UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL FRANCISCO DE MIRANDA REA DE TECNOLOGA PROGRAMA CIENCIAS AMBIENTALES

USO

DEL

HONGO

LIGNOLTICO

ASPERGILLUS

niger

EN

LA

BIODEGRADACIN DE HIDROCARBUROS AROMTICOS POLICCLICOS TOTALES EN MUESTRAS DE AGUA DE LA BAHA DE AMUAY. CASO: C.R.P AMUAY PENNSULA DE PARAGUAN ESTADO FALCN

Autor (a): T.S.U. Depool Chirinos, Belkys B. CI: 9.503619 Tutor: Lcdo. Jos Araujo. Asesor: Lcdo. Jos Francisco Yegres.

Santa Ana de Coro, Octubre de 2010.

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL FRANCISCO DE MIRANDA REA DE TECNOLOGA PROGRAMA CIENCIAS AMBIENTALES

USO

DEL

HONGO

LIGNOLTICO

ASPERGILLUS

niger

EN

LA

BIODEGRADACIN DE HIDROCARBUROS AROMTICOS POLICCLICOS TOTALES EN MUESTRAS DE AGUA DE LA BAHA DE AMUAY. CASO: C.R.P AMUAY PENNSULA DE PARAGUAN ESTADO FALCN

Trabajo Especial de Grado presentado como requisito para optar al Ttulo de Licenciada en Ciencias Ambientales

Autor (a): T.S.U. Depool Chirinos, Belkys B. CI: 9.503619 Tutor: Lcdo. Jos Araujo. Asesor: Lcdo. Jos Francisco Yegres.

Santa Ana de Coro, Octubre de 2010.

Agradecimientos

A Dios por darme la fe y la fuerza de seguir en esta vida.

Dedico especialmente esta tesis a mis hijas: Gabriela, Isabella y Giovanna, porque sus vidas son la razn de la ma, sus alegras son mi alegra y su amor es el motivo de superacin como madre, amiga y ser humano. LAS AMO.

A mis hermanos por el gran amor que les tengo. GRACIAS SU CARIO.

POR

A mi esposo Gracias por su apoyo al logro de esta meta.

A la Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda. Programa de Ciencias Ambientales, por brindarme la oportunidad de incrementar mi nivel profesional.

Al Licenciado Jos Araujo, por la gran dedicacin y paciencia para la orientacin y revisin del presente trabajo, dndome su apoyo como tutor y amigo.

A todas aquellas personas que me apoyaron en el desarrollo de esta tesis experimental: Dr. Ricardo Bitter, Dr. Ivn Leal, Dr. Jos Francisco Yegres, M.S.C. Isabel Olivares, Ing. Qumico Vctor Lpez.

A los tcnicos superiores, en la ejecucin de los anlisis: Ral Chavier, Yajaira Acosta, Manuel Molina, Linda Rebeca Jaimes, Maryhud Blanco y a todas aquellas personas que colaboraron para la realizacin de esta tesis y que involuntariamente fueron omitidas.

A mis amigos Arianny, Yarubi, Carlos, Terecris, Judith.

A todos con infinito amor ternura y esperanza.

NDICE GENERAL Pg. Agradecimiento. ndice General Lista de Tablas Lista de Figuras Resumen..... Abstract. INTRODUCCIN... CAPTULOS I. El PROBLEMA... 1.1. Planteamiento del Problema 1.2. Objetivos 2.1. General.. 2.2. Especficos 1.3. Justificacin. 1.4. Delimitacin II. MARCO TERICO 2.1. Antecedentes.. 2.2. Bases Tericas 2.1. Aspergillus 2.2. Hongos Ligninolticos y Compuestos Xenobiticos. 2.3. Enzimas Lignolticas de Hongos.. 2.4. Microorganismos Lignoliticos 2.5. La Lignina. 2.5.1. Aplicabilidad 2.5.2. Estructura de la Lignina.. 23 24 27 29 30 32 33 33 34 16 19 19 19 19 22 iv vi x xi xii xiii 14

2.5.3. Biodegradacin de la Lignina 2.6. Hidrocarburos. 2.6.1. Contaminacin del Agua por Hidrocarburos.. 2.6.2. Hidrocarburos Aromticos Policclicos (HAPs)... 2.6.3. Biodegradacin de Hidrocarburos 2.6.4. Caractersticas en el Ambiente de los HPAs.. 2.7. Antraceno.. 2.8. Biorremediacin y Biodegradacin 2.8.1. Papel que Desempean los Microorganismos.. 2.9. Principales Caractersticas de los Mtodos Biorremediacin... 2.9.1. Adicin de Nutrientes. 2.9.2. Inoculacin.. 2.10. Carbohidratos III. MARCO METODOLGICO 3.1. Diseo de Investigacin.. 3.2. Variables 3.2.1. Variable independiente. 3.2.2. Variable dependiente 3.3. Zona de Estudio 3.3.1. Toma de Muestra 3.4. Obtencin del Hongo Aspergillus niger 3.4.1. Medios de Cultivo.. 3.4.2. Medios Sabouraud (slido).. 3.4.3. Medio de Cultivo Czapek (lquido).. 3.5. Preparacin y Conservacin del Inculo. 3.5.1. Conteo de Esporas. 3.5.2. Condiciones de Incubacin.. 3.6. Anlisis por Microscopa.

35 36 36 37 38 39 40 40 44 45 45 45 47

49 49 49 49 50 51 54 54 54 55 55 56 56 57

3.7. Anlisis de Muestra. 3.8. Estudio Macroscpico de las Muestras 3.9. Medicin de Biomasa por el Mtodo Gravimtrico. 3.10. Clculo de la Constante de Crecimiento.. 3.11. Determinacin de HPAs. 3.11.1. Mtodo Qumico. 3.11.2. Caracterizacin Fsico-Qumica.. 3.11.3. Extraccin Lquido- Lquido. 3.11.4.Determinacin de los HPAs por Espectrofotometra U.V 3.11.5. Determinacin UV-Vis GENESYS 10 Vis.. 3.11.6.Clculos de Curva. 3.11.7. Medicin en el Espectrofotmetro.. 3.12. Anlisis Estadstico de los Resultados. CAPITULO IV.RESULTADOS 4.1. Estudio Macroscpico del hongo medio Sabouraud... 4.2. Anlisis Microscpico.. 4.3. Crecimiento en medio Czapek con carbohidratos. 4.4. Curva de crecimiento de los HPAs 4.5. Cuantificacin de la biomasa.. 4.6. Curva de calibracin de Antraceno 4.7. Cuantificacin de los HPAs 4.8. Crecimiento de Biomasa y Consumo del Sustrato. CAPITULO V. DISCUSIN CONCLUSIONES.

57 57 58 58 59 59 59 59 60 60 60 60 61

62 63 63 64 65 71 71 74

80

RECOMENDACIONES REFERENCIAS. GLOSARIO. ANEXOS.

81 82 97 99

LISTAS DE TABLAS
Pg.

1. Caractersticas de los grupos/secciones de Aspergillus... 2. Compuestos xenobiticos degradados por cultivos de hongos de la podredumbre blanca 3. Organismos productoras de enzimas ligninolticas 4. Principales microorganismos degradadores de petrleo. 5. Ventajas y desventajas de la biorremediacin.. 6. Factores que afectan la biodegradacin del petrleo 7. Sistema de variables. 8. Ubicacin de las Estaciones donde se tomaron las diversas muestras (Coordenadas UTM)... 9. Composicin del medio para los estudios de cultivo lquido 10. Promedio de biomasa (Aspergillus niger).. 11. Comparacin de medias de biomasa de A. niger. 12. Anlisis de varianza semana 1,2, y 3. 13. Prueba de Tukey para la semana 1. 14. Prueba de Tukey para la semana 2. 15. Prueba de Tukey para la semana 3. 16. Concentracin de los HPAs en las muestras de agua antes de l inoculo... 17. Anlisis de Varianza para la Concentracin HPAs (mg/l) A-N en agua contaminada + Czapek. 18. Medias y Desviaciones tpica para ambos extractos de la Concentracin HPAs (mg/l) A-N en agua contaminada + Czapek 19. Valores Promedios de constante de crecimiento (k)

28 30

31 42 43 46 50 51

55 66 67 68 69 70 70 72

73

73

74

LISTA DE FIGURAS Pg. 1. Deslignificacin por hongos de pudricin blanca. 2. Estructura parcial de la lignina 3. Estructura de los HAPs 4. Estructura del Antraceno 5. Estructura molecular de la glucosa.. 6. Estructura molecular de la Sacarosa. 7. Ubicacin geogrfica Baha de Amuay- Paraguan... 8. Ubicacin geogrfica del muestreo en la baha de AmuayParaguan (Detalle del mapa 3 Km). 9. Ubicacin geogrfica del muestreo en la baha de AmuayParaguan (Detalle del mapa 700 m) 10. Esquema de metodologa empleada 11. Crecimiento Macroscpico A. niger. 12. Crecimiento en menor proporcin 13. A. niger (Czapek+G) y Czapek+S). 14. A. niger en medio Czapek libre de carbono ((Czapek-C) 15. A. niger en medio Czapek en agua contaminada Baha de Amuay (Czapek+H) y agua de la baha de Amuay (solamente) 16. Curva de Calibracin de Antraceno..... 17. Curva de biodegradacin de los extractos HPAs A. niger en agua contaminada + medio Czapek y en agua contaminada sola 18. Crecimiento de biomasa y consumo 75 72 65 71 52 53 62 62 63 64 52 34 35 37 40 47 48 51

RESUMEN

Depool, B. 2010. USO DEL HONGO LIGNOLTICO ASPERGILLUS niger EN LA BIODEGRADACIN DE HIDROCARBUROS AROMTICOS POLICCLICICOS TOTALES EN MUESTRAS DE AGUA DE LA BAHA DE AMUAY. CASO: C.R.P AMUAY PENINSULA DE PARAGUANA ESTADO FALCN. Trabajo Especial de Grado. rea de Tecnologa. Programa de Ciencias Ambientales. Santa Ana de Coro, Estado Falcn, Venezuela.102.p

La Biorremediacin es una de las tecnologas elegidas para remediar los ambientes afectados por las actividades antropognicas, particularmente en agua expuesto a hidrocarburos. Existen diversos mecanismos que permiten a los microorganismos eliminar los Hidrocarburos Aromticos Policclicicos (HPAs) y uno de los principales es la biodegradacin por medio de enzimas producidas por los microorganismos. El diseo de esta investigacin corresponde a la modalidad descriptiva - experimental y un muestreo aleatorio, donde se plantea el uso de una cepa fngica de Aspergillus niger en la biodegradacin de los HPAs en muestras de agua de la Baha de Amuay estado Falcn. El inoculo fue ajustado a 1,5 x106 esporas/ mL Se inoculo por triplicado 0,5 mL de la cepa Aspergillus niger en tubos de

ensayos en medio mineral lquido (MCD) con las diferentes fuentes de carbono, a un pH de 5,5 y 30 C. Como control se ut ilizaron glucosa

(Czapek+G), sacarosa (Czapek+S). El mtodo aplicado mostr que a partir de inculos previamente desarrollados y caracterizados segn el estudio

macroscpico y microscpico de las muestras inoculadas con diferentes fuentes de carbono, se logr una disminucin de los HAPs en (85%) en un perodo de tres semanas, cuantificando la biomasa por el mtodo gravimtrico frente a la degradacin de los hidrocarburos la cual se determin por espectrofotometra ultravioleta visible. Palabras clave: Biomasa, Biorremediacin, HPAs, Hongos lignoliticos.

ABSTRACT

Depool, B. 2010. USE LIGNOLYTIC FUNGUS ASPERGILLUS niger IN AROMATIC HYDROCARBONS BIODEGRADATION POLYCYCLIC TOTAL IN WATER SAMPLES Amuay BAY. EVENT: CRP AMUAY PARAGUAN PENINSULA OF FALCON STATE. Special Degree work. Technology rea. Environmental Sciences Program. Santa Ana de Coro, Falcn State, Venezuela.102. p

Bioremediation is one of the technologies chosen to remedy the communities affected by human activities, particularly in water exposed to hydrocarbons. There are several mechanisms that allow microorganisms to remove Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) and is a major biodegradation by enzymes produced by microorganisms. The design of this research corresponds to the descriptive method - experimental and random sampling, where the issue is the use of a fungal strain of Aspergillus niger in the biodegradation of PAHs in water samples Amuay Bay Falcn state. The inoculum was adjusted to 1.5 x 106 spores / mL was inoculated in triplicate 0.5 mL of the strain Aspergillus niger in test tubes in liquid mineral medium (MCD) with different carbon sources at a pH of 5.5 and 30 C. Glucose were used as control (Czapek + G), sucrose (Czapek + S). The applied method showed that inocula from previously developed and characterized by macroscopic and microscopic study of samples with different carbon sources, achieved a reduction of PAHs (85%) over a period of three weeks, quantifying biomass by the gravimetric method to the degradation of hydrocarbons which was determined by UV visible spectrophotometry. Keywords: biomass, bioremediation, PAHs, Mushrooms lignolytic.

