PRACTICA N 8: OBTENCION Y CUANTIFICACION DE GLUCGENO EN HGADO

INTRODUCCIN

El glucgeno es un polisacrido formado por cadenas de glucosa con uniones alfa 1,4 y alfa 1,6. Las uniones alfa 1.6 son las que permiten la ramificacin del glucgeno. Constituye una forma de almacenamiento de glucosa rpida movilizacin y es fundamental para el musculo esqueltico., el cual obtiene su energa a partir de glucosa durante el ejercicio. Durante el reposo, el principal combustible del musculo esta constituido por acidos grasos. El hgado es el rgano encargado de regular niveles de glucosa durante el ayuno y los periodos post-prandiales, encargndose de almacenar glucosa como glucgeno o de degradar este cuando la glicemia desciende por debajo de los niveles normales. El hgado a diferencia de otros rganos, no usa glucosa como combustible para su funcionamiento , sino principalmente ceto-acidos derivados de la degradacin de aminocidos.

II.-OBJETIVOS

-Extraer el glucgeno a partir de hgado de rata -Cuantificar el glucgeno obtenido -Calcular el rendimiento de la purificacin del mtodo
III.- MARCO TERICO El glucgeno, es un polisacrido de reserva energtica formado por cadenas ramificadas de glucosa; es insoluble en agua, en la que forma dispersiones coloidales. Abunda en el hgado y en menor cantidad en los msculos, as como tambin en varios tejidos. Una sola molcula de glucgeno puede contener ms de 120.000 molculas de glucosa. La importancia de que el glucgeno sea una molcula tan ramificada es debido a que: 1. La ramificacin aumenta su solubilidad. 2. La ramificacin permite la abundancia de residuos de glucosa no reductores que van a ser los lugares de unin de las enzimas glucgeno fosforilasa y glucgeno sintetasa, es decir, las ramificaciones facilitan tanto la velocidad de sntesis como la de degradacin del glucgeno. El glucgeno es el polisacrido de reserva energtica en los animales que se almacena en el hgado (10% de la masa heptica) y en los msculos (1% de la masa muscular) de los vertebrados. Adems, pueden encontrarse pequeas cantidades de glucgeno en ciertas clulas gliales del cerebro. Gracias a la capacidad de almacenamiento de glucgeno, se reducen al mximo los cambios de presin osmtica que la glucosa libre podra ocasionar tanto en el interior de la clula como en el medio extracelular. Cuando el organismo o la clula requieren de un aporte energtico de emergencia, como en los casos de tensin o alerta, el glucgeno se degrada nuevamente a glucosa, que queda disponible para el metabolismo energtico. En el hgado la conversin de glucosa almacenada en forma de glucgeno a glucosa libre en sangre, est regulada por la hormona glucagn y adrenalina. El glucgeno heptico es la principal fuente de glucosa sangunea, sobre todo entre comidas. El glucgeno contenido en los msculos es para abastecer de energa el proceso de contraccin muscular. El glucgeno se almacena dentro de vacuolas en el citoplasma de las clulas que lo utilizan para la gluclisis. Estas vacuolas contienen las enzimas necesarias para la hidrlisisde glucgeno a glucosa. El anlisis del glucgeno presente en un rgano requiere su previo aislamiento, de modo de eliminar otras molculas que pueden interferir en su determinacin. Las protenas y cidos nucleicos precipitan cuando el homogenizado del tejido es sometido a la accin de un agente desnaturalizante como el cido tricloroactico (TCA), lo que permite su rpida separacin. El glucgeno que se encuentra en la solucin remanente precipita en contacto con etanol, con lo

cual se completa su purificacin. Para su cuantificacin se recurre al mtodo colorimtrico, basado en la condensacin de la antrona con derivados del furfural que se forman, cuando los glcidos (y entre ellos tambin los polisacridos sin hidrlisis previa) son calentados en soluciones cidas.

IV.- PROCEDIMIENTO A:Sacrificio del animal y toma del hgado

Usar alcohol etlico para la anestesia ligera del animal y luego decapitado segn el procedimiento conocido. Dejar desangrar al animal

Colocar al animal sobre hielo

Abrir el abdomen y extraer el hgado. Colocado en hielo inmediatamente

B): AISLAMIENTO DEL GLUCGENO

Cortar el hgado en trozos pequeos

Pesar 10 gramos

Aadir 10 mL de ATC al 10 %

Homogenizar

Centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos

Sobrenadante (Sales, metabolitos intemediarios, glucgeno)

Sedimento (protenas, acidos nucleicos desnaturalizados, lpidos)

Agregar 10 mL de alcohol etlico y mezclar

Dejar en reposo 10 minutos

Centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos

Sobrenadante

Sedimento(glucgeno)

C) Determinacin de la pureza del glucgeno por la reaccin de Antrona Se pesa el glucgeno desecado

Disolver el glucgeno. (9mg de glucgeno por ml de tampn fosfato 0.02M pH 7.0) Preparar una dilucin 1/50 del glucgeno (0.1ml en 5ml de agua)

Se preparan tres tubos de ensayo como se describe en la tabla: Componentes Solucin de glucgeno (sol. 1/50) Sol. Patrn de glucosa 9mg/ml Solucin de Antrona El reactivo de Antrona agregar Lentamente y sin agitacin
Llevar a un

1 0.1 0.0 2.0

2 0.0 0.1 2.0

3 0.0 0.0 2.0

Bao con agua hirviendo

Durante

5min . Leer la absorbancia a 620nm.

