Ecosistemas 17 (1): 37-45. Enero 2008.

http://www.revistaecosistemas.net/articulo.asp?Id=522

Cianoalerta: estrategia para predecir el desarrollo de cianobacterias txicas en embalses

E. Forjn Lozano, M.J. Domnguez Vargas, C. Vilchez Lobato , R. Miguel, C. Costa, M.P. Reis
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(1) Grupo Bioqumica y Biotecnologa de Algas. Facultad de Ciencias Experimentales. Universidad de Huelva. Campus del Carmen. 21071. Huelva. Espaa. (2) Facultad de Ciencias Marinas y de Medio Ambiente. Universidad del Algarve. 8005 - 139. Faro. Portugal.

Recibido el 23 de abril de 2007, aceptado el 24 de enero de 2008.

Cianoalerta: estrategia para predecir el desarrollo de cianobacterias txicas en embalses. La eutrofizacin de los pantanos destinados al abastecimiento de agua de consumo humano supone un deterioro de la calidad de la misma, e incluso puede afectar a la salud de los consumidores. ste es el caso de la presencia de la hepatotoxina microcistina, producida fundamentalmente por la cianobacteria Microcystis aeruginosa. A travs de los proyectos Cianoalerta hemos desarrollado mtodos para la pronta deteccin de blooms especficos de cianobacterias, necesarios para llevar a cabo un adecuado tratamiento del agua, evitando el suministro de un producto de baja calidad a los consumidores. El anlisis de la evolucin estacional de cianopigmentos, y su correlacin con la abundancia y dinmica de las poblaciones de microorganismos fotosintticos ha permitido concluir que la evolucin estacional de zeaxantina y beta-caroteno presenta una dinmica muy similar a la evolucin observada de las poblaciones de las cianobacterias Oscillatoria spp, Anabaena spp. y formas cocoides de cianobacterias, y diferente a la evolucin de Microcystis spp. De acuerdo con nuestros resultados, estos fotopigmentos podran emplearse como indicadores de la proliferacin de estas poblaciones. Palabras clave: cianotoxinas, microcistina, bloom, carotenoides, zeaxantina Cianoalerta: a strategy to predict the development of toxic cyanobacterial blooms in water reservoirs. Eutrofization of reservoirs supplying drinking water deteriorates water quality, and may affect consumers health. This is the case of the hepatotoxin microcystin, which is produced by the cyanobacteria Microcystis aeruginosa. Within the framework of Cianoalerta projects we have developed methods for the prompt detection of specific cyanobacteria blooms, a crucial step towards efficient water treatment, thus improving the quality of the product supplied. Seasonal changes in zeaxanthin and beta-carotene paralleled those shown by the cyanobacteria Oscillatoria spp, Anabaena and cocoid forms of cyanobacteria, but were different from those shown by Microcystis. According to our results, these photopigments can be used as indicators of the dynamics of these cyanobacterial populations. Keywords: cianotoxins, microcystin, bloom, carotenoids, zeaxanthin

Introduccin
Las cianobacterias comprenden un grupo de microorganismos presentes en ecosistemas terrestres, de agua dulce y salada, fundamentales como productores primarios. Constituyen aproximadamente 150 gneros que engloban a 2000 especies. La mayora presentan un metabolismo fotoautotrfico y aerbico. Su ciclo vital slo requiere agua, CO2 , sustancias inorgnicas y luz, lo que les permite crecer en medios muy simples. Las especies capaces de fijar el nitrgeno atmosfrico contribuyen a la fertilizacin del suelo y agua (Rai, 1990). Otras son importantes desde el punto de vista econmico, al ser fuentes de compuestos de inters como carotenoides y antibiticos (Falch et al., 1995). Finalmente, algunas especies se utilizan en alimentacin por su alto contenido en protenas, vitaminas y otros factores de crecimiento, como es el caso de Spirulina (Borowitzka et al., 1988). Sin embargo, las cianobacterias pueden provocar importantes problemas ambientales, con posibles implicaciones en la salud humana. As, en aguas eutrofizadas o ricas en nutrientes, nitrgeno y especialmente fsforo, y cuando la intensidad de luz es

Ecosistemas no se hace responsable del uso indebido de material sujeto a derecho de autor. ISBN 1697-2473.

