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CURSO DE CULTIVOS CELULARES

Coordinadores: Milagros Ramos Gmez Alberto Martnez-Serrano

Universidad Autnoma de Madrid

Junio 2008. Docentes (segn calendario): Alberto Martnez Serrano Ignacio Tardieu Juan Rebelles Carmen Punzn Angeles Snchez Jos Antonio Lpez Elena Rodrguez Isabel Liste Elena Holgun Miguel Remacha Milagros Ramos

Contenido:
Introduccin y normas de trabajo. Cultivo de clulas de mamferos: aspectos bsicos Funcionamiento y uso de aparatos generales de laboratorio de cultivos Lavado de material, esterilizacin y preparacin de medios de cultivos celulares Microbiologa: Medios de cultivo, siembra y observacin de microorganismos Virologa: Titulacin de virus y transduccin Clulas de insectos: Generacin de protenas recombinantes mediante el uso de baculovirus Clulas de mamferos: Descongelacin de lneas establecidas Cultivos primarios de linfocitos de ratn Clulas ES Cultivos primarios neuronas de cerebro de ratn Clulas de plantas Seguridad Biolgica

INTRODUCCIN Y NORMAS DE TRABAJO.

Alberto Martnez Serrano Normas de trabajo Laboratorio de cultivos Es de extrema importancia lavarse las manos antes, despus, y frecuentemente durante el trabajo en cultivos, para evitar contaminaciones en los experimentos, y contaminacin del usuario con material biolgico, y posible diseminacin de ste. Se debe trabajar siempre con material estril (pipetas, puntas, etc). El material estril slo puede abrirse, lgicamente, dentro de la campana de cultivos, o a la llama del mechero. Por defecto, todo aquello de lo que no se est seguro al 100% de su esterilidad ha de ser considerado como no estril. Asumir que algo est estril cuando no lo est supone, sin ninguna duda, contaminar (esto es, destruir) el experimento. Se requiere de todos los asistentes al curso un elevado grado de responsabilidad, para no arruinar el trabajo del grupo. En caso de contaminar algo involuntariamente (o incluso sospechar que sto ha pasado), se debe poner inmediatamente en conocimiento del profesor, para evitar males mayores. Marcar siempre cualquier tubo o recipiente que contenga algo til, de la forma ms segura posible, por ejemplo tanto en la tapa como en el tubo. Marcar siempre las placas de cultivos en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar intercambiar tapas. Si se ha de pipetear repetidamente un stock de una solucin (p.ej. botella con medio de cultivo) es conveniente sacar de una vez la alcuota que se vaya a usar a una botella o tubo de menor volumen, para disminuir el nmero de veces que se introducen pipetas en la botella con el stock, y el consiguiente riesgo de contaminacin. Si faltasen cabinas de cultivo para llevar a cabo todo el trabajo necesario, algunas partes de los experimentos se harn en la mesa de laboratorio, previamente descontaminada con hipoclorito, y trabajando en el ambiente estril proporcionado por la llama del mechero. Seguridad biolgica Es obligatorio lavarse las manos despus del trabajo de laboratorio, para evitar contaminacin del usuario con material biolgico, y la potencial dispersin de ste. Todo el material biolgico, p. ej. clulas o material que haya estado en contacto con stas, ha de ser inactivado con hipoclorito antes de tirarlo. Tanto el plstico desechable como el vidrio que haya estado en contacto con material biolgico ha de ser inactivado antes de tirarlo, o disponerlo para su lavado y esterilizacin. Los residuos acumulados en vasos de precipitados han de ser inactivados con hipoclorito antes de tirarlos, y los vasos se dejarn con un poco de hipoclorito hasta su prximo uso. La mesa de trabajo y las campanas se descontaminarn antes y despus de trabajar con material biolgico. Cualquier material biolgico derramado ha de ser descontaminado inmediatamente con hipoclorito, antes de proceder a secar y lavar con jabn la superficie manchada.

CULTIVO DE CLULAS DE MAMFEROS. ASPECTOS BSICOS.

Plsticos, densidades y medio de cultivo SUPERFICIES DE CULTIVO
(*) usadas en este curso

Placas multipocillo (multiwell-plates) Nombre comn Pocillos Dimetro Area/pocillo Area /placa 48 cm2 P96 96 8mm 0.5 cm2 2 48 cm2 P48 48 11mm 1 cm 2 48 cm2 P24 24 16mm 2 cm 2 48 cm2 P12 12 22mm 4 cm 2 P6 * 6 35 mm 10 cm 60 cm2 placas tipo Petri-dish Nombre comn P35 P60 P100 * Botellas (flasks) Nombre comn T-25 T-75 Pocillos Dimetro Area /placa 1 35 mm 10 cm2 1 60 mm 28 cm2 1 100 mm 78 cm2 Pocillos Dimetro 1 ---1 ---Area/botella 25 cm2 75 cm2

DENSIDADES DE CLULAS (en millones) Y VOLMENES (en ml) volumen (ml) millones de clulas Nombre comn Siembra Confluencia Medio Lavados Trip/EDTA P96 0.015 0.06 0.1 0.1 0.060 P48 0.03 0.12 0.25 0.25 0.125 P24 0.06 0.24 0.5 0.5 0.25 P12 0..12 0.5 1 1 0.5 P6 * 0.3 1.2 2 2 1 millones de clulas placas tipo Petri-dish Nombre comn P35 P60 P100 * Botellas (flasks) Nombre comn T-25 T-75 Siembra 0.3 0.8 2.2 Confluencia 1.2 3.2 8.8 Medio 2 3 10 volumen (ml) Lavados Trip/EDTA 2 1 3 2 10 3 volumen (ml) Medio Lavados Trip/EDTA 5 5 0.75 10 10 3

millones de clulas Siembra 0.7 2.2 Confluencia 2.8 8.8

MEDIO DE CULTIVO (DMEM COMPLETO): DMEM suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina 2mM, antibiticos (100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina) y aa no esenciales. INACTIVACIN de protenas del complemento del suero ("des-complementacin"): Descongelar una botella de suero a 37oC, aumentar entonces la temperatura del bao (con la botella dentro) hasta 56oC, incubar a esta temperatura 45min, enfriar la botella en bao de hielo y agua, filtrar (opcional, aunque no recomendable), distribuir en alcuotas (25-50 ml) y guardar a -20oC. Para preparar medio de cultivo, usar una alcuota recin descongelada. TEMPERATURA de los medios: Los medios y soluciones que entren en contacto con las clulas han de estar preferiblemente a 37oC (o, como muy bajo, temperatura ambiente), para no alterar el metabolismo celular. Siempre desinfectar con etanol las botellas que pasen por el bao antes de trabajar con ellas. ALMACENAMIENTO de distintos componentes de medios de cultivo, y otros medios/reactivos. A 4oC, stock DMEM, PBS, PBS/EDTA, DMEM completo, suero inactivado con DMSO A -20oC, suero inactivado, tripsina/EDTA, stocks de tripsina, glutamina, antibiticos, aa. Congelacin y siembra de clulas MEDIO DE CONGELACIN. Dependiendo de la disponibilidad de suero, las clulas se pueden congelar en los siguientes medios: DMEM completo, DMEM con 20% suero, o en 100% suero, en cualquier caso suplementados con 10% di-metil-sulfxido (DMSO), como agente crioprotector. El DMSO es bastante txico a esta concentracin, habiendo clulas que lo soportan peor que otras. En cualquier caso, hay que minimizar el tiempo que las clulas pasan a temperatura ambiente en presencia de DMSO. Por ello, es conveniente enfriar las clulas a 4oC cuando se preparan para congelar. Al descongelar, diluir las clulas (que estn en medio de congelacin conteniendo DMSO) con DMEM completo, centrifugar y resuspender en DMEM completo cuanto antes. GRADIENTES DE TEMPERATURA para congelacin y descongelacin. La congelacin de clulas ha de hacerse partiendo de una suspensin de clulas en suero 10% DMSO, a una densidad tal que, cuando vayan a ser sembradas adquieran inmediatamente la densidad adecuada para su ptimo crecimiento. Una cifra bastante estndar es una densidad de 1 milln de clulas / ml, congeladas en alcuotas de 1ml. Tras preparar esta suspensin y separar en alcuotas, las clulas se enfran a 4oC y posteriormente se congelan a -20 oC, 24h, -70 oC, 24h y N2 l (-170 oC), indefinidamente. Si se dispone de un recipiente aislante, que permite una bajada de temperatura gradual, las clulas se pueden poner directamente a -70 oC (24h) y despus transferir a N2 l. El almacenamiento en N2 l es para guardar clulas indefinidamente. Si se requiere slo conservar las clulas unas pocas semanas (1-2 meses), se pueden guardar a -70 oC. Para descongelar clulas, pasar las clulas de N2 l -70oC a un recipiente con hielo seco (-70oC). Una vez que todo el material y medios estn preparados, descongelar las clulas transfirindolas del hielo seco a un bao a 37oC, agitando el criotubo en el agua con la mano hasta su completa descongelacin. Rociar etanol abundantemente, transferir las clulas a un tubo con 10 ml medio completo, centrifugar 5 min a 700 rpm (centrfuga de mesa, temperatura ambiente [room temp., RT]), descartar sobrenadante, resuspender clulas en el

volumen de medio adecuado y transferir a su placa de cultivo a la densidad adecuada (ver Tabla en pgina 4-5). Colocar placa en incubador con 95% humedad y 5% CO2. MEDIDAS ESPECIALES DE ESTERILIDAD al congelar y descongelar clulas. La manipulacin de clulas durante la congelacin y descongelacin es un proceso que conlleva riesgo de contaminar las clulas. Habr de prestarse especial atencin a no tocar las roscas de los tapones de los criotubos, y tras descongelar las clulas en el bao, es esencial esterilizar el exterior del tubo con abundante etanol, antes de abrirlo y manipularlo. Pases de clulas CAMBIOS DE MEDIO. MANTENIMIENTO. La mayora de lneas celulares doblan en cultivo en 24-48h, cuando las condiciones de crecimiento son adecuadas. De esta manera, el nmero de clulas se multiplica en cualquier cultivo en unos pocos das, ocupando toda la superficie de la placa (en el caso de clulas adherentes), y empobreciendo el medio al consumirse los nutrientes y acumularse productos de deshecho en ste. Es por sto que si se desea mantener una lnea en cultivo por ms de unos pocos das, de manera peridica hay que reponer nutrientes y eliminar productos de degradacin. Como normal general, cuando no se disminuye la densidad de clulas, se cambian 2/3 del medio cada 2-3 das; al dejar 1/3 del medio antiguo, si bien se arrastran productos de deshecho, tambin se mantienen sustancias producidas por las clulas y secretadas al medio que son positivas para su crecimiento (en cierta manera, las clulas no se sienten solas en el cultivo, como lo haran con un medio completamente nuevo, lo que inducira una parada o retraso en su crecimiento). Los cambios de medio pueden hacerse con una frecuencia ligeramente flexible, aumentando sta al aumentar la densidad de clulas. Es fcil observar cmo el pH del medio tiende a acidificarse ms rpidamente (se torna naranja-amarillento) cuando la densidad es elevada, al aumentar los productos de deshecho liberados. DILUCIN DE LA DENSIDAD (PASE) DE CLULAS La mayora de lneas celulares que crecen adheridas a plstico sufren una parada en su crecimiento a densidades elevadas, impuesta por el proceso de inhibicin por contacto. Dependiendo de la morfologa y propiedades de cada lnea, las clulas paran de dividirse, bien cuando ocupan toda la superficie de la placa, o bien cuando todas estn en contacto con otras (sin necesidad de cubrir completamente el plstico). A este momento, situacin (o densidad) se le denomina confluencia del cultivo. Nunca se debe dejar un cultivo en confluencia por periodos prolongados, debiendo reducirse la densidad de clulas en se momento, para permitir su crecimiento de forma continuada. Si se quiere mantener la lnea dividindose en una superficie igual a la usada hasta entonces, se descartarn parte de las clulas; si lo que se pretende es expandir las clulas, para aumentar su nmero total, se distribuirn todas las clulas a un nmero mayor de placas, sin tirar ninguna clula. En cualquiera de los dos casos, la densidad de clulas se reduce en un porcentaje que vara para cada lnea, y que suele ser desde un 80% a un 90% (pase 1/5 o 1/10, respectivamente).
(Diluciones excesivas o periodos prolongados en confluencia pueden alterar seriamente las propiedades de la lnea celular, aspecto que se discutir en ms detalle en clase)

Cuando se disminuye un 90% la densidad de clulas, se dice que las clulas se pasan 1/10 (la densidad de reduce a 1/10 de la inicial). Si es un 80%, el pase es de 1/5.