INTRODUCCIN

En el mundo constantemente estn sucediendo acontecimientos de impacto negativo sobre el ambiente, por lo consiguiente, la biorremediacin surge como una rama de la biotecnologa que busca resolver los problemas de contaminacin mediante el uso de seres vivos (microorganismos, plantas y/o enzimas) capaces de degradar compuestos que provocan desequilibrio en el ambiente, ya sea suelo, sedimento, fango o mar (Eweiss et al., 1999).

Generalmente se emplean mezclas de ciertos microorganismos o plantas capaces de degradar o acumular sustancias contaminantes utilizando los microorganismos tales como bacterias y hongos que puedan degradar con facilidad una gran variedad de compuestos como el petrleo y sus derivados (pireno, fluoreno, benceno, tolueno, acetona, etc.) (Conesa et al., 2000). Por esta razn se utilizan hongos lignoliticos como parte de la biorremediacin microbiana, los cuales son uno de los principales responsables en reciclar el carbn contenido en la lignina (Moore y Jung. 2001).

La pared celular de los tejidos vegetales est conformada principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina; estos componentes son atacados por hongos que poseen la capacidad enzimtica para degradarlos; dependiendo de cmo se realice el ataque se distinguen dos grupos fngicos: los que ocasionan la podredumbre parda (degradacin de celulosa y hemicelulosa) y los que ocasionan la podredumbre blanca (degradacin de lignina) (Mkel et al., 2002).

Se ha demostrado que los sistemas enzimticos de los hongos ligninolticos son capaces de oxidar una gran variedad de compuestos xenobiticos contaminantes, como son los plaguicidas, bifenilos policlorados,

explosivos, hidrocarburos aromticos policclicos, colorantes industriales y otros compuestos de preocupacin ambiental adems de que son los principales responsables en reciclar el carbn contenido en la lignina (Dvila y Vzquez, 2006).

Por otro lado, se requiere tener la capacidad tecnolgica para restaurar los sitios daados ambientalmente, actualmente la biotecnologa tiene un papel importante que desempear en esta transformacin tecnolgica enfocada en la utilizacin de nuevas herramientas biotecnolgicas para la prevencin, control y remediacin de las contaminaciones ambientales (Dvila y Vzquez, 2006).

Como una contribucin al estudio del potencial biodegradador de los hongos lignoliticos, se plantea la utilizacin del Aspergillus niger; en la biodegradacin de HPAs en aguas de la Baha de Amuay estado Falcn como parte de la biorremediacin microbiana como una alternativa saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del ambiente por contaminantes derivados del petrleo crudo o procesado; como es el caso de los hidrocarburos aromticos policclicos, ya que esta problemtica genera una amenaza real a la salud pblica, as como la extincin de gran cantidad de especies vegetales y animales.

CAPITULO I EL PROBLEMA

1.1.

Planteamiento del Problema

Los Hidrocarburos Aromticos Policclico (HPAs), son constantemente liberados al ambiente principalmente a partir de las actividades

antropognicas, siendo la mayor fuente de liberacin, los procesos de quema de combustible fsiles, la licuefaccin del carbn, la gasificacin del petrleo y los derrames accidentales de petrleo. Cuando ocurre un derrame de

petrleo en el ambiente, los compuestos de bajo peso molecular generalmente se pierden por volatilizacin, mientras que los Hidrocarburos Aromticos Policclico permanecen como remanente, hacindose de esta manera persistente en el ambiente, constituyendo un grave problema porque contaminan fuentes de agua y suelos, ocasionando un gran impacto ecolgico, en virtud de los efectos recalcitrantes y txicos que ejercen sobre los seres vivos (Tissot y Welte, 1984). Es por ello que estos hidrocarburos deben ser removidos o su concentracin debe ser sustancialmente reducida del ambiente. Con este propsito, frecuentemente son utilizados procesos de degradacin industrial tanto qumicos como fsicos, que pese haber demostrado su potencial para la recuperacin de cientos de lugares contaminados, resultan relativamente inadecuados para la remocin de hidrocarburos complejos y adems el costo de su aplicacin resulta elevado (Parales et al., 2001).

Esta investigacin busca proveer diferentes expectativas y soluciones con respecto a la recuperacin de ambientes contaminados con petrleo a travs del uso de la biorremediacin como tcnica de descomposicin de

compuestos orgnicos, llevado a cabo por la accin de un determinado grupo de microorganismos, como un eje estratgico ,de inters para la regin Falconiana ya que en esta, se encuentra el Complejo de Refinacin Paraguan el ms Grande de Latinoamrica, que cubre parte de la Baha de Amuay rea de estudio, que corresponde a un puerto petrolero con actividad constante para el transporte del petrleo y sus productos de refinacin.

Estudios sobre el tema muestran que las actividades petroleras de obtencin, transporte, refinado y eliminacin de residuos, arrojan al mar, a nivel mundial 3,2 millones de toneladas de petrleo y sus derivados (Lindstrom et al., 1991); es por ello el inters de estudiar los procesos de biorremediacin de los hidrocarburos, puesto que representan un

contaminante para el medio acutico, los cuales pueden ser biodegradado en la mayora de sus componentes, pero esta degradacin es relativamente lenta.

Para el caso de la Baha de Amuay, se estima que los vertidos que se producen en estos lugares exceden generalmente la capacidad de auto purificacin del ecosistema local. Por otro lado una vez que ocurre un

accidente de derrame, el petrleo que flota en el agua es difcil de contener y de recoger (Exxon Mobil, 2008).

La desaparicin de aves, peces, mariscos, y otros invertebrados, debido a la contaminacin con petrleo parece causar tambin otros efectos de inters sobre la vida marina. Puesto que los componentes aromticos de los hidrocarburos disueltos alteran incluso en concentraciones de algunas partes por billn (ppb) de los mecanismos de quimiorrecepcin de algunos organismos marinos y como es de saber la quimiorrecepcin es fundamental en la bsqueda de alimento y en la reproduccin de diversos grupos de especies de los ecosistemas acuticos (Atlas y Bartha, 1997).

La zona est restringida por la Guardia Nacional como zona aledaa a Petrleo de Venezuela Sociedad Annima (PDVSA) sin embargo es evidente la contaminacin por hidrocarburo en sus orillas, por lo que se propone la bsqueda de soluciones viables con la aplicacin de tecnologas factibles de biorremediacin a escala de laboratorio que posteriormente puedan ser reproducidas y escaladas en dichos espacios contaminados con

hidrocarburos para la mitigacin de los espacios y la disminucin de los pasivos ambientales.

Tomando en cuenta que la actividad petrolera es de gran influencia en el pas y dado a que esta genera productos altamente contaminantes; tales como los Hidrocarburos Aromticos Policclicicos, se han desarrollado tecnologas de biorremediacin ex situ, ya que son productos de amplio uso y por lo tanto presentan una alta probabilidad de ser dispuestos en aguas, suelos y causar daos severos en los ecosistemas (Naranjo et. al., 2007).

Hoy da, se conocen sistemas enzimticos de los hongos ligninoltico que logran degradar de forma total o parcial diferentes hidrocarburos, entre ellos, los Hidrocarburos Aromticos Policclicos, adems de que son los principales responsables en reciclar el carbn contenido en la lignina, y que logran subsistir en casi todos los medios, teniendo en cuenta su capacidad adaptativa (Dvila y Vzquez, 2006).

Se sugiere biodegradar los hidrocarburos aromticos policclicos a travs de tcnicas de biodegradacin utilizando a una cepa de Aspergillus niger presente en la podredumbre la podredumbre blanca ya que tambin degrada derivados del petrleo anlogo de la lignina.

1.1. Objetivos

1.1.1. Objetivo General

Evaluar el uso de Aspergillus niger en la biodegradacin de Hidrocarburos Aromticos Policclicos.

1.1.2. Objetivos Especficos

Determinar las caractersticas macroscpicas y microscpicas de una cepa Aspergillus niger Verificar el crecimiento de una cepa Aspergillus niger con los carbohidratos glucosa y sacarosa Evaluar el crecimiento de una cepa Aspergillus niger en una muestra que contenga Hidrocarburos Aromticos Policclicos totales de (HPAs).

Determinar la concentracin total de Hidrocarburos Aromticos Policclicos (HPAs) presentes en muestras de agua de la Baha de Amuay estado Falcn

Utilizar ensayos de biodegradacin mediante el aumento de la Biomasa y disminucin de la concentracin de Hidrocarburos Aromticos Policclicos (HPAs).

1.2.

Justificacin.

En virtud de la necesidad que ha existido en las ltimas dcadas para mitigar los efectos contaminantes de diferentes ndoles antropognicas en pro del ambiente se han realizado diferentes metodologas, y es por ello que

la biorremediacin es una actividad de gran importancia debido a la capacidad descomponedora y transformadora de los microorganismos sobre la materia, estos se pueden aprovechar para la eliminacin de residuos producidos por diferentes actividades humanas.

El manejo inadecuado de los materiales y residuos peligrosos ha generado a escala mundial un problema de contaminacin de suelos, aire y agua (Benavides et al., 2006). Entre las ms severas contaminaciones se producen a causa de la extraccin y el manejo del petrleo (Fernndez et. al., 2008). Por tanto, la referente investigacin se realiza con la primicia fundamental de corregir el efecto de las actividades petroleras sobre agua en la Baha de Amuay estado Falcn, utilizando Aspergillus niger como agente de biorremediacin ambiental factible en sitios contaminados por HPAs, donde su estabilidad qumica y su disponibilidad son un problema en la recuperacin de recursos naturales impactados con compuestos derivados del petrleo.

Estudios han demostrado que los hongos son ms eficientes en la degradacin de hidrocarburos que las bacterias en ciertas condiciones ambientales y para los compuestos ms recalcitrantes, es por ello que Aspergillus niger se ha divulgado para ser activo degradador de petrleo (Fedorak et al., 1984; Amanchukwu et al., 1989; Ogbonna, 1982) siendo estos capaces de degradar el petrleo crudo ms efectivamente que las bacterias (Adekunle et al., 2004).

La Baha de Amuay est en proceso de estudio sobre biorremediacin y los mismos manifiestan que es de inters propiciar la mitigacin de la contaminacin por hidrocarburos, esta contaminacin es estudiada por la empresa PDVSA y por el Ministerio de Energa y Minas. Dada la capacidad

descomponedora y transformadora de los microorganismos sobre la materia, estos se pueden aprovechar para la eliminacin de residuos producidos en distintas actividades humanas, muchos de ellos con enorme poder contaminante, contribuyendo a la conservacin del ambiente natural.

En virtud de mejorar los pasivos ambientales generados por la extraccin de crudos, como es el caso de los hidrocarburos, la mayora de las grandes empresas petroleras han manifestado la necesidad de enfrentar estos impactos ambientales mediante el establecimiento de Sistemas de Gestin Ambiental (SGA) certificables, como parte de su estructura organizacional (Galvn y Reyes, 2007).

El artculo 50 del decreto 2.635, del control de desechos peligrosos, de gaceta extraordinaria N 5245 ao 1998, considera necesario establecer

mecanismos que orienten la gestin de la generacin, manejo y depsito o tratamiento de desechos peligrosos hacia la reduccin de la misma, el fomento del reciclaje, rehso y aprovechamiento bajo la forma de materiales peligrosos recuperables y el tratamiento y disposicin final, cumpliendo con las medidas de seguridad para que no constituyan una amenaza a la salud humana ni al ambiente.

Esta investigacin tendr pertinencia en instituciones como

la

Fundacin Instituto de Estudios Avanzados (IDEA); Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda (UNEFM) tanto en lo cientfico, social cultural, Petrleos de Venezuela Compaa Annima (PDVSA) como la principal industria de produccin petrolera en el pas; el Ministerio del Poder Popular para el Ambiente (MPPA) como ente protector y ejecutor de leyes ambientales en beneficio de la comunidad en general, la cual tiene participacin protagnica; contribuyendo a minimizar los daos ambientales

que se produzcan, principalmente de los provenidos de la explotacin petrolera cercana a costas y suelos venezolanos.

1.3.

Delimitacin.

La presenta investigacin corresponde a un trabajo tipo piloto el cual se realiz en un perodo de tres meses. La biodegradacin se limit a muestras de agua de la Baha de Amuay estado Falcn, utilizando un solo tipo de hongo (Aspergillus niger) y se evalu la relacin entre su crecimiento y la degradacin con un mtodo factible y econmico.

El presente proyecto de investigacin estuvo enmarcado dentro de los lineamientos exigidos por la Direccin del Programa de Ciencias Ambientales del rea de Tecnologa de la UNEFM, Normas para la Presentacin Escrita de los Trabajos Especiales de Grado, de fecha diez de Enero de 2010,

teniendo para la realizacin y presentacin del presente, contando con un tiempo estipulado en el periodo comprendido entre Junio-Octubre 2010, llevado a cabo la fase experimental en los laboratorios Unidad de Microscopa Electrnica (UME), Laboratorio de Investigacin y Apoyo Docente (LIADSA), Centro de Investigaciones en Ecologa y Zonas ridas (Cieza), Laboratorio de anlisis qumicos (LAQ) de la Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda.

CAPITULO II

MARCO TERICO
2.1. Antecedentes de la Investigacin

Es significativo resear estudios realizados sobre la degradacin de contaminantes generados por la industria petrolera, con aplicacin de tcnicas de biorremediacin utilizando microorganismos (hongos, bacterias, enzimas) con capacidades degradadoras, con el fin de lograr la mineralizacin de los contaminantes o bien convertirlos en compuestos menos txicos.