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alta, pueden multiplicarse de forma profusa, originando desarrollos explosivos, floraciones o blooms. Las cianobacterias presentan gran capacidad para obtener nitrgeno y fsforo del medio (algunas especies pueden utilizar el nitrgeno gaseoso disuelto en el agua). Adems, las cianobacterias muestran una gran capacidad de almacenamiento de P, elemeno limitante de la produccin en sistemas acutico continentales ('estrategia de consumo de lujo'). En algunos casos el P almacenado les permite llevar a cabo de 2 a 4 divisiones celulares (Scheurs, 1992). Por todo ello, son enormemente competitivas en estos ambientes. La eutrofizacin representa un problema ambiental reconocido desde la mitad del siglo XX (Rohde, 1969). Puede provocar el deterioro del medio acutico, agotando el oxgeno disuelto, provocando mortalidad de peces y otros organismos, facilitando la liberacin de sustancias txicas previamente fijadas en los sedimentos, y contaminando el agua para consumo humano. Este proceso puede producirse de forma natural e irreversible; pero lo ms frecuente es que su origen sea antrpico, bien por descargas de aguas residuales, bien por el lixiviado de fertilizantes procedentes de explotaciones agrcolas. En este caso, la tasa es incomparablemente ms rpida, y el proceso puede llegar a ser reversible si se eliminan las condiciones que lo propiciaron. Un aumento en la concentracin de nutrientes, junto a factores coadyuvantes como elevadas temperatura e intensidad de luz, entre otros, pueden originar un desarrollo explosivo de cianobacterias. La temperatura ptima para el desarrollo de estos blooms es de, aproximadamente, 25C, lo que permite que en climas templados se den con mayor frecuencia a finales de primavera, verano y principios del otoo (Robarts et al., 1987). Por otro lado, la capacidad de adaptacin que tienen las cianobacterias para crecer a intensidades de luz bajas y altas favorece la aparicin de carotenoides, fitopigmentos de carcter fotoprotector. Adems de la estabilidad de las poblaciones, otro de los factores que incidirn sobre la formacin de blooms, es la capacidad que poseen las cianobacterias para formar vesculas de gas, tiles para situarse a distintas alturas en la columna de agua, asegurndose unas condiciones ptimas de crecimiento (Walsby, 1987). El bloom de especies capaces de producir toxinas en aguas destinadas al consumo o uso recreativo, puede generar graves problemas para la salud. Como se observa en la Tabla 1, existen cianotoxinas de actividad neurotxica, hepatotxica o txica G-I, producidas por diversidad de gneros, muchos de los cuales estn presentes en los blooms de nuestros embalses. De todas ellas, las ms importantes son las microcistinas, producidas fundamentalmente por especies de Microcystis, especialmente Microcystis aeruginosa, y de la cual se conocen ms de 50 variantes.

Tabla 1. Principales toxinas producidas por cianobacterias.

Toxina Anatoxina-a Toxinas PSP (Saxitoxinas) Nodularina Microcistinas Cilindrospermin LPS

Actividad Neurotoxina

Gneros Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria, Microcystis Aphanizomenon, Anabaena Nodularia Microcystis, Anabaena, Oscillatoria Cylindrospermopsis Muchos gneros

Estructura Alcaloide

N Variantes 1

Neurotoxina

Alcaloide Pentapptido cclico Heptapptido cclico Alcaloide cclico Lipopolisacrido

Al menos 8

Hepatotoxina Hepatotoxina Hepatotoxina Toxicidad G-I

6 Ms de 50 1 Al menos 3

Fuente: OMS (1993). Guidelines for drinking-water quality.