Como ejemplo, si queremos pasar unas clulas 1/5 manteniendo el cultivo en una placa de las mismas dimensiones, simplemente hay que descartar el 80% de las clulas. Si se quiere conservar todas las clulas, para expandirlas, las clulas se habrn de distribuir en 5 placas de la misma superficie que la original. En cualquiera de los dos casos, la densidad se reduce a 1/5, las clulas sufren un pase 1/5, etc. Si las clulas se dividen cada 24h, se puede predecir que (tras 12-24 h de parada del crecimiento tras su siembra), al da 2 habr el doble de clulas que las sembradas, al da 3, cuatro veces, y as sucesivamente. Como ejemplo, tras un pase 1/10, y asumiendo que las clulas no se dividen durante las primeras 24h, da 0 densidad= 100%, por lo que las clulas se pasan dejando densidad 10%. da 1 densidad= 10% da 2 densidad= 20% da 3 densidad= 40% (cambio de medio) da 4 densidad= 80% da 5, las clulas necesitarn ser pasadas de nuevo TRIPSINIZACIN (y otros mtodos de pasar clulas). Para la mayora de lneas celulares que crecen adheridas a un substrato, la forma ms conveniente de levantarlas en una suspensin celular (para poder manejarlas fcilmente en suspensin), es mediante el uso de tripsina (proteasa), que digiere aqullas protenas celulares implicadas en la adhesin celular al soporte.
[En caso que sea importante preservar protenas de membrana, se suele desaconsejar este procedimiento, habiendo de recurrirse a procedimientos mecnicos, como el pipeteo repetido, o el barrido/araado de la superficie de cultivo.]

Para que la tripsinizacin sea efectiva, y para contribuir a debilitar la adherencia de las clulas al soporte, aparte de tripsina, hay que asegurarse de eliminar el suero del medio (que contiene inhibidor de tripsina), as como cationes divalentes presentes en el medio y que median la interaccin clula-sustrato (mediante el uso de EDTA). Para ello, el procedimiento estndar de tripsinizacin es el siguiente (p. ej. para una placa P100) (para otros tamaos de placa ver la tabla anterior): Materiales: * PBS conteniendo 0.004% EDTA (PBS/EDTA) (Mezclar botella 80ml EDTA al 0.02% con 320ml PBS) * Tripsina 0.05% en EDTA (Trip/EDTA) (Mezclar botella 20ml tripsina 0.25% con 80ml EDTA 0.02%) Procedimiento: - retirar el medio de cultivo - lavar 1x (una vez) con PBS/EDTA. - incubar con 1-2 ml solucin de Trip / EDTA, 5 min, RT 37oC (si es posible), hasta que las clulas se vean redondas bajo el microscopio, seal de que su adherencia est muy desminuida. - diluir la tripsina / EDTA en la placa con 8-9 ml de medio completo (con suero); esto detiene la tripsinacin (por el aporte de protenas del suero, el inhibidor de tripsina presente en el suero, y el aporte de Calcio y Magnesio con el medio y el suero). Adems., en el volumen final de 10 ml es fcil pipetear la suspensin para acabar de levantar la clulas (pipetear arriba y abajo, esparciendo la suspensin por toda la superficie de la placa, unas 510 veces, con la energa suficiente (y no ms) como para despegar la clulas). Evitar hacer vaco al pipetear, as como hacer demasiadas burbujas, ya que ambas cosas matan muchas clulas). - si la tripsinazcin ha sido efectiva, todas las clulas de la placa se encontrarn en los 10ml de suspensin, como clulas aisladas, no como agregados. Transferir este

volumen a un tubo estril, y centrifugar 5min a 700rpm. Descartar sobrenadante (este paso es necesario para eliminar tripsina, y sobre todo el EDTA, ya que si no, no se adherirn de nuevo las clulas al sembrarlas) - resuspender el sedimento celular en un volumen adecuado de medio de cultivo (dependiendo de si se van a descartar clulas o no, y del pase elegido) y sembrar en la superficie adecuada. Recuento de clulas Para mantener unas condiciones de cultivo reproducibles entre pases y experimentos, es recomendable sembrar las clulas a la misma densidad (ver tabla arriba), lo cual supone la necesidad de conocer el nmero de clulas en la suspensin preparada (ver punto anterior). La manera ms comn de determinar el nmero de clulas es contando stas en un hemocitmetro (ver Figura 1); como la tripsinizacin y pipeteo de las clulas siempre conlleva algo de muerte celular, es conveniente teir de alguna manera las clulas de forma que se puedan contar clulas vivas y muertas, y el total. Para sembrar de nuevo las clulas, habr que contar, por supuesto, con el nmero de clulas vivas. La distincin entre clulas vivas y muertas se lleva a cabo utilizando colorantes vitales, entre ellos, el ms usado es Azul de Tripano (Trypan Blue), cuyo stock est a una concentracin del 0.4% en tampn fisiolgico (pej. PBS) Continuando con el ejemplo de la tripsinizacin anterior, tomar 20 l de clulas (que al final se van a descartar, o sea que desde este momento no se necesita esterilidad), y mezclar en un tubo eppendorf con 20 l de solucin de trypan blue. Pipetear 10 l de esta nueva suspensin en cada lado del hemocitmetro. (ver Figura 1). Bajo el microscopio, se observar que el hemocitmetro esta equipado con una cuadrcula de 9 cuadrados grandes cada uno subdividido en otros 16 ms pequeos. Debido al diseo de la cmara, el volumen de medio sobre uno de los cuadrados grandes es 0.1 l. El recuento se lleva a cabo sobre dos cuadrados grandes en cada lado de la cmara, de manera que se tengan cuatro determinaciones del nmero de clulas en cuadrado grande, y cuya media ser el nmero de clulas en 0.1 l de la suspensin de clulas en trypan blue. (Para reducir el error de recuento se habr de contar tantos cuadrados como sean necesarios para al menos acumular un mnimo de 100 clulas en total; por tanto, preparar una suspensin que resulte en unas 50 clulas por cuadrado grande es lo ms conveniente.). Teniendo en cuenta las diluciones realizadas, es inmediato llegar a saber el nmero total de clulas en los 10 ml de suspensin preparados en el apartado anterior. Una manera muy intuitiva de hacer estos clculos es como sigue: por ejemplo, si se obtiene 50 clulas por cuadrado grande, habr 50 clulas por cada 0.1 l en el eppendorf, o sea 50x 400= 20.000 clulas en el eppendorf, que proceden de 20 l de la suspensin, o sea 20.000 x (10.000/20) = 10 x 106 clulas en los 10 ml

APARATOS GENERALES DE LABORATORIO DE CULTIVOS Ignacio Tardieu de Chorro

Qu es y de qu consta un laboratorio de cultivos celulares? Un laboratorio de cultivos celulares debe contar con una infraestructura bsica de reas independientes para: Preparacin de Medios de Cultivo. Esterilizacin de Medios y Reactivos. Lavado, esterilizacin y preparacin de materiales. Aparataje de un Laboratorio de Cultivos. Funcionamiento y uso. Y trabajo con cultivos celulares.

Preparacin de Medios y Reactivos. En este caso utilizaremos como ejemplo el sistema de trabajo que se realiza en el CBMSO. En este ejemplo, existen una serie de Tcnicos dedicados enteramente a la preparacin de Medios y Reactivos para uso comn de los usuarios del laboratorio de cultivos. Estos Tcnicos se encargan enteramente de los stocks de medios y dems reactivos para un funcionamiento ms productivo de los trabajos realizados con los diferentes tipos de cultivos celulares. Un buen apoyo Tcnico por parte de estas personas ayuda a una mayor comodidad y un mayor rendimiento, puesto que los usuarios no tienen que preocuparse de la preparacin de Medios y Reactivos. Esterilizacin de Medios, Reactivos.

Desde el punto de vista de los sistemas de esterilizacin se pueden citar los siguientes: Calor Hmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una temperatura de 121oC y una presin de 15 lb. Utilizados para la esterilizacin de soluciones cuyos componentes no se degradan por ste mtodo, material plstico y de vidrio y equipos de filtracin. Calor Seco: lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200oC por espacio de 3 horas. Es empleado para la esterilizacin de material de vidrio particularmente. Filtracin: A travs del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de celulosa con poro de 0.22 0.1 u de dimetro, mediante la aplicacin de presin positiva o negativa. Por ste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solucin de antibiticoantimictico y suplementos

Equipos de filtracin.

En la actualidad se dispone de unidades de filtracin estril (por ej. Millipore, Gelman, ...), muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo, su elevado

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coste por unidad hace que en muchos casos an se empleen unidades reutilizables como pueden ser las unidades Swimmex de Millipore. Estos equipos de filtracin constan o bien de una fuente de vacio conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtracin esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristltica que fuerza el flujo de solucin a travs de una unidad de filtracin hermtica (por ejemplo las ya citadas Swimmex de la empresa Millipore). En ambos casos la esterilizacin se produce al atravesar la solucin un filtro de poro 0.22 um. Autoclave.

Un autoclave es un instrumento que permite la esterilizacin por calor tanto de slidos como de lquidos. La esterilizacin se realiza habitualmente a 121 C, 1 atmsfera de sobre presin durante un tiempo superior a 20 min. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presin, y en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material slido (material de vidrio, instrumentos quirrgicos, tubos,...).

Lavado, esterilizacin y preparacin de materiales. Los Materiales ms comunes en un laboratorio de cultivos son: Vidrio: Prcticamente todos los Medios se preparan y esterilizan para su almacenamiento y clasificacin, en botellas de vidrio. Tambin utilizaremos diferentes tipos de pipetas de cristal, probetas, vasos y matraces para el trabajo rutinario del Laboratorio.

Plstico: Todo el trabajo que se desarrolla en un Laboratorio de cultivos se hace en plstico. Todos los cultivos se hacen en diferentes modelos de placas de plstico y en botellas.