En

el

ao

1990,

aproximadamente,

se

inicia

una

lnea

completamente nueva en el rea de la aplicacin de los hongos de podredumbre blanca en la degradacin de Hidrocarburos Aromticos Policclicos mediante sistema in vitro y en la produccin de las peroxidasas extracelulares responsables de iniciar el ataque oxidativo de estos compuestos (Field et al., 1992).

Los primeros trabajos en el tema consistieron en la seleccin y optimizacin de hongos de podredumbre blanca capaces de degradar HPAs, alcanzndose altos porcentajes (hasta un 90%) de degradacin de diversos HPAs (antraceno, pireno y benzo[a]pireno). En paralelo se efectuaron

estudios sobre la produccin de las peroxidasas extracelulares responsables de iniciar el proceso oxidativo responsable de la degradacin de diferentes tipos de compuestos orgnicos altamente contaminantes: HAPs, pesticidas, dioxinas, colorantes industriales, etc.

La produccin en continuo de estas enzimas permiti, adems, poder utilizarlas en un sistema de tratamiento in vitro en reactores de membrana. Se ha aplicado con xito a la decoloracin de colorantes tipo

azoantraquinonas y ftalocianinas (degradaciones de hasta el 95% en una hora de tratamiento) en medios acuosos y en presencia de disolventes orgnicos (para aumentar la biodisponibilidad de los HAP) (Field et al., 1992).

comienzos

de

los

aos

90,

en

Venezuela,

importantes

investigaciones han sido dirigidas al estudio de los microorganismos y sus actividades, con el propsito de ampliar su versatilidad metablica para la degradacin de contaminantes especficos principalmente los provenientes de las actividades petroleras. En tal sentido, se han desarrollado tecnologas fundamentadas en los procesos biolgicos como alternativas viables en la eliminacin parcial o total de diferentes compuestos orgnicos (Araujo, 2002).

Estos procesos utilizan principalmente (bacterias, hongos) que se encuentran en el mismo ambiente que se pretenda remediar, adems se adicionan los macro y micro nutrientes necesarios para el mantenimiento de las cepas. La etapa de seleccin de las cepas es muy importante, ya que cuanto ms especfica sea su capacidad degradadoras ante los distintos tipos de desechos, mayor ser la capacidad de digerirlo y menor ser el tiempo de permanencia en el ambiente (Araujo, 2002).

Los

hongos

que

tienen

sistemas

ligninolticos

pertenecen

principalmente a la clase de los Basidiomycetes y son llamados hongos de la podredumbre blanca, entre los cuales hay especies saprfitas (Steffen et al., 2002; Olvera 2003). Adems, existen Ascomycetes que han sido estudiados en la degradacin de la lignina como Fusarium oxysporum (Valenzuela et al.,

2001), Penicilium sp y sobre todo el gnero Aspergillus (Prado et al., 1993; Cardoso y Costa, 1994; Valenzuela et al., 2001; Ahammed y Prema, 2002) entre ellos, las especies de A. nger (Conesa et al., 1999; Marquez et al., 2007), A. flavus (Betts y Dart, 1989), A. japonicus (Milstein et al.,1983) y A. fumigatus (Kadam y Drew, 1985). Tambin se han registrado hongos levaduriformes con la capacidad de degradar lignina, como Candida sake, Cryptomyces laurentii, Rhodotorula glutinis (Olvera, 2003).

Otros estudios realizados en la utilizacin de hongos lignoliticos para la biorrecuperacion de suelos contaminados por hidrocarburos, se

encuentran las investigaciones de Martn, en el 2004; en la cual el autor plantean que los hongos basidiomicetos ligninolticos producen un conjunto de enzimas extracelulares para metabolizar la lignina que les confieren, asimismo, la capacidad de degradar diversos contaminantes.

Posteriormente se encuentran estudios similares pertenecientes a los investigadores Dvila y Vzquez en el 2006, donde los autores realizan un anlisis de la informacin existente sobre la capacidad de estas enzimas en la degradacin de compuestos contaminantes con especial nfasis en los HPAs, plaguicidas y colorantes de uso industrial; conjuntamente para la misma fecha Quintero; realiza un anlisis sobre la capacidad para producir las enzimas ligninolticas manganeso peroxidasa (MnP) y lignino peroxidasa (LiP) en cultivos de los hongos Bjerkandera adusta y Phanerochaete chrysosporium sobre tres materiales lignocelulsicos: viruta de madera, carozo de maz y compost de jardinera.

Asimismo se han registrado trabajos de investigacin de Araujo en 2006 sobre la recuperacin biolgica de suelos contaminados con

hidrocarburos. La autora plantea la utilizacin de un cultivo mixto de cepas

bacterianas a travs de las tcnicas de compostaje y fertilizacin, utilizando el gasoil como nica fuente de carbono; se compar la eficiencia de un cultivo mixto de cepas bacterianas endgenas, compostaje y fertilizacin, en la degradacin de hidrocarburos.

Estudios llevados a cabo por los investigadores Delgado, Yegres y Proao en el 2006, consideran que los efluentes de la ampliacin de la planta cataltica y tratadora de gasolina, del Centro de Refinacin Paraguan (CRP Cardn) generan altas concentraciones de fenoles que deben ser tratados antes de ser vertidos al mar; y que la existencia de bacterias y hongos en los mismos, poseen habilidad de sobrevivir en este medio; evaluando as la capacidad de biodegradacin de fenol con cada una de las especies.

Por otro lado Zrraga, en el 2009 ha demostrado el potencial degradador del Aspergillus niger sobre el naftaleno, as como estudios

realizados por Zeppefeldt para el mismo ao, evaluaron a hongos como Aspergillus Crysoporium y Rhizopus como agentes de biorremediacin en espacios contaminados por la actividad petrolera.

Siguiendo esta

lnea de investigacin, Benitez en el 2009 han

demostrado el potencial de hongos lignoliticos autctonos para la biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburo.

Del mismo modo Colina en el 2009 trabaj en la evaluacin del potencial biodegradador de hongos aislados de aguas de servicios petroleros sobre antraceno. Igualmente Zrate Arathe para el mismo ao, realizan una propuesta de tratamiento biotecnolgico a nivel de laboratorio a las agua contaminadas con hidrocarburos provenientes de la laguna de Amuay.

Cabe destacar en esta revisin los estudios efectuados por la Fundacin de Estudios Especializados (IDEA) sobre la degradacin de contaminantes generados por la industria petrolera, con la utilizacin de bacterias y hongos como microorganismos con capacidades degradadoras entre los cuales se mencionan para el 2007, un diseo en el aislamiento de hongos de pudricin blanca como potencial para mejorar enzimticamente en el crudo extra pesado en Venezuela realizado por Naranjo. El autor plantea el uso de hongos para degradar HPAs.

Actualmente se trabaja en el diseo y modelizacin de dos tipos de reactores enzimticos con peroxidasas extracelulares para su aplicacin a la eliminacin de compuestos recalcitrantes (HPAs, pesticidas, etc.) como de microcontaminantes (fundamentalmente PPCPs (Lema et al., 2010).

2.2. Bases Tericas

2.1. Aspergillus

Las especies de Aspergillus son modos de crecimiento rpido con muchas hifas ramificadas y a una disposicin caracterstica de conidios en el conidiforo. Aparecen colonias esponjadas en uno a dos das y para el quinto da pueden cubrir toda la placa con su crecimiento pigmentado. Las especies se definen con base en las diferencias de la estructura del conidiforo y las disposicin de los conidios, tales como el color, la forma y textura de las esporas, lo que han permitido agruparlos en secciones o grupos como se indica en la Tabla 1 (Carrillo, 2003).

Tabla 1. Caractersticas de los grupos/secciones de Aspergillus

Grupo A. clavatus Conidio Verde claro Metula No Vescula Claviforme Conidiforo Liso Otros -

A.

flavus

Verde pardo

Si/No

Globosa

Rugoso

Esclerocio

A. fumigatus Verde azulado No Espatulada Liso

Ascoporo A. nidulans Verde oscuro Si Espatulada Liso, pardo rojo Clula de hulle

A.

niger

Negro

Si/No

Globosa

Liso

Esclerocio

Fuente: Carrillo (2003)

Los Aspergillus tienen una distribucin amplia en la naturaleza y se encuentran en todo el mundo. Parece adaptarse a un amplio espectro de condiciones ambientales y los conidios resistentes al calor proporcionan un buen mecanismo para su dispersin (Carrillo, 2003).

Su morfologa y el color son caractersticas macroscpicas de las colonias a tomar en cuenta para la descripcin de las diferentes especies de Aspergillus. Presentan distintos tonos de verde, pardo, amarillo, blanco, gris y negro (Carrillo, 2003). Microscpicamente el gnero se caracteriza por cadenas de conidios pequeos u ovales a esfricas sostenidas en cadenas en las puntas de filides radialmente ubicadas sobre la superficie del pice dilatado del conidiforo, que se denominan vesculas (Koneman et al., 1987).

Para el aislamiento se usan medios selectivos con inhibidores de la proliferacin bacteriana y del desarrollo exuberante de algunos mohos dando oportunidad a todas las esporas de originar una colonia aunque restringida, si el nmero no es demasiado grande.

2.2. Hongos Ligninolticos y Compuestos Xenobiticos

Los hongos ligninolticos han desarrollado un sistema enzimtico nico y no especfico que funciona en el ambiente extracelular. El mecanismo del sistema degradador de lignina est basado en la produccin de radicales libres. Este mecanismo permite que estas enzimas sean catalticamente activas sobre una gran diversidad de sustratos orgnicos. La enorme diversidad estructural de los contaminantes que son degradados por estos hongos, les confiere un uso potencial en biorremediacin. Estos hongos han sido efectivos en la degradacin de una diversidad de contaminantes ambientales peligrosos (ver Tabla 2).

Los contaminantes recalcitrantes, tales como bifenilos policlorinados y explosivos aromticos, los Hidrocarburos Aromticos Policclicos (Field et al., 1993) los plaguicidas clorados (Kennedy et al., 1990) organofosforados (Bumpus et al., 1993), son y los plaguicidas efectivamente

todos

mineralizados a CO2 por varias especies de hongos ligninolticos. Adems, la poca especificidad de las enzimas de estos organismos les permite degradar mezclas complejas de estos contaminantes. Estudios de degradacin de colorantes sintticos han revelado que los hongos ligninolticos son capaces de decolorar colorantes azo, trifenilmetano y heterocclicos (Pointing, 2001). Especficamente, las (MnPs) de Bjerkandera adusta y de Pleurotus eryngii son capaces de decolorar algunos colorantes sintticos (Heinfling et al., 1998)

Tabla 2. Compuestos xenobiticos degradados por cultivos de hongos de la podredumbre blanca Compuestos xenobiticos Especie
Fenoles clorinados Pentaclorofenol Triclorofenol Diclorofenol Cloroguayacoles Bifenilos policlorinados Aroclor 1254 Tetracloro bifenilo Plaguicidas DDT Terbufos Clorpirifos Fonofos Endosulfan Dioxinas Dicloro dibenzo-p-dioxina Tetracloro dibenzo-p-diaoxina Hidrocarburos policiclicos aromticos Fluoreno Antraceno Fenantreno Benzo()pireno Pc, Ps, Po, Th, Cs Pc Pc Pc
Pc, Tv, Pb, Fg Pc

Pc Pc Pc Pc Pc Pc Pc Pc Pc, Tv, Ba Pc, Tv, Cl Pc Pc, Tv, Ba

Pc, Phanerochaete chrysosporium; Ps, Phanerochaete sordia; Po, Pleurotus ostreatus; Th, Trametes hirsuta; Cs, Ceriporiopsis subvermispora; Tv, Trametes versicolor; Pb, Phlebia brevispora; Fg, Funalia gallica; Ba, Bjerkandera adusta; Cl, Chrysosporium lignosum.

Fuente: Pointing (2001).

2.3. Enzimas Lignolticas de Hongos

A partir de los estudios realizados con hongos ligninolticos en los aos setenta, se comprob que la degradacin de la lignina daba lugar a productos que provenan de la ruptura oxidativa de anillos aromticos. Por lo que se pens que las oxigenasas extracelulares podan estar involucradas en la transformacin de la lignina (Kirk y Chang, 1975). Algunos aos despus, tres grupos reportaron de manera independiente, el descubrimiento de una ligninasa capaz de oxidar y despolimerizar la lignina y compuestos modelo (Glenn et al., 1983), y cuya actividad enzimtica depende del perxido de hidrgeno (H2O2).

Estudios espectroscpicos mostraron que esta ligninasa era distinta de las oxigenasas P450, comparta algunas caractersticas con las hemoprotenas transportadoras de oxgeno y que era en realidad una peroxidasa (Kirk et al., 1987). A esta enzima se le denomina ahora como lignino peroxidasa (LiP) (ver Tabla 3).

