Tecnicas Procedimientos Sifilis 2010

- Manual de Tcnicas y Procedimientos para el Diagnstico de Sfilis -
ManualdeTcnicasy Procedimientosparael DiagnsticodeSfilis
LaboratorioNacionalde ReferenciaenETS InstitutoNacionaldeEnfermedadesInfecciosas ANLISDr.CarlosG.Malbrn
Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisin Sexual. INEI ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn
Redaccin/Adaptacin: Patricia G. Galarza (jefa de Servicio) y Mnica Daz. Servicio Enfermedades de Transmisin Sexual, Laboratorio Nacional de Referencia. INEI, ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn. Ministerio de Salud. Repblica Argentina.
ltima revisin: Abril 2010
La realizacin de esta publicacin se enmarca dentro del Proyecto Seroprevalencia de Sfilis e Infeccin por Virus de la Inmunodeficiencia Humana en Pacientes Purperas de Argentina Direccin de SIDA y ETS, Direccin Maternidad e Infancia, Administracin de Laboratorios e Institutos de Salud
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCION........................................................................................................................................................3 MANIFESTACIONES CLINICAS .....................................................................................................................................3 SEROLOGA: INTERPRETACIN ....................................................................................................................4 SEGUIMIENTO SEROLGICO:........................................................................................................................4 DIAGNOSTICO DE LABORATORIO ........................................................................................................................5 1. 2. 3. EXMEN MICROSCPICO EN CAMPO OSCURO PARA DETECTAR T. pallidum ......................................5 PRUEBA DIRECTA DE ANTICUERPOS FLUORESCENTES PARA T. pallidum...........................................5 PRUEBAS SEROLGICAS INESPECIFICAS PARA LA SIFILIS .....................................................................6 3.1 VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY (VDRL) ...............................................................6
3.1.2. REACCION DE VDRL CUANTITATIVA, EN SUERO .........................................................................9 3.1.3. REACCION DE VDRL CON LQUIDO CEFALORRAQUIDEO ...........................................................10 3.2 REACCION EN SUERO NO CALENTADO. USR (UNHEATED SERUM REAGIN) ...........................12
OTRAS PRUEBAS NO TREPONMICAS.......................................................................................................19 4. PRUEBAS ESPECIFICAS O CONFIRMATORIAS PARA LA SIFILIS.............................................................21 4.1. ENSAYO DE LA MICROHEMAGLUTINACION PARA LOS ANTICUERPOS DE
T. Pallidum (MHA-TP)......................................................................................................................................21 4.2 MTODO AGLUTINACIN PASIVA DE PARTCULAS PARA LA DETECCIN DE
ANTICUERPOS CONTRA T. Pallidum (TP-PA)............................................................................................22 4.3 REACCIN DE ABSORCIN DE ANTICUERPOS TREPONMICOS FLUORESCENTES (FTA-
Abs) CON SUERO Y LCR ..............................................................................................................................24 ANEXO 1: PRINCIPIOS GENERALES DE SEGURIDAD.......................................................................................30 ANEXO 2: TOMA DE MUESTRA DE SANGRE Y LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO ...........................................34
INTRODUCCION
La sfilis es una enfermedad crnica que se contagia por contacto directo, transfusiones o por transmisin vertical (de la madre al feto) a travs de la placenta. Se caracteriza por presentar etapas sintomticas separadas por perodos asintomticos o de latencia. En estos perodos de latencia, slo una reaccin serolgica puede detectar la enfermedad y evitar que contine progresando. El agente responsable es el Treponema pallidum (TP), tiene forma de espiral y su longitud alcanza unos 10 a 15 m con un espesor es de 0,15 m.
MANIFESTACIONES CLINICAS
Las manifestaciones clnicas ocurren en 3 estadios diferentes: a) Primario b) Secundario c) Tardo Esta es la evolucin natural de la sfilis que puede ser detenida en sus primeras manifestaciones por un tratamiento correcto. Los tratamientos inadecuados pueden abortar alguna etapa sin curar la infeccin que se manifestar en una etapa posterior. Se llama sfilis infecciosa, reciente o temprana a las etapas primaria y secundaria por ser contagiosas y factibles de curar totalmente. La sfilis tarda en sus diversas manifestaciones no contagia y si bien puede ser curada, siempre dejar secuelas. a) Sfilis primaria: La lesin caracterstica primaria, el chancro duro, es una lcera indurada e indolora que marca el sitio de inoculacin de la bacteria, acompaada por alteraciones de los ganglios linfticos regionales. El perodo de incubacin promedio es de 2 a 3 semanas, pudiendo variar de 9 das a 3 meses. El treponema puede atravesar la mucosa sana, o bien aprovecha lesiones en la piel (traumticas, por hongos, herpticas). Asienta comnmente en glande, surco balano-prepucial, vulva o crvix; las formas extra-genitales ms frecuentes son lengua, labios, orofaringe y tambin ano y recto. El fluido seroso de la lesin contiene numerosos treponemas los cuales son detectados por microscopa de campo oscuro (CO), que es el diagnstico de eleccin en esta etapa. La serologa no se recomienda para el diagnstico de la lesin, pues el chancro suele corresponder con el perodo pre-serolgico de la sfilis y puede inducir a error (de todos modos, la toma de muestra para serologa debe efectuarse por protocolo, ante la presencia de una lesin). Es importante un cuidadoso interrogatorio del paciente sobre los tratamientos generales o locales efectuados antes de tomar la muestra; la antibioticoterapia general anula la posibilidad de efectuar CO, ya que el TP es sensible a dosis mnimas de varios antibiticos. En este caso deber controlarse la evolucin serolgica del paciente; si se utiliza VDRL y esta fuera negativa (periodo pre-serolgico) repetirla a los 15 y 30 das. La FTA-abs es la ms precoz de las reacciones, aparece aproximadamente a los 10 das del chancro. En los chancros orales no se utiliza el CO por la presencia de T. denticola, saprofito, de morfologa similar; en estos casos, se podra utilizar la prueba directa de anticuerpos fluorescentes, DAF-TP (aunque stos no se comercializan en el pas), la amplificacin gnica (PCR) derivando al laboratorio de referencia o, a la puncin de la adenopata sub-maxilar. Si un chancro sifiltico no es tratado, ir atenundose despus de unas semanas y desaparecer en 30 a 45 das sin dejar cicatriz local.
b) Sfilis secundaria: Si no hay tratamiento exitoso del chancro, luego de una latencia de 60-90 das (latencia temprana) aparecen los secundarismos en diversos sitios del organismo, a raz del ingreso de treponemas a la sangre. Se puede observar el exantema o rosola, una erupcin extendida sobre todo en torso, que no pica ni descama. Otros sntomas son: ppulas palmares y plantares, enantema orofarngeo, condilomas planos anales, alopecias, adenopatas generalizadas. En los condilomas el diagnostico puede hacerse por CO, pero en general en este periodo el diagnstico es serolgico, pues todas las reacciones son fuertemente reactivas. c) Sfilis tarda: Aparece luego de varios aos (10-20) de latencia (latencia tarda) cuando la infeccin no es tratada en las etapas anteriores. Las alteraciones que se producen en este perodo, ya no son infecciosas, sino post-infecciosas (Ej. gomas, cardiovasculares, nerviosas). Aunque se d el caso de que alguna de estas lesiones aflore o est ubicada en la piel, ningn foco de sfilis tarda es contagiante, porque carece de treponemas activos. En cualquiera de sus formas clnicas el diagnstico es serolgico. Aproximadamente el 71% de los pacientes con sfilis tarda presentan pruebas no-treponmicas reactivas (la VDRL presenta ttulos bajos o puede negativizarse), pero las pruebas treponmicas (TP-PA o FTA-abs) casi siempre son reactivas y pueden ser la nicas bases para el diagnstico. Es necesario adems el anlisis qumico y la VDRL del LCR para saber si la infeccin ha afectado al sistema nervioso central (SNC) aun en ausencia de sntomas.
SEROLOGA: INTERPRETACIN
VDRL Reactiva Reactiva TP-PA o FTA-abs Reactiva No reactiva DIAGNOSTICO Sfilis actual o pasada Inespecfico (otras patologas) Sfilis tratada, sfilis primaria muy reciente, sfilis tarda o reaccin de prozona en sfilis secundaria Ausencia de infeccin o perodo de incubacin de sfilis
No reactiva
Reactiva
No reactiva
No reactiva
SEGUIMIENTO SEROLGICO:
Las pruebas no treponmicas (USR, VDRL o RPR) son las nicas reacciones tiles en el seguimiento serolgico del paciente, mostrando la cada gradual del ttulo en la curacin (disminucin del ttulo > 4 veces, ej: 1:32 a 1:8); o un incremento frente a un tratamiento inadecuado; o una reinfeccin. La MHA-TP o TP-PA y la FTA-abs permanecen reactivas por muchos aos, por ello no son adecuadas para el seguimiento serolgico. Es importante que el control se realice en el mismo laboratorio, con la misma prueba no treponmica y, de ser posible, con la misma marca de reactivo a fin de obtener resultados comparables.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
1. EXMEN MICROSCPICO EN CAMPO OSCURO PARA DETECTAR T. pallidum
Muestras: Exudado seroso del chancro con pocas clulas sanguneas o puncin ganglionar.
Tcnica: 1) Limpiar la lesin con gasa y agua estril para retirar secreciones secas o costras; secar y frotar con gasa hasta que comience a sangrar, absorber y esperar que exude una serosidad amarilla poco o nada sanguinolenta. 2) Tomar la gota apoyando sobre ella un portaobjeto limpio o utilizar un ansa estril para transferirla al portaobjeto y cubrir con un cubreobjeto. Observar inmediatamente al microscopio ptico con condensador de campo oscuro y aumento de 400 X. Si la observacin al microscopio se viera retrasada, se deber utilizar una cmara hmeda para colocar los preparados a fin de evitar la desecacin. 3) El T. pallidum presenta 8-14 espiras indeformables, es de movilidad lenta, se identifica como un espiral delgado, rgido y con 3 tipos de movimientos: rotacin sobre su eje (como un tirabuzn), flexin en el centro y traslacin. En los chancros recientes suelen verse numerosos treponemas en el preparado, estos disminuyen o desaparecen al envejecer la lesin. 4) Si el primer portaobjeto fuera negativo, insistir con 2 tomas ms.
Interpretacin La demostracin de treponemas con morfologa y motilidad caractersticas del T. pallidum constituye un diagnstico positivo de sfilis en cualesquiera de sus fases, independientemente del resultado de la reaccin serolgica. La imposibilidad de encontrar la bacteria no excluye un diagnstico de sfilis.
Criterio de informe Observacin en campo oscuro: negativa o positiva.
2.
PRUEBA DIRECTA DE ANTICUERPOS FLUORESCENTES PARA T. pallidum
Es una reaccin de fluorescencia directa que se aplica sobre la exudacin del chancro. Se utiliza una inmunoglobulina anti-Treponema marcada con isotiocianato de fluorescena (FITC) que ha sido absorbida con Treponema phagedensis, treponema Reiter, o un anticuerpo monoclonal anti-T. pallidum marcado con FITC. La inmunoglobulina marcada reacciona con el antgeno T. pallidum, subespecie pallidum en el material de la prueba. Es obviamente ms costosa que el CO y requiere un microscopio de fluorescencia, as como experiencia en la observacin. El material es fijado con acetona antes de la coloracin, por lo tanto solo se vern formas espiraladas fluorescentes pero no la tpica movilidad; presenta la ventaja de permitir el envo a distancia del portaobjeto fijado.
Tcnica 1) Desparramar en un portaobjeto formando un crculo de 1 cm de ancho, aproximadamente 10 l del material y secar al aire. Si es posible preparar 4 portaobjetos de cada espcimen. 2) Fijar los extendidos en acetona por 10 min. o con metanol 100 % por 10 seg. o con calor suave. 3) Cubrir cada extendido con conjugado diluido (aprox. 30 l), y colocar en cmara hmeda a 3537 C por 30 min. Nota: con el anticuerpo monoclonal, adicionar azul de Evans que puede prepararse como una solucin al 0,05 % en PBS. 4) Lavar los extendidos con PBS, y cubrir con PBS por 10 min. Hacer un lavado final con agua destilada. 5) Secar con papel de filtro, colocar una gota de lquido de montaje y colocar un cubreobjeto. Colocar los portaobjetos en una cmara oscura y leer entre las 4 horas. 6) Examinar en microscopio de fluorescencia con objetivo de 40X y con un objetivo de inmersin de 100X para confirmacin.
Criterio de informe: Se observaron por inmunofluorescencia directa, treponemas inmunolgicamente especficos para T. pallidum.
3.
PRUEBAS SEROLGICAS INESPECIFICAS PARA LA SIFILIS
3.1
VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY (VDRL)
Es una reaccin de floculacin, donde el antgeno utilizado est compuesto por colesterol, lecitina y cardiolipina. Esta prueba no treponmica mide anticuerpos antilipdicos; IgG e IgM, los cuales son formados por el husped en respuesta al material lipdico liberado de las clulas husped daadas en la infeccin por TP y material lipdico de la superficie celular treponmica. A causa del antgeno utilizado, esta prueba reacciona frente a otras patologas: colagenopatas, parasitosis, drogadiccin o en determinadas condiciones fisiolgicas como embarazo, vejez, etc. Tiene gran sensibilidad y baja especificidad.
Reactivos: 1) Antgeno de VDRL: Es una solucin alcohlica de 0,03% de cardiolipina, 0,9% de colesterol y 0,21% 0,01% de lecitina.
2) Buffer salino VDRL, pH 6,0 0,1 ( 1,0% NaCl). Puede ser comprado o preparado en el laboratorio (ver tabla siguiente)
Formaldehdo neutro Na2HPO4 anhidro KH2PO4 NaCl Agua destilada
0,5ml 0,037g 0,170 g 10.00 g 1000 ml
NOTA: Cuando ocurra un inexplicable cambio en la reactividad de los sueros controles, verificar el pH del buffer salino ya que esto puede ser la causa. Descartar el buffer si est fuera del rango de pH 6,0 0,1. 3) Sueros controles: Control reactivo (R), dbil reactivo (D) y no reactivo (N). Para la realizacin de las pruebas cuantitativas el suero control debe tener un ttulo de al menos 4 dils. 4) Solucin Salina 0,9%: Agregar a cada 100ml de agua destilada 0,9 gr de NaCl. 5) Solucin Salina 10,0%: Agregar a cada 100ml de agua destilada 10 gr de NaCl.
Equipamiento: 1) Placas de vidrio: a) Suero: Placa de vidrio de 2 x 3 pulgadas (50 X 76 mm aproximadamente) con 12 crculos planos (no cncavos) de 14mm de dimetro. El permetro de cada crculo debe tener un espesor tal que evite el traspaso del suero de un anillo a otro. b) Lquido cefalorraqudeo: 1) Placa de vidrio como la descrita para suero. 2) Placa Kline de vidrio de 3 x 2 pulgadas (76 mm x 25 mm aproximadamente) x 3 mm de espesor, con 12 concavidades de 16 mm de dimetro y 1,75 mm de profundidad. 2) Rotador mecnico ajustable a 180 2 r.p.m. que circunscriba un crculo de 19 mm de dimetro sobre el plano horizontal. 3) Agujas no descartables calibradas (Ver Preparacin y Calibracin de Agujas, pag. 17 ) Para dispensar el antgeno sobre el suero: calibre 18 Para dispensar el antgeno sobre el lquido cefalorraqudeo: calibre 21 22. Si no se disponen de agujas, se pueden utilizar pipetas automticas considerando que se hallen bien calibradas. 4) Un frasco de vidrio para la preparacin del antgeno de VDRL, de 30 ml de capacidad de 35 mm de dimetro con tapa de vidrio base plana. Nota: Como este tipo de frasco resulta difcil de conseguir en el comercio se recomienda un Erlenmeyer de vidrio de 25 ml con tapa de vidrio 5) Microscopio con ocular de 10X y objetivo 10X 6) Pipetas graduada: 1,0 ml graduada en 1/100 5,0 ml graduada en 1/10 10,0 ml graduada en 1/10
Conservacin del suero: Conservar el suero lmpido, separado del cogulo, en heladera (2 - 8 C) o congelado (-20 C) si la determinacin demorar ms de 5 das. Evitar el congelamiento y descongelamiento de los especimenes. Las muestras con contaminacin bacteriana o hemlisis excesiva son insatisfactorias para el ensayo. Preparacin del suero: Calentar a 56 C en bao de Mara durante 30 minutos. Los sueros que se analicen despus de 4 hs del primer perodo de calentamiento, deben volver a calentarse a 56 C durante 10 minutos. NOTA: Las pruebas de floculacin para la sfilis son afectadas por la temperatura ambiente (Ta). Para obtener resultados confiables y reproducibles, las muestras de suero control, el antgeno y los sueros a testear deben estar a una Ta de 23 a 29 C en el momento de la determinacin.
3.1.1
REACCION DE VDRL CUALITATIVA, EN SUERO
Preparacin de la Suspensin del Antgeno VDRL: 1) Al momento de preparar la suspensin todos los reactivos deben estar entre 23 y 29C. 2) Pipetear 0,4ml de Buffer salino VDRL y agregarlo al fondo del frasco de 30 ml o del erlenmeyer de 25ml. 3) Agregar 0,5 ml de suspensin de antgeno (de la mitad inferior de una pipeta 1 ml graduada hasta la punta) directamente sobre la solucin salina mientras se hace girar el frasco suave pero continuamente sobre una superficie plana. NOTA: El antgeno se aade gota a gota, de modo que se permita unos seis segundos para los 0,5ml de antgeno. La punta de la pipeta debe quedar en el tercio superior del frasco y la rotacin no debe ser tan vigorosa que salpique la pipeta con la solucin salina. Se obtendr la velocidad de rotacin adecuada cuando el centro del frasco describa un crculo de 5 cm de dimetro, unas tres veces por segundo. 4) Expeler la ltima gota de antgeno de la pipeta sin que esta toque la solucin salina. 5) Proseguir con la rotacin del frasco durante 10 segundos. 6) Con una pipeta de 5ml aadir 4,1ml de buffer. 7) Tapar el frasco y agitar de abajo hacia arriba y viceversa unas 30 veces en 10 segundos. 8) La suspensin de antgeno est lista y puede ser utilizada durante un da (8Hs). 9) Cada vez que se utilice la suspensin agitarla suavemente. No debe mezclarse hacindola pasar a la fuerza de un lado a otro de la jeringa y la aguja, puesto que podra ocasionar la ruptura de partculas y la prdida de reactividad. Procedimiento: 1) En un anillo de 14 mm de la placa, depositar con pipeta 50 l de suero calentado. 2) Aadir 1 gota (1/60 de ml) de suspensin de antgeno (previamente resuspendida) sobre cada suero, con una aguja no descartable calibrada sin bisel de calibre 18 . 3) Rotar las placas durante 4 minutos a 180 2 rpm sobre un rotador mecnico. 4) Leer la reaccin al microscopio con ocular de 10X y objetivo de 10X. 5) Informar el resultado como: REACTIVO: formacin de flculos medianos o grandes. DBIL REACTIVO: pequeos flculos. NO REACTIVO: ausencia de floculacin o ligeramente rugoso.
3.1.2.
REACCION DE VDRL CUANTITATIVA, EN SUERO
Todos los sueros que produzcan resultado reactivo, dbil reactivo o no reactivo ligeramente rugoso en la reaccin de VDRL en placa, deben analizarse de nuevo cuantitativamente hasta un ttulo en dilucin final. Las diluciones de suero que deben analizarse son: sin diluir (1:1), 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. En casos especiales continuar hasta 1:256. 1) Para cada muestra a ser testada, colocar 50 l de NaCl al 0,9 % en los crculos 2 a 5. 2) Colocar 50 l del suero a testar en los crculos 1 y 2. 3) Mezclar la solucin salina y el suero en el crculo 2 utilizando la pipeta automtica, por aspiracin y eliminacin, 8 veces. Evitar la formacin de burbujas. 4) Transferir 50 l del crculo 2 (1:2) al crculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 l del crculo 3 (1:4) al crculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 l del crculo 4 (1:8) al crculo 5 (1:16), mezclar como en el paso 3 y descartar 50 l. 5) Resuspender suavemente la suspensin antignica. Sosteniendo el frasco del antgeno en posicin vertical, dispensar 1 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire, y luego colocar exactamente una gota (1/60 ml) de la suspensin antignica dentro de cada crculo de prueba con una aguja no descartable sin bisel de calibre 18. 6) Rotar 4 minutos a 180 2 rpm y leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X. 7) Anotar los resultados en trminos de la mayor dilucin de suero que produzca un resultado Reactivo (ver tabla 1).
Diagrama para la reaccin cuantitativa