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MODELOS DE DIFERENTES PLACAS Y BOTELLAS PARA CULTIVOS CELULARES

Contamos tambin con una gran variedad de tubos de ensayo para el desarrollo de una forma efectiva de diferentes tcnicas y rutinas dentro del laboratorio.

Cada tipo de material se utiliza para diferentes funciones, as como todos los materiales de cristal se utilizaran para la preparacin y almacenamiento de medios y reactivos, todo el plstico nos servir para la preparacin de alcuotas de los diferentes reactivos y con esto conseguiremos realizar diferentes stocks para una rpida preparacin de medios y reactivos utilizados en las rutinas de un Laboratorio.

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El lavado, preparacin y esterilizacin de dicho material ser hecho en los cuartos destinados a dicho fin.

Aparataje de un Laboratorio de Cultivos. Funcionamiento y uso. Los aparatos ms comunes dentro de un Laboratorio de cultivos son: Cabinas de Flujo

Su funcin es la de mantener un rea libre de partculas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecnico que fuerza el paso del aire a travs de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del 99.999 % retiene las partculas por debajo de un cierto calibre que es en general de 0.2 um. En la Figura 2.1 se representa una seccin de filtro HEPA. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partculas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de conveccin. Tal como ya se ha indicado, las cabinas de flujo laminar pueden ser de dos tipos: flujo vertical y flujo horizontal, dependiendo de la posicin del filtro HEPA y por ello de la direccin del flujo laminar (ver figura 2.2). Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se disean con diferentes propsitos: a. Proteccin personal: proteccin del personal de los posibles agentes dainos del interior de la cabina. b. Proteccin del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores o de la contaminacin cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina. c. Proteccin medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes.
Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena proteccin del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algn tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto. En las cabinas de flujo vertical, ms sofisticadas, se segura una buena proteccin del producto, y, dependiendo de su diseo se puede asegurar una proteccin total del operador. Son por ello ms adecuadas para el trabajo con agentes

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peligrosos.

Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseo de la cabina se trata de cabinas de clase I, II o III.
1. Cabina de clase I.

Se trata de una unidad de contencin parcial adecuada para la manipulacin de agentes de bajo riesgo, donde existe una necesidad de proteccin del operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinas normalmente denominadas "de gases", y no son de uso comn en el laboratorio de cultivo de tejidos. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p. 142.
2. Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y al medio ambiente. En general las cabinas de clase II se describen como un equipo de proteccin con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar estable en el interior, con una filtracin HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtracin HEPA del aire exhausto (de salida al medio). Los sucesivos diseos que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases : a. Tipo A. En este tipo (figura 2.3.B) el 30 % del aire es eliminado en cada ciclo y el 70 % es recircularizado. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal. b. Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general (figura 2.3.C), y en ella se recirculariza slo el 30 % del aire en cada ciclo, eliminndose el 70 % del aire restante. c. Tipo 100 % exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100 % del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos (figura 2.3.D). Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de toxicologa en los que se requieren reas de contencin limpias y eliminacin del aire posiblemente contaminado. Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la proteccin del usuario, superior en el caso del tipo A, y a la eliminacin de la cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro HEPA. La tipo A, que es la ms adecuada para el trabajo con agentes patgenos particulados (filtrables) es la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos. Asimismo se ha de tener en cuenta que el funcionamiento correcto para la proteccin del producto y del personal depende de una correcta calibracin del instrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire en el sistema y de flujo vertical. El punto de calibracin o ajuste es

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dependiente del instrumento y debe ser realizado por personal especializado cada 6 a 9 meses de funcionamiento para asegurar la proteccin al usuario. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p. 143. 3. Cabina de clase III. Se trata de una cabina de seguridad, estanca, para el trabajo con agentes biolgicos de alto riesgo. Permite mantener al agente patgeno en un ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtracin y disolucin de stos. Figure de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3rd edit, CDC (Center for Disease Control) / NIH (National Institutes of Health), p. 145. Incubadores de CO2.

El mantenimiento de la temperatura en una atmsfera con una tensin controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2.
Un incubador moderno dispone de :

1. dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la funcin en caso de anomala. La estabilidad de la temperatura es una caracterstica esencial del incubador, y por ello suelen estar equipados con camisas de agua ('water jacketed') que incrementan notablemente la inercia trmica. Como consecuencia la estabilizacin de un incubador puede tardar varios das. 2. dispositivo de inyeccin de una mezcla de aire y CO2, en la proporcin deseada, entre el 4 y el 7 %. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyeccin. El control de la mezcla se realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer") . En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO2 presente en la cmara de incubacin, y realiza las correcciones necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la prdida de calibracin que se produce peridicamente. para evitarlo algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibracin peridica (basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor x de CO2). 3. dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada, a fin de reducir la evaporacin de

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agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los pocos das en caldos de cultivo. En los instrumentos ms modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosfrica, inyectando agua estril y filtrada. 4. dispositivo de recircularizacin de aire. Es importante una recirculacin del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior. Si adems en el circuito de circulacin de aire se intercala un filtro HEPA se consiguen eliminar las posibles partculas contaminantes, y se asegura la esterilidad del ambiente. Las condiciones del cultivo: temperatura, humedad atmosfrica y niveles de CO2 son caractersticos de cada lnea celular. El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%. Puedes encontrar informacin de actualidad en los sitios Web de las empresas que fabrican estos incubadores: Forma, Revco, Jouan, ...
Microscopios.

El control morfolgico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (ms de 3 cm. en el caso de frascos de Roux de 250 ml) hace que un microscopio convencional no sea adecuado (por su pequea distancia frontal), por lo que se han desarrollado microscopios de diseo original, en los cuales la fuente de iluminacin y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio ptico convencional (figura 2.5). La segunda caracterstica que condiciona el instrumento ptico es su ausencia de color, es decir se trata de muestras vivas y con poco contraste. El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo). De esta forma el contraste de la imagen aumenta y la calidad obtenida es muy superior. Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captacin de imgenes, fotogrfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos. Congeladores e instalacin de criogenia (depsito de N2 lquido)

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Es recomendable que los congeladores y la instalacin de criogenia estn en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio. Es preciso el almacenamiento de soluciones y clulas a diferentes temperaturas, para lo que se requiere: 1. neveras (4 C) para el almacenamiento de medios, PBS, ... 2. congeladores de -20 C para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibiticos) y soluciones enzimticas (tripsina, colagenasa,...). 3. congeladores de -80 C para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibiticos,...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitogenos, inductores,...).

4. unidad de almacenamiento en nitrgeno lquido (-196 C), para el almacenamiento de las lneas celulares.

Otros instrumentos : centrfugas, contador de clulas electrnico ("cell counter"), equipo de purificacin de agua, balanzas, pH-metro, pipeteadores... Adems del equipo antes citado el laboratorio de cultivo de tejidos deber estar equipado con otros instrumentos que, o bien no son imprescindibles para un laboratorio de tamao pequeo (por ej. el contador electrnico de clulas), o bien son instrumentos que forman parte de un laboratorio de uso ms general (centrfugas, equipo de purificacin de agua, balanzas, pH-metro, pipeteadores...). Centrfugas. En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrfuga refrigerada, preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeo volumen (1 a 2 ml) a botellas de gran capacidad (250 a 500 ml). Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastar con un instrumento que desarrolle hasta 2000 xg.

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La centrfuga se ha de instalar dentro de lo posible alejada de las cabinas de flujo laminar, para evitar las turbulencias de aire que genera. Contador electrnico de clulas ("cell counter"). Un contador electrnico de clulas es un instrumento capaz de contar y medir partculas en suspensin. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar que posteriormente se han desarrollado mtodos alternativos es an hoy en dia el mecanismo ms empleado.
El sistema est formado por los siguientes elementos :

1. dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeo orificio que se introduce en la suspensin de partculas a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensin. El tubo con el orificio est conectado a un manmetro de mercurio y a una bomba. El manmetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexin y desconexin de los electrodos. 2. un amplificador electrnico de la seal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los electrodos. Cuando la vlvula que controla el manmetro se abre 0.5 ml de la suspensin entran en el interior del tubo por el pequeo orificio. Durante ese tiempo los electrodos estn conectados y registran y transmiten al equipo de amplificacin y anlisis de la seal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una clula atraviesa el orificio se produce una variacin de la resistencia proporcional al tamao. Estos datos se registran y se analizan.
Cmara de Neubauer.

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La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.

Equipo de purificacin de agua. Es de gran importancia en la preparacin de los medios, de los aditivos, o en cualquier solucin que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteracin al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de la mxima calidad (tipo MilliQ, Millipore) obtenida mediante equipos de doble destilacin o de intercambio inico y filtracin. Es muy importante la eliminacin de apirgenos, y restos de materia orgnica. Pipeteadores y Micropipetas

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Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medicin de fluidos. Los de uso comn en el laboratorio como las pipetas automticas y las pipetas, pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta, manuales o elctricas que permiten la aspiracin mecnica del fluido. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la proteccin del operador. El aire bombeado es filtrado previamente.

LAVADO, ESTERILIZACIN DE MATERIALES DE CULTIVOS, PREPARCIN DE MEDIOS DE CULTIVOS, MANTENIMIENTO DE STOCKS, GESTIN DE TODO EL TRABAJO.

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Juan Rebelles

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ESTERILIZACION Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS CELULARES

Tanto en cultivos celulares de cllas eucariticas, as como de microorganismoses imprescindible que todo el material que se utilice est privado de toda clase de microorganismos, ya sean saprofitos o patgenos. Esterilizar es destruir todo vestigio de vida. Mtodos fsicos de esterilizacin Calor directo Calor seco Flameado Horno Pasteur Asas, Varillas, Placas, Tubos Material de vidrio, Placas, Tubos , pipetas

Calor Hmedo

Autoclave tyndalizador Medios de cultivos, Apsitos Hervidor

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Filtracin

Bujas filtrantes filtros de membrana Lquidos filtros Seitz de placa

COMPOSICIN DE DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVOS: HSC 2002

76 77 78 79

DMEM / F-12 comercial HEPES 1M (comercial) GLUCOSA G- 7021 de Sigma Albumax al 0.5 % Se agita durante 1 hora exacta

1 litro 5 ml 6 gs 5 gs

HSC 2002 medio de congelacin 76 77 78 79 DMEM / F-12 comercial HEPES 1M (comercial) GLUCOSA G- 7021 de Sigma Albumax al 5 % 100 ml 500 l 0.6 gr 5 gr

Tripsina 0,25 % 81

(Edificio nuevo) Difco rf. 215240 2,5 gr

Tripsina

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PBS 10 X 8 glucosa Rojo fenol 1 % H2O hasta

100 ml 1,1 gr 1,5 ml 1 litro

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PBS BSA 1 % PBS 10 X 8 80 Glucosa BSA 1 % H2O hasta 100 ml 1.19 gr 10 gr 1 litro

LOCKES Solucin PH 7.4 3 4 10 2 8 47 Cloruro sodico Na CL Cloruro potasico K CL Bicarbonato sodico Na H CO3 Cloruro calcico Ca CL2 (2H2O) Glucosa Hepes H2O hasta 9 gr 0.32 gr 0.30 gr 0.29 gr 1.11 gr 2.38 gr 1 litro