Tabla 3. Organismos productores de enzimas ligninolticas Organismo Enzimas ligninolticas

Phanerochaete chrysosporium Trametes versicolor Ceriporiopsis subvermispora Cyanthus stercoreus Phlebia radiate Nematoloma frowardii Pleurotus eryngii, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius Bjerkandera sp. BOS55 Bjerkandera adusta UAMH 8258 y 7308 MnP, LiP MnP, lacasa MnP, lacasa MnP, lacasa MnP, LiP, lacasa MnP, LiP, lacasa MnP, VP, lacasa VP VP

Fuente: (Paszczynski et al., 1998) La capacidad de los hongos para transformar una gran variedad de compuestos orgnicos y llevarlos hasta CO2 y H20 ofrece un potencial indiscutible para su Ese utilizacin potencial en procesos de tratamiento en de las contaminaciones. radica fundamentalmente

caractersticas de su sistema enzimtico que cuenta con una combinacin de enzimas extracelulares, oxidasas y peroxidasas, que contribuyen, en determinadas condiciones, a despolimerizar la compleja estructura de la lignina (De Lorenzo, 1994). La oxidacin y ruptura de la molcula de lignina tiene como finalidad principal eliminar dicha barrera qumica y posibilitar el acceso a los polisacridos de la madera que constituyen una importante fuente de energa (Johri, 1999).

Entre los diferentes xenobiticos que pueden ser transformados por hongos basidiomicetos, se encuentran fundamentalmente: pesticidas,

hidrocarburos

aromticos

(benzo

-pireno,

fenantreno,

pireno,

etc.)

compuestos orgnicos clorados (pentaclorofenoles, cloroanilinas, bifenilos policlorados) azocolorantes, entre otros (Bezalel, 1996).

Como se mencion anteriormente, entre las enzimas ms comunes que intervienen en la degradacin de los hidrocarburos, estn las peroxidasas, principalmente la manganeso (MnP) y la lignina peroxidasa (LiP). Las cuales realizan, la oxidacin de la lignina en presencia de H2O2 (Buswell y Odier, 1987).

La temperatura influye en la velocidad de degradacin, dependiendo del tipo de microorganismo. Comnmente las temperaturas ms adecuadas se encuentran entre 15C y 45C, (microorganismos mesfilos), aunque se han descrito algunos trabajos de biorremediacin con microorganismos hemoflicos extremos y psicrfilos. La velocidad de degradacin aumenta con la temperatura, por lo que un incremento de la misma es til (Npoles, 2005).

Sin embargo cuando supera los 40C ocurre una disminucin de la actividad microbiana por desnaturalizacin de los enzimas, o se produce una rotacin poblacional hacia especies ms resistentes a las altas temperaturas. Durante el cambio de poblaciones disminuye la actividad microbiana (Cerniglia, 1997).

2.4. Microorganismos Ligninolticos

La capacidad para catabolizar la celulosa y hemicelulosa es una caracterstica comn para diversos hongos y otros microorganismos. Por el contrario, al ser la lignina un heteropolmero muy recalcitrante, solamente es mineralizado (transformado hasta dixido de carbono y agua) en forma

limitada por algunas bacterias y extensivamente por un grupo de hongos (Kirk et al., 1987).

Estos hongos ligninolticos, denominados hongos de la pudricin blanca de la madera, comprenden un grupo de organismos cuya caracterstica es su capacidad para mineralizar eficientemente la lignina. Presumiblemente, esta degradacin selectiva les permite tener acceso a la celulosa y hemicelulosa, las cuales finalmente representan su fuente de carbono y energa (Have et al., 2001).

La mayora de los hongos ligninolticos pertenecen al grupo Basidiomycetes y son los microorganismos ms eficientes en degradar totalmente la lignina. Estos organismos secretan varias enzimas

extracelulares que son esenciales para la transformacin inicial de la lignina y que en conjunto logran su mineralizacin (Pointing, 2001).

2.5. La lignina

Es un biopolmero aromtico complejo; es el segundo polmero en abundancia despus de la celulosa, constituye cerca del 15% de la biomasa terrestre y su fuente natural es la madera, donde se encuentra en una proporcin del 20 al 35%. Solamente un pequeo nmero de

microorganismos son responsables de la biodegradacin de la lignina, de los cuales los hongos de la podredumbre blanca constituyen el grupo ms importante, gracias a que producen unas enzimas ligninolticas extracelulares (Hammel, 1996).

2.5.1. Aplicabilidad

Tienen una aplicacin potencial en la industria del papel, principalmente

en el proceso de deslignificacin durante el blanqueo (ver Figura 1), y en biorremediacin de suelos, aguas contaminadas, una amplia variedad de compuestos orgnicos contaminantes como tintes, hidrocarburos

poliaromticos, pentaclorofenol, etc. (Bumpus et. al., 1985).

Degradacin simultnea de las diferentes capas de la pared celular vegetal por los hongos.

Degradacin selectiva de la lmina media que da lugar a la separacin de fibras de los tejidos.

Figura 1. Deslignificacin por hongos de pudricin blanca Fuente: Fritsche y Hofrichter (1999)

2.5.2. Estructura de la Lignina

Este biopolmero contiene alrededor de 10-20% de grupos hidroxilo fenlicos que le confieren rigidez a la pared celular de las plantas y adems las protege del ataque de organismos patgenos (Lin et al., 1992., Higuchi, 1990) (Ver Figura 2).

Biosintticamente, la lignina proviene de tres alcoholes precursores: el alcohol phidroxicinamlico (cumarlico), el alcohol 4-hidroxi-3-metoxicinamlico (coniferlico) y el alcohol 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamlico. La copolimerizacin por radicales libres de estos alcoholes, iniciada por peroxidasas vegetales, da lugar al polmero de lignina (Kirk et. al., 1987). Qumicamente este polmero es heterogneo, amorfo, pticamente inactivo, y altamente ramificado (Fritsche y Hofrichter, 1999).

Figura 2. Estructura parcial de la lignina Fuente: Higuchi (1990)

2.5.3. Biodegradacin de la Lignina.

La biodegradacin de lignocelulosa es un proceso bioqumico complejo y todava no est completamente estudiado. En los lignocelulsicos, la lignina protege a la celulosa y a la hemicelulosa contra la degradacin enzimtica de otros hongos o bacterias. Para la biotransformacin de los lignocelulsicos se ha estudiado que la interaccin de la celulosa, D-glucosa oxidasa y peroxidasas fngica intervienen en su biotransformacin

(Lobarzewski y Paszczynski, 1985).

La biodegradacin de la lignina puede ser dividida en dos procesos:

La separacin de las cadenas que estn conectadas a las unidades monomericas, resultando una despolimerizacin de la lignina.

La ruptura de los anillos aromticos del polmero de lignina.

Rol de la peroxidasas de lignina y la lacasa en la biosntesis y degradacin de la lignina.

El modelo ms comn de ataque en hemicelulosa y celulosas es con una degradacin simultnea de los polisacridos y lignina, no obstante, en otros casos se ha observado una degradacin selectiva de lignina (Daina et al., 2002).

2.6. Hidrocarburos

Son compuestos formados por tomos de carbono e hidrogeno, de gran abundancia en la naturaleza, presentes principalmente en el petrleo (Crispin et al., 1988). El nmero de carbonos y su estructura qumica

determina su clasificacin. Los hidrocarburos alifticos son de cadena lineal o ramificada y pueden ser saturados (alcanos) o insaturados (alquenos y alquinos). Los hidrocarburos de cadena cclica, pueden ser saturados (ciclo alcanos) o con uno o ms anillos bencnicos (aromticos) (Morrison y Boyd 1985).

2.6.1. Contaminacin del Agua por Hidrocarburos Uno de los procesos que contaminan el agua son los que derivan de la actividad petrolera, se trata de la contaminacin por petrleo crudo o por petrleo refinado diesel, gasolina, kerosn, y otros productos obtenidos por destilacin fraccionada y procesamiento qumico del petrleo crudo generado de forma accidental o deliberadamente desde diferentes fuentes, de buques-tanques de fugas en los equipos de perforacin marina otra fuente proveniente de tierra firme que es arrojado al suelo en las ciudades y en zonas industriales que son arrastrados por corrientes fluviales terminando en los ocanos (Hidalgo, 2009).

Hoy en da, es evidente que la contaminacin debida a la intensificacin de los transportes martimos y de las actividades de perforacin estn provocando estragos nunca conocidos en la vida de los ocanos en la actualidad se est frente al derrame de petrleo ms grande que ha ocurrido, se trata del derrame en el Golfo de Mxico producido por la British Petroleum BP producto de la explosin de la plataforma Deepwater Horizon donde estimaciones conservadoras muestran el vertido de 800 mil litros de petrleo al Golfo de Mxico (Beaton, 2010).

2.6.2. Hidrocarburos Aromticos Policclicos (HAPs) y Estructura Se definen por ser estructuras formadas por 2 o ms molculas de benceno fusionadas. Se conocen unos 100 HPAs diferentes ya que existe una elevada cantidad de ismeros. La estructura atmica del anillo bencnico les confiere una gran estabilidad termodinmica debido a la elevada energa de resonancia negativa que proporciona contener seis orbitales moleculares por solapamiento cclico (Ver Figura 3). Todos los compuestos con sistemas electrnicos cclicos son catalogados como aromticos (Dagley, 1981).

Figura 3. Estructura de los HAPs Fuente: Vias (2005).

2.6.3. Biodegradacin de Hidrocarburos

Existen dos mtodos usados en la biodegradacin de hidrocarburos, el primero se basa en las capacidades metablicas de las especies presentes en los hidrocarburos, el biodegradacin se consigue al modificar el sustrato, por aeracin o aplicando un fertilizante, y el segundo se adiciona poblaciones forneas de microorganismos que son escogidos por sus capacidades de biodegradar hidrocarburos. El mtodo de siembra de microorganismos

requiere que se agregue una cantidad de inoculo mayor a la biomasa que est presente en el medio para asegurar la supervivencia del inoculo (Atlas, 1995).

Procesos que se soportan en la capacidad de los hongos lignoliticos quienes pueden degradar e incluso mineralizar los HPAs, lo hacen mediante un conjunto de enzimas que se usan para la degradacin de polmeros vegetales como la lignina. (Bumpus et al., 1985; Bumpus, 1989; Cerniglia et al., 1997; Hammel et al., 1992; Sutherland et al., 1992).

Por ello son considerados compuestos complejos formados por anillos aromticos, en especial los de tipo polinuclear condensados, poseen una degradacin ms lenta que los alcanos, mientras que los compuestos alicclicos normalmente no son usados como fuente de carbono para el crecimiento microbiano-bacterias- a no ser que tenga cadenas laterales alifticas suficientemente largas. Por otro lado estos compuestos pueden ser degradados en cometabolismo en unin de dos o ms cepas bacterianas, que forman gremios con capacidades metablicas complementarias que actan en cooperacin (Atlas, 1981).

Pero aun as no siempre se logra la biodegradacin ya que muchos de estos compuestos son altamente recalcitrantes para las bacterias, no

obstante este proceso puede ser llevado por los hongos ligninolticos quienes poseen la capacidad de degradar gracias a su maquinaria enzimtica.

En tal sentido la aceleracin del proceso de degradacin de los HPAs puede ser logrado mediante la manipulacin de los sustratos del microambiente, tales como la adicin de nutrientes, el aumento del estatus aerbico, la introduccin de un inoculo microbiano o aumento de la viabilidad de los HPAs (Xu y Obbard, 2004).

2.6.4. Caractersticas en el Ambiente de los HAPs Las caractersticas ms importantes que condicionan el

comportamiento de los HAPs

en el medio ambiente van ligadas a las

caractersticas fisicoqumicas propias de la estructura de cada HPAs.. Son de gran importancia la hidrofbicidad, que aumenta cuanto mayor sea el nmero de anillos y la volatilidad de los HPAs de menor peso molecular. De hecho los compuestos aromticos heterocclicos, los cuales contienen tomos de nitrgeno, azufre u oxgeno, tambin pueden considerarse HPAs, en sentido amplio, debido a que tambin muestran caractersticas similares (Sims et al., 1983).

Debido a las propiedades hidrofbicas, los HPAs muestran una fuerte tendencia a adsorberse a las superficies lo que dificulta su biodegradacin, as como a acumularse en la cadena trfica (Clements et al., 1994).

Es bueno resaltar que la determinacin cuantitativa de hidrocarburos en los suelos es compleja ya que la mayor parte de las tcnicas se basan en la extraccin de las diversas fracciones por solventes. La solubilidad de dichas fracciones en distintos solventes es variable. De all que, segn sea el mtodo utilizado para la determinacin de hidrocarburos se obtendrn

valores diferentes, que para determinados tipos de suelos e hidrocarburos pueden ser muy marcados (Ercolli, 1999).

2.7. Antraceno

Es un Hidrocarburo Aromtico Policclico. A temperatura ambiente se trata de un slido incoloro que sublima fcilmente, pero muestra una coloracin azul fluorescente cuando se somete a radiacin ultravioleta. Posee una formula molecular de C14H10 (Figura 4), masa molar de 178,23 g/mol, densidad de 1,25 g/cm, punto de fusin 217,5 C y un punto de ebullicin de 340 C (Caballero, 2006).

Figura 4. Estructura del Antraceno Fuente: Caballero (2006).

2.8. Biorremediacin y Biodegradacin Es considerada como la ms deseable aproximacin a la remediacin de ambientes contaminados en contraste a alternativas ms costosas de menor aceptacin pblica como la incineracin. Los tratamientos biolgicos de degradacin pueden ser eficientes y econmicos si las condiciones de

biodegradacin son optimizadas (lvarez, 2001; Belloso, 1998; Cursi y Calleja, 2000).

