Manual de Calidad de Inmunohistoqumica en Anatoma Patolgica

Dr. Manuel Vaquero S. Anatoma Patolgica

2007

NDICE

Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 Fijacin de tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7 Recuperacin antignica . . . . . . . . . . . . . . . . .9 Cuantificacin del resultado inmunohistoqumico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 Realizacin de inmunohistoqumica en preparaciones citolgicas . . . . . . . . . . . . . .11 Evaluacin de nuevos anticuerpos . . . . . . . . . .12 Tipos de anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14 Anticuerpos disponibles . . . . . . . . . . . . . . . . .14 Paneles de anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . .14 Primario desconocido . . . . . . . . . . . . . . . .14 Tumores indiferenciados . . . . . . . . . . . . . .17 Utilidad del EMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 Mama . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 S. Nervioso: neurodeg. y tumores . . . . . . .18 Pulmn/mesotelio . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 Piel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Hgado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Rin-urotelio/prstata/testes . . . . . . . . .21 Ovario/trofoblasto . . . . . . . . . . . . . . . . .24 Endocrinos-neuroendocrinos . . . . . . . . . . .25 Partes blandas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Algoritmo en carcinoma colorectal . . . . . . .26 Hematopoyticos . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 Controles externos recomendados . . . . . . . . . .28

Hoja de peticin de estudios inmunohistoqumicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Anexo: Ejemplo de la base de datos de anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

Introduccin (J Histotech 1999; 22:163; Arch Pathol Lab Med 2000;124: 945)
El uso de tinciones de tejidos para facilitar su observacin microscpica se inici con la hematoxilina-eosina en el siglo XIX. En el primer tercio del siglo XX se introduce la histoenzimologa que utiliza tejidos sin fijar y de la que quedan nicamente restos, como los estudios con DPNasa y ATPasa en enfermedades musculares. La primera inmunohistoqumica se realiz con anticuerpos fluorescentes sobre tejidos frescos como los que se utilizan actualmente en diversas enfermedades de piel y rin. Los mtodos inmunoenzimticos (peroxidasa, avidita-biotina) que permitan amplificar la seal del cromgeno favorecieron la utilizacin de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Actualmente se utilizan polmeros sintticos para amplificar la seal (Envision, Powervision). La inmunohistoqumica es una tcnica esencial en el diagnstico anatomopatolgico de las enfermedades, fundamentalmente de las neoplsicas. Para que su utilidad sea plena es necesario realizar la fijacin de los tejidos, las indicaciones de uso, las tcnicas y la lectura y valoracin de los resultados atenindose a unos criterios de Controles de Calidad tanto internos del propio servicio como externos, en nuestro caso los auspiciados por la Sociedad Espaola de Anatoma Patolgica. Con el objetivo de servir de gua para la obtencin de resultados ptimos con las tcnicas de inmunohistoqumica se recogen en este Manual los distintos apartados necesarios para conseguir, primero, unos niveles de calidad estndares y que ello conduzca despus a su mejora continua. En el Servicio de Anatoma Patolgica del Hospital Donostia se cuenta con un laboratorio de Inmunohistoqumica con los medios tcnicos y una cantidad suficiente de anticuerpos que permiten obtener los mejores
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resultados diagnsticos. Sin embargo, es necesario organizarlos y gestionarlos adecuadamente para que cualquiera de los patlogos del servicio obtenga la mayor eficacia y reproducibilidad con los mismos. Por ello, es imprescindible contar con una base de datos que incluya todos los anticuerpos y sus caractersticas, con una gua tcnica y con indicaciones sobre paneles de conjuntos de anticuerpos segn las patologas a estudiar y algoritmos diagnsticos para las mismas; tambin deben existir controles internos en el mismo corte o de tejidos o tumores ad hoc que permitan unas valoraciones cuantitativas objetivas con mnimas variaciones inter e intraobservador. La estandarizacin de cada uno de los pasos, desde la recogida del tejido hasta la valoracin final del resultado obtenido, es clave para que la inmunohistoqumica sea totalmente fiable y, a la vez, que el gasto realizado sea el ms ajustado a las necesidades. Con estos fines nace este Manual. Agradezco la colaboracin de los patlogos del servicio, as como el apoyo y la asistencia tcnica recibida para la realizacin de este trabajo a los tcnicos del laboratorio de inmunohistoqumica Elena, Juana y Puri; a Koro, supervisora del servicio, y a Linda, por su apoyo informtico. Sin ellas la tarea hubiese sido mucho ms ardua y el resultado inaccesible.