Suero N 1 Suero N 2
1:1
1:8
1:1
1:8
1:2
1:16
1:2
1:16
1:4
1:4
Tabla 1: Informe de los resultados cuantitativos en suero Suero no diluido (1:1) R R R D N (rugoso) D 1:2 D R R D D N Resultado en dilucin de suero: 1:4 N D R R R N 1:8 N N D R R N 1:16 N N N D R N 1:32 N N N N N N Reactivo, no diluido (1 dil) Reactivo, 2 dils Reactivo, 4 dils Reactivo, 8 dils Reactivo, 16 dils Dbil Reactivo, 1 dil Informe
R: Reactivo, N: no reactivo, D: dbil
8) Si la ms alta dilucin probada (1:16) es reactiva, proceder como sigue: a) Preparar una dilucin 1:16 de la muestra por adicin de 100 l del suero a 1,5 ml de NaCl al 0,9 %. Mezclar. b) Colocar 50 l de la solucin de NaCl 0,9 % en los crculos 2, 3, 4 y 5 de la placa. c) Colocar 50 l de la dilucin 1:16 en los crculos 1 y 2. d) Con la misma pipeta, realizar diluciones seriadas dobles a partir del crculo 2 y completar la prueba como se describi antes en los pasos 3 a 6. e) Leer los resultados como se describi previamente.
3.1.3.
REACCION DE VDRL CON LQUIDO CEFALORRAQUIDEO
Preparacin de la "Suspensin de antgeno sensibilizada": a) Preparar la suspensin de antgeno como describe el fabricante para la reaccin en suero. b) Aadir una parte de solucin salina al 10 % a una parte de suspensin del antgeno. c) Mezclar bien por rotacin o inversin del tubo y dejar en reposo durante 5 minutos por lo menos, pero no ms de 2 horas, antes de utilizarla.
Control de la reactividad de la suspensin del antgeno sensibilizado Siempre se debe incluir en la realizacin de la reaccin de VDRL LCR controles para verificar la reactividad de la suspensin de antgeno sensibilizado. Preparar muestras de LCR simulado diluyendo un suero que al menos sea reactiva su VDRL cuando es diluido en 1:80 en solucin salina de NaCl al 0,9%. Para este control no se debe calentar a 56C el suero. Ejemplo: hacer una dilucin en un tubo de ensayo de 50l del suero en 3,95 ml de NaCl al 0,9%. Tambin incluir un suero VDRL no reactivo. Realizar la reaccin como esta indicado bajo el ttulo de reaccin de VDRL cualitativa con LCR.
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Registrar los resultados de los controles como: REACTIVO: flculos definidos de cualquier grado. NO REACTIVO: Sin flculos o muy ligera rugosidad. No utilizar el antgeno sensibilizado si no cumple con estos criterios de reactividad.
Preparacin del LCR: Centrifugar y decantar el LCR. El LCR se analiza sin calentarlo previamente. Las muestras que a simple vista se vean contaminadas o que contengan sangre no son adecuadas para la reaccin. Si el ensayo demora ms de 4 hs. refrigerar la muestra (2-8 C), si demora ms de 5 das congelar a 20 C o menor.
3.1.3.1.
REACCION DE VDRL CUALITATIVA CON LCR.
1) En una concavidad de la placa de aglutinacin depositar 50 l de LCR con pipeta automtica. 2) Aadir una gota (10 l) de suspensin de antgeno sensibilizada con una aguja de calibre 21 o 22. 3) Agitar la placa durante 8 minutos a 180 2 rpm en un rotador automtico. 4) Leer la reaccin al microscopio con ocular y objetivo de 10X. 5) Informar el resultado como: REACTIVO: flculos definidos de cualquier grado. NO REACTIVO: Sin flculos o muy ligera rugosidad.
3.1.3.2.
REACCION CUANTITATIVA VDRL EN LCR.
Se practican reacciones cuantitativas con todos los LCR que resulten Reactivos en la reaccin cualitativa. 1) Para cada muestra a ser testada, colocar 50 l de NaCl al 0,9 % en los crculos 2 a 5. 2) Colocar 50 l del LCR a testar en los crculos 1 y 2. 3) Mezclar la solucin salina y el suero en el crculo 2 utilizando la pipeta automtica, por aspiracin y eliminacin, 8 veces. Evitar la formacin de burbujas. 4) Transferir 50 l del crculo 2 (1:2) al crculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. 5) Transferir 50 l del crculo 3 (1:4) al crculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3. 6) Transferir 50 l del crculo 4 (1:8) al 5 (1:16), mezclar como en el paso 3 y descartar 50 l. 7) Resuspender suavemente la suspensin antignica. Sosteniendo el frasco del antgeno en posicin vertical, dispensar 1 o 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire, y luego colocar exactamente una gota (10 l) de la suspensin antignica dentro de cada crculo de testeo con una aguja de calibre 21 22. 8) Rotar 8 minutos a 180 2 rpm y leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X. 9) Anotar los resultados en trminos de la mayor dilucin de LCR que produzca un resultado Reactivo.
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Tabla 2: Informe de los resultados cuantitativos en LCR LCR no diluido (1:1) R R R R N (rugoso) 1:2 N R R R R Resultado en dilucin de LCR: 1:4 N N R R R 1:8 N N N R R 1:16 N N N N R 1:32 N N N N N Reactivo, no diluido (1 dil) Reactivo, 2 dils Reactivo, 4 dils Reactivo, 8 dils Reactivo, 16 dils Informe
R: Reactivo, N: no reactivo
3.2
REACCION EN SUERO NO CALENTADO. USR (UNHEATED SERUM REAGIN)
PRINCIPIOS DE LA PRUEBA La USR es una prueba microscpica, no-treponmica y de floculacin en placa. El antgeno de USR detectara anticuerpos (reaginas) antilipoidales en muestras de suero de personas con otras condiciones agudas y crnicas. La prueba de microfloculacion USR usa una suspensin de antgeno de VDRL modificado que contiene cloruro de colina, la cual incrementa la reactividad del anticuerpo en suero no calentado. Semejante a la VDRL, la prueba se lee microscpicamente y es rpido y fcil de hacer. Sin embargo, a diferencia de la VDRL, la suspensin antignica de la USR no debe ser preparada o descartada diariamente.
RECOLECCION Y MANIPULEO DE LA MUESTRA Muestra 1. Evitar infecciones accidentales por pinchaduras o cortes cuando se colecta y procesa la muestra, observando las normas de bioseguridad correspondientes. 2. El suero es la nica muestra apropiada para la USR. 3. Una muestra de suero aceptable no debera contener partculas que pudieran interferir con la lectura de los resultados. Las muestras de suero que estuvieran excesivamente hemolizadas, visiblemente contaminadas con bacterias, quilosas o extremadamente turbias, son insatisfactorias. Una muestra esta muy hemolizada cuando un impreso no puede ser ledo a travs de ella. Nota: La hemlisis puede ser causada por transportar la muestra en un clima extremadamente fro o caliente, sin el aislamiento apropiado. 4. No todas las muestras inadecuadas deberan ser descartadas o no analizadas. Cuando una muestra no satisfactoria es recibida en el laboratorio, avisar al medico solicitante y discutir si la
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muestra debera ser analizada. Si el resultado de la prueba es aun requerida por el mdico, la condicin de la muestra debe ser indicada en el informe. Recoleccin Los procedimientos para la recoleccin y procesamiento de sangre venosa y lquido cefalorraqudeo se indican en el anexo 2. 1. Recolectar sangre entera en un tubo limpio y seco sin anticoagulante. 2. Rotular cada muestra con la identificacin del paciente y la fecha. Procesamiento 1. Dejar el tubo a temperatura ambiente el tiempo suficiente (aproximadamente 20 minutos) para que se forme el coagulo en la muestra. 2. Centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos, entre 1000 a 1200 x g a fin de sedimentar los elementos celulares. 3. Dejar la muestra de suero en el tubo de recoleccin original o transferirlo a un tubo limpio si el anlisis va a demorarse ms de 4 hs. o el suero va a ser calentado. Aunque la inactivacin por calentamiento no es necesaria, el suero puede ser calentado a 56C por 30 minutos para reducir el virus del VIH tipo 1, sin afectar la prueba en curso. 4. Si la muestra de suero va a ser derivada a otro sitio para el testeo, se deben utilizar los contenedores apropiados. 5. Si la prueba va a ser demorada, guardar el suero en la heladera (2 a 8C). Si la prueba va a ser demorada ms de 5 das, congelarla a 20C o menos. Evitar repetidos congelamientos y descongelamientos de la muestra. 6. Las muestras debern ser llevadas a temperatura ambiente (23 29C) antes de realizar la prueba.
MATERIALES Reactivos Adquiridos 1. Suspensin antignica USR. Una combinacin estabilizada de cardiolipina, colesterol y lecitina en una solucin resuspendida de EDTA, cloruro de colina, fosfato y timerosal. La suspensin antignica se guarda a 2 8 C. Suspensiones no abiertas son estables al menos por 1 ao desde la fecha de manufactura o hasta la fecha de expiracin. 2. Alcohol, Etanol 95% 3. Acetona Preparados 1. Muestras de suero control. Reactivo (R), dbil reactivo (D) y no reactivo (NR). 2. Solucin salina 0,9%. Agregar 0,9 g de cloruro de sodio seco (ACS) a 100 ml de agua destilada.
Equipamiento 1. Aguja no descartable calibrada, calibre 18 sin bisel (ver Preparacin y Calibracin de Agujas, pag. 17 ) 2. Jeringa de vidrio (2 a 5 ml) 3. Pipeta automtica de 50 l. 4. Portaobjetos, 2 x 3 pulgadas con 12 anillos parafinados o cermicos de aproximadamente 14 mm de dimetro. 5. Rotador mecnico ajustable a 180 2 rpm, circunscribiendo un crculo de 19 mm de dimetro sobre un plano horizontal. 6. Microscopio con oculares de 10X y un objetivo de 10X. 7. Centrfuga.
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8. Heladera de 2-8 C. 9. Cobertor humidificante (opcional). 10. Guantes de latex descartables, anteojos de seguridad y ropa protectora. 11. Contenedores para descartar y desinfectantes.
PROCEDIMIENTOS Prueba Cualitativa 1. Las pruebas de floculacin en placa para sfilis, son afectadas por la temperatura. Para obtener resultados confiables y reproducibles, la suspensin antignica de USR, los controles y la muestra a analizar deben estar a temperatura ambiente (23 29 C) cuando se realiza la prueba. 2. Colocar con una pipeta automtica 50 l de suero no calentado en un anillo de parafina o cermica de la placa. No usar placas de vidrio con concavidades, pocillos o anillos de vidrio. 3. Resuspender suavemente la suspensin de antgeno de USR. 4. Sostener la aguja dispensadora de la suspensin antignica y la jeringa en posicin vertical, dispensar varias gotas para eliminar el aire de la aguja; luego agregar exactamente 1 gota (22 l) de suspensin antignica a cada crculo conteniendo suero. 5. Colocar la placa sobre el rotador mecnico. Rotar la placa por 4 minutos a 180 2 rpm. Cuando se realiza la prueba en un clima seco, cubrir las placas con un cobertor humidificante durante la rotacin para prevenir la evaporacin excesiva. 6. Inmediatamente despus de la rotacin, sacar la placa del rotador y leer los resultados. 7. Realizar la prueba cuantitativa en todas las muestra de suero que produzcan un resultado reactivo, dbil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa.
Lectura e informe de los resultados cualitativos 1. Leer las reacciones usando un microscopio equipado con ocular de 10X y objetivo de 10X. 2. Informar los resultados de la siguiente manera: Lectura Grumos grandes o medianos Grumos pequeos Sin grumos o muy ligera rugosidad Informe Reactivo (R) Dbil reactivo (D) No reactivo (NR)
Prueba Cuantitativa 1. Diluir hasta un ttulo de punto final todas las muestras que produzcan resultados reactivo, dbil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa. Analizar la muestra de suero no diluida y diluida 1:2, 1:4 y 1:8. Se pueden realizar en una sola placa las pruebas cuantitativas hasta diluciones 1:8 de tres muestras de suero, segn se muestra en la figura siguiente.
Suero 1
1:1
Suero 2
1:2
1:4
1:8
1:1
Suero 3
1:2 1:2 1:4
1:4 1:8
1:8
1:1
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2. Colocar 50 l de solucin salina al 0,9 % en los crculos 2 a 4. No desparramar la solucin salina. 3. Con una pipeta automtica, colocar 50 l del suero en el crculo 1 y 50 l en el crculo 2. 4. Mezclar la solucin salina y el suero en el crculo 2 utilizando la pipeta automtica, por aspiracin y eliminacin, 8 veces. Evitar la formacin de burbujas. 5. Transferir 50 l del crculo 2 (1:2) al crculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 l del crculo 3 (1:4) al crculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3 y descartar los ltimos 50 l. 6. Resuspender suavemente la suspensin antignica. Sosteniendo el frasco del antgeno en posicin vertical, dispensar 1 o 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire y luego colocar exactamente una gota (22 l) de la suspensin antignica dentro de cada crculo. 7. Colocar la placa sobre el rotador mecnico. Rotar 4 minutos a 180 2 rpm. Cuando la prueba es realizada en un clima muy seco, colocar la placa bajo un cobertor humidificante durante la rotacin para preservar la evaporacin. 8. Inmediatamente despus de la rotacin, leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X. 9. Anotar los resultados en trminos de la mayor dilucin de suero que produzca un resultado Reactivo (NO dbil reactivo).
Informe de los Resultados Cuantitativos Suero no diluido (1:1) R R R D N (rugoso) D Resultado en diluciones del suero 1:2 D R R D D N 1:4 N D R R R N 1:8 N N D R R N 1:16 N N N D R N 1:32 N N N N N N Reactivo, no diluido (1 dil) Reactivo, 2 dils Reactivo, 4 dils Reactivo, 8 dils Reactivo, 16 dils Dbil Reactivo, 1 dil
Informe
10. Si la dilucin ms alta probada (1:8) es reactiva, continuar de la siguiente manera: a. Preparar en un tubo una dilucin 1:8 de la muestra de suero. Agregar 0,1 ml (100 l) de suero a 0,7 ml de solucin salina 0,9%. Mezclar adecuadamente. b. Colocar 50 l de solucin salina 0,9% en los crculos 2, 3 y 4 de la placa. Preparar diluciones seriadas adicionales para muestras fuertemente reactivas. c. Agregar 50 l de la dilucin 1:8 preparada anteriormente a los anillos 1 y 2. d. Realizar diluciones seriadas al medio, comenzando con el anillo 2 y descartar los ltimos 50 l. Completar la prueba como se describi en los pasos 6 a 9.
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11. Una vez finalizadas las pruebas del da, tapar el antgeno remanente. En el caso de utilizar una aguja y jeringa dispensadora o un dispositivo dispensador separado, limpiarlos enjuagando con agua, alcohol y acetona. Sacar la aguja de la jeringa despus de limpiarlos. Interpretacin de los Resultados 1. La prueba de USR es una gran ayuda en el diagnstico de sfilis. Para arribar al diagnostico definitivo de sfilis, el profesional combina los resultados de la USR con otras pruebas serolgicas, exmenes de campo oscuro, signos y sntomas clnicos y factores de riesgo. Sin alguna otro soporte para el diagnostico de sfilis, un resultado de USR reactivo, puede deberse a causas que no correspondan con una infeccin por treponema patgeno. El valor predictivo de una USR en el diagnstico de sfilis se incrementa cuando se combina con una prueba treponmica reactiva. 2. La prueba reactiva puede sugerir infeccin pasada o presente con Treponema patgeno aunque tambin podra ser una reaccin falso positiva. 3. Las reacciones falso positivas pueden deberse a un error de laboratorio como as tambin a anticuerpos sricos que no estn relacionados con Treponemas patgenos. Los errores tcnicos son detectados por la prueba USR no reactiva sobre una segunda muestra srica. Un resultado reactivo de USR debido a infeccin no relacionada u otros factores, es identificada por los resultados de una prueba treponmica no reactiva simultnea. 4. La prueba USR no reactiva sin evidencia clnica de sfilis, puede sugerir una infeccin sifiltica pasada, infeccin con tratamiento efectivo u ocasionalmente, una infeccin de larga evolucin. Una prueba no reactiva USR con evidencia clnica de sfilis puede deberse a sfilis primaria temprana; sfilis secundaria, como resultado de una reaccin de prozona; y a algunos casos de sfilis tarda. Si se sospecha reaccin de prozona, debera repetirse la prueba con diluciones del suero del paciente 1:16 antes de determinar que la muestra de suero es no reactiva. Una prueba USR no reactiva no excluye una sfilis en perodo de incubacin. 5. Cuando se realiza la prueba USR cuantitativa en pacientes con sfilis, una subida de cuatro veces el ttulo (1:4 a 1:16) en una muestra seriada puede sugerir una infeccin, una reinfeccin o un fallo de tratamiento; una disminucin de 4 veces el ttulo (1:64 a 1:16) despus del tratamiento para sfilis temprana (estado primario o secundario), usualmente sugiere que la terapia fue adecuada. 6. Todos los resultados de USR cualitativa reactivos, deberan ser cuantificados hasta un punto final y su ttulo informado. De forma infrecuente, se pueden observar ttulos altos de USR en pacientes con coinfeccin por HIV-1 y altos ttulos falsos positivos en pacientes con linfomas. Fuentes de error 1- La reactividad de la prueba disminuye si la temperatura del rea de trabajo, muestras y/o reactivos es menor a 23C y se incrementa si es mayor a 29C. 2- Si se trabaja con muestras de sueros hemolizados, contaminados o extremadamente turbios, los resultados son impredecibles. 3- Si el antgeno est vencido o carece de adecuada reactividad estndar los resultados pueden ser impredecibles. 4- Si no se siguen estrictamente las condiciones en cuanto a la velocidad y el tiempo de rotacin de los antgenos y las muestras, los resultados pueden ser incorrectos. Limitaciones de la prueba 1- Ocasionalmente puede aparecer la reaccin de prozona, en la cual ocurre una inhibicin parcial o completa de la reactividad con suero no diludo y la maxima reactividad se obtiene solamente con suero diludo. El fenmeno de prozona puede sospecharse cuando la muestra produce un resultado no reactivo rugoso o dbil reactivo en la prueba de tamizaje cualitativa. Todas las muestras probadas que producen algn grado de rugosidad o reactividad con el antgeno de USR en la prueba de tamizaje cualitativa
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2-
3-
4-
5-
puede ser probado de nuevo usando un procedimiento cuantitativo. Una muestra debera ser analizada para el fenmeno de prozona cuando existe sospecha clnica de sfilis, pero la USR cualitativa es no reactiva. La USR puede ser reactiva en personas provenientes de reas geogrficas done el yaws es endmico. Se hallaron ttulos residuales de estas infecciones menores a 1:8 cuando se utilizaron otras pruebas treponmicas. Las reacciones biolgicas falso positivas ocurren ocasionalmente con antgenos cardiolipinicos, principalmente en muestras de drogadictos, en personas con lupus eritematoso, mononucleosis, malaria, lepra, o neumona viral, o en quienes recientemente han sido vacunados. Los ttulos sricos de pruebas no treponmicas de personas tratadas en estado de sfilis latente o tarda o quienes se han reinfectado, no disminuyen tan rpidamente como en aquellas personas en estados ms tempranos de su primera infeccin. De hecho, en estas personas los ttulos sricos disminuyen rpidamente reteniendo un titulo de bajo nivel de reactividad de por vida. La USR no ha sido evaluada para muestras de plasma, por lo tanto el plasma no debera ser usado en esta prueba.
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Calibracin de Agujas para las Pruebas de VDRL, USR y RPR