Dejar enfriar Calcular el porcentaje de pureza con la siguiente formula:

Expresar los resultados en gramos de hgado RESULTADOS Se obtuvo los pesos Hgado de pollo completo: 59,156g Porcin de hgado: 10.068g Tubos de ensayo

Tubo 1: Sol. de glucgeno, Tubo2: Sol. Patrn de glucosa 9mg/ml, Tubo3: Blanco

Tubos de ensayo con los reactivos despus del bao con agua caliente

Absorbancia a 620nm Tubo N Tubo 1: Sol. de glucgeno (1/50) Tubo2: Sol. Patrn de glucosa 9mg/ml Tubo3: Blanco Absorbancia 0.580 1.166 0.199 Absorbancia real 0.381 0.967 0

Peso Seco de glucgeno = 5mg 5mg X X=1.97mg 100% 39.4%

1.97mg X2

10.068g 1g

X2= 0.1957 mg/g tejido

CONCLUSIONES Ser extrajo glucgeno del hgado de rata Se identific el glucgeno: pues este precipita por estar en esa situacin. El glucgeno obtenido corresponde a un 39,4% el rendimiento es igual a 0,1957 mg/g tejido

DISCUSIONES Determinacin de la pureza del glucgeno por la reaccin de Antrona Para determinar la pureza del glucgeno se utilizo la Antrona, en el tubo nmero 1 se coloco la solucin de glucgeno con la antrona en acido sulfrico aqu ocurre una serie de reacciones de deshidratacin debido al poder deshidratante del acido sulfrico, entonces el glucgeno es hidrolizado hasta sus monosacridos que son deshidratados hasta el hidroximetilfurfural que reacciona con la antrona producindose un compuesto coloreado (verde) que se visualizo mejor en el tubo numero 2 que contena nuestro patrn de glucosa. El tubo numero 1 no tenia el color verde del tubo numero 2 y al llevarlo al espectrofotmetro arrojo una absorbancia mucho menor de 0.381 respecto al del patrn 0.967 lo que indica que la concentracin de glucgeno en el hgado de pollo analizado es baja. Se presenta entonces varios factores que influyen en estos resultados como tener refrigerado el hgado inmediatamente al extraerse del animal, realizar un buen homogenizado, lisiar las clulas que contienen el glucgeno almacenado en las vacuolas, tambin puede ser un indicativo que el animal no haya sido alimentado. Se debe tener en cuenta que hay hormonas como la adrenalina que influye en la transformacin del glucgeno a glucosa (glucogenlisis) la adrenalina incrementa la produccin de glucosa a partir del glucgeno influenciado por estress del animal que se refleja en los resultados 0.1957 mg de glucgeno en 1g de hgado de pollo.

Glucgeno

AISLAMIENTO DEL GLUCGENO El aislamiento del glucgeno exige utilizar un animal bien alimentado, en caso contrario, si este se encuentra en ayunas, la glucosa almacenada en el hgado en forma de glucgeno, tendra que utilizarse; por tanto el glucgeno que se obtendra seria en poca cantidad. Segn lo realizado en la prctica, esto pudo haber sido un factor a tomar en la obtencin del glucgeno, pues lo que se obtuvo fue mnimo. En cuanto a los reactivos utilizados para la separacin de glucgeno, se us ATC al 10 % y al centrifugar, nos permiti separar en primera instancia a las protenas, lpidos, cidos nucleicos desnaturalizados, todas estas estaran en el residuo, mientras que en el sobrenadante encontraramos metabolitos intermediarios, sales y glucgeno. Para poder purificar mas al glucgeno se le agreg alcohol etlico, esto se agreg pues el glucgeno es insoluble en mezclas hidroalcohlicas, de lo cual se obtuvo una turbidez blanca, debida al glucgeno. Y al centrifugarlo, se observ un sedimento, el cual correspondera al glucgeno.

CUESTIONARIO

1.- Cul es el fundamento de la extraccin de glucgeno que se emple en la prctica?

La homogenizacin del hgado de rata en cido tricloroactico (TCA) se precipita muchos compuestos de alta masa molecular, como son las protenas y los cidos nucleicos, mientras que el glucgeno permanece en la solucin, a 10 g de hgado se aadieron 10 mL TCA al 10%, se centrifugo a 3000 rpm 20 min. El glucgeno puede separarse de los monosacridos contaminantes y de otros compuestos solubles en agua, precipitndolos con alcohol etlico. Este mtodo se fundamenta en la centrifugacin diferencial y las reacciones especficas de glucgeno.