Fijacin de los tejidos

La inmunohistoqumica se puede realizar en tejidos de biopsia y de autopsia, generalmente fijados en formol e incluidos en parafina, as como en material de citologa. La fase de fijacin del material para inmunohistoqumica es esencial. Una fijacin inadecuada impide cualquier resultado fiable. El fijador que se utilizar para inmunohistoqumica es el formaldehdo al 4% tamponado a pH 7,4 (formalina). El perodo ideal de fijacin no ser menor de 24 horas ni mayor de 48 horas. Fuera de estos estndares la calidad de la tcnica baja sensiblemente. Es aconsejable, por tanto, indicar en la hoja de peticin de la biopsia la hora en que se introdujo en formol. Hay evidencias de que la fijacin a mayores temperaturas que la ambiental empeora los resultados. Lo ideal para la piezas mayores es mantenerlas en el frigorfico a 4 C si se van a dejar toda la noche antes de tallarlas. El material autpsico ofrece generalmente malos resultados debido a los fenmenos postmorten que sufren los tejidos. La inmunohistoqumica con vimentina permite observar el deterioro sufrido durante la fijacin. Las piezas que vayan a procesarse el fin de semana iniciarn dicho procesamiento el mismo viernes para evitar que permanezcan excesivo tiempo en el formol; en caso de no ser posible, es preferible iniciar el procesamiento por alcohol de 70. Cuando el tejido ha estado menos de 24 horas en formol, se produce una fijacin hbrida: perifricamente se fijan con formol mientras las partes profundas centrales lo hacen gracias a los alcoholes que se emplean durante el procesamiento. Esto les hace ms sensibles a los mtodos de recuperacin antignica y resultan ms falsos positivos. Las citologas, al no tener que fijarse en formol, llevan un procesamiento diferente que se recoge en el apartado correspondiente.
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En caso de necesitarse utilizar un mtodo de descalcificacin se elegirn los ms suaves, preferiblemente el EDTA. Si se han empleado cidos, es crtico realizar un lavado de duracin variable con agua corriente, de mayor duracin cuanto ms haya durado la descalcificacin.

Mtodos de recuperacin antignica

Durante la fijacin con formalina se producen puentes metilo cruzados entre las protenas y se forman compuestos clcicos adyacentes. Estos compuestos afectan tambin a las zonas antignicas y deben eliminarse para obtener un resultado ptimo en la inmunohistoqumica. El mtodo de recuperacin antignica se realiza fundamentalmente mediante incubacin con calor, en torno a los 100 C, en bferes de citrato o EDTA. Menos frecuente es el uso de enzimas proteolticas, sin calentamiento, ya que dejan un fondo mayor y favorecen el desprendimiento del tejido. Protease-induced epitope retrieval (PIER) Descrito para inmunofluorescencia por Huang en 1976. En parafina tan slo es til para un nmero limitado de anticuerpos y adems es difcil de reproducir. El que da resultados ms estandarizados es la proteasa. Las variables ms importantes son el tiempo de digestin y la concentracin de la enzima. Heat-induced epitope retrieval (HIER) En 1991 Shi comienza a utilizar el microondas, entre 8 y 12 minutos, introduciendo las laminillas en buffer citrato 0,001 m a pH 6. El mayor problema es que algunos epitopos se daan con el calor de forma irreversible y esto acontece ms fcilmente si el tejido est poco fijado. Para evitar el desprendimiento de los cortes tisulares se utilizan laminillas adherentes especiales.

Cuantificacin del resultado inmunohistoqumico (J Histoch 2005; 28:89)

Se seguir en general la siguiente pauta, aunque hay frecuentes casos especficos en los que los porcentajes y su significado pueden variar: Negativo (-): total negatividad o menos del 50% de las clulas diana con menor intensidad que el control. Positividad dbil (+/-): ms del 50% de las clulas diana con menor intensidad que el control. Positivo (+): ms del 50% de las clulas diana con igual o mayor intensidad que el control. El lmite de intensidades entre negativo y positividad dbil o positivo se hace por comparacin con un control interno existente u otro externo ad hoc.

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Realizacin de inmunohistoqumica en preparaciones citolgicas

Lo mejor es prever siempre un bloque para procesar en parafina. Hay dos posibilidades, o bien realizar la inmunohistoqumica sobre la misma laminilla citolgica o tambin despegar las zonas deseadas y transferirlas a otros portas. Esta ltima es ms tediosa pero ofrece los mejores resultados y permite sacar varios portas de una sola extensin citolgica. El mtodo es muy reciente y se desarrolla de la siguiente manera: Es importante la utilizacin del medio Mount-Quick (Newcomer supply. Middleton WI) (Cancer Cytopathol 2005;105:158/ J Histoch 2002;25:251). Echad el medio sobre la laminilla y endurecerlo en estufa a 50-60 C varias horas. Marcad las zonas a estudiar con rotulador indeleble. Calentad al bao Mara (45 C) durante 15-20 minutos para ablandarlo. Levantad el medio del porta con un bistur y cortadlo en lonchas. Transferid a porta adherente especial y mantened durante un minuto una presin con papel de filtro humedecido. Mantened a 60 C durante toda la noche. Retirad el MontQuick mediante tres pasos por xilol. Rehidratar (No es necesario desteir si se va a utilizar HIER).