Preparacin y calibracin de agujas no descartables para el ensayo de floculacin en placa: Si no se cuenta con agujas sin bisel, este se puede eliminar utilizando alguna herramienta adecuada. 1) Hacer una muesca profunda por encima del bisel de la aguja. Romper la punta con un alicate. 2) Colocar la aguja en una jeringa de 1 ml, llenarla con 1 ml de la suspensin de antgeno, eliminar las burbujas y enrasar para que queden 0,5ml, (enrasar a 1ml en el caso del antgeno USR). Sostener la jeringa en posicin vertical, y cuidadosamente presionar el mbolo. 3) Contar la cantidad de gotas que se liberan en el volumen medido. 4) Las agujas que no cumplan con las condiciones indicadas deben ser ajustadas antes de usarse, a fin de que rindan los volmenes correctos. 5) Si la aguja libera demasiadas gotas, la abertura de la extremidad es pequea. Para ajustarla, debe abrirse con un instrumento puntiagudo. 6) Si la aguja libera insuficiente cantidad de gotas, la abertura es demasiado grande. Ajstese aplastando ligeramente los bordes de la aguja hacia delante o limndolos. 7) Una vez calibrada, se debe proteger contra golpes y cadas. Limpiarla con agua, alcohol y acetona. 8) Controlar el volumen una vez al mes o cuando sufre algn golpe o deformacin.
Reaccin (cuali y cuantitativa)
Reactivo
Calibre de la aguja
Volmen requerido por gota (l)
N de gotas liberadas por 0,5 ml de reactivo
VDRL VDRL-LCR USR RPR
Suspensin de Ag Suspensin de Ag sensibilizado Suspensin de Ag Suspensin de Ag
18 21 22 18 20
17 10 22 17
30 1 50 1 45 1 ( por 1 ml) 30 1
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OTRAS PRUEBAS NO TREPONMICAS