La biorremediacin es un proceso de digestin, asimilacin y metalizacin de un compuesto orgnico llevado a cabo por bacterias, hongos, protozoos y otros microorganismos. Se define como biorremediacin al proceso de aceleracin de la tasa de degradacin natural de contaminantes por adicin de fertilizante para provisin de nitrgeno y fosforo (Ercolli et al., 2002).

Esta tcnica puede ser aplicada in situ, en el lugar donde se encuentra la contaminacin, o exsitu, cuando el contaminante es trasladado a una instalacin para su tratamiento (Saracino et al., 2001). La actividad de los organismos presentes en el sitio contaminado se pueden favorecer mejorando determinadas condiciones: edficas, aadiendo nutrientes, agua, oxigeno y modificando el pH. Otra forma es la introduccin de nuevas especies para aumentar la concentracin de microbiota presente.

La biodegradacin es un proceso natural, ventajoso no solo por permitir la eliminacin de compuestos nocivos impidiendo su concentracin, sino que adems es indispensable para el reciclaje de los elementos en la biosfera, permitiendo la restitucin de elementos (carbohidratos, lpidos, protenas) esenciales en la formacin y crecimiento de los organismos (Garbisu et al., 2002). En la tabla 4 se muestran microorganismos

degradadores del petrleo, en principio, todo compuesto sintetizado biolgicamente puede ser descompuesto biolgicamente. Sin embargo, muchos biolgicos (lignina, celulosa, etc.) son difcilmente degradados por los microorganismos debido a sus caractersticas qumicas.

Tabla 4. Principales microorganismos degradadores de petrleo Bacterias Hongos Achrornobacter Acinetobacter Actinomyces Aeromonas Alcaligenes Arthrobacter Bacillus Beneckea Brevebacterium Coryneforms Erwinia Flavobacterium Klebsiella Lactobacillus Leumthrix Moraxella Nocardia Peptococcus Pseudomonas Sarcina Spherotilus Spirillum Streptomyces Vibrio Xanthomyces Allescheria Aspergillus Aureobasidium Botrytis Candida Cephalosporium Cladosporium Cunninghamella Debaromyces Fusarium Gonytrichum Hansenula Helminthosporium Mucor

Fuente: (Garbisu et al., 2002).

Los

microorganismos

utilizados

pueden

ser

los

ya

existentes

(autctonos) en el sitio contaminado o pueden provenir de otros ecosistemas, en cuyo caso deben ser agregados o inoculados (Madigan et al., 2003).

Los microorganismos utilizados en biorremediacin son generalmente no-fotosintticos; ecolgicamente ocupan el nivel trfico (de alimentacin) denominado los descomponedores, en el que los hongos y bacterias son componentes principales. Estos organismos estn presentes en

prcticamente todos los lugares del planeta, inclusive a profundidades y temperaturas que se crea libres de ellos, como los pozos petrolferos profundos (Leadbetter, 2002).

Cuando el oxgeno es utilizado como aceptor de electrones la respiracin microbiana se produce en condiciones aerobias. Los compuestos orgnicos son en general oxidados en presencia de oxigeno, como si se tratara de un compuesto sencillo, como la glucosa, generando como

producto, biomasa, CO2 y H2O. (Madigan et al., 2003). Degradacin aerobia: C6H12O6+6 O26 CO2+ 6 H2O + biomasa. En la respiracin anaerbica el ltimo aceptor de los electrones no es el oxgeno (sino nitratos, sulfatos, hidrgeno, etc.) normalmente estos organismos son anaerobios estrictos, o sea que slo pueden crecer en ausencia total de oxgeno (el oxgeno es txico para ellos). Es un grupo pequeo (pocas especies) de organismos, formado slo por bacterias (metanognicas y sulfatorreductoras) (Madigan et al., 2003). Como proceso la biorremediacin tiene ventajas y desventajas, caractersticas (ver Tabla 5), inclinndose la balanza hacia las primeras por lo que es un mtodo aceptado y atractivo para solucionar los diversos impactos ambientales por derrames petroleros, ya sea en el momento de la perforacin, extraccin, transporte o refinacin, as como diversos derivados del mismo (Ensley y Zylstra, 1997). Tabla 5. Ventajas y desventajas de la biorremediacin Ventajas Origina cambios fsicos menores sobre el medio Producen pocos o ningn adverso til para retirar compuestos txicos del petrleo Es una solucin ms simple y ms completa Desventajas Su efectividad no ha sido determinada Difcil su aplicacin en el mar Largo tiempo de actuacin Su implementacin es especifica Su optimizacin requiere informacin sustancial acerca del lugar contaminado y las caractersticas del vertido

Fuente: (Ensley y Zylstra, 1997)

2.8.1. Papel que Desempean los Microorganismos

Los microorganismos juegan un papel importante en la eliminacin de los hidrocarburos en los ecosistemas terrestres y acuticos, siendo la degradacin microbiana el principal proceso de descontaminacin natural (Prince, 1993). Por lo tanto es necesario un buen conocimiento y control de este proceso natural para aplicarlo a tecnologas de biorremediacin (Whise, 2000).

La degradacin de los compuestos recalcitrantes y en especial de hidrocarburos han sido evaluadas con consorcios microbianos donde se han encontrado resultados satisfactorios para la disminucin de estos

contaminantes en el suelo y agua de igual manera se le atribuyen a las bacterias un alto porcentaje en la degradacin de los hidrocarburos aunque en algunos casos los hongos son ms eficientes en la degradacin de hidrocarburos que las bacterias en ciertas condiciones ambientales y para los compuestos ms recalcitrantes, es por ello que estos hongos se han

divulgado para ser activos degradadores de petrleo (Fedorak et al., 1984; Amanchukwu et al., 1989) siendo estos capaces de degradar el petrleo crudo ms efectivamente que las bacterias (Adekunle et al., 2004).

Los hongos ligninolticos pueden degradar e incluso mineralizar los HPAs mediante el conjunto de enzimas implicados en la utilizacin de polmeros vegetales caomo la lignina (Bumpus et al., 1993). La capacidad de degradcin de compuestos que contienen anillos aromticos est

ampliamente distribuida en la naturaleza, y de hecho, se han aislado numerosas especies de bacterias y hongos degradadores de compuestos aromticos conteniendo entre 2 y 5 anillos (Gibson y Subramanian, 1984). Asimismo tambin se han descrito una gran variedad de gneros de hongos

degradadores hidrocarburos aromatico policclicos totales (HPAs) como: Agrocybe, Aspergillus, Candida, Crinipellis, Chrysosporium, Cunninghamella, Bjerkandera, Fusarium, Kuehneromyces, Marasmiellus, Marasmius,

Morteriella, Mucor, Naematoloma, Laetiporus, Phanerochaete, Pleurotus, Penicillium, Ramaria, Rhizoctonia, Rhodotorula, Saccharomyces,

Syncephalastrum, Trametes y Trichoderma (Cerniglia, 1997).

2.9. Principales Caractersticas de los Mtodos Biorremediacin

2.9.1. Adicin de Nutrientes El metabolismo microbiano est orientado a la reproduccin de los organismos y stos requieren que los constituyentes qumicos se encuentren disponibles para su asimilacin y sintetizacin. Los nutrientes principalmente requeridos son el fsforo y el nitrgeno (Arroyo et al., 2004). Al aadir nutriente se acelera el proceso, en el mismo medio modificado las condiciones ambientales como (pH, humedad, temperatura, oxigeno, etc.)

La adicin de nutrientes es la opcin ms econmica y la que ofrece ms posibilidades de xito hoy en da, aplicado para superarla principal limitacin sobre la velocidad de la biodegradacin natural del petrleo. De los tres mtodos de biorremediacin, este ha sido el ms estudiado, y actualmente se presenta como el de ms factible aplicacin para la mayora de los vertidos (Muerza, 2006).

2.9.2. Inoculacin

Este proceso incorpora microorganismos para realizar una funcin especfica, como es la degradacin de contaminantes. Los microorganismos pueden ser comerciales o preparados para un fin especfico. La inoculacin

se usa cuando los microorganismos no pueden degradar el contaminante presente, o cuando se producen inhibicin por presencia de sales o metales (Alexander, 1999).

Aplicado

para

aprovechar

la

ventaja

de

las

especies

de

microorganismos ms eficientes en la degradacin de petrleo. Los resultados de pruebas de campo, no han sido concluyentes. Por lo tanto el uso de microorganismos modificados genticamente, probablemente no es necesario en la mayora de los casos debido a la amplia variedad de microorganismos naturales (Muerza, 2006).

Existen, segn el mismo autor, diversos factores que logran la total y perfecta biodegradacin del petrleo, con rangos mximos y mnimos de optimizacin en cuanto a la temperatura, estableciendo de igual manera la utilizacin de oxigeno durante el proceso (ver Tabla 6). Tabla 6. Factores que afectan la biodegradacin del petrleo Rango de temp: -2 35 C Menor degradacin a menor temperatura 25 _ 5 C; Temperatura la vel. De degradacin disminuye 10 veces Menor volatilidad, mayor viscosidad. Su disponibilidad no suele ser limitante en ambientes marinos La biodegradacin aerobia es mucho mayor que la Anaerobia. Oxigeno Depende de su ubicacin en el ambiente marino, por ejemplo es mucho menor en sedimentos, playas de baja energa, etc. Su disponibilidad suele ser mas limitante que la deO2 La mayora de los ambiente marinos son deficiente Nutrientes en algunos nutriente esenciales como N, P o Fe Relacin C/N/P necesaria: 120:10:1 Fuente: Alexander (1999)

2.10. Carbohidratos

Los

carbohidratos

sacridos

son

polihidroxialdehdos

polihidroxicetonas, as como sus derivados que poseen la frmula emprica (CH2O)n, los monosacridos o azcares sencillos estn constituidos por un nico polihidroxialdehdo o polihidroxicetona. El polisacrido ms abundante es el azcar de seis (6) carbonos llamado glucosa, el cual se considera como el monosacrido primordial del que derivan todos los dems.

La glucosa es la molcula combustible ms importante para la mayor parte de los organismos (Figura 5) y es tambin la unidad estructural bsica o precursora de los polisacridos ms importantes (Lehninger, 1972). Cabe destacar que ste carbohidrato es la principal fuente de carbono de los organismos, es por ello que es muy utilizado para realizar medios de cultivo, ya que asegura el alimento de los microorganismos.

Figura 5. Estructura molecular de la glucosa Fuente: Lehninger (1972)

Por su parte los disacridos son molculas formadas por la unin de dos monosacridos como es el caso de la sacarosa, formada por una molcula de glucosa y una de fructosa (Figura 6). Abunda sobremanera en el reino vegetal, algunas de sus propiedades son que no experimenta

mutorrotacin ni reacciona con la fenilhidracina para formar osazonas, no es un azcar reductor, se hidroliza con facilidad (Lehninger, 1972).

Figura 6. Estructura molecular de la Sacarosa Fuente: Lehninger (1972)

CAPTULO III MARCO METODOLGICO

3.1.

Diseo de investigacin El diseo utilizado corresponde con la modalidad descriptiva y

experimental, el tipo de muestreo corresponde al muestreo aleatorio donde se plantea el anlisis de la evaluacin de el uso del hongo lignoltico (Aspergillus niger) en la biodegradacin de HPAs en muestras de agua de la Baha de Amuay estado Falcn.

La investigacin descriptiva est representada por el crecimiento del hongo (Aspergillus niger) con los carbohidratos glucosa y sacarosa e hidrocarburos presentes en el medio (agua colectada). Las unidades experimentales corresponden a los medios de cultivo (tubos de ensayo) para medir la biorremediacin.

3.2.

Variables

3.2.1. Variable independiente

El crecimiento del hongo Aspergillus niger en las diferentes fuentes de carbono (carbohidratos e hidrocarburos aromticos policclicos), donde se evaluara la disminucin en la concentracin como elemento contaminante degradado por el hongo en medios de cultivo, y aumento de la biomasa.

3.2.2. Variable dependiente

Los Hidrocarburos Aromticos Policclicos totales presente en el agua

de la Baha de Amuay. Tabla 7. Sistema de variables Dimensiones Variable independiente

Hongo lignoltico (Aspergillus niger) Caractersticas macroscpica Biomasa

Indicadores
Microscopa ptica

ndice
Presencia de Cuerpos Fructferos g Color (Negro) Textura (Globosa Topografa (Liso)

Variable dependiente
Hidrocarburos Aromticos Policclicos HAPs

Extraccin Lquido-lquido

ppm

Espectrometra ultravioleta-visible

nm

3.3. Zona de Estudio

El sitio de estudio corresponde a la Baha de Amuay al sur de la costa occidental de la Pennsula de Paraguan del estado Falcn. En esta zona se vierten gran cantidad de efluentes industriales; adems del turstico y pesquero de zonas aledaas (Figura 7). desarrollo

Figura 7. Ubicacin geogrfica Baha de Amuay-Paraguan Fuente: Map Sourcin Garmin 2010

3.3.1. Toma de Muestra

El muestreo se realiz en cuatro estaciones; en cada lugar se procedi a tomar con un GPS de alta sensibilidad marca ETREX VHC Garmin, las coordenadas de ubicacin son las siguientes:

Tabla 8. Ubicaciones de las Estaciones donde se tomaron las diversas muestras (Coordenadas UTM).
Estacin 1 19P3680891301679 Estacin 2 19P3684031301096 Estacin 3 19P3687011300389 Estacin 4 19P3687081299912

Las muestras de agua fueron recolectadas por triplicado en cuatro en recipientes de vidrio previamente esterilizados y posteriormente refrigeradas a una temperatura de 20 C para su posterior ensayo en el laboratorio (ver Figura 8 y 9).

