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ESA Escola Superior de Cincias da Sade

Dosagem de colesterol e triacilglicerois, e determinao de corpos cetnicos na urina.

Manaus 2013

Carolina Melo, Enfermagem Iarin Leiros, Enfermagem 131201002 Ikaro Espndola, Medicina 1312020027 Gabriel Saboia, Medicina Las Ribeiro, Medicina Nayelle Paula, Enfermagem

Relatrio

apresentado

disciplina

Bioqumica Celular e Metablica, na Escola Superior de Cincias da Sade da

Universidade do Estado do Amazonas.

Orientadora: Professora Kilmara H. G. Carvalho

Manaus 2013

1. 1.1

Introduo Lipdeos

Os lipdeos so molculas biolgicas hidrofbicas de composio qumica variada e que exercem inmeras funes no organismo. Segundo MARZZOCO e TORRES:
Os lipdeos constituem uma classe de compostos bastante variada, caracterizados por sua baixa solubilidade em gua. Exercem diversas funes biolgicas, como componentes de membranas, isolantes trmicos e reserva de energia; eles prprios ou seus derivados tm funo de vitaminas e hormnios.

(MARZZOCO; TORRES, 1999, p. 94). Os lipdeos, insolveis em meio aquoso, so transportados pelo sistema circulatrio do homem em agregados moleculares hidrossolveis denominados lipoprotenas - complexos moleculares de conformao esfrica com um ncleo de lipdeos neutros (steres do colesterol e triglicerdeos), e periferia composta por uma lmina de apolipoprotenas anfipticas, fosfolipdeos e colesterol livre. Os constituintes proteicos das lipoprotenas so denominados apoprotenas (apo). Estes contm domnios hidroflicos e hidrofbicos especficos, de modo que parte da lipoprotena est compartilhada adequadamente com o ambiente aquoso, enquanto outra parte da protena interage com o material lipdico neutro no centro da lipoprotena. As principais lipoprotenas plasmticas so: quilomicron, lipoprotenas de muito baixa densidade (VLDLs), lipoprotenas de baixa densidade (LDLs) e as lipoprotenas de alta densidade (HDLs). Elas diferem na composio lipdica e proteica, no tamanho e na densidade. A tabela a seguir apresenta as classes de lipoprotenas.

Em humanos, o sistema de transporte menos eficiente que em outros animais e, como resultado, pode ocorrer uma deposio gradual de lipdeos - especialmente de colesterol - nos tecidos. Essa deposio de lipdeos pode ser potencialmente um fator de risco, por contribuir para a formao de placas, que causam o estreitamento dos vasos (aterosclerose). Os lipdeos so classificados em funo de suas caractersticas qumicas e funcionais como triacilglicerois, colesterol, fosfolipdeos, cerdeos e glicolipdeos.

1.1.1 cidos graxos e Triacilglicerois


Os cidos graxos so cidos monocarboxlicos de cadeia carbnica longa, saturada, mono ou poli-insaturada e de natureza anfiptica. Os cidos graxos existem no organismo na forma livre (isto , no-esterificados) e tambm so encontrados como steres de acila em molculas mais complexas, tais como os triacilglicerois (PAMELA; RICHARD; DENISE, 2006, p. 189). Os lipdeos mais simples, construdos a partir de cidos graxos, so os triacilglicerois, tambm chamados triglicerdeos, gorduras ou gorduras neutra s (LEHNINGHER, 2002, p. 282). Os triacilglicerois so formados por trs molculas de cidos graxos esterificados a um glicerol, um lcool triidroxilco.

Classificam-se em triacilglicerois simples - aqueles com apenas um tipo de cido graxo nas trs posies do glicerol; triacilglicerois mistos, aqueles com dois ou mais tipos de cidos graxos ligados ao glicerol; e em saturados, mono ou poli-insaturados, conforme apresentam nenhuma, uma, e duas ou mais ligaes duplas entre os carbonos do cido graxo esterificado, respectivamente. Os triglicerdeos so molculas altamente hidrofbicas e, portanto, so armazenados em forma anidra no tecido adiposo. Formam gotculas de gordura nos adipcitos e, quando necessrio, so oxidados por lipases e seus constituintes liberados na corrente sangunea. Exercem importantes funes no organismo, atuando como fonte de molculas para obteno de energia durante o jejum prolongado; isolantes trmicos e amortecedores de impacto, fornecendo proteo adicional s vsceras das cavidades torcica e abdominoplvica.