Con la excepcin del antgeno de VDRL, los antgenos de las pruebas no treponmicas estn estabilizados por el agregado de sal disdica de EDTA, adems de cloruro de colina para eliminar la necesidad de inactivar el suero por calentamiento. Las pruebas no treponmicas se dividen en procedimientos microscpicos y macroscpicos.
Microscpicos VDRL (venereal disease research laboratory) USR (unheated serum reagin) Los procedimientos se describieron anteriormente.
Macroscpicos RPR (rapid plasma reagin) En esta prueba, se le agregan partculas de carbn al antgeno para facilitar la visualizacin de la floculacin.
TRUST (toluidine red unheated serum test) Esta prueba difiere de la anterior en que se agregan partculas de pintura pigmentada al antgeno. Esta prueba no se comercializa en nuestro pas. En ambas pruebas, las partculas quedan atrapadas en el complejo antgeno-anticuerpo formado con el suero.
Sensibilidad y Especificidad de las Pruebas No-Treponmicas Sensibilidad (%) por estado de sfilis no tratada (rango) Prueba Primaria VDRL RPR USR TRUST 78 (74-87) 86 (77-99) 80 (72-88) 85 (77-86) Secundaria 100 100 100 100 Latente 96 (88-100) 98 (95-100) 95 (88-100) 98 (95-100) Tarda 71 (34-94) 73 Especificidad No-sfilis % (rango) 98 (96-99) 98 (93-99) 99 99 (98-99)
Limitaciones de los procedimientos no especficos