McCoYs 82 10

PH= 7,2 McCoYs Bicarbonato sodico Na H CO3 H2O hasta 11.9 gr 2.2 gr 1 litro

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GLUTAMINA 200 mM 21
L - glutamina

29,23 1 litro

dH2 O hasta

Se aade 10 ml / litro de medio de cultivo

Se esteriliza por filtracin a presin con membranas de 0,2 , 0,45 , y prefiltro Se reparte en alicuotas de 10 ml Se almacena a 20C

AMINOACIDOS NO ESENCIALES 100 X 16 18 14 15 29 L -alanina L asparagina dH2 O L cido aspartico L cido glutamico L - prolina dH2 O hasta
Se reparte en alicuotas de 10 ml

3,92 gr 6 gr 5,32 gr 5,88 gr 4,6 gr 1 litro

Se esteriliza por filtracin a presin con membranas de 0,2 , 0,45 , y prefiltro Se almacena a 20C
Se ajusta con NaOH (sosa) 10 N el pH a 7

ROJO FENOL 1 %

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Rojo fenol NaOH 1N

dH2 O hasta

2,5 gr 8,12 ml 250 ml

Se esteriliza en autoclave 15 min. a 120 C

Se almacena a 4C

BSS
2

Ca CL2 2H2 O Na CL K CL Mg SO4 7H2 O CL2 Mg 6H2 O KH2 PO4 Na2 H PO4 Rojo fenol 1% dH2 O hasta

1,5 gr 80 gr 4 gr 2 gr 2 gr 0,6 gr 5 gr 10 ml 10 litros

3 4 42 44 11 12

pH 7,2..7,4

(se filtra y se guarda a 4C)

EDTA 0,02%

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EDTA PBS 10 X

0,2 gr 100 ML 1,5 ml 1 litro

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Rojo fenol 1% dH2 O hasta

Se reparte en alicuotas de 80 ml Se esteriliza en autoclave 15 min. a 120 C Se almacena a 20 C

PBS 10 X 3 4 12 11 Na CL K CL PO4 HNa2 12H2O PO4 H2K dH2O hasta 800 gr 20 gr 289,6 gr 20 gr 10 litros

Se esteriliza en autoclave 20 min. a 120 C Se hacen alicuotas de 1 litro Se almacena a 4C

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PBS 1X 3 4 12 11 Na CL K CL PO4 HNa2 12H2O PO4 H2K dH2O hasta 8 gr 0,2 gr 2,9 gr 0,2 gr 1 litro

Se esteriliza en autoclave 20 min. a 120 C Se almacena a 4C

CLORURO POTSICO 20% 4 Cloruro potsico dH2O hasta 50 gr Se guarda a 4C 250 ml

ANTIMICOTICO 200 Mg / L ( 0,02 % )

1 Antimicotico dH2O Se guarda a 4C Se disuelve calentando a 60 C hasta 0,2 gr 1 litro

MEDIO M 3
42 2 59 Sulfato de magnesio 7H2O Cloruro clcico 2H2O Glutamato potasico 4,40 gr 1 gr 7,88 gr

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63 39 8 61 62 66 14 31 30 18 21 29 20 16 34 27 24 25 32 28 64 22 33 17 26 69 65 9

Glutamato sdico dihidrogeno fosfato Na dihidratado (Na H2 PO4 2H2O) Glucosa Acido Oxalactico Bis-tris TC- yeastolate cido aspartico Threonina Serina Asparagina Glutamina Prolina Glicina Alanina Valina methionina Isoleucina Leucina tirosina Phenylalanina B- alanina Histidina HCl Trytophano Arginina Lisina HCl cisteina HCl Colina HCl Hidrogeno carbonato K dH2O hasta

6,53 gr 0.8 gr 10 gr 0,25 gr 1,05 gr 1 gr 0,30 gr 0,50 gr 0,35 gr 0,30 gr 0,60 gr 0 40 gr 0,50 gr 1,50 gr 0,40 gr 0,25 gr 0,25 gr 0,40 gr 0,25 gr 0,25 gr 0,25 gr 0,55 gr 0,10 gr 0,50 gr 0,85 gr 0,20 gr 0,05 gr

(ojo)

0,50 gr 1 litro

Se ajusta el pH a 6,6 con Na OH 1% (ojo) se aade el hidrogeno carbonato k despus de ajustar el pH a 6,6 y se vuelve a ajustar el pH a 6,8

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TC- 100
49 TC-100 Se ajusta a pH a 5 con cido clorhdrico (H CL) 10
Bicarbonato Na (HCO3 Na)

20 gr

0,35 gr

Se ajusta el pH a 6,2 con Hidrxido potasico 10 N dH2O hasta 1 litro

Se esteriliza por filtracin a presin con membranas de 0,2 , 0,45 , y prefiltro Se almacena a 4C

Hidrxido potasico 10N

51 Hidrxido potasico (KOH) dH2O Se almacena a 4C hasta 28 gr 50 ml

Tripsina EDTA 10X comercial 54 Tripsina EDTA 10X PBS 10 X dH2O hasta 100 ml 100 ml 1 litro

Se esteriliza por filtracin a presin con membranas de 0,2 , 0,45 , y prefiltro Se almacena a 20C

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PBS 1X completo
PBS 10 X 2 44 Cloruro clcico (Ca Cl2 2H2 O) Cloruro de magnesio (Mg Cl2 2H2O) dH2O hasta 1 litro 1,32 gr 1 gr 10 litros

Se esteriliza por filtracin a presin con membranas de 0,2 m, 0,45 m, y prefiltro Se almacena a 4C

RPMI
38 10 RPMI Bicarbonato Na (CO3 H Na) dH2O hasta 104,2 gr 20 gr 10 litros

Se gasea con CO2 Se esteriliza por filtracin a presin con membranas de 0,2 , 0,45 , y prefiltro Se almacena a 4C Mezcla de antibiticos 6 35 Estreptomicina sulfato Penicilina G 1580 u / mg dH2O hasta 10 gr 6,32 gr 100 ml

Estreptomicina sulfato (100 mg / ml) Penicilina G 1580 u / mg (105 u / ml)

Se utiliza a 1 / 1000
Se esteriliza por filtracin a presin con membranas de 0,2 , 0,45 , y prefiltro Se almacena a 20C

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CARMEN PUNZON Clulas linfocitarias, y cultivos en suspensin.

Congelacin de lineas celulares 1. Crecer la linea celular en placas p100 (o flash 75 ) en fase media de crecimiento logaritmico. 2. Marcar el vial de congelacin con nombre de la linea celular, nmero de clulas, y fecha. 3. Transferir las celulas a un tubo de centrifuga. En caso de clulas adherentes al plastico se deben despegar. 4. Centrifugar las clulas 5 min. A 1200rpm, temperatura ambiente. Deshechar el sobrenadante. 5. Aadir medio de congelacin al pellet celular lentamente (gota a gota hasta aproximadamente 1ml), concentracin final de clulas debe ser de 5-10 millones clulas/ml. El medio de congelacin es Suero con 10%de DMSO. 6. Transferirle vial con las clulas resuspendidas en medio de congelacin a una caja de congelacin a -70C. 7. Transferir las clulas a un tanque de nitrogeno liquido.

Descongelacin de lineas celulares 1. Coger el vial congelado de -70C o tel tanque de nitrgeno y ponerlo en nieve Carbnica para disminuir el proceso de descongelacin. 2. Colocar el vial en un Bao a 37C. Mover el vial hasta que las clulas esten descongeladas. 3. Limpiar el vial con etanol 70%. 4. Transferir con una pipeta del pellet a un tubo de centrfuga y aadir lentamente 9ml de medio, tapar el tubo y centrifugar a 1200 rpm, temperatura ambiente y Deshechar el sobreadante. 5. Resuspender las clulas en medio y transferir a una placa de cultivo o flask. 6. Mirar las clulas en un microscopio invertido.

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Obtencin de esplenocitos 1. Depositar el bazo en una placa Petri (p100) que contenga de 8-10ml de medio RPMI completo sin suero. 2. Se coge por la parte inferior una jeringa de 20ml estril de tal forma que lo que tenemos en el extremo superior es el mbolo. Con el embolo, se aplastan los bazos depositados en un filtro de nylon situado en un tubo falcon de 50ml, asi hasta que queden completamente disgregados., aadiendo medio RPMI. 3. La suspensin de clulas obtenidas de los bazos que hay en el tubo, se centrifugan a 1500 rpm, temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. 4. Lisis de eritrocitos: resuspender el pellet celular en 1-3 ml de tampn de lisis a 4C y dejar en esta solucin 1-2 minutos sobre hielo. 5. Aadir 20ml de RPMI sin suero y centrifugar de nuevo. 6. Resuspender el pellet de las clulas en RPMI con 5% de suero, contar las clulas y plaquear . 7. Dejar las clulas 48-72 horas para ver proliferacin.

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Clonaje de hibridomas 1. Contar clulas viables usando un hemocitometro y azul tripan. Las clulas resuspendidas en RPMI con 10% de suero. 2. Preparar una placa de 96 pocillos. 3. Cacular las clulas para poner una clula por pocillo y 10 clulas por pocillo. 4. Esperar que las clulas formen clones. 5. Una vez formado los clones expandir a una placa de 48 pocillos y asi sucesivamente . Es conveniente congelar en cada paso por posibles contaminaciones. 6. Recoger sobrenadante para testar el anticuerpo monoclonal.

Isabel Liste Noya Cultivo y diferenciacin de clulas ES.

Guin Curso de Cultivos Celulares 2008

Tcnicas de cultivo y diferenciacin de clulas madre embrionarias (ESCs)

Isabel Liste; CBMSO, lab 305 Objetivo del curso: El estudio de las clulas madre, y en concreto, de las clulas madre embrionarias (ESCs), esta teniendo una enorme importancia en el desarrollo de futuras terapias celulares para

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enfermedades degenerativas y el cncer, siendo adems una excelente herramienta para el estudio del desarrollo embrionario temprano. Este curso pretende introducir y familiarizar al alumno con la puesta en cultivo y el posible uso/aplicacin de estas clulas. Partes del Curso: El curso se dividir en: 1 - Una introduccin terica 2 - Demostracin/observacin al microscopio de los distintos tipos celulares y tcnicas antes descritas. 3 - Prcticas en el laboratorio de cultivos: 1. Introduccin terica: - Definicin de clulas madre, caractersticas y tipos. - Definicin de clulas ESCs (embryonic stem cells), caractersticas, obtencin, cultivo y aplicaciones. 2. Demostracin/Observacin: - Observacin al microscopio de los distintos tipos celulares y tcnicas descritas en la introduccin terica. 3. Prcticas en el laboratorio de cultivos: - Obtencin/derivacin de fibroblastos embrionarios de raton (MEF); cultivo, congelacin/descongelacin. - Cultivo, congelacin y descongelacin de clulas estromales (PA6). - Preparacin de las clulas nodrizas para su uso en el crecimiento y diferenciacin de clulas ESCs. - Siembra y observacin de clulas ESCs. Tipos celulares que se van a utilizar: A) Clulas nodrizas o feeder-layers - Fibroblastos de ratn (MEF) (cultivo primario obtenido de embriones de ratn) y humanos (hFF) (derivados de la piel); usados para el crecimiento, expansin de clulas ES. Derivacin, cultivo, congelacin y descongelacin. - Clulas estromales de ratn (PA6; OP9); usados como nodrizas para la diferenciacin de clulas ES. Cultivo, congelacin y descongelacin. B) Clulas ES de ratn - Usaremos una o dos lneas comnmente utilizadas y ampliamente caracterizadas (R1 y/o E14).

