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ESA – Escola Superior de Ciências da Saúde Dosagem de colesterol e triacilglicerois, e determinação de

ESA Escola Superior de Ciências da Saúde

Dosagem de colesterol e triacilglicerois, e determinação de corpos cetônicos na urina.

Manaus

2013

Carolina Melo, Enfermagem Iarin Leiros, Enfermagem 131201002 Ikaro Espíndola, Medicina 1312020027 Gabriel Saboia, Medicina Laís Ribeiro, Medicina Nayelle Paula, Enfermagem

Relatório

apresentado

disciplina

à

Bioquímica Celular e Metabólica, na Escola

Superior de

Ciências

da

Saúde

da

Universidade do Estado do Amazonas.

Orientadora: Professora Kilmara H. G. Carvalho

Manaus

2013

1.

Introdução

1.1

Lipídeos

Os lipídeos são moléculas biológicas hidrofóbicas de composição química variada e que exercem inúmeras funções no organismo. Segundo MARZZOCO e TORRES:

Os lipídeos constituem uma classe de compostos bastante variada, caracterizados por sua baixa solubilidade em água. Exercem diversas funções biológicas, como componentes de membranas, isolantes térmicos e reserva de energia; eles próprios ou seus derivados têm função de vitaminas e hormônios.

(MARZZOCO; TORRES, 1999, p. 94).

Os lipídeos, insolúveis em meio aquoso, são transportados pelo sistema circulatório do homem em agregados moleculares hidrossolúveis denominados lipoproteínas - complexos moleculares de conformação esférica com um núcleo de lipídeos neutros (ésteres do colesterol e triglicerídeos), e periferia composta por uma lâmina de apolipoproteínas anfipáticas, fosfolipídeos e colesterol livre. Os constituintes proteicos das lipoproteínas são denominados apoproteínas (apo). Estes contêm domínios hidrofílicos e hidrofóbicos específicos, de modo que parte da lipoproteína está compartilhada adequadamente com o ambiente aquoso, enquanto outra parte da proteína interage com o material lipídico neutro no centro da lipoproteína. As principais lipoproteínas plasmáticas são: quilomicron, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDLs), lipoproteínas de baixa densidade (LDLs) e as lipoproteínas de alta densidade (HDLs). Elas diferem na composição lipídica e proteica, no tamanho e na densidade. A tabela a seguir apresenta as classes de lipoproteínas.

1. Introdução 1.1 Lipídeos Os lipídeos são moléculas biológicas hidrofóbicas de composição química variada e que

Em humanos, o sistema de transporte é menos eficiente que em outros animais e, como resultado, pode ocorrer uma deposição gradual de lipídeos - especialmente de colesterol - nos tecidos. Essa deposição de lipídeos pode ser potencialmente um fator de risco, por contribuir para a formação de placas, que causam o estreitamento dos vasos (aterosclerose). Os lipídeos são classificados em função de suas características químicas e funcionais como triacilglicerois, colesterol, fosfolipídeos, cerídeos e glicolipídeos.

  • 1.1.1 Ácidos graxos e Triacilglicerois

Os ácidos graxos são ácidos monocarboxílicos de cadeia carbônica longa, saturada, mono ou poli-insaturada e de natureza anfipática. Os ácidos graxos existem no organismo na forma livre (isto é, não-esterificados) e também são encontrados como ésteres de acila em moléculas mais complexas, tais como os triacilglicerois(PAMELA; RICHARD; DENISE, 2006, p. 189). Os lipídeos mais simples, construídos a partir de ácidos graxos, são os triacilglicerois, também chamados triglicerídeos, gorduras ou gorduras neutras” (LEHNINGHER, 2002, p. 282). Os triacilglicerois são formados por três moléculas de ácidos graxos esterificados a um glicerol, um álcool triidroxilíco.