A. Muestras de plasma inapropiadamente recolectadas, por ej. muestras procesadas despus de 24 hs de su recoleccin o suero de cordn, pueden dar reacciones mnimamente reactivas. Por esta dificultad el uso de plasma y/o sangre de cordn debe restringirse a situaciones de pruebas especiales.
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B. Pueden ocurrir fenmenos de prozona en un 1 a 2 % de los pacientes con sfilis secundaria. Un fenmeno de prozona ocurre cuando el anticuerpo esta en exceso, es incompleto o bloquea la reaccin normal antgeno-anticuerpo. Si el fenmeno de prozona ocurre como resultado del exceso de anticuerpo, como es usualmente el caso en las pruebas serolgicas para sfilis, entonces una dilucin del anticuerpo a 1:16 es adecuado para obtener la concentracin proporcional ptima y una reaccin realmente detectable. Inicialmente estas muestras pueden exhibir un patrn de no reactividad, la cual es ligeramente granular o rugosa, o mostrar una apariencia atpica. Por encima de la dilucin, la reactividad se incrementar y luego decrecer hasta que el punto final del ttulo sea alcanzado. C. Un porcentaje entre 1-2 % de resultados falso positivos ocurren en la poblacin general, sin tener en cuenta la prueba no treponmica usada. En poblaciones de drogadictos endovenosos, ms del 10 % de las muestras de suero pueden dar resultados falso positivos. Los ttulos falso positivos son usualmente menores que 1:8, pero ttulos bajos pueden observarse durante la sfilis latente y tarda y ttulos altos de resultados falso positivos ocurren en drogadictos endovenosos y en algunos pacientes con linfomas. Los resultados falso positivos pueden ser excluidos por la repeticin de la prueba, confirmacin por una prueba treponmica, y subsiguiente evaluacin de una segunda muestra. D. La mala interpretacin de las pruebas ocurren ms frecuentemente por: 1) Falla en reconocer que una variacin de 1 ttulo de punto final es inherente a la mayora de las pruebas serolgicas. 2) Falla para establecer la verdadera positividad de los resultados de la prueba. 3) Falla para obtener una adecuada historia del paciente. E. Un error particular que puede conducir a una mala interpretacin, es usar ms de una prueba no treponmica para monitorear el tratamiento. La misma prueba deber ser usada en la determinacin cualitativa inicial y subsecuentes pruebas cuantitativas.
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4.
PRUEBAS ESPECIFICAS O CONFIRMATORIAS PARA LA SIFILIS
Todas las pruebas treponmicas usan T. pallidum o sus componentes como antgeno. Los ensayos treponmicos son usados primariamente para verificar la reactividad en las pruebas notreponmicas, sensibles pero menos especficas. Estos ensayos pueden ser usados para confirmar una impresin clnica de sfilis en pacientes con resultados no reactivos en ensayos no-treponmicos, tal como ocurre en la sfilis tarda. Los ensayos treponmicos standardizados de uso actual consisten en tcnicas que utilizan anticuerpos anticuerpos indirectos, tcnicas de hemoaglutinacin y aglutinacin de partculas.
4.1.
ENSAYO DE LA MICROHEMAGLUTINACION PARA LOS ANTICUERPOS DE T. Pallidum (MHA-TP)
Preparar los reactivos de acuerdo a las indicaciones del fabricante del equipo. Preparacin del suero: Aadir 20 l de suero no calentado de prueba y control a 0,38 ml de diluente sorbente en tubo (dilucin de 1:20). Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Valoracin cualitativa: 1) Colocar 25 l de cada suero de prueba absorbido en dos celdillas contiguas de la placa de microhemoglutinacin (96 hoyos fondo en U). 2) Con una pipeta automtica aadir 75 l de la dilucin de trabajo de clulas sensibilizadas (antgeno) a cada celdilla de las hileras A, C, E y G (reaccin de suero absorbido). 3) Aadir 75 l de la dilucin de trabajo de clulas no sensibilizadas a cada una de las celdillas de las hileras B, D, F y H (suero control absorbido). 4) La dilucin srica final en cada celdilla de prueba y control es de 1:80. 5) Preparacin de sueros control Reactivos y No Reactivos: a) Preparar diluciones al doble del suero control Reactivo absorbido en diluente sorbente que exceda del ttulo terminal (dilucin srica final) establecido para este suero, por ejemplo, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, etc. Medir 25 l del suero control Reactivo absorbido en otra celdilla para los sueros-control con eritrocitos no sensibilizados. b) Medir 25 l de suero control No reactivo absorbido en cada una de dos celdillas contiguas (suero de prueba y control). Aadir 75 l de clulas no sensibilizadas a cada celdilla para los sueros control con eritrocitos no sensibilizados Reactivos y No reactivos. Aadir 75 l de las clulas sensibilizadas a todas las dems celdillas que contengan diluciones de sueros control Reactivas y la dilucin de suero control No Reactiva.
c)
d)
6) Preparacin de los reactivos control: a) Aadir 75 l de eritrocitos sensibilizados a 25 l de diluente sorbente en una celdilla. b) Aadir 75 l de eritrocitos no sensibilizados a 25 l de diluente en otra celdilla. 7) Agitar suavemente la bandeja y cubrir con una bandeja vaca.
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8) Incubar la bandeja a temperatura ambiente durante 4 horas, por lo menos. El perodo de incubacin puede extenderse toda la noche. 9) Hacer la lectura de las caractersticas de sedimentacin de los glbulos rojos.
Criterio de Informe: REACTIVO: Capa celular lisa que cubre todo el fondo de la celdilla o un rea menor de la celdilla. NO REACTIVO: Fondo compacto bien definido en el centro de la celdilla.
4.2 MTODO AGLUTINACIN PASIVA DE PARTCULAS PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS CONTRA T. Pallidum (TP-PA)
Fundamento El mtodo utiliza como soporte partculas de gelatina sensibilizadas con Treponema pallidum patgeno (cepa Nichols). El principio de la reaccin se basa en que las partculas sensibilizadas son aglutinadas por la presencia de anticuerpos contra TP en suero/plasma humano.
Tcnica Preparar los reactivos de acuerdo a las indicaciones del fabricante del equipo. 1) En una microplaca de fondo en U colocar 100 l de diluyente de muestra en los pocillos 1A, 1B, 1C, 1D, y 1E. 2) Colocar 25 l de diluyente de muestra en los pocillos 2 a 11 de la hilera A y en los pocillos 2 a 4 de las hileras B a E. 3) Agregar 25 l del control positivo al pocillo N1A (dilucin 1:5 ). 4) Con la misma pipeta mezclar bien y transferir 25 l al pocillo 2A . Mezclar bien y repetir el procedimiento hasta el pocillo 9A descartando 25l para obtener diluciones seriadas al doble. 5) Colocar 25l del suero N1 al pocillo 1B, mezclar bien y transferir 25l al pocillo 2B. Mezclar y repertir el procedimiento hasta el pocillo 4B descartando 25l 6) Realizar la misma operacin con los sueros: N 2 en la hilera C N 3 en la hilera D N 4 en la hilera E 7) Colocar 25l de partculas no sensibilizadas (PNS) en los pocillos: 3, 3B, 3C, 3D, 3E y 11A 8) Colocar 25l de partculas sensibilizadas (PS) en los pocillos 4A hasta 10A y en los pocillos 4B, 4C, 4D y 4E .
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9) Agitar suavemente la placa. Luego cubrirla y dejarla reposar a temperatura ambiente (entre 1530 C) por 2 hs horas antes de la lectura. La incubacin puede extenderse toda la noche sin diferencias perceptibles en los patrones. 10) Controles: a) Confirmar que cada muestra y el control reaccionen negativamente (en la dilucin final 1:40) con las partculas no sensibilizadas, pocillos: 3A, 3B, 3C, 3D, y 3E. b) Confirmar que el diluyente de muestra reaccione negativamente con las partculas sensibilizadas, pocillo 9A y con las partculas no sensibilizadas, pocillo 10A [control de reactivos (C )]. c) Confirmar que, el ttulo del control positivo sea de 1:320 1 dilucin.
Esquema de la microplaca: diluciones finales 1 Control Positivo Suero 1 Suero 2 Suero 3 Suero 4 A B C D E 2 3 1:40 PNS 1:40 PNS 4 1:80 PS 1:80 PS 5 1:160 PS 6 1:320 PS 7 8 9 1:2560 PS 10 C PS 11 C PNS
1:640 1:1280 PS PS
Interpretacin de los resultados: Colocar suavemente la microplaca sobre un lector de placa, comparar los patrones de aglutinacin con los de los reactivos control e interpretar segn el siguiente criterio:
Patrn de aglutinacin Partculas concentradas en forma de botn en el centro del hoyo con un suave crculo marginal externo. Partculas concentradas en forma de anillo compacto con un contorno externo redondeado y liso Anillo grande definido con un margen externo desparejo y aglutinacin perifrica. Partculas aglutinadas extendidas cubriendo el fondo del hoyo uniformemente.
Lectura
Interpretacin
(-)
No reactivo
()
No concluyente
(+) (++)
Reactivo Reactivo
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3.4 REACCIN DE ABSORCIN DE ANTICUERPOS TREPONMICOS FLUORESCENTES (FTA-Abs) CON SUERO Y LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)
Fundamento del ensayo: Es una tcnica de inmunofluorescencia indirecta utilizada como ensayo confirmatorio para sfilis. El suero del paciente, el cual es diludo1:5 en sorbente (un extracto de cultivo de Treponema phagedenis, treponema Reiter), es colocado sobre un crculo de una placa que contiene fijado T. pallidum subespecie pallidum. Si el suero del paciente contiene anticuerpos anti T. pallidum - IgG e IgM- estos se unirn a los treponemas. A continuacin se agrega un antigamma humana marcada con isocianato de fluorescena que se unirn a estos anticuerpos y como resultado se observar, con microscopa de fluorescencia , espiroquetas con morfologa tpica fluorescente de color verde limn. Materiales necesarios: Pipetas de 1ml y 5ml Propipetas Cubre objetos Tubos de ensayo Microtubos de ensayo de 1,5 ml Tips amarillos Cmara hmeda Cmara para lavar portaobjetos (Jarra de Coplin) Planchuela de telgopor para colocar los tubos de ensayos en el bao termostatizado Equipos: Incubador 35-37C Bao termostatizado de agua a 56C Microscopio de fluorescencia Micropipetas de 5-40ul y 50-200ul Vortex phmetro Cronmetro Reactivos: 1) Antgeno de Treponema pallidum Placa de vidrio con crculos de 6mm de dametro conteniendo el antgeno fijado de Treponema pallidum (cepa Nichols) extrada de tejido testicular de conejo. 2) Sorbente para la reaccin de FTA-Abs. Sorbente obtenido a partir de cultivo de treponema Reiter. Se puede comprar en estado liofilizado. 3) Globulina antihumana marcada con fluorescena (conjugado) Determinar el ttulo de trabajo de cada nuevo lote de acuerdo a lo detallado bajo el ttulo de: Titulacin de Globulina antihumana marcada con fluorescena (conjugado). 4) Sueros controles: a) Control reactivo (4+): Mezcla de sueros humanos obtenidos de donadores sifilticos que presenta fuerte fluorescencia (4+) al diluirse 1:5 en PBS, y una fluorescencia solo ligeramente disminuida cuando es diluido 1:5 en sorbente. b) Control mnimo reactivo (1+): Una dilucin de suero reactivo que presente el grado mnimo de fluorescencia notificado como Reactivo a fin de usarla como estndar para la lectura. El suero control Reactivo (4+) puede usarse para este control cuando se diluye en PBS.
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c) Control de suero inespecfico: Una mezcla de sueros no sifiltico que muestre una fluorescencia inespecfica mayor o igual a 2+ cuando es diluido 1:5 en PBS y que no muestre fluorescencia inespecfica cuando es diluido 1:5 en sorbente. 5) Solucin salina amortiguada de fosfato, pH 7,2 0,1 (PBS) NaCL Na2HPO4 KH2PO4 Agua destilada 7.65 g 0.724 g 0.21 g 1000 ml
Determinar el pH y ajustarlo a pH 7,2 0,1 con NaOH 1N 6) PBS con 2% de Tween 80: Precalentar a 56C el Tween 80 y el PBS a utilizar. Agregarle a 49ml de PBS, 1 ml de Tween 80 midindolo desde la parte inferior de la pipeta y enjuagar la pipeta para lograr una buena disolucin. Ajustar a pH 7,2 con NaOH 0,1 N. Descartar la solucin cuando aparezcan precipitados o cambia el pH. 7) Lquido de montar: Agregarle a una parte de PBS, pH 7,2, nueve partes de glicerina ( grado reactivo) 8) Agua destilada, cantidad necesaria
Procedimiento: 1) Desactivar en microtubos de ensayo como mnimo 30l de los sueros incgnitas y los sueros controles -reactivo (4+), mnimo reactivo (1+), control inespecfico- en el bao termostatizado a 56C durante 30 minutos. Si los sueros fueron previamente desactivado el tiempo requerido ser de 10 minutos. Dejar la placa del antgeno que tome temperatura ambienta antes de sacarla de su envoltorio. 2) Control de calidad diario: Preparar los siguientes controles para cada corrida ensayada (ver tabla 4) a) Control reactivo (4+): 1) Sin absorber: En un microtubo de ensayo mezclar bien 10 l de control reactivo con 40 l de PBS. 2) Absorbido: En un microtubo de ensayo mezclar bien 10 l de control reactivo con 40 l de sorbente. b) Control mnimo reactivo (1+): Este es una dilucin en PBS de un suero control reactivo el cual da un grado de fluorescencia (1+) considerado reactivo. c) Control de suero inespecfico: Una mezcla de sueros no sifiltico que muestre una fluorescencia inespecfica 2+ sin absorber y que esencialmente no muestre fluorescencia (N ) cuando es absorbido. 1) Sin absorber: En un microtubo de ensayo mezclar bien 10 l de control de suero inespecfico con 40 l de PBS. 2) Absorbido: En un microtubo de ensayo mezclar bien 10 l de control de suero inespecfico con 40 l de sorbente. d) Control de fluorescencia no especfica por el conjugado: 1) Cubrir un crculo de antgeno con 10l de PBS en lugar del suero
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2) Cubrir un crculo de antgeno con 10l de sorbente en lugar del suero
Tabla 4: Patrn de controles para FTA-Abs