BREVE INTRODUCCION TEORICA

Definicin de clula troncal o stem cell y tipos: Podemos definir, a nivel muy general, una clula troncal como: aquella clula capaz de autoreplicarse/ renovarse y que puede diferenciarse hacia clulas mucho mas especializadas. En

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funcin de su capacidad de diferenciacin se pueden distinguir distintos tipos de clulas troncales: 1) Totipotentes. Son las clulas procedentes de las primeras divisiones despus de la fertilizacin del vulo (estadio de mrula); pueden dar origen tanto a tipos embrionarios como extra-embrionarios. 2) Pluripotentes: Clulas derivadas del blastocisto embrionario, que pueden dar lugar, tras su diferenciacin , a clulas de las tres lneas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Recientemente se ha conseguido la induccin de clulas pluripotentes (iPS) a partir de clulas somticas humanas, simplemente mediante la introduccin gentica de 4 factores (Takahashi y col., 2007). 3) Multipotentes: Solo pueden producir un determinado tipo de linaje, prximo a ellas ( por ejemplo, las clulas troncales neurales pueden diferenciarse solo hacia: neuronas y glia). 4) Unipotentes: Clulas que solo pueden producir un tipo celular, aunque si tienen la capacidad de auto-renovacin (por ejemplo stem cells del msculo).
Fig. 1. Esquema representando los distintos tipos de clulas troncales atendiendo a su capacidad de diferenciacin.

Definicin, caractersticas y cultivo de las clulas troncales embrionarias o ES. Son clulas derivadas de la masa celular interna del blastocisto embrionario (3.5 das postfertilizacin en ratn y 5-6 das post-fertilizacin en humano) (Thomson y col., 1998; Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981). Se caracterizan por su capacidad de proliferacin o autorenovacin y por su pluripotencia y gran plasticidad a nivel de diferenciacin. De tal forma, que podran generar todos los tipos celulares de un organismo si se les diferencia en las condiciones adecuadas. En general, para el mantenimiento de sus propiedades durante la proliferacin/expansin necesitan de una capa de clulas nodrizas. Las nodrizas mas ampliamente usadas son los fibroblastos embrionarios de ratn (MEF) que se han venido utilizando tanto para el crecimiento de ES de ratn (mES) como ES humanas (hES). Sin embargo, en estas ultimas, se tiende a sustituir los MEF por fibroblastos humanos (hFF), con el fin de evitar contaminaciones cruzadas o infeccin con virus de origen murino. Las celulas mES necesitan para su proliferacin

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de la adicin al medio de una citoquina, LIF (Leukemia inhibitory factor), mientras que en hES se usa un factor de crecimiento, el FGF2.
Fig. 2. Fotos en contraste de fase de colonias de clulas troncales embrionarias de ratn (mES; foto izquierda) y de hES (foto derecha) creciendo sobre clulas las nodrizas, MEF.

Diferenciacin de clulas ES en cultivo: mtodos Para la diferenciacin de las clulas ES se han usado tres mtodos diferentes (segn el tipo celular a generar) (Keller, 2005). 1) Formacin de cuerpos embrionarios (EBs), en el cual las clulas ES se agregan entre ellas generando estructuras tridimensionales en flotacin, no se usan clulas nodrizas. 2) El segundo mtodo consiste en la diferenciacin de ES directamente sobre clulas nodrizas, generalmente se usan clulas estromales de ratn. 3) Como mtodo alternativo tambin se ha usado la diferenciacin sobre una monocapa de protenas de la matriz extracelular. Mediante el empleo de los protocolos anteriores, se han conseguido generar hasta el momento un elevado nmero de clulas especializadas o precursores representativos de las tres lneas germinales (ver tabla adjunta a modo de resumen). 1) Diferenciacin hacia ectodermo: incluyendo clulas de la piel, cornea, y diferentes tipos de clulas neurales y neuronales (neuronas dopaminrgicas, motoneuronas, oligodendrocitos, etc.). 2) Diferenciacin hacia linaje mesodrmico: como la derivacin de osteoblastos, condrocitos, cardiomiocitos, clulas hematopoyticas y diferentes tipos de clulas sanguneas. 3) Diferenciacin hacia endodermo: cabe destacar principalmente la derivacin de clulas pancreticas y hepatocitos a partir de clulas ES. Fig.3. Esquema representativo de los 3 diferentes protocolos usados para diferenciar clulas ES (Keller, 2005).
Tabla 1. Tabla resumen de los diferentes tipos celulares especializados obtenidos hasta el momento despues de la diferenciacin de celulas ES humanas. (Metallo y col. 2008).

Posibles aplicaciones de las clulas troncales embrionarias: Dadas sus caractersticas, las posibles aplicaciones de las clulas ES son mltiples: A) Terapia celular: se podran utilizar para generar clulas y tejidos de reemplazo para tratar muchas enfermedades y lesiones, incluyendo: Enfermedad de Parkinson, diabetes, lesin

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traumtica de la medula espinal, lesiones de la piel, etc. B) Estudio a nivel molecular y celular del desarrollo embrionario temprano. Muy poco conocido hasta el momento, sobre todo en humanos. C) Screening y desarrollo de nuevas drogas/frmacos. Las clulas especializadas derivadas de ES (diferentes subtipos neuronales, clulas pancreticas, etc.) podran, en un futuro, servir para el testaje de nuevos frmacos y para estudios de excitotoxicidad. D) Modelos de enfermedades in vitro. Al igual que en el caso anterior, las clulas diferenciadas pueden servir para la obtencin de modelos de diferentes enfermedades en una placa de cultivo, disminuyendo la necesidad del uso de animales. A pesar del enorme potencial que suponen las clulas ES, existen limitaciones en su uso por el momento, asociadas a : 1) La gran controversia a nivel tico/moral que suscitan. 2) Falta todava de condiciones definidas de cultivo y diferenciacin. 3) La gran heterogeneidad de los cultivos celulares obtenidos tras la diferenciacin y la presencia de clulas indiferenciadas que podran causar tumores in vivo, etc. Bibliografa - Bryja V. y col. (2006). Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat. Protoc. 1: 2082-87. - Evans MJ. And Kaufman M. (1981). Establishment in culture of pluripotential stem cell lines from mouse embryos. Nature 292: 151-56. - Hovatta O. y col. (2003). A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction 18: 140409. - Keller G. (2005). Embryonic stem cell differentiation: emergence of aa new era in biology and medicine. Genes Dev. 19: 1129-55. - Martin GR. (1981). Isolation of a pluripotent stem cell line from early Mouse embryos cultured in mdium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-38. - Metallo CM. Y col. (2008). Engineering tissue from human embryonic stem cells. J. Cell. Mol. Med. 12: 709-29. - Takahashi K. y col. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-72. - Thomson JA. y col. (1998). Embryonic stem cells derived from human blastocysts. Science 282: 1142-45.

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COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE LOS DISTINTOS TIPOS CELULARES.

Mouse stromal cells (PA6) medium

MEM (Gibco, ref: 32571-028) 10% FBS (Gibco, ref: 10270-106) 1% L-Glutamine

PA6 freezing medium

80% PA6 medium 10% FBS 10% DMSO

hF/ MEF medium

DMEM 10% FB

hF/ MEF freezing medium

80% medium 10% FBS 10% DMSO

Mitomycin C (Roche)

Use 10 g/ml (stock 1mg/ml), medium (PA6 or MEF). Remove the old medium and add new medium with Mitomycin for 2-4 hours (at 37oC). After that, wash the cells with PBS, trypsinize, count the cells, and plate them again in plates of your election. Mitomycin C can be used also at 1 g/ml for overnight treatment of the cells.

mESC proliferation medium (500ml)

500 ml Knockout medium (Gibco) 75 ml 15% Knockout Serum Replacement (Gibco) 5 ml 200 mM L-Glutamine (Gibco) 5ml 1:100 non-essential aminoacids 5ml 10.000 U/ml pen/strep 500l 1000U/ml LIF (ESGRO) 1ml 0.1 mM -ME

mES freezing medium

90% FBS (Gibco) 10% DMSO )

mESC differentiation medium (example of differentiation into dopaminergic neurons, Barberi et al., 2003; Nat. Biotechnol.)
SRM (=proliferation medium without LIF) 200 ng/ml Shh (2 l Shh/3 ml medium) stock: 0,311 g/ l 20-100 ng/ml FGF8 (0,8-4 l/ml medium) stock: 25 ng/ l 10 ng/ml bFGF (1 l/ml) stock: 10ng/ l 200 M AA (2 l/ml) stock: 100mM 20ng/l BDNF (1 l/ml) stock: 20ng/ l 30 ng/ l GDNF (3 l/ml) stock: 10ng/ l N2

mESC differentiation protocol (Barberi et al., 2003)

Basically the protocol is based on plating mES cells in low density on stromalfeeders (we use PA6

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cell line, from Riken Cell Bank, Japan), and posterior factor and media addition as follows:
Day: 0 5 8 11 14
SRM SRM + FGF8 N2 + FGF8 + Shh N2 + AA +BDNF + Shh + FGF2 + GDNF

Derivacin de fibroblastos embrionarios de ratn (MEF) Equipamiento requerido:

- Cabina de cultivos - Incubador a 37oC con 5% de C02 - Lupa de diseccin - Centrifuga

Material requerido:

- Ratones (hembras) de 13-14 das de gestacin - Tijeras de diseccin - Etanol 70% - Pinzas - Pipetas - Placas cultivo - Tubos Falcon

Medios y Tampones:

- PBS fro (sobre hielo) - Tripsina (0.25%) - Medio cultivo MEF (DMEM 1X + 10 % FBS + Antibitico) - Medio congelacin MEF (medio MEF + 10% FBS + 10% DMSO).

Protocolo a seguir:

- Decapitacin de la hembra gestante - Rociar el abdomen con etanol 70% - Separar el tero conteniendo los embriones, depositarlo directamente en PBS fro (placa Petri o tubo de 50 ml) - Abrir los sacos embrionarios vitelinos dejando los embriones al descubierto - Lavar los embriones con PBS limpio y frio. - Eliminar la cabeza y todas las visceras de cada embrin. - Pasar a otra placa con PBS y seccionar lo mas posible. - Pasar los trozos a un falcon y aadir 3 ml de tripsina/EDTA (0.25%). - Incubar a 37 aprox. 30 min. - Aadir 7 ml de medio (MEF) y pipetear 20-30 veces. - Dejar reposar hasta que se forme un pellet en el fondo del falcon. - Eliminar el sobrenadante y repetir el proceso de disgregacin. - Aadir mas medio y centrifugar 5 min a 900 rpm. - Resuspender en suficiente medio, segn pellet. - Sembrar en placas de 10 o 15 cm. - Dejar crecer las clulas hasta que estn confluentes y congelar parte de ellas. - Otra parte puede ser tripsinizada y pasada a nuevas placas, para su uso y mantenimiento.