Figura 8. Ubicacin geogrfica del Muestreo en la Baha de AmuayParaguan (Detalle del mapa 3 Km) Fuente: MapSource Garmin 2010

Figura 9. Ubicacin geogrfica del Muestreo en la Baha de AmuayParaguan (Detalle del mapa 700 m) Fuente: MapSource Garmin 2010

La Figura 10 muestra a detalle la metodologa aplicada desde la recoleccin de las muestras hasta en el desarrollo de los anlisis.

Figura 10. Esquema de la metodologa empleada.

3.4. Obtencin del Hongo Aspergillus niger

Se realiz una investigacin de tipo descriptiva para evaluar, el efecto biodegradador del hongo Aspergillus niger cuantificando la capacidad de consumo y crecimiento en los diferentes medios de cultivo. Se utilizaron cepas de hongos filamentosos: UNEFM-M-2007-40 Aspergillus niger donada por el laboratorio LIADSA-UNEFM, con una posterior replicacin y conservacin de las mismas para su uso en procesos de biorremediacin en ambientes contaminados.

La especie Aspergillus niger fue seleccionada para evaluar el crecimiento sobre diferentes fuentes de carbono. Se procedi a un proceso de agotamiento energtico en medio lquido de composicin definida (MCD) para la utilizacin como inoculo para los estudios macroscpicos y las curvas de crecimiento.

3.4.1. Medios de Cultivo

Se utilizaron diversos medios de cultivo un medio selectivo Sabouraud para replicar al hongo obtenido, en botellas de 125 ml (slido) que posteriormente serian identificados mediante el estudio macroscpico y registrado en imgenes digitales, luego se prepararon medios de cultivo en tubo (lquido) para los distintos tratamientos a ser evaluados, dos medios control, Sacarosa y Glucosa respectivamente, y un medio mineral sin fuente de carbono, Czapek con y sin fuente de carbono proveniente de los hidrocarburos presentes en el agua de la Baha de Amuay.

3.4.2. Medio Sabouraud (slido)

Se preparo el medio comercial Sabouraud dextrosa agar marca BB a

una concentracin de 33 g/l, se esteriliz a 121 C por 20 minutos, se utiliz para preparar inculos y preservar la cepa evaluada y fueron colocados 50 ml del medio en botellas de 125 ml generando una cua con bisel inclinado a 45 aproximadamente, cada frasco se tap con tapone s de algodn y papel parafilm a los lados, la cepa se mantuvo por triplicado y se realizaron

resiembras peridicas (una vez/semana).

3.4.3. Medio de Cultivo Czapek (lquido)

Se prepar el medio de cultivo lquido con la composicin sealada en la Tabla 9, ajust el pH a 5.5 y se esteriliz por dos horas 121C , colocando 10ml del medio en cada tubo por triplicado.

Tabla 9. Composicin del medio para los estudios de cultivo lquido

Czapek- Czapek Dox medio lquido Sacarosa Fosfato Dipotsico Nitrato de Sdio Cloruro de Potasio Sulfato de Magnesio Sulfato Ferroso Agua destilada pH G 30 1 2 0,5 0,5 0, 001 1000 cc 5,5

Fuente: (BD, 2010)

3.5. Preparacin y Conservacin del Inculo

El inculo se prepar por el mtodo de estra con un asa, las botellas contenan el medio Sabouraud previamente preparado, se incubaron a 30 C por 4 das, la cepa de Aspergillus niger, luego se colectaron las esporas con una solucin salina estril al 0,9%; en una pipeta Pasteur, la suspensin de esporas se vaci a un matraz tomando 5ml de esta y aforando a 50 ml con

agua destilada, para las diluciones respectivas, se logro una dilucin de 5:50 para obteniendo un factor de dilucin de 10x, Se preservaron las esporas en viales 10 ml con una solucin salina estril al 0,9%

3.5.1. Conteo de Esporas

La concentracin de esporas se determin a travs del microscopio aplicando el mtodo de conteo con cmara de Neubauer (Vlez et al., 1997) se contaron 25 cuadrculas de la cmara utilizando la dilucin adecuada, la concentracin de esporas se determin aplicando la siguiente ecuacin (Casas R, 1994). Luego de contada las esporas el inoculo es ajustado a 1,5 x106 esporas/mL (ver Anexo A)

N esporas/mL = X * F* D Donde: N: Nmero de esporas/mL X: Promedio del nmero de esporas contadas en la cmara de Neubauer F: Factor de la cmara empleada (10.000) D: Dilucin empleada para el conteo

3.5.2. Condiciones de Incubacin

Se sembr por triplicado 0,5 ml del inoculo de Aspergillus niger previamente ajustado, a 1,5 x106 esporas/mL, en tubos de ensayos 16x150 ml con 10 ml con medio lquido Czapek con las diferentes fuentes de carbono, quienes representan los diversos tratamientos o unidades experimentales. Como control se utilizaron medios de composicin definida (MCD), glucosa (Czapek+G), sacarosa (Czapek+S), (Czapek libre de carbono), medio Czapek preparado en agua contaminada (colectada) de la

baha de Amuay (Czapek+Hidrocarburo) y (agua contaminada (colectada) de la Baha de Amuay. Llevadas a cabo durante tres semanas de estudio. Los tubos se incubaron por una semana, dos y tres semanas

respectivamente. Una vez inoculados los tubos se colocaron inclinados a 45 en un rotador multipropsito modelo 151, se agitaron a 5 rpm y a una temperatura de 30 C.

3.6. Anlisis por Microscopa

Las muestras expuestas en los diferentes tratamientos fueron sometidas mediante anlisis de microscopa ptica en un microscopio Marca Nikon modelo HFX-DX para obtener micrografas de los cuerpos fructferos y cuerpo vegetativo, as como tambin de los primeros estadios de desarrollo de las esporas, para la identificacin y evaluacin del crecimiento de estos hongos frente a su exposicin a los HPAs.

3.7. Anlisis de Muestra

Las muestras fueron analizadas mediante el estudio macroscpico, la medicin de la biomasa por el mtodo gravimtrico, y determinacin de los HPAs en los tratamientos: glucosa (Czapek+G), sacarosa (Czapek+S), (Czapek libre de carbono), medio Czapek preparado en agua contaminada (colectada) de la baha de Amuay (Czapek+Hidrocarburo) y (agua contaminada (colectada) de la Baha de Amuay.

3.8. Estudio Macroscpico de las Muestras Se registraron en fotografa digital los datos obtenidos de los crecimientos en medio Sabouraud de botellas, evaluando caractersticas al reverso como el Color, Textura y Topografa.

A cada tubo o muestra se realiz una inspeccin visual para observar cambio de color o aumento de la turbidez como indicativo del crecimiento de la biomasa.

3.9. Medicin de Biomasa por el Mtodo Gravimtrico Las muestras de las tres semanas, fueron centrifugadas a 3000 rpm por 5 min. Para obtener un precipitado de biomasa y un sobrenadante. Se filtr en un embudo milipore swinnex utilizando papel filtro whatman 185 mm previamente pesado.

El sobrenadante fue tomado en un tubo de ensayo previamente esterilizado y el precipitado junto con resto del residuo del tubo fue pesado en una balanza analtica marca (MeTTer H80), y se sec por 24 horas en la estufa a 40 C. Se dej enfriar en un desecador por 20 minutos,

posteriormente se pesaron los tubos de ensayo junto con la biomasa y por ltimo se calcul el peso de la biomasa, segn la siguiente ecuacin (Collins et al., 1995). Biomasa = Tubo ensayo con biomasa Tubo ensayo vacio Los resultados obtenidos fueron determinados en (g) todos a peso constante y se realizaron tablas para la comparacin de los datos. 10. Clculo de la Constante de Crecimiento

3.10. Clculo de la Constante de Crecimiento

Se calcul la velocidad de crecimiento (K) para los distintos tratamientos, segn los datos obtenidos de la biomasa en cada una de las etapas medidas en mg*h-1, de igual manera se calcul la constante de

degradacin (Y) medidas en L*h-1 (Brock, 2010) el porcentaje de degradacin (%) (Stardar Mtodos EPA, 2009) segn las siguientes ecuaciones: K= (X1-X2)/ (0,301*(t2-t1)) Y= Biomasa/Sustrato consumido %= conc. HPAS (inicial) conc.HPAs (final) / conc. HPAS (inicial) 3.11. Determinacin de Hidrocarburos Aromticos Policclicos (HAPs) en los diferentes tratamientos

3.11.1. Mtodo Qumico

Se realiz una caracterizacin fsico-qumica, una extraccin de los hidrocarburos por el mtodo lquido-lquido y la estandarizacin y aplicacin del mtodo de espectrofotometra por UV, para Hidrocarburos Aromticos Policclicos (Mtodo 418.1 EPA, UV.1986)

3.11.2. Caracterizacin Fsico-Qumica

Se aplic el mtodo de extraccin, 418.1 U.S. EPA, que consiste en una extraccin con n hexano como solvente. Tanto para las muestras de agua colectada antes de inocular el hongo, como a los sobrenadantes de los medios inoculados.

3.11.3. Extraccin Lquido-Lquido

En un embudo de separacin se agregaron 100 ml de muestra (agua colectada) y 50 ml de hexano como solvente para la extraccin

lquido-lquido de HPAs, en cuatro muestras diferentes, agitando y dejando reposar hasta que se generara una formacin clara de dos fases una orgnica y la fase acuosa para ser separadas.

3.11.4. Determinacin de HAPs por Espectrofotometra U.V

Se seleccion el Antraceno para

preparar una solucin de 100

ppm. A partir de esta solucin se prepararon soluciones patrones a concentraciones de 5, 10, 15 y 20 ppm.

3.11.5. Determinacin UV-Vis GENESYS 10 Vis

Se determinaron las absorbancias de diferentes soluciones patrn de antraceno de 5, 10, 15 y 20 ppm inicialmente entre un rango de longitud de onda de 425 nm a 1150 nm con una intercalacin de 25 nm entre cada medicin. Para primeramente establecer a que concentraciones las absorbancias mostraba un comportamiento lineal, en segundo lugar una vez determinada la concentracin de la solucin con comportamiento lineal (15 ppm y 20 ppm de las concentraciones empleadas), se seleccion el rango del espectro electromagntico donde se observaron los valores de mayor absorbancia, y se determinaron las absorbancias con un intercalacin de 1 nm, 2 nm y 5 nm para dicho rango.

3.11.6. Clculos de Curva Se aplicaron clculos para la calibracin de la curva y determinacin de las soluciones patrn aplicando software del equipo y paquete estadstico InfoStat/P profesional Versin 1.1 2002 (ver Anexo C) formulas para espectrofotometra (LAQ-UNEFM, 2010).

3.11.7. Medicin en el Espectrofotmetro

Realizada la extraccin, el extracto o fase orgnica se analiz en el espectrofotmetro, obteniendo valores de concentracin para cada extracto,

con lo cual se pudo determinar la cantidad de HPAs que se extrajo en cada lavado, y as establecer el nmero de lavados ptimos necesarios para la extraccin de HPAS. El anlisis se realiz por duplicado para verificar el resultado (APHA, 1998).

Los resultados obtenidos fueron reportados en nm, como el resultado de la degradacin y se tabularon para su comparacin y correlacin con los datos obtenidos de la biomasa.

3.12. Anlisis Estadstico de los Resultados

Una vez proyectados los datos experimentales, se procedi a la operacionalizacin de las variables para luego ser procesado mediante el paquete estadstico SPSS versin 12.0.0, una vez ordenados los datos de los cinco tratamientos, se trabaj con una comparacin de medias, el anlisis de varianza en relacin a las semanas 1, 2 y 3, y por ltimo se realiz una prueba post hoc en cada caso de estudio.

CAPITULO IV RESULTADOS

4.1.

Estudio Macroscpico del hongo -medio Sabouraud

El Aspergillus niger present como caractersticas macroscpica un aspecto aterciopelado de Color negro y textura globosa (ver Figura 11 y 12).

Figura 11. Crecimiento macroscopico A. niger

Figura 12. Crecimiento en menor proporcion A. niger en los cinco tratamientos.

4.2. Anlisis Microscpico

Las micrografas obtenidas mediante anlisis de microscopa ptica de los cuerpos fructferos y cuerpo vegetativos de las muestras expuestas en los diferentes tratamientos, presentaron las caractersticas distintivas de la especie de Aspergillus (Carrillo, 2003) (ver Anexo B).