Classificam-se em triacilglicerois simples - aqueles com apenas um tipo de ácido graxo nas três posições do glicerol; triacilglicerois mistos, aqueles com dois ou mais tipos de ácidos graxos ligados ao glicerol; e em saturados, mono ou poli-insaturados, conforme apresentam nenhuma, uma, e duas ou mais ligações duplas entre os carbonos do ácido graxo esterificado, respectivamente. Os triglicerídeos são moléculas altamente hidrofóbicas e, portanto, são armazenados em forma anidra no tecido adiposo. Formam gotículas de gordura nos adipócitos e, quando necessário, são oxidados por lipases e seus constituintes liberados na corrente sanguínea. Exercem importantes funções no organismo, atuando como fonte de moléculas para obtenção de energia durante o jejum prolongado; isolantes térmicos e amortecedores de impacto, fornecendo proteção adicional às vísceras das cavidades torácica e abdominopélvica.

1.1.1.a. Método de dosagem de triacilglicerois em amostra de soro

Os níveis de triglicerídeos plasmáticos variam com o sexo e a idade, mas, mais especificamente, com a dieta. Os triacilglicerois, quando necessário, são oxidados a ácidos graxos e glicerol. Esses compostos passam para a circulação sanguínea, entram em vias catabólicas para geração de energia, ou na gliconeogênese para produção de glicose. O método de dosagem da concentração de triacilglicerois baseia-se no conteúdo de glicerol presente na amostra de soro analisado, conforme a sequência de reações a seguir:

triglicerídeos

glicerol + ATP

Lipase lipoproteica

Classificam-se em triacilglicerois simples - aqueles com apenas um tipo de ácido graxo nas três posições

glicerol quinase

glicerol + ácidos graxos

Classificam-se em triacilglicerois simples - aqueles com apenas um tipo de ácido graxo nas três posições

GPO

glicerol-1-P + ADP

glicerol-1-fosfato + O2

Classificam-se em triacilglicerois simples - aqueles com apenas um tipo de ácido graxo nas três posições

POD

H2O2 + dihidroxiacetonafosfato

2 H2O2 + 4-AF + clorofenol

Classificam-se em triacilglicerois simples - aqueles com apenas um tipo de ácido graxo nas três posições

coloração vermelha

A intensidade da cor vermelha é diferente e diretamente proporcional à concentração de triacilglicerois presente na amostra.

1.1.1.b. Interferentes

Os soros com hemólise intensa ou ictéricos produzem resultados errôneos, portanto, não devem ser utilizados. Os triglicerídeos em soro são estáveis por 3 dias sob refrigeração (2- 10ºC), se acima desse período de tempo ou se congelados, produzem resultados incorretos quando submetidos ao exame pelo método adotado. A cor da reação final é estável por 60 minutos e o sangue para análise deve ser coletado após jejum de 12 horas, caso esse intervalo de tempo não seja observado ou o paciente não esteja em jejum os resultados obtidos podem não condizer com a realidade. Anticoncepcionais orais estrogênios-progestina, estrogênios, corticoesteróides, b- bloqueadores, diuréticos tiazídicos, colestiramina pode causar resultados falsamente elevados. Resultados falsamente reduzidos podem resultar da presença, na amostra, de ácido ascórbico, asparaginase, clofibrato, fenformin e metaformin. .

1.1.1.c. Significados clínicos

Níveis elevados de triglicerídeos no soro estão associados a quatro condições patológicas que aceleram a aterosclerose: diminuição dos níveis de aterosclerose no soro; aumento das lipoproteínas remanescentes; pequena elevação na LDL; e aumento das condições trombogênicas. Além de disso, existem evidências de que a hipertrigliceridemia é

um fator de risco independente para doenças coronarianas, pois contribui para as cardiopatias devido a efeito aterogênico direto das lipoproteínas ricas em triglicerídeos.