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MICROBIOLOGIA Miguel Remacha

MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROORGANISMOS
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. Composicin de un medio de cultivo: - componentes indispensables: agua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgnicos (P, N, Mg, S, etc.) - componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agaragar), tampones, indicadores de pH, etc. Tipos de medios de cultivo: a) En funcin de su consistencia: - medios lquidos - medios slidos (en tubo, en placa) - medios semislidos b) En funcin de su composicin: - medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura) - medios sintticos c) Existen medios de cultivo cuya composicin permite el crecimiento de una gran diversidad de microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario). Otros en cambio, se utilizan para la seleccin de determinados grupos de organismos, o se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiolgicas o test bioqumicos. - medios selectivos - medios diferenciales - enriquecimientos - medios para test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir de azcares, etc.).

Preparacin de medios de cultivo: Caldo comn. Composicin por litro: Extracto de carne 3g Peptona bacteriolgica 10 g Cloruro sdico 5g Para prepararlo, se aaden los distintos componentes en un matraz, se disuelven en agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 y se lleva al volumen final correspondiente. Posteriormente, se reparten en tubos o matraces. Los recipientes se aslan con tapones metlicos o de algodn graso envuelto en gasa y se esterilizan a 1 atm de sobrepresin durante 20 minutos.

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Agar nutritivo. La composicin es la misma que la del caldo comn, pero se aade antes de esterilizar 15 g de agar por litro, disolvindolo durante la esterilizacin. Cuando an est caliente, se agita para hacer la disolucin de agar homognea y se extiende en placas (a 45C) y en tubos, que seguidamente son inclinados para obtener una superficie ms extensa. Medios selectivos. El resto de los medios utilizados ya vienen premezclados en forma deshidratada y listos para su reconstitucin. Las principales caractersticas a destacar de su composicin son: Agar de McConkey (MC). Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que vira hacia rojo a pH cido cuando la lactosa es fermentada. Adems, contiene sales biliares que inhiben el crecimiento de muchas bacterias, especialmente Gram positivas. Agar Baird Parker (BP). Contiene telurito potsico, que lo hace selectivo (al inhibir a las bacterias gram negativas) y diferencial (al utilizarlo como acceptor electrnico) adems de yema de huevo (para detectar actividad lecitinasa). ESTERILIZACIN La presencia de microorganismos en todos los medios ambientales hace imprescindible que para estudiar una bacteria determinada sea necesario destruir todas aquellas que pudieran encontrarse contaminando los medios o los instrumentos de trabajo. Esto se consigue mediante la ESTERILIZACION, consistente en la destruccin de todo microorganismo. Vamos a utilizar especialmente el calor como mtodo de esterilizacin. Los medios con contenido acuoso han de ser esterilizados en el AUTOCLAVE mediante calor hmedo, obtenido por calentamiento en un depsito hermtico que contiene agua y del que previamente ha sido evacuado el aire. En este sistema el vapor de agua sobrecalentado difunde muy rpidamente, haciendo que los elementos termosensibles de las clulas se desnaturalicen, especialmente sus enzimas. Por lo tanto, una vez preparados los medios de cultivo hay que proceder a su esterilizacin en autoclave, realizada habitualmente a 1 atm de sobrepresin (121C) durante 15 20 min., salvo en el caso de medios cuyos componentes sufran alteraciones tales que los hagan inadecuados para el crecimiento. Este es el caso de los azcares, urea, antibiticos, etc

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Por otra parte, todo el material de vidrio se esteriliza mediante calor seco en el Horno Pasteur. Una vez limpio, el material se envuelve en aluminio o se introduce en un contenedor (ej: pipetas en pipetero) y se mantiene en el horno durante dos horas a 160C. En el caso de los portainculos que se estn utilizando constantemente, se utiliza el calor directo del mechero, que tambin sirve para flamear los bordes de tubos, matraces, pipetas, etc. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS En Microbiologa se entiende como siembra el proceso mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de microorganismos, denominada entonces inculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados. Es fundamental trabajar siempre prximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de conveccin verticales que genera son capaces de crear un ambiente estril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama. Como instrumento portainculos ms frecuente se utiliza el asa de siembra, con el que se puede tomar inculo a partir de colonias o de medio lquido, debido a que mantiene un pequeo volumen de agua por tensin superficial. Para depositar el inculo en lquido basta con introducir el extremo en el medio y agitar ligeramente. Sobre slido hay que hacer un recorrido largo sobre la superficie. Procedimiento: Inocular una serie de tres bacterias conocidas: Escherichia coli 37C Gram negativa Pseudomonas aeruginosa 37C Gram negativa Staphylococcus aureus 37C Gram positiva Se inocularn cada una de estas bacterias en un tubo de caldo comn y en un tubo de agar inclinado. Se inocularn las tres bacterias en otro tubo de caldo comn (las tres en el mismo tubo) para tener un cultivo mixto. A partir de los cultivos anteriores anteriores, se inocularn: a) Crecimiento en medios selectivos-diferenciales. Con las tres bacterias, los medios slidos preparados anteriormente: McConkey y Baird-Parker. b) Aislamiento de cultivos puros. Con el cultivo mezclado, en una placa de agar comn, otra de McConkey y otra de Baird-Parker, al objeto de

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obtener colonias aisladas, bien por agotamiento de la siembra o bien por siembra y esterilizacin entre recorridos solapantes. c) Estimar la cantidad de bacterias presentes en un cultivo. A partir del cultivo en caldo, se harn diluciones decimales seriadas y vertido de las mismas en una placa de Petri con agar nutritivo,.
I. Preparar una serie de 8 tubos con 0,9 ml de caldo comn. II. Mediante una pipeta con una punta estril, tomar 0,1 ml del cultivo mixto, y depositarlo 1ml en el primer tubo con 0,9ml (dilucin 10-1). Agitar hasta conseguir una suspensin homognea III. Con otra punta estril, transferir de esta primera dilucin 0,1ml al siguiente tubo con 0,9 ml de caldo ( dilucin 10-2), y as sucesivamente. IV. Poner 0,1 ml de cada dilucin (a partir de 10-4) sobre el centro de una placa con agar nutritivo. Extender por toda la superficie con ayuda de bolas de vidrio estriles. V. Tras incubar se podrn obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitir conocer el nmero de clulas existentes en el cultivo original: Ci = N x D x 10 ( donde Ci=concentracin inicial de ufc/ml, N=n de colonias, D factor de dilucin).

OBSERVACION MACROSCOPICA El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista, para observarlas se necesita un microscopio ptico. Sin embargo, las colonias que forman sobre medios slidos s son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de caractersticas que nos ayudan a su identificacin. A nivel morfolgico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamao, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio lquido las bacterias producen modificaciones de inters para su clasificacin y que tienen que ver esencialmente con las caractersticas de su metabolismo. As se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc. En medios diferenciales/selectivas se pueden observar caractersticas adicionales que reflejan el metabolismo de las bacterias sembradas. OBSERVACION MICROSCOPICA Puesto que la inmensa mayora de las bacterias son incoloras, la nica forma de observarlas bien en el microscopio ptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teido con colorantes o mediante la disposicin de una ptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio.

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La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las bacterias vivas y determinar algunas caractersticas tales como su movimiento. Procedimiento a) Contraste de fases. Disponer una gota de cultivo lquido, previamente agitado, sobre un portaobjetos y taparlo con un cubre de forma que se establezca una delgada pelcula entre ambos cristales. Posteriormente, se observa con el objetivo de contraste de 40x y el condensador anular en la posicin adecuada. Con este sistema se deben de poder distinguir aquellas bacterias con flagelacin polar, que se mueven en zig-zags muy rpidos, de la peritricas, de movimientos ms suaves y ondulados. En las inmviles se producen desplazamientos generales por la existencia de corrientes y vibraciones en el medio de observacin. b) Tincin. Para observar las bacterias teidas, hay que proceder previamente a su fijacin. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio lquido o dispersando en una gota de agua una porcin de clulas crecidas en slido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijacin por calor se procede a la tincin. 1) Hacer un frotis y fijar segn se indica anteriormente. 2) Cubrir con cristal violeta durante 1 minuto. En este paso, todas las clulas quedan teidas por el colorante. 3) Eliminar el cristal violeta volcando el porta y lavar con agua. 4) Observar al microscopio, sin contraste de fases, con aceite de inmersin en el objetivo de 100x.

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VIROLOGIA
TITULACION DE UN VIRUS BACTERIANO y TRANSDUCCION Base terica: Titular una suspensin de virus consiste en determinar el nmero de unidades infectivas por ml presente en la misma. En el caso de los virus bacterianos lticos, la titulacin se realiza asumiendo que cada unidad infectiva es capaz de producir una placa de lisis sobre un csped bacteriano, lo que es cierto para bajas multiplicidades de infeccin. As, determinando el nmero de placas de lisis producidas al infectar con distintas diluciones de la suspensin de virus, podremos calcular el nmero de unidades infectivas presentes en la muestra original. Utilizaremos la estirpe de E. coli JM83 que permite la expresin de un bacterifago lambda utilizado en ingeniera gentica (derivado de RS45) que porta el gen de la -galactosidasa bajo el control de un potente promotor de transcripcin constitutivo, y un gen de resistencia a kanamicina, de forma que podremos seleccionar y detectar la integracin en la prctica simultnea de transduccin. Como medios para el cultivo e infeccin se puede utilizar directamente caldo y agar comn a los que se aade siempre Cl2Mg a una concentracin final de 10mM, al objeto de evitar la disgregacin de los componentes de la cpsida del virus. Tambin se utilizar agar blando, que se obtiene aadiendo 0.6% (p/v) de agar al caldo comn (con el Cl2Mg presente), y que tiene como funcin el permitir una difusin limitada de la progenie vrica tras la lisis de la bacteria. Para el ensayo de transduccin emplearemos placas de agar de McConkey con el antibitico kanamicina Procedimiento: 1) Se prepara un inculo de la cepa de E. coli a infectar en un medio que contiene 10 mM de Cl2Mg y maltosa al 0.2%, y se deja incubando a 37C y con agitacin durante la noche anterior (Esto lo hacen los monitores para todo el grupo). 2) Se funden los matraces con el agar blando (con 10mM de Cl2Mg) y se mantienen en estado lquido en los baos a 50C (Los monitores hacen esto). 3) Preparar diluciones decimales (tantas como indiquen los monitores) de la suspensin de virus utilizando el caldo comn con el magnesio. 4) Disponer 0.2 ml del cultivo de bacterias ya crecido en cinco tubos estriles, y aadir a cada uno 0.1 ml de tres diluciones consecutivas del virus, siguiendo las indicaciones de los monitores. Homogeneizar suavemente e incubar a 37C durante 15 minutos con el fin de permitir la adsorcin del virus a la superficie de las bacterias.

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5) Aadir tambin 0,1 ml de la dilucin 10-1a otro tubo con 0,1 ml de la bacteria para la prctica de transduccin. Incubar en la estufa como en el punto 4. Hacer un control paralelo con igual cantidad de bacterias, pero sin virus.