4.3. Crecimiento en Medio Czapek con Carbohidratos

La Figura 13 muestra el comportamiento de la cepa Aspergillus niger, en medio Czapek con glucosa (Czapek+G) durante un periodo de 3 semanas la primera semana se determin un crecimiento de 1,64 g la segunda semana se determin un crecimiento de 1,74 g y la tercera semana mostr un crecimiento de 3,15 g, en comparacin con en el medio Czapek con sacarosa (Czapek+S), cuyo valores fueron menores.

3,5 3 2,5 2,20 1,81 A-N-G 1,5 1 0,5 0 Semana 1 Semana 2 Semana 3 1,64 1,74 A-N-S 3,15 2,22

Biomasa (g/mL)

Figura 13. A. niger (Czapek+G) y (Czapek+S)

En la figura 14. El Aspergillus niger presenta un crecimiento lento, en este medio la cepa fue sometida a stress sin ninguna fuente de carbono.

Figura 14. A niger en medio Czapek libre de carbono (Czapek-C)

3 2,5 2,42

Biomasa (g/ml)

2 1,5 1 0,5 0 Semana 1 Semana 2 Semana 3 1,02 1,41 A-N-Z

4.4.

Curva de Crecimiento de Hidrocarburos Aromticos Policclicos

A travs de la Figura 15 se aprecia el crecimiento de A. niger con agua de Baha de Amuay, donde mostr un aumento en el crecimiento a partir de la semana (1) con 1,52 g y entre las semanas (2), 1,68 g y (3), 2,41 g; considerando que la fuente de carbono eran los hidrocarburos presentes en el agua. De igual manera el crecimiento de A. niger en el medio Czapek en agua contaminada de la baha de Amuay el hidrocarburo (Czapek+ Hidrocarburo), fue de 0,76 g para la primera semana, 0,82 g para la segunda semana y 1,63 g para la tercera semana.

3 2,5 2 1,52 1,5 1 A-N-H 0,5 0 Semana 1 Semana 2 Semana 3 0,76 0,82 A-N-H20 1,63 2,41

Biomasa (g/ml)

1,68

Figura 15. A. niger en medio Czapek en Agua contaminada de la Baha de Amuay (Czapek+H) y en el agua de la Baha de Amuay solamente (A-NH2O)

4.5.

Cuantificacin de la Biomasa

La Tabla 10, expresa el promedio de la biomasa por el mtodo gravimtrico por un periodo de tres semanas para los cinco tratamientos. Todos los tratamientos mostraron un comportamiento de crecimiento exponencial, los dos primeros tratamientos como controles mostraron la mayor proporcin para el crecimiento, como un resultado esperado, de la misma manera los tratamientos con hidrocarburo mostraron resultados de crecimiento proporcionales con tendencias adaptativas.

Tabla 10. Promedio de biomasa (Aspergillus niger), medido en gramos

Tratamientos 1 Czapeck+ glucosa Biomasa (g) Semanas de crecimiento SEMANA 1 SEMANA 2 SEMANA 3 1,64 1,74 3,15

2 Czapeck+sacarosa 3 Czapeck libre de hidrocarburo 4 Czapeck+hidrocarburo

1,81

2,20

2,22

1,02

1,41

2,42

0,76

0,82

1,63

5 Agua de Baha de Amuay

1,52

1,68

2,41

A continuacin la Tabla 11 muestra la cuantificacin de la biomasa donde se evidenci un mayor crecimiento de la cepa Aspergillus niger en glucosa la cual fue el control del estudio, respecto a la relacin de biomasa entre los hidrocarburos se logr un mayor crecimiento de Aspergillus niger en el agua contaminada cuya fuente de carbono fueron los hidrocarburos presentes, logrando as su biodegradacin. En todos los casos los valores de la desviacin tpica son estadsticamente pequeos (no llegan a pasar de 1%) por lo que demuestra la similitud entre datos pertenecientes a cada tratamiento.

Tabla 11. Comparacin de medias en la Biomasa de Aspergillus niger

TRATAM 1 Czapeck+ glucosa Media SEMANA 1 1,6382 5 ,02924 1,8692 5 ,04352 1,0242 5 ,04944 ,7084 5 ,01455 1,5488 5 ,02051 1,3578 25 ,43644 SEMANA 2 1,7380 5 ,02442 2,2270 5 ,07164 1,4782 5 ,24981 ,8338 5 ,07510 1,6240 5 ,10857 1,5802 25 ,47459 SEMANA 3 3,1584 5 ,14947 2,2414 5 ,21688 2,4130 5 ,10576 1,6268 5 ,04011 2,4714 5 ,06253 2,3822 25 ,51452

N Desv. tp. 2 Media Czapeck+ N Sacarosa Desv. tp. 3 Media Czapeck libre N de Desv. tp. hidrocarburo 4 Media Czapeck N +hidrocarburo Desv. tp. 5 Media Agua de N baha de Desv. tp. Amuay Media Total N Desv. tp.

Al procesar los datos, se evala el efecto individual de los tratamientos estudiados en esta investigacin. En este caso de estudio existen diferencias significativas para las tres semanas en las cuales se evalu la biomasa del Aspergillus niger por el mtodo gravimtrico (ver Tabla 12). Los niveles observados en la fila TRATAMIENTO refieren a los efectos del modelo tomados en cuenta junto con los factores de asociacin propios del estudio.

Por otro lado, se puede destacar los niveles crticos asociados al estadstico F = (p=0,000 0,05) lo cual indica que el modelo explica una parte significativa de la variacin observada para las variables dependientes para este estudio (semanas 1, 2 y 3). As mismo, durante las tres semanas el Modelo R2 0,99, lo que indica que al dividir la suma de cuadrados del Modelo Corregido entre la suma de cuadrados Total corregida, indica que

para las tres semanas el modelo explica ms del 90 % de la varianza de las variables dependientes.

Una vez contrastada la hiptesis general y se observa que existen diferencias significativas entre los tratamientos, es necesario realizar un estudio estadstico que evidencie cual de los cinco tratamientos aqu estudiado es cuantitativamente mayor o menor, para esto, las variables se someten a un estudio de comparaciones mltiples posterior al anlisis de varianza para destacar cual o cuales de los tratamientos de manera detallada, permitiendo inferir tomar decisiones en pro de controlar la tasa de error para este caso estudiado. Para este estudio se procedi a inferir con la prueba de Tukey la cual agrupa en subconjuntos las medias que no difieren entre s.

Tabla 12. Anlisis de Varianza Semana 1, 2 y 3.

Fuente Modelo corregido Variable dependiente SEM1 SEM2 SEM3 Interseccin SEM1 SEM2 SEM3 Tratamiento SEM1 SEM2 SEM3 Error SEM1 SEM2 SEM3 Total SEM1 SEM2 SEM3 Total corregida SEM1 SEM2 SEM3 4,572 5,406 24 24 Suma de cuadrados tipo III 4,548(a) 5,063(b) 6,009(c) 46,088 62,426 141,872 4,548 5,063 6,009 ,023 ,342 ,344 50,659 67,831 148,225 Gl Media cuadrtica 1,137 1,266 1,502 46,088 62,426 141,872 1,137 1,266 1,502 ,001 ,017 ,017 F Significacin

4 4 4 1 1 1 4 4 4 20 20 20 25 25 25

975,997 73,977 87,260 39559,669 3648,161 8240,453 975,997 73,977 87,260

,000 ,000 ,000 ,000 ,000 ,000 ,000 ,000 ,000

6,354 24 a R cuadrado = ,995 (R cuadrado corregida = ,994); b R cuadrado = ,937 (R cuadrado corregida = ,924); c R cuadrado = ,946 (R cuadrado corregida = ,935)

En la primera semana, los cinco tratamientos se comportaron de forma diferente, se puede apreciar (ver Tabla 13) los cinco subconjuntos, uno para cada tratamiento, esto indica que cada uno de los tratamientos se comporto aislado y no existi alguna similitud estadstica entre ellos.

Tabla 13. Prueba de Tukey para la semana 1

TRATAM DHS de 4 Tukey(a,b,c) 3 5 1 2 Significacin N 1 5 5 5 5 5 1,000 ,7084 1,0242 1,5488 1,6382 1,000 1,000 1,000 1,8692 1,000 2 Subconjunto 3 4 5

Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogneos. Basado en la suma de cuadrados tipo III El trmino error es la Media cuadrtica (Error) = ,001. a Usa el tamao muestral de la media armnica = 5,000 b Los tamaos de los grupos son distintos. Se emplear la media armnica de los tamaos de los grupos. No se garantizan los niveles de error tipo I. c Alfa = ,05.

Para la segunda semana, se observa que el tratamiento nmero cinco (05) Agua de Baha de Amuay se asemeja estadsticamente al tratamiento uno (01) Czapeck+ glucosa y al 3 Czapeck libre de hidrocarburo. Con todo esto, es necesario destacar que para este periodo el tratamiento con mayor desarrollo de biomasa es el tratamiento 2 Czapeck+sacarosa (ver Tabla 14).

Tabla 14. Prueba de Tukey para la semana 2

TRATAM DHS de Tukey(a,b,c) 4 3 5 1 2 Significacin N 1 5 5 5 5 5 1,000 ,8338 1,4782 1,6240 1,6240 1,7380 ,648 2,2270 1,000 Subconjunto 2 3 4

,421

Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogneos. Basado en la suma de cuadrados tipo III El trmino error es la Media cuadrtica (Error) = ,017. a Usa el tamao muestral de la media armnica = 5,000 b Los tamaos de los grupos son distintos. Se emplear la media armnica de los tamaos de los grupos. No se garantizan los niveles de error tipo I. c Alfa = ,05.

En la tabla 15, se puede apreciar que para la tercera semana los tratamientos ya comienzan agruparse en tres subconjuntos, de esto se puede evidenciar que el tratamiento 4 Czapeck en agua contaminada de la Baha de Amuay no obtuvo un adecuado desarrollo experimental, cabe mencionar que el tratamiento 1 Czapeck+ glucosa logro desarrollar mayor promedio de Biomasa en el Aspergillus niger.

Tabla 15. Prueba de Tukey para la semana 3

TRATAM 4 2 3 5 1 Significacin N 5 5 5 5 5 Subconjunto 1 2 1,6268 2,2414 2,4130 2,4714 1,000 ,078 3

DHS de Tukey(a,b,c)

3,1584 1,000

Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogneos. Basado en la suma de cuadrados tipo III El trmino error es la Media cuadrtica (Error) = ,017. a Usa el tamao muestral de la media armnica = 5,000 b Los tamaos de los grupos son distintos. Se emplear la media armnica de los tamaos de los grupos. No se garantizan los niveles de error tipo I. c Alfa = ,05.

Considerando que los tratamientos 1 y 2 son bsicamente para el control del experimento y que los tratamientos 4 y 5 son las muestras donde existe el hidrocarburo contaminante (real) en el Agua de la Baha, se puede apreciar que el tratamiento 5 logr mayor biomasa lo que indica un avanzado comportamiento en relacin al tratamiento 4.

4.6. Curva de Calibracin de Antraceno

La Figura 16, muestra la curva de calibracin obtenida a partir de los valores anteriores, se obtuvo un factor de correlacin lineal (R) de 0,99 y valor de la pendiente es de 0,001 (positiva) valor mnimo detectable por el paquete estadstico.

0,025

0,02

Absorbancia nm

0,015

0,01
Pendiente= 0,001 R= 0,99

0,005

0 5 10 15 20

Concentraciones mg/L

Figura 16. Curva de Calibracin de Antraceno 4.7. Cuantificacin de los HPAs

Como se describi en la seccin 3.11.2. Para la cuantificacin de los

HPAs. Lo anterior permiti el clculo de las respectivas concentraciones por duplicado en el agua contaminada colectada en la Baha de Amuay antes del inoculo, como en los extractos de los tratamientos 4 y 5, con el propsito de evaluar la biodegradacin de Aspergillus niger el cual se llevo a cabo en un 87% de eficiencia promedio como se muestra en la Tabla 16, siendo esta degradacin mayor en el tratamiento ( 5) A. niger en agua contaminada (colectada) de la Baha de Amuay AN-H2O (Extracto B) como se muestra en la Figura 17. Los resultados obtenidos son aceptables, ya que es econmico y provee resultados en poco tiempo.

Tabla 16. Concentracin de HPAs en las muestras de agua antes de l inoculo (A. niger) Muestras Concentracin HPAs (mg/l) M1 22,90 M2 23,96 M3 21,87 M4 21,90

25 20 21 18 15 10 5 0 Semana 1 Semana 2 Semana 3 14,58 16 12,5 ANH2O-H ANH-H

Extracto A

Concentracin mg/l

Extracto B

Figura 17. Curva de biodegradacin de los extractos HPAs en AN- H2O y en AN-H

Para el siguiente caso de estudio, la Tabla 17 refleja como el nivel de significancia entre los dos EXTRACTOS es indicadora de variacin entre los extractos a y b, es decir F = (p=0,000 0,05), lo cual indica que el modelo explica la variacin observada, cabe mencionar que todo esto tiene relacin con la medias observadas en el transcurso de las tres semanas (ver Tabla 18) las cuales son suficientes para incidir que existe determinadas diferencias en ambos extractos y que para el extracto b se le observ una mejor evolucin y que reflej que el HPAs a la tercera semana fue de 12,5 (mg/l).