1.1.2 Colesterol

O colesterol é o esteroide característico dos tecidos animais e desempenha várias funções essenciais no organismo (PAMELA; RICHARD; DENISE, 2006). O colesterol, o composto chave dos esteróis, lipídeos que apresentam um núcleo tetracíclico em sua estrutura, é fracamente anfipático com um grupo cabeça-polar e corpo hidrocarbônico apolar. Entre suas funções destaca-se a de precursor dos hormônios esteroídicos, sais biliares e de vitamina D. Além disso, o colesterol é um importante componente das membranas biológicas, influenciando sua fluidez. Apesar de suas funções essenciais, o colesterol é muito lembrado por sua relação com arteriosclerose. O colesterol total em humanos está distribuído entre as três maiores classes de lipoproteínas: HDL, LDL e VLDL. Quantidades menores estão presentes nas lipoproteínas de densidade intermediária (IDL) e na Lipoproteína (a), sendo que estas duas lipoproteínas contêm aproximadamente 2-4 mg/dl.

1.1.2.a. Método de dosagem de colesterol em soro

A determinação de colesterol em forma isolada tem utilidade diagnóstica e clínica. No método de dosagem utilizado, os ésteres de colesterol são transformados em colesterol e ácidos graxos pela enzima colesterol esterase (CHE); A enzima colesterol oxidase (CHOD) catalisa a reação do colesterol e oxigênio formando colesten-3-ona e peróxido de hidrogênio; a peroxidase (POD) catalisa a reação do peroxido de hidrogênio com a 4-aminofenazona, resultando em um cromógeno vermelho.

ésteres do colesterol

CHE

um fator de risco independente para doenças coronarianas, pois contribui para as cardiopatias devido a efeito

colesterol + O2

CHOD

um fator de risco independente para doenças coronarianas, pois contribui para as cardiopatias devido a efeito

POD

H2O2 + 4-AF + aceitador

um fator de risco independente para doenças coronarianas, pois contribui para as cardiopatias devido a efeito

colesterol + ácidos graxos

colesten-3-ona + H2O2

coloração vermelha

A cor da reação final é estável por 30 minutos. Ler absorbância durante esse período. A equação de Friedewald estima o nível plasmático de LDL-colesterol através das concentrações plasmáticas de colesterol total, HDL-colesterol e VLDL (estimada a partir das concentrações de triglicerídeos). A equação de Friedewald é: LDL-colesterol mg/dl = (colesterol total) (HDL-colesterol) (triglicerídeos/5). A fórmula de Friedewald, [LDL] = (CT - HDL) - (TG/5), envolve várias etapas como, as determinações diretas do colesterol total (CT), colesterol HDL (HDL) e triglicérides (TG), consequentemente, cada quantificação contribui com uma potencial fonte de erro. Os valores de referência do perfil lipídico para a faixa etária entre 2 e 19 anos (tabela I) e para adultos maiores de 20 anos (tabela II) são mostrados nas tabelas a seguir.

TABELA I: Valores de referência para perfil lipídico da faixa etária entre 2-19 anos

Variáveis

 

lipídicas

 

Valores em mg/dL

 

Desejáveis

Limítrofes

Elevados

CT

<150

150-169

>ou=170

LDL-C

<100

100-129

>ou=130

HDL-C

> ou = 45

   

TG

<100

100-129

>ou=130

TABELA II: Valores de referência do perfil lipídico para adultos maiores de 20 anos

Lipídeos

Valores

Categoria

(mg/dl)

CT

< 200

Desejável

200-239

Limítrofe

≥ 240

Alto

LDL-C

< 100

Ótimo

100-129

Desejável

130-159

Limítrofe

160-189

Alto

≥ 190

Muito alto

HDL-C

> 60

Desejável

< 40

Baixo

TG

<150

Desejável

150-200

Limítrofe

200-499

Alto

≥ 500

Muito alto

Colesterol

não-

< 130

Ótimo

HDL

130-159

Desejável

160-189

Alto

≥ 190

Muito alto

Fonte: V diretriz Brasileira de dislipidemias e prevenção de aterosclerose

1.1.2.b. Interferentes

Resultados falsamente elevados: adrenalina, androgênios, anticoncepcionais orais, ácido ascórbico, brometos, borato de adrenalina, clorpropamina, corticoesteróides, fenitoína, iodetos, levodopa, sulfonamidas e viomicina. Resultados falsamente reduzidos: ácido aminossalicílico, clofibrato, heparina, niacina, tetraciclinas, tiazidas e vitamina A.