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml 0.9 ml CC+Mg +2

MUESTRA

10

-1

10

-2

10

-3

-4 10

10

-5

6) Aadir 3-4 ml del agar blando (a 45-50C) sobre los tres tubos ms diludos, homogeneizar y extender sobre placas de agar comn procurando que no queden burbujas. Dejar que se solidifique este agar manteniendo las placas sobre la mesa durante 5-10 minutos. 7) Extender directamente los tubos para la transduccin sobre placas de seleccin de McConkey con kanamicina, empleando para ello bolitas de cristal estriles. 8) Incubar a 37C en posicin invertida durante toda la noche. 9) Al da siguiente contar las placas de lisis que se han formado en las placas con el agar blando. Puesto que cada una de ellas corresponde a un proceso de infeccin por un virus nico, multiplicando por los factores de dilucin correspondientes en cada caso se podr determinar el TITULO del fago, esto es, el nmero de unidades infectivas por ml. 10) En las placas de Mc con kanamicina observar si aparecen colonias y el color de stas. La aparicin de colonias rojas indicar que el fago se ha integrado en el cromosoma confiriendo a esta bacteria resistencia al antibitico de seleccin y capacidad de utilizacin de lactosa mediante la introduccin de genes procedentes de otras bacterias (Transduccin).
Repartir: - Una gradilla para tubos eppendorf - Tres tubos de plstico de 5 ml - Caldo con Magnesio para diluciones - P1000, P200 y puntas estriles - Que est el bao a 50 C con el agar blando - Tres placas de agar comn - Dos placas de agar de Mc con kanamicina (AMcK) - Que haya bolitas estriles.

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CLULAS DE INSECTOS
GENERACIN DE UNA PROTENA RECOMBINANTE EN CLULAS DE INSECTO MEDIANTE EL USO DE BACULOVIRUS.

1.- Introduccin. Los baculovirus son una familia de virus infectivos para invertebrados. Poseen un genoma de DNA de doble cadena circular con un tamao de 80-180 Kb. Se caracterizan por albergar dicha informacin gentica en una cpside recubierta de envoltura viral. Durante la infeccin se generan dos formas de progenie viral: partculas extracelulares (ECV) y partculas de virus en cuerpos de oclusin, que estn formados por la protena viral poliedrina y que protegen al virus de la inactivacin por el entorno. El virus entra en la clula por endocitosis o fusin, la replicacin del DNA tiene lugar 6 horas despus y, a partir de las 10 horas, el virus empieza a liberarse al medio extracelular, alcanzndose los niveles mximos 36-48 horas. El gen de la poliedrina se ha clonado y secuenciado y se ha visto que no es esencial para el ciclo de infeccin o replicacin del virus en cultivo de tejidos. La sustitucin del gen de poliedrina por un gen de inters, que lleva a la generacin de ECV nicamente, ha sido utilizado para el control de plagas y la produccin de protenas recombinantes, La utilizacin del sistema de baculovirus ha surgido como un sistema popular de produccin de protena recombinante en clulas eucariotas. Distintos factores han contribuido a su popularidad:

Al contrario que los sistemas de expresin en clulas procariotas, el sistema de expresin en clulas de insecto mediante baculovirus es un sistema eucaritico por lo que las modificaciones posttraduccionales que sufrirn las protenas recombinantes sern las propias de este sistema.

El sistema de expresin de baculovirus posibilita la propagacin del virus y la obtencin de ttulos altos que permitirn la infeccin de un gran nmero de clulas de insecto y, por tanto, la produccin de una gran cantidad de protena.

La mayora de las protenas permanecen solubles (cuando son citoslicas) y no embebidas en cuerpos de inclusin, como ocurre en sistemas bacterianos. Debido a que el genoma viral es grande, es posible la inclusin segmentos de DNA extrao grandes.

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El sistema de expresin de baculovirus Bac-to-Bac est diseado para generar baculovirus recombinantes que permitan obtener altos niveles de expresin del gen de inters en clulas de insecto. El sistema Bac-to-Bac consiste en la generacin de un baculovirus recombinante por transposicin en un sitio especfico de E. Coli en lugar de por recombinacin homloga en clulas de insecto. El gen de inters se clona en el vector pFastBacTM y se transformar bacterias E. Coli competentes DH10Bac. La transposicin ocurre entre el vector pFastBac y el ADN genmico bacteriano en presencia de las proteinas de transposicin proporcionadas por el plsmido Helper. Cuando la transposicin tiene lugar correctamente, el cassette de expresin se inserta dentro del gen LacZ y se visualizan colonias bacterianas blancas. El DNA genmico se extrae y se transfectan clulas Sf9 (lnea celular derivada de Spodoptera frugiperda). Despus de dos das, se puede aislar el baculovirus recombinante para su amplificacin o expresin.

En esta prctica vamos a infectar clulas Sf9 con el baculovirus recombinate de GRK2 (quinasa de receptores acoplados a protenas G) y vamos a analizar la expresin de la protena mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS. 2.- Materiales y mtodos.

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Clulas Sf9. Medio X-Press (CAMBREX). Aminocidos no esenciales. Gentamicina. Mezcla de antibiticos. Baculovirus recombinante de GRK2. Placas de cultivo p6. Incubadores a 27C y sin CO2. Tampn fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2mM, pH 7.4). Tampn de lisis (Tris-HCl 10 mM pH7.4, EDTA 2mM pH 7.4). Inhibidores de proteasas: Benzamidina (10 g/ml), Inhibidor de Tripsina (10 g/ml), aprotinina 1x y PMSF (200 M). Albmina 1 mg/ml. Reactivo de Bradford.

3.- Infeccin de las clulas con el baculovirus. Levantar las clulas Sf9 de la placa en el mismo medio en el que se encuentran (no hace falta tripsina) y transferir la suspensin celular a un falcon. A continuacin, contar las clulas utilizando un hemocitmetro y sembrar tres pocillos con 800.000 clulas/pocillo de p6, completando con medio XPress (+10 % FBS + aaee + gentamicina + mezcla antibiticos) hasta 2 ml. Incubar a 27C sin CO2 durante 1 hora para que las clulas se adhieran a la placa. Transcurrido este tiempo, eliminar el medio, aadir 2 ml de medio fresco por las paredes para no levantar las clulas y poner en dos pocillos el baculovirus GRK2 previamente diluido 1/100 y 1/1000 en medio X-Press y dejar un tercer pocillo como control. Incubar a 27C sin CO2 durante 48 horas. 4.- Lisis celular (se debe hacer a 4C para que las protenas no se alteren). Eliminar el medio de la placa utilizando una pipeta pasteur. Lavar las clulas 2 veces con 1 ml de tampn fosfato, aadindolo con cuidado para que no se levanten las clulas. A continuacin, aadir otro ml de PBS, levantar y transferir cada pocillo a un tubo eppendorf. Centrifugar 5 minutos/ 1200 rpm/ 4C. Resuspender el pellet en 100 l de tampn de lisis (con inhibidores de proteasas) y homogeneizar con una jeringuilla (10 veces). Centrifugar 15 min./ mx. rpm / 4C. Transferir el sobrenadante a tubos eppendorf nuevos y medir protena mediante el mtodo Bradford.

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5.- Determinacin de la concentracin de protenas mediante el mtodo Bradford. Para ello, primero se hace una recta patrn con albmina, en la cual se interpolarn los valores obtenidos para los diferentes puntos. Trazar la recta patrn con 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 g de albmina y completar con agua hasta 200 l. Aadir 50 l de reactivo de Bradford y agitar. Preparar, as mismo, duplicados con 4 l de cada muestra, completar hasta 200 l con agua, aadir 50 l de reactivo Bradford y agitar. Medir la densidad ptica a 595 nm. Determinar la concentracin de protenas en mg/ml.

Plantilla:

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS

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1.- Introduccin.
El principio bsico de la electroforesis es el movimiento que experimenta una partcula cargada en un determinado medio cuando se ve sometida a la accin de un campo elctrico. Dada una partcula de carga neta Q sometida a un campo elctrico de intensidad E, se mover por la accin de una fuerza igual a: F = Q E = Q V/d siendo V la diferencia de potencial y d la distancia entre los electrodos. Esta tcnica es utilizada frecuentemente en el laboratorio para la separacin de protenas y cidos nucleicos. Uno de los medios de soporte ms empleado en la electroforesis, es el gel de poliacrilamida. Este gel o red tridimensional se consigue mediante la polimerizacin lineal de la acrilamida, y el entrecruzamiento de cadenas provocado por la bisacrilamida. El gel se organiza en una serie de fibras que al entrecruzarse, y segn el grado de entrecruzamiento, deja poros a travs de los cuales circulan las protenas a separar. El tamao de los poros depende de la concentracin absoluta y de la proporcin de acrilamida y bisacrilamida del gel. La polimerizacin de la acrilamida y bisacrilamida es promovida por radicales libres generados por el persulfato amnico y que son estabilizados por el TEMED. La poliacrilamida presenta la ventaja de ser a la vez criba y soporte, no presenta fenmenos de adsorcin de tipo inico ni flujo electro-osmtico, y ofrece la posibilidad de utilizar un amplio rango de pH. Los pesos moleculares de las protenas pueden ser determinados midiendo la movilidad en geles de poliacrilamida en presencia del detergente dodecilsulfato sdico (SDS). Esto es debido a que la cantidad de SDS, detergente aninico, que se une a una protena es proporcional al peso molecular del polipptido y es independiente de su secuencia; a saturacin, se unen aproximadamente 1,4 g. de detergente por gramo de protena. As, si una serie de protenas de peso molecular conocido son sometidas a electroforesis y se separan en una serie de bandas, la representacin grfica de la distancia recorrida en funcin del logaritmo del peso molecular, da una lnea recta. Este sistema de electroforesis en poliacrilamida-SDS se conoce como mtodo de Laemmli. 2.- Materiales y reactivos. - Acrilamida/bisacrilamida al 30/0.8% (p/v). - Tris-HCl 1M, pH 6,8. - Tris-HCl 1M, pH 8,8. - SDS 10% (p/v).

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- Persulfato amnico (APS) 10% (p/v). - TEMED. Importante: no se puede almacenar en tubos o botellas de plstico. - Isobutanol saturado con agua destilada. - Tampn de electroforesis: SDS 0,1%, Tris 0,025M/glicina 0,192M, pH 8,3 - Tampn de carga 2x: SDS 4% (p/v), glicerol 20% (v/v), 2-mercaptoetanol 10% (v/v), EDTA 15 mM, azul de bromofenol 0,008% (p/v), Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8 - Cubetas de electroforesis, cristales y fuentes. - Marcadores de peso molecular de protenas - Solucin de fijacin: etanol / c. actico / agua en proporciones 5/1/5. - Solucin de tincin: 0,1% de azul de Coomassie en 40% de etanol, 10% de cido actico. - Solucin de destincin: 7% de cido actico.

3.- Preparacin del gel de poliacrilamida.