Tabla 17. Anlisis de Varianza para Concentracin HPAs (mg/l) A-N-H

Fuente Interseccin EXTRAC SEMA REPET Hiptesis Error Hiptesis Error Hiptesis Error Hiptesis Error Suma de cuadrados tipo III 1413,712 23,074 61,147 25,123 248,351 1,098 ,442 1,098 Media cuadrtica 1413,712 1,626(a) 61,147 1,794(b) 124,175 ,137(c) ,110 ,137(c) ,805 ,555 905,122 ,000 34,075 ,000 Significacin ,000

Gl 1 14,190 1 14 2 8 4 8

F 869,396

Tabla 18. Medias y Desviacin tpica para ambos extractos de la Concentracin HPAs (mg/l) A-N-H
EXTRAC A Media N Desv. tp. Media N Desv. tp. Media N Desv. tp. HPAS1 21,4840 5 ,09072 21,1660 5 ,23912 21,3250 10 ,23908 HPAS2 18,5620 5 ,38642 14,3980 5 ,24356 16,4800 10 2,21565 HPAS3 16,5120 5 ,37805 12,4280 5 ,45921 14,4700 10 2,18868

Total

La Tabla 19 representa el promedio de las constantes (K) de crecimiento de los diferentes tratamientos, a partir de medidas

experimentales del incremento en la biomasa.

Tabla 19. Valores Promedio de contantes de crecimiento (k) en mg*h-1

Tratamiento 1 Czapeck+ glucosa 2 Czapeck+ sacarosa 3 Czapeck+Zcapek 4 Czapeck+Hidrocarburo 5 Czapeck+Hidrocarburo K (mg*h-1) 0,00382069

0,00087565

0,00462485

0,00447276

0,00257918

4.8.

Crecimiento de Biomasa y Consumo del Sustrato

La Figura 18 representa la relacin entre el crecimiento de la biomasa y la utilizacin del sustrato, debido a que los microorganismos tienden aclimatarse primero a su ambiente y al alimento disponible. En este caso corresponde al aumento de biomasa por efecto de la degradacin de los HPAs presentes en el agua de acuerdo al tiempo de anlisis.

50 45 40 43,68 43,11 30,32 26,00 30,05 26,83

Concentracin mg/l

35 30 25 20 15 10 5 0 Semana 1

Biomasa % Sustrato %

Semana 2

Semana 3

Tiempo

Figura 18. Crecimiento de biomasa y consumo del sustrato

CAPITULO V DISCUSIN

Existen diversos mecanismos que permiten a los microorganismos eliminar los HPAs, y uno de los principales es la biodegradacin por medio de enzimas producidas por los microorganismos. El Aspergillus niger es un hongo lignoltico capaz de degradar diversos compuestos orgnicos entre los que se incluyen los presentes en el petrleo, hemos probado una metodologa con el fin de hacer factible y verificable la capacidad de este hongo para la degradacin de los HAPs moleculares complejas, quienes poseen estructuras por lo que

estables y difciles de degradar

proponemos a Aspergillus niger como un candidato efectivo para su biodegradacin.

El mtodo aplicado mostr que a partir de inculos previamente crecidos y caracterizados segn el estudio macroscpico y microscpico (Peterson, 2000); de las muestras inoculadas con diferentes fuentes de carbono (Figuras 11 y 12), se logr una disminucin de los HAPs en (87%) en un periodo de tres semanas. En diversos estudios (Nyanhongo et. al, 2001), han demostrado que la eficiencia de degradacin de hidrocarburos depende del tipo de microorganismo a emplear y de la estructura del contaminante.

Los resultados obtenidos en la determinacin de los HPAs, mostraron que al final del ensayo, los valores fueron inferiores a los valores obtenidos inicialmente (ver Tabla 16) es decir, el hongo Aspergillus niger fue capaz de degradar los HPAs, siendo ms eficiente la remocin en el agua de la baha sin medio mineral a las tres semanas de tratamiento.

Se obtuvo la degradacin de HPAs con fuente de carbono, como se muestra en la Figura 17 y 15 frente a un aumento de la biomasa con un crecimiento proporcional exponencial donde se determin una constante de crecimiento promedio (K) de los HPAs en los tratamiento 4 y 5 de 0,00352597 mg*h-1 similar a otros trabajos (Gutirrez et. al, 2003) quienes han aplicado tal metodologa (ver Tabla 19). De igual forma se aprecia a la Figura 18 el crecimiento de biomasa y el consumo del sustrato obtenindose un valor de velocidad de degradacin (Y) del mismo de 0,011 L*h-1

Del mismo modo estudios realizado por (Zrraga, 2009) donde ha demostrado el potencial degradador del Aspergillus niger sobre el naftaleno en agua de la Baha de Amuay.

Asimismo, se propone el uso de la tcnica de la espectrofotometra U.V como un mtodo factible y econmico en comparacin con otros mtodos, para el anlisis de degradacin de HAPs presentes en el agua usando Aspergillus niger.

De igual forma, la degradacin en medio de cultivo lquido para los tratamientos 4 y 5, pudo observarse para los HPAs estudiados con

diferentes grados de eficiencia de degradacin para el hongo evaluado, siendo mayor en el tratamiento 5.

Con respecto al porcentaje de degradacin de los HPAs obtenido en la Figura 17 se puede observar que el hongo Aspergillus niger muestra diferentes eficiencias de degradacin, sin embargo, en promedio se obtuvo una degradacin por encima de 87%, lo anterior coincide con los resultados obtenidos en medio lquido por (Kasinath et. al, 2003) quienes reportaron que los cultivos agitados son ms efectivos en la degradacin que los estticos.

Para la evaluacin del hongo, existe a la fecha reportes sobre la capacidad del gnero Aspegillus de degradar HPAs, revisiones sobre el tema muestran estudios realizados con diferentes hongos, adems de los ms ampliamente investigados que pertenecen a los basidiomicetos, tambin se han realizado estudios con diversas especies de Aspegillus, Penicillium, Geotrichum, Candida, Kluyveromyces, entre otros. En una revisin realizada por (Fu y Viraraghavan, 2001) sobre la degradacin fngica de hidrocarburos presentes en efluente industriales.

El tratamiento en medio con glucosa usado como control para evidenciar el crecimiento del hongo, se observ que Aspergillus niger present mayor biomasa como era esperado (Figura 13) (Padmavathy et. al, 2003), reportaron que la presencia de glucosa es necesaria para apoyar el crecimiento inicial de los microorganismos.

El crecimiento de la biomasa fngica mostr diferentes patrones a lo largo del tiempo, en diversos tratamiento sin embargo todos mostraron un crecimiento exponencial, de la misma forma para que un microorganismo sea recomendable de utilizar en procesos de biorremediacin es necesario que sea capaz de degradar al sustrato con una eficiencia de 30-40% durante 3 a 5 semanas (Eweis et al, 1999 y Flathman et al, 1995).

Segn lo antes planteado el hongo y la metodologa empleada muestra una alta eficiencia puesto que la degradacin lograda fue de un 87% en el trmino de 3 semanas incluso en el agua colectada sin medio mineral con hidrocarburos como nica fuente de carbono (Pareja, 1993., Young y Gerniglia, 1995).

El uso de este hongo como agente de biorremediacin ambiental y sus enzimas es factible en sitios contaminados por HPAs, donde su estabilidad

qumica y su disponibilidad son un problema en la recuperacin de recursos naturales impactados con compuestos derivados del petrleo, por lo anteriormente expuesto, el futuro basado en este grupo es prometedor.

CONCLUSIONES

Se propone el uso del hongo lignoltico Aspergillus niger para la biodegradacin de Hidrocarburos Aromticos Policclicos.

Se logro satisfactoriamente la biodegradacin de los HPAs ya que los resultados obtenidos para Aspergillus niger muestran una eficiente remocin de contaminantes de HPAs, correspondiente a un 87% de degradacin para los tratamientos 4 y 5 en muestras de agua colectada en la Baha de Amuay.

Se propone el uso de esta tcnica de biodegradacin mtodo econmico rpido y factible.

como un

Con base a los resultados obtenidos en los experimentos, se considera que es posible lograr la biorremediacin de los HPAs en agua de la Baha de Amuay usando Aspergillus niger.

El aumento en biomasa demuestra que el medio aporta al microorganismo las condiciones nutricionales para el desarrollo vegetativo, segn resultados obtenidos similares a (Nyanhongo et. al, 2001)

Se comprob el crecimiento A. niger, en glucosa y sacarosa, utilizados como control, y se demostr que este fue tambin capaz de utilizar los derivados del petrleo como sustrato, logrando degradarlo en menor porcentaje. La cepa es apta, para ser utilizada en pruebas que permitan generar tecnologas de biorremediacin para las areas contaminadas por

hidrocarburos en el estado Falcn.

RECOMENDACIONES

Se recomienda el uso de Aspergillus niger como agente de biorremediacin; continuar con esta lnea de trabajo en busca de soluciones para remediar ambientes afectados por las actividades antropognicas, particularmente en agua expuesto a hidrocarburos.

Para futuros estudios se recomienda aumentar el tiempo de experimentacin hasta alcanzar el mximo crecimiento del hongo estudiado, sobre la biodegradacin de los Hidrocarburos Aromticos Policclicos totales.

Establecer procesos y pruebas de biorremediacin in situ, para comprobar la eficiencia del mismo. Incorporar programas investigativos por parte de nuestra institucin, quien cuenta con el recurso humano, infraestructura, para realizar trabajos de inters en esta rea.

Se propone este mtodo de biodegradacin como una prueba de factibilidad para la evaluacin previa de un hongo antes de ser usado en proceso de biorremediacin a gran escala.

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Especial de Grado para Ingeniero Qumico. Zeppefeldt E, Francisco Yegres, Nicole Richard-Yegres. 2009. Evaluacin del efecto biodegradador de un hongo sobre un hidrocarburo para la biorremediacin de espacios contaminados por la actividad petrolera Caso: gnero Aspergillus Crysosporium y Rhizopus. Especial de Grado para Ingeniero Qumico.

GLOSARIO

Bioacumulacin. Acumulacin progresiva de sustancias txicas persistentes en los seres vivos, a travs de la cadena alimenticia. Biodegradable. Materiales que se descomponen generalmente por la accin de microorganismos. Biosntesis. (bio- + sntesis). Formacin de una sustancia orgnica en el interior de un ser vivo. Biotoxinas. Son protenas que pertenecen al grupo conocido como enzimas, que son molculas protenicas grandes y complejas que descomponen a otras molculas orgnicas. Carcingeno. Agente que provoca o acelera el desarrollo de algn tipo de cncer. Celulosa (de clula). Sustancia slida, blanca, amorfa, insoluble en el agua, el alcohol y el ter, que forma la parte esencial de la membrana celular de los vegetales. Cepa. Poblacin de clulas que descienden de una sola; clona. Contaminacin: Cualquier alteracin fsica, qumica o biolgica del aire, el agua o la tierra que produce daos a los organismos vivos. Degradadores aerbicos. Que utilizan oxgeno para la degradacin de la materia. Descomponedor. Organismo que obtiene sus (monmeros) nutrimentos de organismos muertos, de partes de organismos o de excrementos.

Desintegradores. Grupo de organismos, principalmente hongos y bacterias, que digieren el material orgnico mediante la secrecin de enzimas digestivas en el ambiente. Enzimas. Protenas que funcionan como un catalizador biolgico de alta especificidad, que hacen posible la sntesis, modificacin y degradacin de compuestos qumicos presentes en los organismos vivos y en su hbitat. Espora. Estructuras en reposo resistentes formadas por bacterias y hongos. Especie. Del latn significa tipo, grupo bien delimitado de organismos. Hidrocarburos Compuestos orgnicos formados por carbono e hidrgeno. Los tomos de C pueden formar largas cadenas. Inoculado. Organismo vacunado con un germen vivo (bacteria o virus) para prevenir de una enfermedad.

Micronutriente. Nutriente esencial que requieren las plantas y animales en cantidades muy pequeas.

Saprfito. Planta que obtiene su alimento de materia vegetal o animal muerta.

ANEXO- A

Conteo de las esporas Se obtuvo la dilucin adecuada a partir del inculo que se prepar de Aspergillus niger 1,5x106 esporas/ml, contadas al microscopio- cmara de Neubauer.

1) Dilucin para conteo de microorganismos viables 2) cmara de Neubauer 3) Diferentes cuadrantes en la cmara.

ANEXO-B

Micrografa del Aspergillus niger

ANEXO-C

Preparacin de Soluciones Madre C = M sto / V sln Donde: C: Concentracin de la solucin M sto: masa de soluto V sln: Volumen de la solucin Para: C= 1000 ppm = 1000 (mg / L) * (1L / 1000 ml) = 1 mg/ml V sln= 100ml M sto = C * V sln M sto = 1 mg/ ml * 100 ml = 100 mg = 0,100 g Preparacin de soluciones patrn C1*V1 = V2* C2 Donde C1: Concentracin de solucin concentrada V1. Volumen de solucin concentrada C2: Concentracin de solucin diluida V2: Volumen de solucin diluida. Calculo de ppm respectivamente

Determinacin del lmite de deteccin Limite de deteccin: Es el valor mnimo detectable por el

espectrofotmetro m: pendiente de la Lnea de tendencia de la Curva de calibracin Limite de deteccin = 0,0044 / m = 0,0044 / 0,0447 = 0,098 ppm