1.1.1.a. Mtodo de dosagem de triacilglicerois em amostra de soro


Os nveis de triglicerdeos plasmticos variam com o sexo e a idade, mas, mais especificamente, com a dieta. Os triacilglicerois, quando necessrio, so oxidados a cidos graxos e glicerol. Esses compostos passam para a circulao sangunea, entram em vias catablicas para gerao de energia, ou na gliconeognese para produo de glicose. O mtodo de dosagem da concentrao de triacilglicerois baseia-se no contedo de glicerol presente na amostra de soro analisado, conforme a sequncia de reaes a seguir: Lipase lipoproteica triglicerdeos glicerol quinase glicerol + ATP
GPO

glicerol + cidos graxos glicerol-1-P + ADP H2O2 + dihidroxiacetonafosfato


POD

glicerol-1-fosfato + O2 2 H2O2 + 4-AF + clorofenol

colorao vermelha

A intensidade da cor vermelha diferente e diretamente proporcional concentrao de triacilglicerois presente na amostra.

1.1.1.b. Interferentes
Os soros com hemlise intensa ou ictricos produzem resultados errneos, portanto, no devem ser utilizados. Os triglicerdeos em soro so estveis por 3 dias sob refrigerao (210C), se acima desse perodo de tempo ou se congelados, produzem resultados incorretos quando submetidos ao exame pelo mtodo adotado. A cor da reao final estvel por 60 minutos e o sangue para anlise deve ser coletado aps jejum de 12 horas, caso esse intervalo de tempo no seja observado ou o paciente no esteja em jejum os resultados obtidos podem no condizer com a realidade. Anticoncepcionais orais estrognios-progestina, estrognios, corticoesterides, bbloqueadores, diurticos tiazdicos, colestiramina pode causar resultados falsamente elevados. Resultados falsamente reduzidos podem resultar da presena, na amostra, de cido ascrbico, asparaginase, clofibrato, fenformin e metaformin. .

1.1.1.c. Significados clnicos


Nveis elevados de triglicerdeos no soro esto associados a quatro condies patolgicas que aceleram a aterosclerose: diminuio dos nveis de aterosclerose no soro; aumento das lipoprotenas remanescentes; pequena elevao na LDL; e aumento das condies trombognicas. Alm de disso, existem evidncias de que a hipertrigliceridemia

um fator de risco independente para doenas coronarianas, pois contribui para as cardiopatias devido a efeito aterognico direto das lipoprotenas ricas em triglicerdeos.

1.1.2 Colesterol
O colesterol o esteroide caracterstico dos tecidos animais e desempenha vrias funes essenciais no organismo (PAMELA; RICHARD; DENISE, 2006). O colesterol, o composto chave dos esteris, lipdeos que apresentam um ncleo tetracclico em sua estrutura, fracamente anfiptico com um grupo cabea-polar e corpo hidrocarbnico apolar. Entre suas funes destaca-se a de precursor dos hormnios esterodicos, sais biliares e de vitamina D. Alm disso, o colesterol um importante componente das membranas biolgicas, influenciando sua fluidez. Apesar de suas funes essenciais, o colesterol muito lembrado por sua relao com arteriosclerose. O colesterol total em humanos est distribudo entre as trs maiores classes de lipoprotenas: HDL, LDL e VLDL. Quantidades menores esto presentes nas lipoprotenas de densidade intermediria (IDL) e na Lipoprotena (a), sendo que estas duas lipoprotenas contm aproximadamente 2-4 mg/dl.

1.1.2.a. Mtodo de dosagem de colesterol em soro


A determinao de colesterol em forma isolada tem utilidade diagnstica e clnica. No mtodo de dosagem utilizado, os steres de colesterol so transformados em colesterol e cidos graxos pela enzima colesterol esterase (CHE); A enzima colesterol oxidase (CHOD) catalisa a reao do colesterol e oxignio formando colesten-3-ona e perxido de hidrognio; a peroxidase (POD) catalisa a reao do peroxido de hidrognio com a 4-aminofenazona, resultando em um cromgeno vermelho.
CHE