Limpiar perfectamente los cristales. Colocar los espaciadores que definirn el grosor del gel entre los cristales y sellar perfectamente con grasa y la ayuda de pinzas. En la prctica se va a preparar un gel discontinuo constituido por un gel concentrador y un gel separador. Las cantidades y caractersticas se muestran en la siguiente tabla. Utilizar recipiente de vidrio. [Madre o Sotck] Sol. AA/BA al 30% Tris-HCl 1.5M, pH 8,8 Tris-HCl 1M, pH 6,8 SDS 10% TEMED APS 10% Agua destilada Gel Separador (7.5%) Vt = 10ml 2,50 ml 2,50 ml ---------------100 l 5 l 100 l 4,85 ml

Gel Empaquetamiento (3%) Vf = 5 ml 0,84 ml --------------1,25 ml 100 l 5 l 50 l 2,80 ml

El APS y el TEMED sern los ltimos componentes a incluir en la mezcla. Preparar primero la solucin del gel separador y verter cuidadosamente entre los cristales hasta 1 cm por debajo del nivel que ser ocupado por el peine formador de los pocillos. Colocar cuidadosamente un poco de isobutanol saturado con agua sobre la solucin del gel y dejar polimerizar a temperatura ambiente. Una vez polimerizado, retirar el isobutanol lavando con agua destilada y preparar la solucin del gel concentrador. Verter esta solucin y colocar el peine. Dejar polimerizar a temperatura ambiente.

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Cuando el gel concentrador haya polimerizado, retirar el peine e instalar el gel en el aparato de electroforesis siguiendo las instrucciones del Profesor. Rellenar las cmaras de los electrodos con el tampn de electroforesis.

4.- Preparacin y carga de las muestras.

Mezclar 1:1 las muestras a desarrollar en la electroforesis con el tampn de carga (descrito en el apartado 2). Las muestras a desarrollar sern: a) Patrones de peso molecular (mezcla de diferentes protenas que se indican a continuacin) b) 10 g de protena de cada una de las muestras.

Marcadores coloreados:

5.- Tincin del gel de protenas. Colocar el gel de protenas, con cuidado para que no se rompa, en una tartera donde se aadir la solucin fijadora. Incubar 30 min a temperatura ambiente con agitacin leve. Tras retirar el fijador, aadir la solucin de tincin e incubar durante 30 min a temperatura ambiente, retirar la solucin de tincin y pasar a desteir. El proceso de destincin se prolongar hasta que las bandas de protenas sean claramente visibles. En este punto, el gel est listo para ser secado y/o fotografiado.

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CULTIVOS DE CLULAS DE PLANTAS Elena Ramrez La clula vegetal: peculiaridades y caractersticas especficas versus la clula animal. Equipamiento e incubadores especficos para los cultivos de clulas de plantas (control temperatura, humedad y luminosidad). Medios para el cultivo de clulas vegetales (macronutrientes, micronutrientes, vitaminas y hormonas). Tipos de cultivos (clulas, tejidos y plntulas). Cultivos en suspensin y en soporte slido. Preparacin de protoplastos y callos. Mtodos de transformacin. Clulas y plantas transgnicas Especies ms empleadas en laboratorio. Aplicaciones biotecnolgicas de los cultivos vegetales.

Informacin adicional, protocolos, etc, en Anexos

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Cultivos primarios de cerebro fetal de ratn. Milagros Ramos. Objetivos: 1. Anestesia y obtencin de fetos de ratn de los cuernos uterinos de dos ratonas preadas. 2. Diseccin de la regin cerebral de inters. 3. Disgregacin del tejido hasta suspensin de clula nica. 4. Siembra y observacin al cabo de 3 das de la generacin de redes neuronales en los cultivos.
PROTOCOLO DE CULTIVO PRIMARIO NEURONAS CORTEZA DE RATA Corteza rata o ratn E18 (1 embrin aprox. 5x106 cels) Poner cubres de vidrio de 12mm de dimetro en las placas P24 Aadir 0.5ml de poli-lisina por pocillo de P24 Polilisina: stock: 500g/ml en H2O. Conc final: 10g/ml en PBS1x Dejar la poliLys durante 1h mnimo. Lavar 2 veces con PBS y 1 vez con H2O. Dejar secar las placas, destapadas, 30min en la cabina con luz ultravioleta. Aadir la laminina a las placas secas, 30min a 37C en el incubador (0.3ml/well P24). Laminina: stock 1mg/ml. Conc final 1.5g/ml en NB + B27 + Gln 500M + Antibiticos 1x + 50% Horse Serum. Diseccin cortezas de cerebro. Poner los embriones en PBS1x + 6mM Glucosa + 1% BSA (PBS completo), trocear con tijeras el tejido. Aadir 200l papana en 5ml de PBS completo, calentar a 37C hasta que se disuelva (se tiene que quedar transparente). Filtrar con filtro de 0.22m directamente sobre el tejido. Dejar 5min a 37C. Retirar la papana y aadir 1ml de PBS completo. Aadir unos grumos de DNAsa en polvo. Pasar por pipetas Pasteur o capilares de diferente tamao hasta que se disgregue todo el tejido. Aadir PBS completo hasta 15ml finales. Centrifugar 5min a 900rpm

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Retirar sobrenadante Resuspender en 1ml de NB+B27+ Gln 500M+ Antibiticos 1x Contar Sembrar 200.000 cels/pocillo de P24 en 0.4ml medio (sobre los 0.3ml de laminina) Hacer un cambio total de medio a las 3h (NB+B27+ Gln 500M+ Antibiticos 1x)

Cambio de medio parcial cada 3 dias (NB+B27+ Gln 500M+ Antibiticos 1x).

Material para cultivo primario: Lupa y material de diseccin P24 Cubres 12mm dimetro Polilisina PBS1x H2O estril Lamimina Horse Serum NB+B27 Glutamina Antibiticos PBS+Glucosa+BSA Papana DNAsa

SEGURIDAD BIOLGICA
- OBJETIVOS Conocimiento en la manipulacin, gestin de residuos y diseo de instalaciones especificas de bioseguridad para prevenir los riesgos de exposicin a agentes biolgicos en laboratorios de cultivos celulares

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- PROGRAMA: Teora: (10 horas) Caractersticas y clasificacin de agentes biolgicos. Legislacin sobre agentes biolgicos Riesgos biolgicos especficos en laboratorios de cultivos Caractersticas y diseo de laboratorios de contencin biolgica. Organizacin de la bioseguridad. Manual de bioseguridad. Medios, equipos, e instrumentacin en bioseguridad. Vigilancia personal. Procedimientos de emergencia. Medidas de prevencin y control en laboratorios de cultivos. Gestin de residuos biolgicos. Legislacin. Gestin de otros riesgos especficos en laboratorios de cultivos celulares

Visita Prctica ( 2 horas) Visita a laboratorios de cultivos con nivel de contencin 2 ( Nivel Bioseguridad 2 ) y laboratorio de marcajes celulares laboratorio de istopos del CBMSO Resumen de loa contenidos: Riesgos biolgicos La manipulacin y/o la exposicin a los agentes biolgicos: virus, bacterias, parsitos, hongos, y organismos genticamente modificados puede suponer un riesgo real para los trabajadores y el medio ambiente Las reas donde se manipulan estos agentes biolgicos en la experimentacin son principalmente las siguientes: microbiologa, inmunologa, parasitologa biologa celular y molecular, gentica y neurobiologa. En los laboratorios de investigacin biolgica, en las tcnicas de cultivos celulares, las muestras biolgicas estn constituidas bien por cultivos de clulas animales infectadas experimentalmente o no, en medio lquido dentro de frascos y placas de cultivo (laboratorios de cultivo "in vitro" de clulas animales), o bien por cultivos de bacterias, hongos o parsitos en medio slido dentro de placas Petri y tubos de ensayo en medio lquido dentro de matraces y tubos de ensayo. En los laboratorios de diagnstico el tipo de muestras puede ser

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muy variado pero bsicamente estn constituidas por tejidos procedentes de biopsias y necropsias y por fluidos corporales como: sangre, orina, etc. Adems, tambin se realizan cultivos de clulas animales, de bacterias y de hongos con objeto de caracterizar el o los microorganismos causantes de la infeccin en el paciente o en el animal infectado. Las vas de transmisin de estos agentes biolgicos son: la va respiratoria, la va drmica, la va y la digestiva, y la va parenteral. Debido a esto es necesario establecer un plan especfico de prevencin de riesgos biolgicos. Estn descritos diferentes niveles de bioseguridad de acuerdo con la probabilidad del riesgo de infeccin y las medidas disponibles que van del nivel 1 hasta el 4, que estn descritos en la legislacin vigente, tanto para los laboratorios cmo para animalarios. El objetivo de un plan de prevencin de riesgos biolgicos es reducir o eliminar la

exposicin de los trabajadores y el medio ambiente Esto implica la utilizacin de prcticas y tcnicas de laboratorio especficas y de los equipos de seguridad ( barreras primarias), principalmente cabinas de seguridad biolgica y/o equipos de proteccin personal y un diseo y construccin del laboratorio especfico ( barreras secundarias) de acuerdo con los niveles de contencin Para establecer el mencionado plan es preciso realizar una evaluacin de cada uno de los puestos de trabajo y para reducirlos es necesario tener en cuenta diferentes aspectos: mnimo nmero de trabajadores expuestos, medidas de seguridad en la recepcin, manipulacin y transporte de agentes biolgicos, medidas de proteccin colectiva y/o equipos de proteccin personal, gestin de residuos biolgicos, medidas higinicas, sealizacin de bioriesgo, plan de emergencia, vigilancia de la salud de los trabajadores y establecer planes de formacin en bioseguridad. Toda la informacin, a disposicin de los trabajadores, deber estar contenida en el Manual de Bioseguridad .

LEGISLACIN Y DOCUMENTACIN TCNICA DE REFERENCIA La legislacin aplicable a la manipulacin de material biolgico es la siguiente: Ley 31/1995 de 8 de noviembre, de Prevencin de Riesgos Laborales Real Decreto 39 / 1997, de 17 de enero, por el que se aprueba el Reglamento de los Servicios de Prevencin.

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Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo . BOE n 124, de 24 de mayo de proteccin de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposicin a agentes biolgicos durante el trabajo. Real Decreto 773/97 ,de 30 de mayo sobre Disposiciones mnimas de seguridad y salud relativa a la utilizacin por los trabajadores de equipos de proteccin individual. Real Decreto 485/1997, de 14 de abril, sobre disposiciones mnimas en materia de sealizacin de seguridad y salud en el trabajo. Ley 15/1994, de 3 de junio (BOE n 133 de 4 de junio de 1994, por el que se establece el rgimen jurdico de la utilizacin confinada, liberacin voluntaria y comercializacin de Organismos Modificados Genticamente, a fin de prevenir los riesgos para la salud humana y el medio ambiente. Real Decreto 178/2004, de 30 de enero, por el que se aprueba el Reglamento General para el Desarrollo y Ejecucin de la Ley 9/2003 de 25 de abril por lo que se establece el rgimen jurdico de la utilizacin confinada, liberacin voluntaria y comercializacin de organismos modificados genticamente (BOE n 27 de 31 de enero de 2004). Ley 5/2003, de residuos de la Comunidad de Madrid

Gua tcnica para la evaluacin y prevencin de los riesgos relacionados con la exposicin a agentes biolgicos. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. (2001). Manual de Bioseguridad en el laboratorio. Organizacin Mundial de la Salud (2005). Prevencin de riesgos biolgicos en el laboratorio.Mart Sol MC et al. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. (1997). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. US Government Printing Office (2007).
NTP 571: Exposicin a agentes biolgicos. Equipos de proteccin i

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