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Rugai & Arajo modificado por Pessoa & Silva ou meio IAL :: Identificao de Bacilos Gram Negativos

Identificao de Bacilos Gram Negativos

Meio de Rugai & Arajo modificado por Pessoa & Silva ou meio IAL
Atualmente conhecido como IAL (Meio Instituto Adolfo Lutz) foi inicialmente proposto por Rugai & Arajo, em 1986, com a inteno de eliminar as falhas existentes nos meios similares, at ento usados. Em 1972, Pessoa & Silva, desenvolveram um meio que possibilitou a pesquisa da motilidade e da descarboxilao da lisina, concomitantemente com as reaes obtidas no meio clssico de Rugai & Arajo. Este meio utilizado para identificar as principais espcies de Enterobactrias, Vbrios e Aeromonas , permitindo em um s tubo a leitura, das seguintes reaes: motilidade da bactria indicado pela turvao da lisina na base, lisina descarboxilase, fermentao da glicose em profundidade e da sacarose na superfcie do meio, produo de gs sulfdrico (H2 S), gs em glicose, utilizao do aminocido L-triptofano (desaminao), hidrlise da uria e no tampo do tubo, um desenvolvimento de colorao avermelhada que indica a formao de indol. O meio IAL constitudo por duas fases, superior e inferior, separadas por uma camada intermediria, chamada vascar, de cerca de 2 mm.

1 - Fase Intermediria (Vascar)

Frmula:
Vaselina lquida Cera de carnaba 90 mL 10 g

Preparo:
Pesar a cera e adicionar a vaselina em um copo de Becker e aquecer com agitao constante at completa fuso da cera e o aparecimento de uma mistura lquida homognea. Tomando cuidado para no ocorrer o superaquecimento (repetir este procedimento de aquecimento toda vez que for usar o vascar). O vascar armazenado em um recipiente de boca larga, rotulado em geladeira. Distribuir cerca de 0,2 mL de vascar em tubos 12 mm x 120 mm antes de colocar a fase inferior do meio.

2 - Fase Inferior
Fase semi-slida permite observar a descarboxilao da lisina e a mobilidade da bactria. Aps preparo, o meio apresenta colorao lils.

Frmula:
Extrato de levedura Dextrose Nitrato de potssio L-Lisina gar gar Soluo alcolica de prpura de bromocresol 0,2% gua destilada pH final = 6,4 1,2 g 0,2 g 0,2 g 2g 1,6 g 4 mL 400 mL

Preparo:
Pesar todos os reagentes individualmente e adicionar a um balo com a gua sem o gar. Homogeneizar e verificar o pH 6,4. Juntar o gar-gar, e aquecer levemente sob constante agitao at a completa dissoluo do gar. Distribuir 2 mL nos tubos de vidro 12 mm x 120 mm, j contendo o vascar.

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Fechar cada tubo com rolhas de algodo hidrfilo (branco), coloc-los na posio vertical, embalar, rotular e autoclavar a 120 C por 15 minutos. Aps autoclavao, deixar solidificar em posio vertical a temperatura ambiente. O vascar forma um anel sobre a fase inferior, s assim ele estar pronto para receber a fase superior assepticamente.

3 - Hidrxido de sdio (NaOH) 1N

Frmula:
Hidrxido de sdio gua destilada 0,4 g 100mL

Preparo:
Armazenar em frasco mbar a temperatura ambiente.

4 - Soluo alcolica de prpura de bromocresol a 0,2%

Frmula:
Hidrxido de sdio 1N Prpura de bromocresol lcool etlico gua destilada 1mL 0,2g 63mL 49mL

Preparo:
Adicionar 1mL da soluo de hidrxido de sdio 1N gua e esperar 30 minutos para estabilizar. Aps 30 minutos acrescentar a prpura e o lcool, homogeneizar at a completa dissoluo. Armazenar em frasco mbar temperatura ambiente. Utilizar somente aps 48 horas.