La OMS ha establecido unos niveles de vigilancia y alerta para la presencia de cianobacterias en aguas de consumo, y niveles gua en aguas de bao (Fig. 1). En aguas de consumo, la Alerta de Nivel 1 se alcanza con 2000 cl/ml 1 ug/l de

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clorofila a; en este caso se tendr que establecer un programa de monitorizacin de la biomasa de cianobacterias y anlisis de toxinas. La Alerta de Nivel 2 se alcanza cuando ya la captacin est eutrofizada y con toda seguridad se da una presencia confirmada de cianotoxinas, lo que requerir unos tratamientos efectivos en las estaciones de tratamiento. En este caso no se debern usar algicidas, pues se producira la destruccin de las cianobacterias y la consiguiente liberacin de toxinas, debiendo usarse procedimientos como la filtracin por carbn activo y sistemas combinados de coagulacin-floculacin. La OMS estableci que el valor mximo de Microcistina-LR en aguas susceptibles de ser transformadas en agua potable sea de 1,0 ug/l, y es este valor el que aparece en el Real Decreto 140/2003, actual legislacin vigente en nuestro pas sobre aguas potables de consumo pblico, que indica, adems, que este parmetro analtico deber determinarse cuando se sospeche de eutrofizacin en la captacin a la salida de la estacin de tratamiento o en el depsito de cabecera. Por la importancia de la presencia de cianobacterias en aguas destinadas al uso humano, y la necesidad de desarrollar indicadores rpidos y fiables que permitan la adopcin eiciente demedidas de control, hemos llevado a cabo un estudio de las variaciones en los fotopigmentos en aguas de embalses del Algarve (Portugal) y Huelva (Espaa) y de su relacin con la presencia de diversas cianobacterias representativas.

Figura 1. Niveles de vigilancia y alerta para la presencia de cianobacterias en aguas de consumo y niveles gua en aguas de bao. Fuente: OMS (1993). Guidelines for drinking-water quality.

Metodologa
Se desarroll y optimiz la metodologa necesaria para la determinacin cualitativa y cuantitativa de fotopigmentos presentes en el material biolgico de las muestras de agua de los embalses y canalizaciones, fundamentalmente clorofilas y carotenoides. El anlisis de los resultados obtenidos, y su correlacin con el contenido en biomasa y abundancia de las distintas poblaciones de cianobacterias fotosintticas permitir establecer un mtodo de bioindicacin que pueda estimar de forma indirecta y precisa la presencia de dichas poblaciones. Filtracin y pretratamiento de muestras Las muestras de agua fueron filtradas a travs de membranas de 0,45 m con objeto de retener el material biolgico. Los filtros de membrana se dejaron en presencia de metanol, utilizado como extractante, durante toda la noche y en oscuridad. Seguidamente, las muestras se centrifugaron a 4000 rpm y se filtraron a travs de filtros Millex-HV de 0,22 m, quedando dispuestas para el posterior anlisis cromatogrfico. Determinacin de clorofilas y carotenoides Las clorofilas a, b, total y carotenoides totales tambin se cuantificaron siguiendo el procedimiento descrito por Wellburn (1994). Los carotenoides especficos zeaxantina y -caroteno se determinaron por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), segn modificacin del mtodo descrito por Young et al. (1997), que se detalla a continuacin. Los anlisis se realizaron en un cromatgrafo HPLC Merck-Hitachi L-7100, provisto de un detector UV-Visible de la misma casa comercial, modelo L-7420. La columna usada fue una LichroCart RP18 (5 m), tamao 250 x 4 mm. Las fases mviles utilizadas en la separacin fueron una mezcla de acetonitrilo-agua 9:1 (A) y acetato de etilo puro (B). La columna fue previamente equilibrada con la fase A. El volumen de inyeccin fue de 20 l. Los carotenoides se eluyeron de la columna a un flujo de 1 ml/min de acuerdo con el siguiente programa: 0, 100 % A; 0-10 gradiente lineal hasta 50 % A; 10-15, gradiente lineal hasta 40 % A;

