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Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Unesp

Instituto de Biociências de Botucatu – IBB


Departamento de Física e Biofísica

Relatório de Aulas Práticas

Bioinformática

Trabalho apresentado como


parte da avaliação do
rendimento dos alunos na
disciplina de Biofísica
Molecular.

Carina Miranda Carvalho


Paulo Roberto da Fonseca Filho
1. Introdução e Objetivos

Para estudar a estrutura de uma proteína existem diversos métodos, tais como
espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS), espectroscopia por ressonância
magnética nuclear (NMR), ressonância paramagnética eletrônica (EPR), fluorescência,
dicroísmo circular (CD) e cristalografia.
A cristalografia tornou-se um dos métodos mais eficientes para se elucidar a
estrutura de uma proteína porque apresenta altíssima resolução e eficiência na resolução
estrutural. Nela os cristais são analisados mediante difração de raios-X e então
submetidos a uma modelagem computacional para resolver o espectro da difração e
retornar à estrutura responsável pelo padrão de difração. Para trabalhar com esses
dados, foram desenvolvidos softwares com alto poder de processamento e diversas
ferramentas dedicadas à estrutura de proteínas. Trabalhar com alguns desses softwares e
analisar a estrutura de uma proteína elucidada em trabalho científico específico foram
os objetivos dessas aulas práticas.

2. Um pouco mais sobre a proteína

Em 1909, um criador de galinhas na zona rural de Nova York observou um tumor


em uma galinha doente, e levou a ave Peyton Rous, um pesquisador do Insituto
Rockefeller, na cidade de Nova York. Rous preparou um filtrado isento de células, a partir
desse tumor de tecido conjuntivo e o injetou em galinhas normais. O resultado marcante foi
que as receptoras desenvolveram tumores altamente malignos do mesmo tipo, chamados
sarcomas. Ele também descobriu que o agente causador no filtrado, atualmente conhecido
como vírus do sarcoma de Rous ou vírus do sarcoma aviário (ASV), podia ser propagado
por uma passagem em série por galinhas. Cinqüenta e cinco anos mais tarde, Rous recebeu
o prêmio Nobel em reconhecimento dessa descoberta pioneira.

3. Materiais e Métodos

Para fazer a modelagem, fizemos download de duas estruturas já resolvidas que


estavam disponíveis em um banco de dados on-line (www.rcsb.org) , cujos códigos eram
1ASU e 1VSD. A proteína com código 1ASU é, na verdade, o sítio ativo do vírus ASV, que
foi cristalizada a partir de 2% Peg 400, 2M sulfato de amônio e Hepes pH 7.5. Doravante as
referências a essa proteína serão como ASU.
A estrutura mais aceita para a forma biológica da molécula é apresentada na figura
1.
Figura 1: Estrutura biológica mais aceita para a ASU.

A proteína cristalizada, unidade assimétrica da figura1, é apresentada na figura 2:

Figura 2: unidade assimétrica da ASU a ser trabalhada.

A proteína com código 1VSD é, na verdade, o sítio ativo da proteína “Avian


Sarcoma Virus Integrase”, que foi cristalizada a partir de Cofactor Mg(II) e Ligante Hepes e
Alta concentração de Mg. Doravante as referências a essa proteína serão como VSD.
A estrutura mais aceita para a forma biológica da molécula é apresentada na figura
3.
Figura 3: Estrutura biológica mais aceita para o VSD.

A proteína cristalizada é a unidade assimétrica da figura 3 e é apresentada na figura


4:

Figura 4: Unidade assimétrica da VSD que foi cristalizada.

Para proceder com a modelagem computacional de proteínas, foram usados diversos


softwares, como O, Pymol e Procheck, todos em ambiente Linux. Com os dados coletados
deu-se início os trabalhos com a estrutura das proteínas, imagens que são apresentadas no
tópico 4.
4. Resultados e Discussão

Os resultados obtidos com a manipulação computacional são apresentados abaixo.

Figura 5: Representação da ASU.

Figura 6: Representação da ASU como cartoon.


Figura 7: Representação da ASU como ribon sobreposta à uma estimativa de sua estrutura .

Figura 8: Representação da ASU como ribon.


Figura 9: Representação da ASU como sticks.

Figura 10: Representação da ASU com uma estimativa de superfície.


Figura 11: Representação da VSD.

Figura 12: Representação da VSD como cartoon.


Figura 13: Representação da VSD como ribon

Figura 14: Representação da VSD como sticks.


Figura 15: Representação da VSD como ribon sobreposta a uma estimativa de sua
superfície.

Figura 16: Representação da superfície da VSD.

Para fazer mutações nas moléculas, foi tomada a proteína ASU e em seguida mutados três
de seus resíduos aleatoriamente, conforme mostra a tabela abaixo:

Tabela 1: Mutações realizadas na proteína ASU.


Num. Resíduo Resíduo ASU Resíduo MUT
48 PRO TRP
49 LEU ALA
50 ARG GLY

Os rezíduos mutados são apresentados nas figures abaixo:


Figura 17: Região da ASU que foi submetida à mutação.

Figura 18: Região após a mutação.

Após a mutação, surge a molécula MUT, apresentada abaixo:


Figura 19: Representação da MUT.

Figura 20: Representação da MUT como cartoon.


Figura 21: Representação da MUT como ribon.

Figura 22: Representação da MUT como sticks.


Figura 23: Representação da MUT como ribon sobreposta a uma estimativa de sua área.

Figura 24: Representação da superfície da MUT.

Com as estruturas em mãos, pode-se estimar a variação da superfície das moléculas,


conforme apresentamos abaixo através de sobreposição:
Figura 25: Em rosa e vermelho: ASU, em verde: a mutação realizada (parte da MUT)

Figura 26: Em verde mais escuro, ASU. Em verde –água, VSD. Note que a VSD não
possui a porção lateral em destaque.
Figura 27: sobreposição da ASU e da VSD.

Note que a ASU (em verde escuro) possui uma cadeia muito maior que a VSD,
justificando a cadeia lateral mencionada acima.

Quando foram feitos os gráficos de Ramachandran, usando o programa procheck,


foram obtidos os seguintes resultados:
Também foi feita a cela unitária para as proteínas, o que é apresentado nas figuras
abaixo:
Figura 28: Cela unitária da ASU.

Figura 29: Cela unitária da MUT.

5. Conclusões

Aplicando então alguns conceitos de modelagem de proteínas, vemos que é possível


de se estudar e modelar macromoléculas biológicas de uma maneira bastante eficiente com
a cristalografia. É bom lembrar que os resultados apresentados nesse relatório se referem à
mesma proteína, variando somente os métodos de cristalização.

6. Referências Bibliográficas

• High-resolution structure of the catalytic domain of avian sarcoma virus integrase,


Bujacz G, Jaskolski M, Alexandratos J, Wlodawer A, Merkel G, Katz RA, Skalka
AM, J. Mol. Biol. 253, 333-346.
• The catalytic domain of avian sarcoma virus integrase: conformation of the active-
site residues in the presence of divalent cations, Bujacz G, Jaskolski M,
Alexandratos J, Wlodawer A, Merkel G, Katz RA, Skalka AM. Structure. 1996 Jan
15;4(1):89-96.

• Bioquímica, Lubert Streyer, 4ª edição.

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