1.1.2.c. Significados Clínicos

Desde há muito tempo sabe-se que o perfil lipídico, fundamentalmente o colesterol e suas frações, guardam relação direta com a doença isquêmica do coração, demonstrando-se riscos cada vez mais elevados, quanto maior a colesterolemia. Estudos recentes mostram uma melhor correlação do LDL-colesterol com o risco de aterosclerose do que o colesterol total (HOEFNER et al, 2001). Quanto mais elevada a fração lipoprotéica de baixa densidade (LDL), tanto mais frequente a doença aterosclerótica do coração; e, quanto mais elevada a lipoproteína de alta densidade (HDL), tanto menor o risco para essa doença (LESSA apud PIVA; FERNANDES, 2008). A hipercolesterolemia pode resultar de aterosclerose, fatores genéticos, como no caso da hipercolesterolemia familiar; gravidez, pós-menopausa, síndrome nefrótica, hipotireoidismo cirrose biliar primária e diabetes melito (.

1.1.2.d. Dislipidemias

As dislipidemias, distúrbios que alteram os níveis séricos dos lipídeos, são a causa fundamental de doenças coronarianas ateroscleróticas. A classificação bioquímica considera os valores de CT, LDL-C, TG e HDL-C e compreende quatro tipos principais bem definidos:

a) hipercolesterolemia isolada: elevação isolada do LDL-C (≥ 160 mg/dl); b) hipertrigliceridemia isolada: elevação isolada dos TGs (≥ 150 mg/dl) que reflete o aumento do

número e/ou do volume de partículas ricas em TG, como VLDL, IDL e quilomícrons; c) hiperlipidemia mista: valores aumentados de LDL-C (≥ 160 mg/dl) e TG (≥ 150 mg/dl); d) HDL- C baixo: redução do HDL-C (homens < 40 mg/dl e mulheres < 50 mg/dl) isolada ou em associação a aumento de LDL-C ou de TG.

1.1.3 Corpos Cetônicos

A mitocôndria do fígado tem a capacidade de converter acetii-CoA proveniente da beta- oxidação de ácidos graxos em corpos cetônicos. Os compostos classificados como corpos cetônicos são o acetoacetato, o 3-hidroxibutirato (chamado também de beta-hidroxibutirato) e a acetona (um produto colateral não-metabolizável). Embora o fígado constantemente sintetize baixos níveis de corpos cetônicos, sua produção torna-se muito mais significante durante o jejum, quando os corpos cetônicos são necessários para produzir energia nos tecidos periféricos. A acetona não sofre metabolização no organismo e é eliminada nos pulmões e na urina. O ácido beta-hidroxibutírico e acetoacetato não são utilizados como combustíveis pelo fígado, mas são lançados na corrente sanguínea para suprimento de outros tecidos. O fígado embora produza corpos cetônicos, não possui a enzima tioforase, sendo incapaz de usar corpos cetônicos como combustível.

1.1.3.a. Dosagem de corpos cetônicos na Urina

A análise rotineira da urina envolve os caracteres físicos, químicos e sedimentoscópicos. As tiras reagentes apresentam áreas que por diversos mecanismos assumem modificações de coloração que permitem visualmente a quantificação dos parâmetros avaliados. O método para análise de corpos cetônicos na urina (sensibilidade de 5-10mg/dl) está baseado em uma reação do ácido acetoacético com nitroprussiato e meio alcalino resultando em coloração que vai do rosa ao púrpura. Quando há presença detectável de corpos cetônicos na urina os valores são expressos + a ++++ ou mg/dL.