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15-20, gradiente lineal hasta 35 % A; 20-25, gradiente lineal hasta 24 % A; 32, 100 % A. La longitud de onda para la deteccin de los carotenoides se ajust a 450 nm. Todos los reactivos utilizados fueron de grado HPLC, pertenecientes a la casa comercial Panreac. Los patrones utilizados en la determinacin y cuantificacin de clorofilas y carotenoides especficos se adquirieron a DHI Water and Environment. En la Figura 2 se muestra un cromatrograma obtenido, en el que se detallan los picos correspondientes a cada uno de los fotopigmentos analizados.

Figura 2. Cromatrograma ejemplo obtenido en el que se detallan los picos correspondientes a cada uno de los fotopigmentos identificados. 1: Lutena. 2: Zeaxantina. 3: Clorofila b. 4: Clorofila a. 5: Beta-Caroteno.

El primer paso en el diseo de un programa de monitorizacin de la presencia de cianobacterias en abastecimientos de agua de consumo humano ha de ser la identificacin y seleccin adecuada de las reas de estudio en las captaciones. Para ello y una vez tenidos en cuenta factores como la estratificacin de nutrientes y temperatura, y la direccin del viento (Lindholm et al., 1989), se seleccionaron entre dos y tres profundidades de muestreo significativas en los distintos embalses estudiados. Estos embalses, todos prximos entre s, fueron los del Algarve portugus Beliche, Bravura, Choa Queimada y Funcho, y los espaoles Piedras y Chanza, situados en la provincia de Huelva. El segundo paso consisti en el estudio de los factores asociados al crecimiento de cianobacterias, entre los que se encontraban las concentraciones de nitrgeno, fsforo y amonio, la temperatura, la pluviosidad y la intensidad de luz. La Universidad del Algarve identific y cuantific los niveles de las distintas poblaciones de cianobacterias, mientras que la Universidad de Huelva estudi la evolucin cuali-cuantitativa de fotopigmentos presentes en el agua del pantano que podran actuar como indicadores. El anlisis de resultados se plante desde la base de poder encontrar correlaciones entre los diferentes fotopigmentos, para cada embalse y profundidad, y los perfiles de las poblaciones de cianobacterias. Ping Li et al. (2002) ya hicieron una aproximacin al analizar los pigmentos del fitoplancton marino por HPLC y aplicarlo a la investigacin de comunidades de algas. La existencia de tales correlaciones permitira proponer la determinacin de algunos fotopigmentos como herramienta para predecir la aparicin de blooms de cianobacterias.

Resultados y discusin
Como ejemplo de los resultados obtenidos en los pantanos estudiados, en las Figuras 3, 4 y 5 se muestran los resultados para el pantano Choa Queimada, correspondientes al periodo comprendido entre Julio de 2003 y Diciembre de 2004 (desde Marzo de 2004 para el -Caroteno), y para el que se establecieron dos puntos de muestreo (superficie y fondo).

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Figura 3. Resultados de los parmetros clorofila total, carotenoides totales, zeaxantina y -caroteno correspondientes al pantano Choa Queimada. En abscisas se recogen las fechas de muestreo.