5 - Soluo de substratos
Frmula:
Citrato de ferro amoniacal Tiossulfato de sdio Sacarose Glicose ou Dextrose Uria gua destilada 2g 2g 80 g 10 g 40 g 85 mL

Preparo:
Adicionar em um copo de Becker todos os reagentes previamente pesados e a gua, em seguida levar ao banho-maria 65 C, para dissolver. Aps a completa dissoluo, esterilizar por filtrao e distribuir assepticamente em frasco mbar com tampa de rosca j estril. Armazenar em geladeira.

6 - Soluo alcolica de azul de bromotimol a 1,5%

Frmula:
Azul de bromotimol lcool etlico (q.s.p.) 1,5 g 100mL

Preparo:
Pesar o azul de bromotimol e adicionar em um copo de Becker com um pouco do lcool para dissolver. Aps a completa dissoluo, completar com o restante do lcool (q.s.p.) para 100mL.

7 - Fase Superior
Meio slido, permite observar a utilizao da glicose em profundidade com ou sem produo de gs, utilizao da sacarose e desaminao de l-triptofano (LTD), no pice do meio, produo de H 2S, hidrlise da uria e a produo de indol na rolha de algodo hidrfilo. Aps preparo o meio apresenta colorao verde.

Frmula:
Triptona Extrato de carne Cloreto de sdio Fosfato dissdico L triptofano Soluo alcolica de azul de bromotimol 1,5% 4g 0,8 g 2g 0,8 g 0,4 g 0,8 mL

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gar gar gua destilada pH final = 6,4

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4,4 g 400 mL

Preparo:
Pesar todos os reagentes um a um e ir adicionando em um balo com a gua sem o gar. Homogeneizar e acertar o pH para 6,4. Juntar o gar, aquecer levemente sob constante agitao at a completa dissoluo do gar, evitando o superaquecimento. Tampar com algodo hidrfobo, embalar, identificar e levar a autoclave 120 C por 15 minutos. Aps autoclavao, resfriar 65 C, adicionar assepticamente 1,75 mL da soluo de substrato, para cada 100 mL de meio. Homogeneizar e distribuir assepticamente 2 mL deste meio em tubos de vidro 12 mm x 120 mm, contendo a fase inferior e o vascar j estril e solidificado. Colocar os tubos inclinados em ngulo de 45 a temperatura ambiente at solidificar. Aps completa solidificao, rotular cada tubo e armazenar na geladeira em recipiente fechado, para que o meio no desidrate.

8 - Reativo de Ehrlich para indol (para teste na rolha de algodo)

Frmula:
Paradimetilaminobenzaldedo cido orto-fosfrico na formula lquida xaroposo lcool etlico absoluto gua destilada (qsp) 1g 14 mL 50 mL 100 mL

Preparo:
Em frasco mbar com tampa esmerilhada, dissolver o aldedo no lcool.

Inoculao
O Meio de IAL deve ser inoculado com fio bacteriolgico flambado e resfriado. Se Pega uma colnia a ser pesquisada, e inocula-se em picada (puno) at quase chegar ao final do tubo, cuidando para no mexer a agulha. Ao voltar superfcie semear em estria na superfcie inclinada do meio. Incubar em estufa bacteriolgica a 37 C por 18 a 24 horas.

9 - Leitura do meio de IAL

Interpretao
Fase Superior pice: azul: sacarose negativa LTD negativo Amarelo: sacarose positiva LTD negativo verde garrafa: sacarose negativa LTD positivo castanho: sacarose positiva LTD positivo Base: amarelo: glicose positiva Base: amarelo: glicose positiva Azul: uria positiva Preto: H2 S positivo amarelo com bolhas : glicose e gs positivos Fase Inferior: violeta : lisina descarboxilase positiva Amarelo : lisina descarboxilase negativa com turvao : motilidade positiva (mvel) sem turvao : motilidade negativa se observa nitidamente o crescimento Teste de indol na rolha: Aps a incubao pingar assepticamente, 2 3 gotas do reativo de Ehrlich para indol na rolha do algodo hidrfilo. Indol positivo: algodo fica rosa ou vermelho Indol negativo: algodo permanece sem cor ou com colorao amarelo. .: ndice :.
2005-2012 - Helena C ristina Ferreira Franz contedo sob licena creative commons

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