steres do colesterol
CHOD

colesterol + cidos graxos colesten-3-ona + H2O2


POD

colesterol + O2 H2O2 + 4-AF + aceitador

colorao vermelha

A cor da reao final estvel por 30 minutos. Ler absorbncia durante esse perodo. A equao de Friedewald estima o nvel plasmtico de LDL-colesterol atravs das concentraes plasmticas de colesterol total, HDL-colesterol e VLDL (estimada a partir das concentraes de triglicerdeos). A equao de Friedewald : LDL-colesterol mg/dl = (colesterol total) (HDL-colesterol) (triglicerdeos/5). A frmula de Friedewald, [LDL] = (CT - HDL) - (TG/5), envolve vrias etapas como, as determinaes diretas do colesterol total (CT), colesterol HDL (HDL) e triglicrides (TG), consequentemente, cada quantificao contribui com uma potencial fonte de erro. Os valores de referncia do perfil lipdico para a faixa etria entre 2 e 19 anos (tabela I) e para adultos maiores de 20 anos (tabela II) so mostrados nas tabelas a seguir. TABELA I: Valores de referncia para perfil lipdico da faixa etria entre 2-19 anos Variveis lipdicas
CT LDL-C HDL-C TG Desejveis <150 <100 > ou = 45 <100

Valores em mg/dL Limtrofes 150-169 100-129 100-129

Elevados >ou=170 >ou=130 >ou=130

TABELA II: Valores de referncia do perfil lipdico para adultos maiores de 20 anos
Lipdeos CT Valores (mg/dl) < 200 200-239 240 < 100 100-129 130-159 160-189 190 > 60 < 40 <150 150-200 200-499 500 < 130 130-159 160-189 190 Categoria Desejvel Limtrofe Alto timo Desejvel Limtrofe Alto Muito alto Desejvel Baixo Desejvel Limtrofe Alto Muito alto timo Desejvel Alto Muito alto

LDL-C

HDL-C TG

Colesterol HDL

no-

Fonte: V diretriz Brasileira de dislipidemias e preveno de aterosclerose

1.1.2.b. Interferentes
Resultados falsamente elevados: adrenalina, andrognios, anticoncepcionais orais, cido ascrbico, brometos, borato de adrenalina, clorpropamina, corticoesterides, fenitona, iodetos, levodopa, sulfonamidas e viomicina. Resultados falsamente reduzidos: cido aminossaliclico, clofibrato, heparina, niacina, tetraciclinas, tiazidas e vitamina A.

1.1.2.c. Significados Clnicos


Desde h muito tempo sabe-se que o perfil lipdico, fundamentalmente o colesterol e suas fraes, guardam relao direta com a doena isqumica do corao, demonstrando-se riscos cada vez mais elevados, quanto maior a colesterolemia. Estudos recentes mostram uma melhor correlao do LDL-colesterol com o risco de aterosclerose do que o colesterol total (HOEFNER et al, 2001). Quanto mais elevada a frao lipoprotica de baixa densidade (LDL), tanto mais frequente a doena aterosclertica do corao; e, quanto mais elevada a lipoprotena de alta densidade (HDL), tanto menor o risco para essa doena (LESSA apud PIVA; FERNANDES, 2008). A hipercolesterolemia pode resultar de aterosclerose, fatores genticos, como no caso da hipercolesterolemia familiar; gravidez, ps-menopausa, sndrome nefrtica, hipotireoidismo cirrose biliar primria e diabetes melito (.

1.1.2.d. Dislipidemias
As dislipidemias, distrbios que alteram os nveis sricos dos lipdeos, so a causa fundamental de doenas coronarianas aterosclerticas. A classificao bioqumica considera os valores de CT, LDL-C, TG e HDL-C e compreende quatro tipos principais bem definidos: a) hipercolesterolemia isolada: elevao isolada do LDL-C ( 160 mg/dl); b) hipertrigliceridemia isolada: elevao isolada dos TGs ( 150 mg/dl) que reflete o aumento do

nmero e/ou do volume de partculas ricas em TG, como VLDL, IDL e quilomcrons; c) hiperlipidemia mista: valores aumentados de LDL-C ( 160 mg/dl) e TG ( 150 mg/dl); d) HDL C baixo: reduo do HDL-C (homens < 40 mg/dl e mulheres < 50 mg/dl) isolada ou em associao a aumento de LDL-C ou de TG.