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Los valores ms altos de clorofilas y carotenoides totales se obtuvieron en el periodo de Junio a Octubre, meses en los que la radiacin lumnica es ptima. La dinmica en la evolucin de los carotenoides totales fue muy similar a la de clorofila total. As, para el pantano Choa Queimada (Fig. 3) pueden observarse mximos de estas variables durante el mes de Junio de 2004 para el punto de muestreo fondo. Ello se deba a un bloom de Oscillatoria spp. En este perodo se observaron concentraciones de nitrato bajas (datos no mostrados), en coherencia con el mayor consumo debido al crecimiento de microalgas. Durante los meses de verano se observ, de forma general y para todos los abastecimientos, una disminucin de la proporcin de clorofila determinada en superficie y en otras profundidades. La mayor irradiancia lumnica y las temperaturas elevadas en superficie son factores que pueden provocar fotoinhibicin, y una ralentizacin o inhibicin del crecimiento, que unido a la capacidad de las cianobacterias de formar vesculas de gas para disponerse a la altura adecuada en la columna de agua, hace que se encuentren sus poblaciones a mayores profundidades durante estos periodos. No obstante, se observ un bloom de Microcystis spp. en el mes de enero en el pantano Bravura (punto de muestreo superficie, datos no mostrados), cuyo desarrollo podra ser debido a condiciones climatolgicas favorables e inusuales, especialmente temperatura, alcanzadas durante ese mes. Se ha descrito por numerosos autores que la zeaxantina es un carotenoide implicado en el ciclo de las xantofilas, involucrado en las reacciones de respuesta antioxidante de microalgas y sintetizado en situaciones de alta intensidad de luz PAR y UV-A (Hieber et al., 2000). Durante los meses de verano se observ que los niveles de zeaxantina determinados en los puntos de muestreo establecidos en las zonas medias y ms profundas de los embalses eran mayores que los determinados en superficie. Sin embargo, en los meses anteriores al verano, en un periodo que podra abarcar desde Marzo a Mayo, la mayora de los pantanos presentaron niveles ms altos de zeaxantina en superficie (Funcho, Beliche, Piedras Bravura), debido probablemente a que las intensidades lumnicas no eran nocivas para el crecimiento y permitan el desarrollo de las microalgas a esa profundidad. Durante los meses de verano, las cianobacterias se vieron obligadas a migrar hacia profundidades mayores, en busca de las condiciones ptimas de luz y temperatura. En la Figura 3 puede observarse que los mximos de zeaxantina y - Caroteno para Choa Queimada (punto de muestreo fondo) se produjeron en el mes de Junio, coincidiendo con el bloom antes referido de Oscillatoria spp. En Choa Queimada (Fig. 4 y Fig. 5; puntos de muestreo superficie y fondo, respectivamente), puede observarse que los mximos de zeaxantina y -Caroteno se corresponden con los contajes mximos de cianobacterias obtenidos, tendencia seguida en los dems pantanos. No obstante, se estima que esta correlacin puede depender de las poblaciones de cianobacterias dominantes. En la Tabla 2 se muestran los valores obtenidos para 13 muestras tomadas en distintos pantanos y distintos periodos, que tenan en comn un nmero de cianobacterias superior a 20.000 clulas/ml. Del total de las muestras, en 4 de ellas predominaba Oscilatoria spp., en 5 Microcystis spp., en 3 formas cocoides de cianobacterias, y en una de ellas predominaba Microcystis aeruginosa. En estas muestras se pone de manifiesto que los blooms o floraciones de Oscillatoria eran los que presentaban las mayores razones zeaxantina/n clulas y -Caroteno/n clulas, generalmente bastante superiores a las obtenidas para Microcystis.

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Figura 4. Perfiles zeaxantina-cianobacterias y -caroteno-cianobacterias correspondientes al pantano Choa Queimada, profundidad superficie. En abcisas se recogen las fechas de muestreos.

Figura 5. Perfiles zeaxantina-cianobacterias y -caroteno-cianobacterias correspondientes al pantano Choa Queimada, profundidad fondo. En abcisas se recogen las fechas de muestreo.

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Tabla 2. Relaciones entre fotopigmentos y poblaciones dominantes encontrados en las floraciones (desarrollos explosivos) detectados. Rat. car/Sp. Dom. (x 106 ) n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2,947 4,085 11,646 74,962 5,88 19,372 4,877 2,305

Punto de Muestreo Bravura superficie Bravura medio Bravura superficie Bravura medio Bravura superficie Bravura medio C. Queim. Superf. Beliche Superficie C. Queim. fondo Beliche fondo C. Queim. fondo Beliche fondo Bravura medio

Fecha

Cianobacterias (Cl/ml) 45611 64957 54380 22725 42038 20707 88840 23982 60128 29153 30703 22285 30774

Especie Dominante Microcystis spp. Microcystis spp. Microcystis spp. Outras (cocides) M. aeruginosa Otras (cocodes) Microcystis spp. Otras (cocodes) Oscillatoria spp. Oscillatoria spp. Oscillatoria spp. Oscillatoria spp. Microcystis spp.