1.1.3.b. Interferentes

Para análise de corpos cetônicos na urina, fenilcetonas ou metabólitos da L-Dopa podem induzir resultados falsos positivos. A volatilidade dos corpos cetônicos é outro interferente, se a urina não for bem armazenada ou se durante a realização do teste a tira reagente embebida em urina ficar por tempo prolongado em contanto com o ar, os corpos cetônicos evaporarão da amostra em analise, originando um valor falso-negativo.

1.1.3.c. Significados Clínicos

Os diversos parâmetros avaliados auxiliam no diagnóstico e monitoramento de diversos estados patológicos e fisiológicos, tais como diabetes, icterícias de origens diversas e infecções do trato urinário entre outras. Quando a velocidade de formação dos corpos cetônicos é maior do que a velocidade de seu consumo, seus níveis começam a aumentar no sangue (cetonemia) e, por fim, na urina (cetonúria). Essas duas condições são observadas mais frequentemente em casos de diabetes melito do tipo 1 (dependente de insulina) não-controlado. Corpos cetônicos na urina também podem aparecer em decorrência de vômitos, jejum prolongado, febre, hipoglicemia, alcoolismo agudo. Em pacientes diabéticos é de grande importância, pois levam a um distúrbio no balanço acido/básico conhecido como cetoacidose diabética.

2.

Objetivos

  • 2.1 Objetivos Gerais

Dosar a concentração de triglicerídeos e colesterol total em amostra de soro/plasma. Analisar presença de corpos cetônicos em amostra de urina. Conhecer os valores de referências e correlaciona-los com patologias.

  • 2.2 Objetivos Específicos

    • 3. Material e Reagentes

      • 3.1 Materiais

        • 6 Tubos de Ensaio;

        • Cronômetro;

        • Óculos de Proteção Individual;

        • Luvas;

        • Espectrofotômetro;

        • Cubetas do espectrofotômetro;

        • Pipeta automática de 20 µL;

        • Pipeta automática de 1 mL;

        • Ponteiras de Pipetas de 20 µL e 1 mL

        • Folhas de papel absorvente.

          • 3.2 Reagentes

3.2.1 Dosagem de Colesterol em Amostra de Soro (Kit Colestat enzimático

AA- Wiener lab.)

  • Padrão: Solução de Colesterol 2 g/L.

  • Reagente A: frasco com colesterol esterase, colesterol oxidase, peroxidase, e 4- aminofenazona.

    • Reagente B: solução de tampão Good, pH 6,8, contendo fenol e colato de sódio.

  • Reagente de Trabalho (previamente realizado): Dissolveu-se o conteúdo do frasco de Reagente A com uma parte do Reagente B. Depois, colocou-se dentro do frasco de Reagente B, lavando-o várias vezes com a preparação. Misturou-se, homogeneizou-se e datou-se.

3.2.2 Dosagem de Triglicerídeos em Amostra de Soro (Kit TG Color

GPO/PAP AA Wiener lab.)

  • Padrão: Solução de glicerol 2,26 mmol/L(equivalente a 2 g/L de trioleína)

  • Reagente A: frasco contendo lipase lipoproteica, glicerol quinase, glicerol fosfato oxidase, peroxidase, adenosina trifosfato (ATP) E 4-aminofenazona.

    • Reagente B: tampão Good contendo clorofenol, pH 7,5.

  • Reagente de Trabalho (previamente realizado): Dissolveu-se o conteúdo do frasco de Reagente A com uma parte do Reagente B. Depois, colocou-se dentro do frasco de Reagente B, lavando-o várias vezes com a preparação. Misturou-se, homogeneizou-se e datou-se.