1.1.3 Corpos Cetnicos


A mitocndria do fgado tem a capacidade de converter acetii-CoA proveniente da betaoxidao de cidos graxos em corpos cetnicos. Os compostos classificados como corpos cetnicos so o acetoacetato, o 3-hidroxibutirato (chamado tambm de beta-hidroxibutirato) e a acetona (um produto colateral no-metabolizvel). Embora o fgado constantemente sintetize baixos nveis de corpos cetnicos, sua produo torna-se muito mais significante durante o jejum, quando os corpos cetnicos so necessrios para produzir energia nos tecidos perifricos. A acetona no sofre metabolizao no organismo e eliminada nos pulmes e na urina. O cido beta-hidroxibutrico e acetoacetato no so utilizados como combustveis pelo fgado, mas so lanados na corrente sangunea para suprimento de outros tecidos. O fgado embora produza corpos cetnicos, no possui a enzima tioforase, sendo incapaz de usar corpos cetnicos como combustvel.

1.1.3.a. Dosagem de corpos cetnicos na Urina


A anlise rotineira da urina envolve os caracteres fsicos, qumicos e sedimentoscpicos. As tiras reagentes apresentam reas que por diversos mecanismos assumem modificaes de colorao que permitem visualmente a quantificao dos parmetros avaliados. O mtodo para anlise de corpos cetnicos na urina (sensibilidade de 5-10mg/dl) est baseado em uma reao do cido acetoactico com nitroprussiato e meio alcalino resultando em colorao que vai do rosa ao prpura. Quando h presena detectvel de corpos cetnicos na urina os valores so expressos + a ++++ ou mg/dL.

1.1.3.b. Interferentes
Para anlise de corpos cetnicos na urina, fenilcetonas ou metablitos da L-Dopa podem induzir resultados falsos positivos. A volatilidade dos corpos cetnicos outro interferente, se a urina no for bem armazenada ou se durante a realizao do teste a tira reagente embebida em urina ficar por tempo prolongado em contanto com o ar, os corpos cetnicos evaporaro da amostra em analise, originando um valor falso-negativo.

1.1.3.c. Significados Clnicos


Os diversos parmetros avaliados auxiliam no diagnstico e monitoramento de diversos estados patolgicos e fisiolgicos, tais como diabetes, ictercias de origens diversas e infeces do trato urinrio entre outras. Quando a velocidade de formao dos corpos cetnicos maior do que a velocidade de seu consumo, seus nveis comeam a aumentar no sangue (cetonemia) e, por fim, na urina (cetonria). Essas duas condies so observadas mais frequentemente em casos de diabetes melito do tipo 1 (dependente de insulina) no-controlado. Corpos cetnicos na urina tambm podem aparecer em decorrncia de vmitos, jejum prolongado, febre, hipoglicemia, alcoolismo agudo. Em pacientes diabticos de grande importncia, pois levam a um distrbio no balano acido/bsico conhecido como cetoacidose diabtica.

2. Objetivos 2.1 Objetivos Gerais


Dosar a concentrao de triglicerdeos e colesterol total em amostra de soro/plasma. Analisar presena de corpos cetnicos em amostra de urina. Conhecer os valores de referncias e correlaciona-los com patologias.

2.2 Objetivos Especficos 3. Material e Reagentes 3.1 Materiais


6 Tubos de Ensaio; Cronmetro; culos de Proteo Individual; Luvas; Espectrofotmetro; Cubetas do espectrofotmetro; Pipeta automtica de 20 L; Pipeta automtica de 1 mL; Ponteiras de Pipetas de 20 L e 1 mL Folhas de papel absorvente.

3.2 Reagentes 3.2.1 Dosagem de Colesterol em Amostra de Soro (Kit Colestat enzimtico
AA- Wiener lab.) Padro: Soluo de Colesterol 2 g/L. Reagente A: frasco com colesterol esterase, colesterol oxidase, peroxidase, e 4aminofenazona. Reagente B: soluo de tampo Good, pH 6,8, contendo fenol e colato de sdio. Reagente de Trabalho (previamente realizado): Dissolveu-se o contedo do frasco de Reagente A com uma parte do Reagente B. Depois, colocou-se dentro do frasco de Reagente B, lavando-o vrias vezes com a preparao. Misturou-se, homogeneizou-se e datou-se. 3.2.2 Dosagem de Triglicerdeos em Amostra de Soro (Kit TG Color GPO/PAP AA Wiener lab.) Padro: Soluo de glicerol 2,26 mmol/L(equivalente a 2 g/L de triolena) Reagente A: frasco contendo lipase lipoproteica, glicerol quinase, glicerol fosfato oxidase, peroxidase, adenosina trifosfato (ATP) E 4-aminofenazona. Reagente B: tampo Good contendo clorofenol, pH 7,5. Reagente de Trabalho (previamente realizado): Dissolveu-se o contedo do frasco de Reagente A com uma parte do Reagente B. Depois, colocou-se dentro do frasco de Reagente B, lavando-o vrias vezes com a preparao. Misturou-se, homogeneizou-se e datou-se.