Especie Rat. Zx/Sp. Dom. Dominante (Cl/ml) (x 106 ) 41535 55802 45889 12930 41511 20701 83473 22583 59897 25852 29579 21119 24728 0,120 0,233 1,373 2,629 4,770 0,773 1,821 0,753 27,681 3,868 13,489 7,576 3,720

05/08/2003 05/08/2003 02/09/2003 07/10/2003 14/01/2004 03/03/2004 10/05/2004 10/05/2004 07/06/2004 07/06/2004 17/06/2004 30/06/2004 14/09/2004

Conclusiones
A partir de nuestros resultados se puede concluir que los valores ms altos de clorofila total y carotenoides totales, indicativos de una mayor biomasa, se encuentran mayoritariamente en los meses de final de primavera y finales del verano. Los valores mximos se observaron en los puntos de muestreo medio y fondo, debido al movimiento de las cianobacterias a lo largo de la columna de agua en busca de las condiciones bioclimticas ptimas. La dinmica observada en la evolucin de los carotenoides totales es muy similar a la de la clorofila, aunque en condiciones de proliferacin o dominio de Microcystis, los valores de carotenoides obtenidos son, en proporcin al nmero de clulas, menores de lo que cabra esperar respecto a otras especies de cianobacterias como Oscillatoria o Anabaena. Los perfiles de zeaxantina y -caroteno se correlacionan con el nmero de clulas y la dinmica de las poblaciones de cianobacterias, por lo que su uso podra ser interesante como bioindicadores. No obstante, y segn lo observado, tambin se concluye que las especies de Microcystis tendran una menor capacidad de produccin de los carotenoides sealados que otras especies de cianobacterias, por lo que se considera que la zeaxantina y -caroteno se podran utilizar como indicadores mucho ms especficos de desarrollos explosivos o blooms de especies como Oscillatoria, Anabaena o formas cocoides de cianobacterias, que de Microcystis.

Lneas futuras de investigacin

Dentro del proyecto CIANOALERTA II se seguir profundizando en el estudio de la evolucin especfica de las principales especies de cianobacterias productoras de blooms (Microcystis, Anabaena u Oscillatoria), y su relacin con los niveles de los pigmentos zeaxantina y -caroteno, con el objeto de obtener mayor informacin respecto al perfil de produccin de pigmentos de estas microalgas en ambientes naturales. Por otro lado y junto a la determinacin del contenido de protenas en las muestras problema, se proceder a la deteccin, determinacin y estudio de los principales productos de degradacin de la clorofila (feofitinas) con el objeto de obtener una idea aproximada del grado de viabilidad en el que se encontraban las clulas de microalgas. Este hecho presentara gran importancia en las floraciones de Microcystis aeruginosa, pues la liberacin de la toxina ocurre cuando la cianobacteria muere y se produce la liberacin del contenido celular al agua.

Agradecimientos
Los autores quieren mostrar su agradecimiento al Fondo Europeo de Desarrollo Regional y a la Direccin General de Fondos Comunitarios y Financiacin Territorial del Ministerio de Hacienda, as como a todas las entidades implicadas en el proyecto junto a las Universidades de Huelva y del Algarve. Estas entidades son: guas do Algarve, CCDR y GIAHSA (Gestin Integral de Aguas de Huelva, S.A.). Los datos incluidos en este artculo corresponden al perodo del proyecto CIANOALERTA I (Julio

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2003-Diciembre 2004), cuyo informe final fue redactado en Septiembre de 2005. Para ms informacin pueden acudir a la web www.cianoalerta.org.

Referencias
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