3.2.3 Dosagem de Corpos Cetônicos na Urina

  • Tira Reagente da Uriclin 10- Laborclin

4.1

Dosagem de Colesterol em Amostra de Soro

Separou-se 3 tubos de ensaio e marcou-se como B (Branco), P (Padrão) e D

(Desconhecido), colocou-os no suporte de tubos de ensaio. Utilizou-se a pipeta automática de

  • 1 mL, com a ponteira adequada, duas vezes, para pipetar 2 mL do reagente de trabalho no

tubo B, a pipeta automática de 20 µL ,com a ponteira adequada, para pipetar 20 µL da solução

padrão (colesterol 2 g/L) e a pipeta automática de 1 mL, com a ponteira adequada, para pipetar, duas vezes, resultando em 2 mL do reagente de trabalho no tubo P, adicionou-se, também, 20 µL da amostra (soro ou plasma), com auxílio da pipeta automática de 20 µL, com a ponteira adequada, e 2 mL do reagente de trabalho, com auxílio da pipeta automática de 1 mL, com a ponteira adequada, duas vezes, no tubo D. Aguardou-se 20 min em temperatura ambiente e procedeu-se a leitura da absorbância no espectrofotômetro a 505 nm, zerou-se o aparelho com o branco, para obter o valor exato da concentração de colesterol no soro.

  • 4.2 Dosagem de Triglicerídeos em Amostra de Soro

Separou-se 3 tubos de ensaio e marcou-se como B (Branco), P (Padrão) e D

(Desconhecido), colocou-os no suporte de tubos de ensaio. Utilizou-se a pipeta automática de

  • 1 mL, com a ponteira adequada, duas vezes, para pipetar 2 mL do reagente de trabalho no

tubo B, a pipeta automática de 20 µL ,com a ponteira adequada, para pipetar 20 µL da solução

padrão (glicerol 2,26 mmol/L) e a pipeta automática de 1 mL, com a ponteira adequada, para pipetar, duas vezes, resultando em 2 mL do reagente de trabalho no tubo P, adicionou-se, também, 20 µL da amostra (soro ou plasma), com auxílio da pipeta automática de 20 µL, com a ponteira adequada, além de 2 mL do reagente de trabalho, com auxílio da pipeta automática de

  • 1 mL, com a ponteira adequada, duas vezes, no tubo D. Aguardou-se 20 min em temperatura ambiente e procedeu-se a leitura da absorbância no espectrofotômetro a 505 nm, zerou-se o aparelho com o branco, para obter o valor exato da concentração de triglicerídeos no soro.

    • 4.3 Dosagem de Corpos Cetônicos na Urina

Imergiu-se na amostra de urina homogeneizada em tubo, retirou-se em seguida. Removeu-se o excesso de amostra batendo levemente a tira contra o papel absorvente. Realizou-se a leitura do parâmetro de corpos cetônicos após 40 segundos por comparação com a escala de cores impressa no rótulo do frasco e anotou-se o resultado observado.

REFERÊNCIAS

Arquivos Brasileiros de Cardiologia: V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e prevenção de aterosclerose. Rio de Janeiro: Volume 101, Nº 4, suplemento 1, outubro de 2013. Bula Laborclin Uriclin 10 Áreas, disponível em: www.laborclin.com.br CHAMPE, Pamela C.; HARVEY, Richard A.; FERRIER, Denise R. Bioquímica ilustrada. Terceira edição. Porto Alegre: Artmed, 2006. MARZZOCO, Anita; TORRES, Baptista Bayardo. Bioquímica básica, segunda edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S.A., 1999. MOTTA, Valter T. Bioquímica clínica para o laboratório: princípios e interpretações. Quarta edição. Porto Alegre: Editora Médica Missau; São Paulo:

Robe editorial, EDUCS Caxias do Sul, 2003. NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. Terceira Edição. Editora Savier, 2002.

www.endoclinicasp.com.br/exames-que-realizamos/corpos-cetonicos-pesquisa-

na-urina/