea.ac.kr Received December 24, 2008; Accepted March 14, 2009. Copyright 2009 The Korean Academy of Medical Sciences This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution NonCommercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-

commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. This article has been cited by other articles in PMC. Articles from Journal of Korean Medical Science are provided here courtesy of Korean Academy of Medical Sciences

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