Controles Reactivo Mnimo reactivo Suero no especfico Fluorescencia no especfica por el conjugado
N: No reactivo R: Reactivo
Dilucin a. 1:5 dilucin en PBS b. 1:5 dilucin en sorbente dilucin en PBS del control reactivo a. 1:5 dilucin en PBS b. 1:5 dilucin en sorbente a. Antgeno, PBS, conjugado b. Antgeno, sorbente, conjugado
Lectura R 4+ R (4+ a 3+) R1+ R (2+ a 4+) Na N N
3) Para cada suero a ensayar, agregar 10 l de suero en un microtubo de ensayo. 4) Pipetear 40 l de sorbente y mezclarlo con el suero ochos veces, aspirando y expulsando con la micropipeta. 5) Colocar el portaobjeto que contiene los crculos del antgeno sobre la base de la cmara hmeda. 6) Se cubren los crculos del antgeno con 10 l de: CrculoN1: CrculoN2: CrculoN3: CrculoN4: CrculoN5: CrculoN6: CrculoN7: CrculoN8: CrculoN9: CrculoN10: Control Reactivo 4+, dilucin en PBS Control Reactivo 4+, dilucin en sorbente Control mnimo reactivo 1+ Control suero no especfico, dilucin en PBS Control suero no especfico, dilucin en sorbente Control de fluorescencia no especfica por el conjugado, PBS Control de fluorescencia no especfica por el conjugado, sorbente Suero a ensayar, dilucin 1:5 en sorbente Suero a ensayar, dilucin 1:5 en sorbente Suero a ensayar, dilucin 1:5 en sorbente
7) Se coloca la tapa de la cmara hmeda y se incuba a 35-37C durante 30 minutos 8) Procedimiento de lavados: a) Lavar hacindole correr PBS durante 5 segundos, manteniendo la placa del antgeno inclinada. b) Sumergirla dentro de PBS en la jarra de Coplin durante 5 minutos. c) Agitar la placa levantndola y sumergindola al menos 30 veces d) Cambiando el PBS repetir los pasos b y c. e) Lavar la placa hacindole correr agua destilada y secarla cuidadosamente con papel secante. Dejarla sobre la plataforma de la cmara hmeda 9) Diluir el conjugado a su ttulo de trabajo con PBS conteniendo 2% de Tween 80 y colocar 10 l de esta dilucin en cada crculo 10) Repetir los pasos 7 y 8. 11) Inmediatamente, colocar una pequea gota de lquido de montar en cada crculo y colocarles un cubre objetos. 12) Colocar la placa en una caja oscura y leerla dentro de las 4 horas.
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NOTA: Si la placa no ser leda dentro de las 4 Hs desde la preparacin, se la debe proteger de la luz y se guarda entre 2 y 8C. 13) Leer con ocular de 10X y objetivos de 40X y 60X cada crculo con microscopio de fluorescencia.
Lectura e informe de resultados 1) Usando el control mnimo reactivo (1+) de fluorescencia como el estndar de lectura, registrar la intensidad de fluorescencia de los treponemas como muestra la tabla 5. 2) Informar los resultados del ensayo de FTA-Abs como describe en la tabla 6. Si los controles no muestran los resultados, de acuerdo a la tabla 4, se debe repetir el ensayo. No informar los resultados de los sueros de los pacientes cuando los resultados obtenidos de los controles son insatisfactorios.
Tabla 5: Registro de Intensidad de Fluorescencia Lectura 2+ hasta 4+ 1+ * + a < 1+ Atpica
Intensidad de fluorescencia Moderada a intensa Equivalente al control reactivo mnimo (1+) Dbil pero definida, menor que el control reactivo mnimo (1+) Ninguna o vagamente visible Variado: los treponemas aparecen como apolillados o como perlas de un collar sobre su longitud
* Repetir las muestras de pacientes que inicialmente den una intensidad de fluorescencia 1+.
Fluorescencia atpica han sido descrita en pacientes con lupus u otra enfermedad autoinmune.
Tabla 6: Sistema de Informe para FTA-Abs Lectura del ensayo inicial: 4+ 3+ 2+ 1+ Lectura de la repeticin del ensayo Informe Reactiva Reactiva Reactiva Reactiva Reactiva mnimo* No reactivo No reactivo No reactivo Fluorescencia atpica observada
>1+ 1+ <1+
<1+ N apolillada/perla de collar
*Sin historia o evidencia clnica de infeccin por treponema, este resultado del ensayo sera considerado equvoco. Un
segundo ensayo se realizar con una nueva muestra obtenida entre una y dos semanas mas tarde de la primera.
Interpretacin de los resultados: El ensayo de FTA-Abs no debe utilizarse como un procedimiento de tamizaje. Su mayor valor es distinguir un verdadero positivo de una prueba no treponmica (VDRL, USR, RPR, TRUST), de un resultado falso positivo. Tambin permite establecer el diagnstico de sfilis latente o tarda. Una prueba de FTA-Abs reactiva: Confirma la reactividad de una prueba no treponmica utilizada como primera prueba para sfilis.
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Sugiere infeccin actual o pasada con treponemas patognicos. Tambin puede apoyar el diagnstico de sfilis tarda o latente tarda, en aquella pequea proporcin de casos donde las pruebas no treponmicas ya son negativas, pero se sospecha la infeccin por la presentacin clnica o por una historia consecuente con sfilis. Un resultado no reactivo de FTA-Abs sugiere que un resultado reactivo de un ensayo no treponmico es una falsa reaccin positiva.
Consideraciones para el procedimiento del ensayo de FTA-Abs en LCR. Mientras que el ensayo de VDRL-LCR es la nica prueba recomendada para detectar neurosfilis, la FTA-Abs LCR es altamente sensible y especfica para detectar anticuerpos treponmicos. Un resultado no reactivo de una prueba de FTA-Abs LCR puede ser usado para descartar neurosfilis. Sin embargo, un resultado positivo de esta prueba es incierto, ya que puede indicar un remanente de anticuerpos provenientes de una infeccin de sfilis pasada y tratada adecuadamente o provocada por una mnima cantidad de suero reactivo que contamina el LCR.
Procedimiento para FTA-ABS LCR Realizar este ensayo como est descrito bajo Procedimiento para FTA-Abs con la siguiente excepcin: No calentar el LCR a 56C antes del ensayo. Los controles son los mismos que se utilizan para el ensayo con sueros.
Lectura e Informe de los resultados del ensayo FTA-ABS LCR Los resultados son ledos como estn descritos para el ensayo de FTA-Abs en las tablas 5 y 6. Adems, la siguiente aclaracin deber acompaar al informe: El significado de una prueba reactiva de FTA-Abs en LCR es incierto. Las personas que fueron tratadas durante el perodo secundario o latente de sfilis y que no presentan signos de neurosfilis, pueden tener reactivo el ensayo FTA-Abs LCR. Un resultado no reactivo en el ensayo de FTA-Abs LCR, sugiere la ausencia de neurosfilis.
Titulacin de Globulina antihumana marcada con fluorescena (conjugado) La mayora de los fabricantes indican en la etiqueta el ttulo de trabajo del conjugado que fue determinado en condiciones de prueba y con el equipo de sus laboratorios. En vista de las condiciones y el equipo, varan de un laboratorio a otro, es necesario titular y comprobar un lote nuevo de conjugado con el microscopio provisto de iluminacin fluorescente. 1) Preparar diluciones al doble del nuevo conjugado en PBS pH 7,2 conteniendo 2% de Tween 80 de manera tal que las diluciones incluyan el ttulo sugerido por el fabricante. Ejemplos: i) 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 ii) 1:12,5, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 2) Ensayar cada dilucin de conjugado con un control reactivo 4+ diluido 1:5 en PBS, y con un control mnimo reactivo 1+ siguiendo las indicaciones detalladas arriba. 3) Incluir un control de fluorescencia no especfica con cada dilucin de conjugado. 4) Simultaneamente preparar una dilucin de trabajo del conjugado de referencia, con el cual se estaba teniendo resultados satisfactorios, para utilizarlo como control de los reactivos y las
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condiciones del ensayo. Este conjugado se prueba con el control reactivo 4+ y 1+ y con los controles de fluorescencia inespecfica. 5) Leer los crculos de la placa del antgeno en el siguiente orden: a) Examinar los tres controles (4+, 1+ e inespecficos) realizado con el conjugado de referencia para asegurar que los reactivos y las condiciones del ensayo sean satisfactorias. b) Examinar los crculos de la placa con el nuevo conjugado; comenzar con la menor dilucin de conjugado. Registrar la lectura como 4+, 3+, 2+ 1+. c) El punto terminal de la titulacin es la mxima dilucin que permite obtener una lectura de 4+ con el suero control reactivo 4+ y una lectura menor a 1+ con el suero control 1+. El ttulo de trabajo del nuevo conjugado es una dilucin al doble por debajo del punto terminal y deber ser el punto final del suero control 1+. En el ejemplo, la dilucin seleccionada para el ttulo de trabajo es 1:200 (ver tabla 7: Titulacin del conjugado) d) El nuevo conjugado no debe tomar coloracin inespecfica a tres diluciones al doble por debajo del ttulo de trabajo del conjugado.
Tabla 7: Titulacin del conjugado Control de fluorescencia no especfica (PBS) Dilucin Conjugado de referencia (1:400) Diluciones nuevo conjugado 1:12,5 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 Control suero reactivo (4+) (1:5 en PBS) 4+ Control suero reactivo (1+) 1+
<1+ -
4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+
3+ 3+ 2+ 2+ 1+* <1+
*La dilucin seleccionada para el ttulo de trabajo es 1:200, una dilucin al doble por debajo del punto terminal (1:400), 1+ con el suero control mnimo 1+, y ninguna fluorescencia inespecfica a tres diluciones al doble (1:25) por debajo del ttulo de trabajo.
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ANEXO 1: PRINCIPIOS GENERALES DE SEGURIDAD