3.2.3 Dosagem de Corpos Cetnicos na Urina


Tira Reagente da Uriclin 10- Laborclin

4. Metodologia/Procedimento

4.1 Dosagem de Colesterol em Amostra de Soro


Separou-se 3 tubos de ensaio e marcou-se como B (Branco), P (Padro) e D (Desconhecido), colocou-os no suporte de tubos de ensaio. Utilizou-se a pipeta automtica de 1 mL, com a ponteira adequada, duas vezes, para pipetar 2 mL do reagente de trabalho no tubo B, a pipeta automtica de 20 L ,com a ponteira adequada, para pipetar 20 L da soluo padro (colesterol 2 g/L) e a pipeta automtica de 1 mL, com a ponteira adequada, para pipetar, duas vezes, resultando em 2 mL do reagente de trabalho no tubo P, adicionou-se, tambm, 20 L da amostra (soro ou plasma), com auxlio da pipeta automtica de 20 L, com a ponteira adequada, e 2 mL do reagente de trabalho, com auxlio da pipeta automtica de 1 mL, com a ponteira adequada, duas vezes, no tubo D. Aguardou-se 20 min em temperatura ambiente e procedeu-se a leitura da absorbncia no espectrofotmetro a 505 nm, zerou-se o aparelho com o branco, para obter o valor exato da concentrao de colesterol no soro.

4.2 Dosagem de Triglicerdeos em Amostra de Soro


Separou-se 3 tubos de ensaio e marcou-se como B (Branco), P (Padro) e D (Desconhecido), colocou-os no suporte de tubos de ensaio. Utilizou-se a pipeta automtica de 1 mL, com a ponteira adequada, duas vezes, para pipetar 2 mL do reagente de trabalho no tubo B, a pipeta automtica de 20 L ,com a ponteira adequada, para pipetar 20 L da soluo padro (glicerol 2,26 mmol/L) e a pipeta automtica de 1 mL, com a ponteira adequada, para pipetar, duas vezes, resultando em 2 mL do reagente de trabalho no tubo P, adicionou-se, tambm, 20 L da amostra (soro ou plasma), com auxlio da pipeta automtica de 20 L, com a ponteira adequada, alm de 2 mL do reagente de trabalho, com auxlio da pipeta automtica de 1 mL, com a ponteira adequada, duas vezes, no tubo D. Aguardou-se 20 min em temperatura ambiente e procedeu-se a leitura da absorbncia no espectrofotmetro a 505 nm, zerou-se o aparelho com o branco, para obter o valor exato da concentrao de triglicerdeos no soro.

4.3 Dosagem de Corpos Cetnicos na Urina


Imergiu-se na amostra de urina homogeneizada em tubo, retirou-se em seguida. Removeu-se o excesso de amostra batendo levemente a tira contra o papel absorvente. Realizou-se a leitura do parmetro de corpos cetnicos aps 40 segundos por comparao com a escala de cores impressa no rtulo do frasco e anotou-se o resultado observado.

REFERNCIAS Arquivos Brasileiros de Cardiologia: V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e preveno de aterosclerose. Rio de Janeiro: Volume 101, N 4, suplemento 1, outubro de 2013. Bula Laborclin Uriclin 10 reas, disponvel em: www.laborclin.com.br CHAMPE, Pamela C.; HARVEY, Richard A.; FERRIER, Denise R. Bioqumica ilustrada. Terceira edio. Porto Alegre: Artmed, 2006. MARZZOCO, Anita; TORRES, Baptista Bayardo. Bioqumica bsica, segunda edio. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S.A., 1999. MOTTA, Valter T. Bioqumica clnica para o laboratrio: princpios e interpretaes. Quarta edio. Porto Alegre: Editora Mdica Missau; So Paulo: Robe editorial, EDUCS Caxias do Sul, 2003. NELSON, David L.; COX, Michael M. Princpios de Bioqumica de Lehninger. Terceira Edio. Editora Savier, 2002.

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