2.- Cul es la importancia fisiolgica del glucgeno? La importancia fisiolgica del glucgeno es de mantener la homeostasis. En el organismo el glucgeno es la reserva de carbohidratos que se utiliza en caso de necesidad de glucosa. El almacenamiento de glucosa como tal no es posible porque las concentraciones elevadas tornaran fuertemente hipertnico el interior de la clula y ocasionaran la entrada de agua. Por el contrario el glucgeno es insoluble y carece de actividad osmtica. Para cumplir su funcin biolgica, el polmero de glucgeno debe almacenar la mayor cantidad de glucosa en el menor volumen posible y el nmero de extremos no reductores (para maximizar la velocidad a la que se pueden movilizar los residuos glucosa). Adems la funcin del glucgeno en el hgado es vital para la vida, ya que garantiza que la glucosa llegue correctamente al cerebro y a los glbulos rojos que dependen casi por completo de la glucosa como fuente de energa. Bajo condiciones de ayuno, las necesidades de glucosa de la mayor parte del cuerpo se satisfacen mediante la gluconeogenesis La importancia del glucgeno como depsito de glucosa se ilustra sencillamente por los efectos de las deficiencias de las enzimas que liberan glucosa almacenada. La enfermedad de McArdle, por ejemplo, es una afeccin hereditaria cuyo sntoma principal son calambres musculares dolorosos ante esfuerzos. Los msculos en los individuos afectados carecen de la enzima requerida para la descomposicin del glucgeno para producir glucosa. Aunque el glucgeno se sintetiza normalmente, no puede abastecer el combustible para que la glucolisis se mantenga con la demanda de ATP

10

3.-Cuntos mg. de glucgeno puro se obtiene despus de la extraccin, si se cuantific mediante la reaccin de antrona y se obtuvieron los siguientes resultados. Tabla 2. Absorbancia a 620 nm. Glucosa Glucgeno 1,420 0,527

Considerar: se obtuvo 25mg. del precipitado a partir de 4,54g. de hgado utilizado como muestra que se trabaj. Solucin: a) Hallamos el porcentaje de glucgeno obtenido: % de glucgeno= A620nm glucgeno x 100 = 0.527 x 100 = 37.1% A620nm glucosa b) hallamos el rendimiento de glucgeno: Glucgeno puro (mg) = mg precipitado x %glucgeno = 9,257mg. 100 mg. c) Hallamos el rendimiento de glucgeno en la muestra de hgado: Rendimiento = mg. de glucgeno puro = 2,04 mg. glucgeno puro/g hgado g. de muestra de hgado 1,420

4.- Qu explicacin le dara si despus del procedimiento de extraccin llega a obtener un precipitado de 5mg y despus de la cuantificacin con el reactivo de antrona, no se llega a obtener diferencia entre la absorbancia del blanco (agua) y su muestra problema. Si se obtendra poco precipitado, en este caso glucgeno, esto podra deberse a que el animal al cual se le extrajo su hgado a estado en ayunas por un tiempo de 12 a 14 horas, que es el tiempo en el que el organismo utiliza al glucgeno presente en el hgado para producir glucosa, cuando este no lo obtiene de la alimentacin. Si al momento de cuantificar, tanto el blanco y la muestra problema presentaran la misma absorbancia esto podra deberse a que en la muestra que se aisl, no solo hay glucgeno sino que pueden haber tambin otros compuestos en pequeas cantidades, que pudieron no haber sido extrada en los ensayos anteriormente realizados, y que la cantidad de glucgeno en la muestra sea an menor, por tanto al agregarle antrona no haya ocurrido la reaccin esperada o esta puede ser mnima, que no puede ser detectada por el espectrofotmetro, por ello es que puede indicar la misma absorbancia.

11

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Bioqumica: textos y atlas 3ra Edicin Jan Koolman,Klaus-Heinrich Rhm pg. 156 Disponible en: http://books.google.com.pe/books?id=f61Mvdvl60C&pg=PA156&dq=glucogeno&hl=es&sa=X&ei=cou8UauQOMLE0gH0noDgCw &ved=0CDoQ6AEwAg#v=onepage&q=glucogeno&f=false Fundamentos de Bioqumica la vida a nivel molecular 2da edicin Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt pg. 473-488 Disponible en: http://books.google.com.pe/books?id=FXDiqLK6GmAC&pg=PA487&dq=glucogeno& hl=es&sa=X&ei=cou8UauQOMLE0gH0noDgCw&ved=0CCwQ6AEwAA#v=onepage &q=glucogeno&f=false Qumica de Alimentos: Manual de laboratorio 1era edicin Nuria Bolaos V., Giselle Lutz C., Carlos H. Herrera R. pg. 13-14 Disponible en: http://books.google.com.pe/books?id=8VpJ8foyDiIC&pg=PA14&dq=antrona&hl=es&s a=X&ei=q1uUeGeNbWr4AOT9YHIBQ&ved=0CC4Q6AEwAA#v=onepage&q=antrona&f=false

12