Este captulo es una versin abreviada de las recomendaciones de bioseguridad del Centro para el Control de Enfermedades y Prevencin (Larsen S; Pope V; Jonson R; Kennedy E. 1998. A Manual of test for SYPHILIS)
Manual de Bioseguridad
Debe estar disponible un manual de bioseguridad, con instrucciones fciles de entender e incluir la siguiente informacin: Telfonos de emergencia Procedimientos de primeros auxilios Manejo de inflamables y txicos custicos Manejo y almacenamiento de gases comprimidos Uso de decontaminantes y desinfectantes e informacin de bioseguridad.
Precauciones generales:
Debido a que el exmen mdico o la historia clnica no permiten identificar de buena fuente si los pacientes estn infectados con el virus del VIH u otros patgenos que afectan a la sangre, todo paciente debe ser considerado infeccioso. Se deben seguir las precauciones universales cuando un operador se expone a la sangre y otros fluidos corporales (lquido amnitico, peritoneal, pericrdico, pleural, cefalorraqudeo, sinovial, semen y secrecin vaginal) u otro fluido visiblemente contaminado con sangre.
Inmunizacin
Todo trabajador involucrado en tareas que puede estar expuesto a sangre u otro fluido debe ser vacunado con la vacuna de la hepatitis B.
reas del Laboratorio

Limitar o restringir el acceso al laboratorio. En las entradas colocar el signo de peligro biolgico. Disear el laboratorio de manera que se pueda limpiar fcilmente. Las mesadas deben ser impermeables a los derrames y resistentes a los solventes orgnicos, cidos, lcalis y al calor moderado. Cada laboratorio debe tener una pileta para lavarse las manos y disponibilidad de un autoclave para decontaminar el material infeccioso. No se debe comer, beber, fumar, preparar alimentos, aplicar cosmticos o lentes de contacto en el rea de trabajo. Almacenar los alimentos en heladeras o gabinetes preparados para este propsito localizados fuera del rea de trabajo. Decontaminar las superficies con un apropiado germicida qumico (dilucin 1:10 de lavandina de 55 g/l de cloro libre) cuando se produce una salpicadura con sangre u otro fluido corporal y de manera rutinaria cuando se completa la tarea.
Manos
La frecuencia y el cuidadoso lavado de las manos es una de las mejores medidas de prevencin enfermedades en el laboratorio. Deben lavarse las manos frecuentemente y con un efectivo detergente (jabn bactericida). Si se produjo una contaminacin con fluidos inmediatamente lavarse las manos y otras superficies. Siempre lavarse las manos luego de sacarse los guantes y dejar el laboratorio, antes de comer, beber, fumar o usar el bao. No tocar elementos tales como el telfono, picaportes, equipamiento de laboratorio y teclados de computadoras con las manos contaminadas.
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Guantes (ltex)*
Usar guantes protectores todo el tiempo cuando se trabaja con sangre, muestras de fluidos corporales y tejidos; al extraer o manipular membranas de las mucosas de los pacientes, piel lastimada, lesiones o material de lesiones. Cuando los guantes estn visiblemente contaminados, quitrselos cuidadosamente y descartarlos; inmediatamente lavarse las manos y colocarse guantes nuevos. Los guantes contaminados pueden ser una fuente de infeccin. Mientras se usan evitar tocarse la cara. Quitarse los guantes y lavarse las manos antes de tocar elementos como el telfono o teclados de computadora. No se deben lavar los guantes o desinfectarlos para volverlos a usar. *El personal con dermatitis u otras lesiones sobre las manos, brazos, cuello, cara y aquellas personas que potencialmente puedan tocar material infeccioso, debern cubrir las lesiones con un vendaje o con una vestimenta impermeable al agua. El personal con alergia al ltex deber usar guantes recomendados por su dermatlogo. Bajo ciertas circunstancias el personal puede estar temporalmente asignado a un rea sin riesgo.
Vestimenta de laboratorio
Usar guardapolvo o uniforme de mangas largas cuando se trabaja con muestras. Los camisolines de manga larga y abertura trasera protegen mejor que los de abertura frontal y son preferibles en los laboratorios de microbiologa y cuando se trabaja en una cabina de seguridad biolgica (CSB). Los camisolines se pueden utilizar encima de los guardapolvos cuando se necesita mayor proteccin por el riesgo de derrame de sustancias qumicas o material biolgico como sangre. Los servicios de lavandera deben encontrarse en las instalaciones o cerca de ellas. Antes de abandonar el laboratorio tendrn que quitarse las prendas protectoras y lavarse las manos.
Protectores faciales
Usar barbijos y gafas o viseras que protegen todo el rostro cuando hay probabilidad que se generen salpicaduras y aerosoles. Por ejemplo cuando se destapa un tubo colector de sangre por vaco fuera de la CSB, usar protectores faciales. Cubrir la tapa con papel absorbente y suavemente remover la tapa del tubo. Luego descartar el papel en el recipiente de residuos biolgicos.
Cabinas de seguridad biolgica

No es necesario utilizar una cabina de seguridad biolgica para los procedimientos de rutina tales como estudios histolgicos y patolgicos, o de rotacin de las muestras en las pruebas no treponmicas Sin embargo se deben utilizar CSB (Clase I o II) cuando exista la potencial formacin de salpicaduras y aerosoles o cuando concentraciones altas de agentes infecciosos estn presentes. Esto incluye actividades tales como, sonicado, vortexeado y otras agitaciones vigorosas. Limpiar y desinfectar la cabina luego de cada uso.
Centrfugas
Los aerosoles producidos durante la centrifugacin pueden contribuir a la extensin de algunas enfermedades infecciosas Las centrfugas se utilizaran de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los tubos y los recipientes de muestras deben estar bien cerrados (con tapa a rosca si es posible) para la centrifugacin. Operar la centrfuga con la tapa cerrada y no abrirla hasta que el rotor no se haya detenido. Si es posible localizarla alejada de otras reas del laboratorio. Posicionar el extractor de aire de la centrfuga en direccin contraria a la del personal del laboratorio. Limpiar la centrfuga diariamente y cuando una contaminacin se produjo, con una solucin germicida de 1:10 de lavandina de 55g/l de cloro libre. El mayor peligro es cuando se rompen tubos dentro de la centrfuga. Retirar los tubos que no estn rotos y desinfectarlos externamente. Empapar los cestillos con un desinfectante y luego retirarlos y sumergirlos en la solucin desinfectante. Desinfectar el interior de la centrfuga.
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Otros equipamientos de laboratorio

Antes de enviar a reparar el equipamiento, tales como freezers, centrfugas, planos mviles, desinfectarlos con germicida qumico. Algunos instrumentos debern ser desinfectados con un detergente desinfectante en vez de un desinfectante qumico o autoclave.
Agujas e instrumental corto punzante

Se deben tomar precauciones para prevenir injurias causadas por agujas, escalpelos y otro instrumental corto punzante. Para prevenir inoculacin accidental con agujas no se deben volver a cubrirse, ni sacarlas con la mano de la jeringa, ni doblarlas o romperlas. Una vez que haya sido utilizada, descartarla en un recipiente resistente al material punzante. El descartador debe estar ubicado tan cerca como haga falta. Informar inmediatamente al supervisor cuando ocurra un pinchazo con aguja u otro tipo de injuria.
Material de Vidrio
Descontaminar preferentemente en un autoclave el material de vidrio contaminado o sospechoso de estarlo, antes de lavarlo, descartarlo o reciclarlo. El material que se junta para autoclavar se debe depositar sumergido en un desinfectante. El material de vidrio roto o resquebrajado se debe descartar. No manipular material de vidrio roto con la mano desnuda. Colocar el material roto en un descartador resistente y si estaba contaminado, autoclavarlo antes de descartarlo.
Pipetas
No se debe pipetear con la boca. Utilizar propipetas para pipetear todos los reactivos, muestras y otros lquidos de laboratorio. Despus de utilizarlas, cuidadosamente colocarlas en un pipetero horizontal conteniendo solucin desinfectante. Los aerosoles pueden producirse cuando se colocan las pipetas en el pipetero vertical.
Esterilizacin, descontaminacin y desinfeccin

Se procede de acuerdo a los procedimientos estandarizados de esterilizacin y desinfeccin utilizados en hospitales y en los laboratorios de microbiologa.
Descontaminacin de derrames
Recomendaciones para descontaminar derrames y salpicaduras de sangre, fluidos corporales u otro material infeccioso. 1. Usar guantes y delantal. Son recomendados los guantes resistentes a los instrumentos corto punzantes, como los utilizados para lavar la vajilla. Si el derrame contiene vidrios rotos, estos debern ser removidos sin tocarlos con la mano. Una caja rgida de cartn ser utilizada para colocarlos, y luego descartarlos en un contenedor apropiado de residuos biolgico. 2. Absorcin de derrames* Ya que la mayora de los desinfectantes son menos activos o ineficaces cuando existe alta concentracin de protenas (como en sangre y suero), la mayor cantidad del lquido derramado deber ser absorbido con toallas de papel antes de la desinfeccin.
*Con grandes derrames de cultivos o de agentes infecciosos concentrados. El rea deber ser cubierta con abundante solucin lquida germicida antes de la desinfeccin. El objetivo es diluir el material derramado, lisar los glbulos rojos y remover las protenas del rea contaminada.
Desinfectar el sitio del derrame usando un desinfectante con lavandina diluida al 10% (partiendo de lavandina 55 g/l de Cl libre). Mojar el sitio o empaparlo con toallas de papel embebidas en desinfectantes. El tiempo de accin del desinfectante ser el recomendado por el fabricante.
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3. Absorber la solucin desinfectante con material absorbente o alternativamente, permitir que el desinfectante se seque. 4. Enjuagar el sitio con agua. 5. Colocar todo el material descartable, utilizado para descontaminar el sitio. Limpieza en un contenedor de residuos biolgicos. Manejar el material de la misma manera como otros desechos infecciosos.
Limpieza general de paredes y pisos

Las superficies tales como las paredes y pisos debern ser limpiadas rutinariamente. Adems un programa de control de insectos y roedores deber llevarse a cabo, incluyendo una revisin de las ventanas que abren al exterior.
Desechos infecciosos
Tomar especial precaucin con los desechos provenientes del laboratorio de microbiologa, los desechos de patologa y las muestras de sangre o productos sanguneos. Aunque cualquier elemento que haya estado en contacto con sangre, exudados o secreciones puede ser potencialmente infeccioso, no son necesariamente considerados desechos infecciosos. Los desechos infecciosos, en general debern se incinerados o autoclavados antes de descartarlos. Cada laboratorio deber redactar los procedimientos a seguir segn la normativa de cada hospital con respecto al descarte de material infeccioso.
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ANEXO 2: TOMA DE MUESTRA DE SANGRE Y LQUIDO CEFALORRAQUIDEO

Extraccin de sangre
El suero es la muestra de eleccin para la mayora de las pruebas para sfilis. El plasma como muestra, no puede utilizarse en los ensayos que se requiere calentar la muestra (FTA- Abs, VDRL) y su uso no ha sido evaluado en la prueba de microhemoaglutinacin para anticuerpos de T. pallidum (MHA-TP). El plasma puede ser utilizado en la prueba RPR pero solo est limitado a los laboratorios especializados, tales como bancos de sangre, y en situaciones donde no se puede conseguir suero. El plasma debe ser utilizado solamente en pruebas cualitativas. Equipamiento 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Aguja descartable estril de calibre 18 a 21 G (Gauge) para adultos o 21 a 23 G para nios. Jeringa y tubos de plstico sin anticoagulante Torniquete Alcohol 70% y gasa Gasa seca y cinta adhesiva Guantes de ltex, guardapolvo y protectores faciales de bio-seguridad Gradilla de tubos de ensayo Descartador de agujas y de residuos biolgicos Solucin de lavandina (55 g/l Cl libre) diluda al 1:10 en agua.
Sangre venosa 1. Rotular el tubo de recoleccin para identificar la muestra. 2. El paciente deber sentarse y apoyar el antebrazo en el apoya brazos. Cerrar la mano en forma de puo para que las venas sean ms prominentes. 3. Las venas mayores superficiales del antebrazo son las ms frecuentemente utilizadas. 4. Palpar la trayectoria de la vena con el dedo ndice. 5. Limpiar el rea de venipuncin con una gasa embebida en alcohol y dejar que se seque la zona. 6. Aplicar un torniquete entre 7 y 9 centmetros del sitio de puncin, procurando que la stasis venosa sea mnima. 7. Ensamblar la aguja a la jeringa y sacarle el capuchn 8. Agarrar firmemente con el pulgar, a 3 - 5 cm por debajo de la zona de puncin para mantener tensa la piel. 9. Con el bisel hacia arriba, realizar la puncin. Sacar el torniquete tan rpido fluya la sangre. Llenar la jeringa a una velocidad del flujo sanguneo de 0,5 ml por segundo, desplazando el mbolo hacia fuera. 10. Indicar al paciente que abra la mano, colocar una gasa seca sobre el sitio de puncin, aplicar una suave presin sobre la gasa y lentamente retirar la aguja. 11. Indicarle al paciente que se sostenga la gasa con la otra mano. 12. Sacar la aguja con el descartador de aguja (no recolocar el capuchn). 13. Traspasar la sangre apoyando el pico de la jeringa sobre la pared del tubo para que escurra. La velocidad debe ser similar a la de extraccin. Debe evitarse la formacin de espuma. 14. Descartar la jeringa y colocar el tubo en la gradilla. 15. Regresar al paciente, presionar suavemente la gasa y colocar una cinta adhesiva. 16. Indicar al paciente que permanezca con el vendaje al menos 15 minutos.
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Sangre de cordn umbilical: consideraciones Cuando la madre tiene serologa reactiva, la mejor muestra para los neonatos es el suero obtenido por puncin del taln del beb. Sin embargo la sangre de cordn puede ser usada para tamizaje de base cuando no se dispone de otra muestra. La sangre de cordn se contamina fcilmente con la jalea de Wharton, lo cual causa falsos positivos en los ensayos no treponmicos, por lo tanto el laboratorio deber aceptar solamente las muestras que han sido recolectadas apropiadamente. La serologa realizada con una muestra de sangre de cordn no puede ser usada en lugar de la serologa sobre sangre venosa de la madre. Equipamiento adicional 1. Pinzas (Clamps) 2. Tubos con abertura superior a los 25 mm y tapa. Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. Usar guantes, guardapolvo y protectores faciales de seguridad. Limpiar superficialmente el cordn umbilical hacer un doble pinzado y un corte. Recolectar la sangre de manera que no corra fuera del tubo. Si es necesario, descontaminar la superficie exterior del tubo con desinfectante y cerrar el tubo. Colocar el tubo en la gradilla.
Procesamiento de la sangre
Equipamiento 1. Centrfuga con o sin refrigeracin (cuando se usa una refrigerada colocar la temperatura a 2025C.) 2. Tubos, tapas para tubos y gradilla (si se derivara la muestra, utilizar de preferencia tubos con tapa a rosca). 3. Guantes de latex, guardapolvo y gafas protectoras. 4. Pipetas y propipetas. 5. Etiquetas adhesivas (son preferibles etiquetas numeradas que puedan ser transferidas del tubo con la muestra al tubo receptor del suero). 6. Descartador de residuos biolgicos. 7. Pipetero. Suero 1. Luego de la extraccin de sangre, dejar el tubo en posicin vertical durante 20-30 minutos como mnimo a temperatura ambiente (23 a 29C) para que se forme el cogulo. 2. Cuando se haya formado, en lo posible centrifugar la muestra dentro de los 60 minutos posteriores a la extraccin a 1000-1200 g por 10 5 minutos. Si la centrfuga est equipada con portatubos con tapa de seguridad se deben utilizar. 3. Si un tubo se rompe durante la centrifugacin, retirar los tubos que no estn rotos con un papel empapado de desinfectante y desinfectarlos externamente. Empapar los portatubos con un desinfectante, retirarlos y sumergirlos en la solucin desinfectante. No intentar remover los tubos rotos del interior de los portatubos hasta que no hayan sido sumergidos al menos por 10 minutos en solucin de lavandina 1:10. Desinfectar el interior de la centrfuga. 4. Al finalizar la centrifugacin si se est trabajando en una cabina de seguridad biolgica (CSB), clase I o II, destapar el tubo. Si se esta trabajando en un lugar del laboratorio fuera de la CSB,
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5.
6. 7.
8. 9.
usar gafas protectoras y cubrir la tapa con papel absorbente y suavemente abrir el tubo. Luego descartar el papel y la tapa. Pipetear y transferir el suero libre de clulas a un tubo rotulado, cerrar el tubo. No pipetear con la boca. Si el tubo se encuentra contaminado superficialmente, limpiarlo con solucin de lavandina diluda 1:10. Descartar el tubo conteniendo el cogulo. Como medida de precaucin, las muestras de suero pueden ser calentadas 20 minutos a 56C en un bao de agua sin que esto afecte los resultados de las pruebas de sfilis. Calentar pequeos volmenes de suero reduce la infectividad del HIV a niveles menores de los detectables. La modalidad de calentar el suero no debe alterar o remplazar la adherencia a las precauciones universales. El calentamiento del suero puede descartar su uso para realizarle las pruebas de deteccin de anticuerpos HIV-1 (verificar las indicaciones del fabricante del ensayo) Mientras se calientan los sueros, rotular los tubos de transferencia. Los sueros deben estar a temperatura ambiente antes del calentamiento y de realizarles las pruebas (10-30 minutos). Conservar los sueros refrigerados (2-8), si se demorara ms de 4 horas en realizarles las pruebas. Si se realizar mas all de los 5 das, congelarlos a -20C. Evitar repetidas congeladas y descongelados de los sueros.
Plasma El procesamiento y manejo del plasma es idntico al del suero pero con las siguientes excepciones: 1. El plasma puede ser retenido en el tubo de recoleccin si la prueba se realizara inmediatamente. De otro modo, el plasma deber ser removido de los elementos celulares. Las muestras recolectadas con anticoagulante pueden ser centrifugadas a los pocos minutos de ser recolectada. 2. El plasma debe ser usado dentro de las 48 hs. 3. Guardar el plasma refrigerado (2-8C) si la demora es superior a 4 hs para hacerles las pruebas. Las muestras de plasma debern estar entre 23 y 29 C en el momento del ensayo. 4. Las muestras de plasma no deben ser calentadas.
Criterio de aceptacin de muestras de suero y plasma 1. Para que una muestra sea aceptada no deber contener partculas que interfieran en la lectura de los resultados 2. Las muestras excesivamente hemolizadas, contaminadas con bacterias, quilosas o turbias, son inadecuadas para los ensayos. Una muestra est demasiado contaminada cuando al colocar un papel impreso por detrs del tubo, no se puede leer a travs de l. No todas las muestras inadecuadas debern ser descartadas o no analizadas. Cuando una muestra insatisfactoria es recibida, comunicrselo al mdico solicitante y discutir si es apropiado realizarle las pruebas. Si se decide realizarlas por orden mdica, entonces deber ser informada la condicin de la misma y las indicaciones sobre las limitaciones en la interpretacin de los resultados.
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Recoleccin de LCR
La puncin lumbar ser realizada nicamente por personal mdico calificado. Ciertos riesgos son asociados con la puncin lumbar, incluyendo con poca frecuencia, complicaciones serias como infeccin y dolor persistente; ms comnmente dolor de cabeza transitorio y parestesia. La puncin lumbar debe ser contraindicada en pacientes con presin intracraneal incrementada o dficit en la coagulacin debido al riesgo incrementado de hernia cerebral o sangrado local, respectivamente. La prueba Venereal Disease Research Laboratory -(VDRL) LCR es el nico ensayo serolgico estandarizado para LCR.
Equipamiento 1. Agujas (el uso de 20 G o menor puede reducir la frecuencia de dolor de cabeza) 2. Estilete 3. Tres tubos y gradilla 4. Tintura de yodo al 2% 5. Gasa y cinta adhesiva 6. Guantes de ltex , guardapolvo y protectores faciales de seguridad 7. Descartadores de aguja y de residuos biolgicos Procedimiento 1. Mantener el paciente en forma de ovillo recostado de un lado, sobre una superficie firme con la espalda en el borde de la mesa. La espalda deber estar en plano vertical con respecto a la superficie de la mesa. 2. Desinfectar el sitio con tintura de yodo al 2% 3. Insertar la aguja con el estilete en L3-L4 mas abajo para los adultos. En nios pequeos el cono medular se extiende mas abajo que en los adultos; insertar la aguja con estilete en L4-L5 o mas abajo. 4. Una vez alcanzado el espacio subaracnoide, remover el estilete. 5. Recolectar 1-2ml de fludo en cada uno de de los tres tubos 6. Para reducir el riesgo de dolor de cabeza, el paciente deber permanecer en posicin decbito ventral varias horas despus de la puncin lumbar. Procesamiento del LCR 1. Realizar la determinacin de protenas de acuerdo al procedimiento estndar. 2. Recuento celular: deber ser hecho dentro de las 2hs de la puncin lumbar. 3. Centrifugar a 1000-1200 x g por 10 5 minutos y transferir a un tubo limpio y rotulado. 4. Si se demorara ms de 4 horas en realizar las pruebas, conservar los LCRs refrigerados (2-8). Si se realizaran mas all de los 5 das, congelarlos a -20C. Evitar congelados y descongelados repetidos de los LCRs. 5. Las muestras debern estar a temperatura ambiente, entre 23 a 29C en el momento de la prueba. 6. No calentar el LCR antes del ensayo Criterio de aceptacin de muestras de LCR 1. Para que una muestra de LCR sea aceptada no deber contener partculas que interfieran en la lectura de los resultados. 2. Para la prueba de VDRL-LCR, son adecuadas las muestras de LCR con trazas de sangre ( > 0,8 L de sangre /1ml de LCR), en cambio son inadecuadas para los otros ensayos. Son inadecuadas para la VDRL-LCR las muestras ligeramente rojas (rosa) (> 3 L de sangre /1ml de LCR) 3. No todas las muestras inadecuadas debern ser descartadas o no analizadas. Cuando una muestra insatisfactoria es recibida, comunicrselo al mdico solicitante y discutir si es apropiado realizarle las pruebas. Si se decide realizarlas por orden mdica, entonces deber informarse la condicin de la misma y las indicaciones sobre las limitaciones en la interpretacin de los resultados.
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Tabla 5: Registro de Intensidad de Fluorescencia Lectura 2+ hasta 4+ 1+ * + a < 1+ Atpica

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