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Evaluacin de nuevos anticuerpos

(J Histoch 2001; 24:275) 1. Seleccin de un nuevo anticuerpo primario: los motivos pueden ser por que existan nuevas demandas o para sustituir a otro existente. Deben predecirse el nmero de test que se realizarn anualmente y el coste de cada estudio. Deben conocerse la dilucin aunque se preferirn los no diluidos previamente, el mtodo de recuperacin antignica y la sensibilidad y especificidad del anticuerpo. Vg. para p53 el DO7 o el pAb 1801; HER2/neu mejor el policlonal de conejo pero falsos +. Los policlonales tiene en general mayor afinidad y pueden emplearse diluciones >1/1000, aunque tienden a dar ms fondo lo que obliga a bloqueos suplementarios (vg. con la clona LeuM1 tipo IgM debe utilizarse un anticuerpo secundario de tipo IgM). 2. Optimizacin de la inmunorreactividad Los factores ms importantes son. Dilucin del anticuerpo primario. Duracin de la incubacin del primario. Tipo y concentracin del anticuerpo secundario. Tcnica de recuperacin antignica empleada. Temperatura de incubacin. Sistema de deteccin y amplificacin. En la prctica se manejan nicamente tres variables: Dilucin del anticuerpo primario. Tiempo de incubacin del primario (si se aumenta el tiempo se pude diluir ms el anticuerpo primario). Tcnica de recuperacin antignica (el EDTA alcalino suele ser mejor que el citrato. Excepciones: LMP-1 y CD21, en los que se preferirn enzimas).
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La hoja de trabajo para la validacin de nuevos anticuerpos es la siguiente (tabla orientativa):

Dilucin* 1/10 1/20 1/40 1/80 Recup antg/ T ** 10 mM citrato pH 6 / 20 minut Tiempo antc 32 minutos Sist Resultados *** incubacin 0- negativo 1- positivo dbil en algunas clulas diana 2- positivo dbil en muchas clulas diana 3-positivo moderado en la mayora clulas diana 4-positivo fuerte en la mayora clulas diana

Envision

1/10 1/80

1mM EDTA pH 8/ 20 minut

32 minutos Envision

1/10 1/80

Proteasa 8 minutos

32 minutos Envision

* Seguid diluciones segn especificaciones de cada anticuerpo. ** Calentad (olla, microondas o autoclave) a 100C 15-20 minutos y otros tantos para enfriar. En muchos casos, es mejor el pH 9. *** Slo para ajustar la valoracin. No para resultados en diagnsticos.

Adems de la positividad de la diana debe valorarse el fondo. Dicha tincin de fondo tiene causas variadas. A veces es debido a que el anticuerpo no est totalmente purificado y tiene inmunoglobulinas inespecficas. Muchas veces es por una titulacin deficiente del anticuerpo primario y/o secundario (disminuid la concentracin y aumentad los tiempos para solucionarlo). En las tinciones citoplsmicas deben tenerse en cuenta los falsos positivos como los debidos a biotina endgena (neutralizadla con avidina despus del anticuerpo primario) y con las peroxidasas (se neutraliza con agua oxigenada) y fosfatasa (se bloquea con levamisol) endgenas. Para detectar problemas de fijacin es til introducir un control de vimentina (Dako) pero sin realizar con ella recuperacin antignica alguna.
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Tipos de anticuerpos
Los anticuerpos pueden ser poli o monoclonales. Estos ltimos son ms especficos y se obtienen mediante el mtodo de hibridoma de Kohler que consiste en la fusin de clulas esplnicas de un ratn inmunizado con una lnea celular de mieloma no secretor murino. Dado que el conejo es ms fcil de inmunizar que el ratn actualmente se estn introduciendo anticuerpos monoclonales de conejo a pesar de que este animal no padece mieloma, por lo que deben generarse heterohibridomas conejo-ratn. Los anticuerpos de conejo son ms sensibles y parecen conservar la especificidad. (Am J Clin Pathol 2005;124:295).

Anticuerpos disponibles
Como puede observarse en la base de datos, anexada a modo de ejemplo al final del manual, se recogen todos los datos necesarios para la identificacin, manejo y gestin de calidad de la tcnica de inmunohistoqumica. De ella, junto con la hoja de peticin, se desprendern las estadsticas mensuales de anticuerpos utilizados, porcentaje de positividad de cada uno e incidencias tcnicas.

Paneles de anticuerpos

(Dabs. Diagnostic Immunohistochemistry 2002; www. immunohipermart.net; www.immunoquery.com/login.cfm; www.cap.org) Metstasis de primario desconocido (J Histoch 1999; 22:209) Las citoqueratinas (CK) se clasifican segn el Pm y el punto isoelctrico (Moll). In vivo tienden a expresarse en parejas, una bsica y la otra cida (CK8/CK18; CK5/CK14). En la prctica las ms tiles son:

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- PanCK AE1-AE3. - 34beta E12 (alto Pm): se detecta en epitelios complejos como el ductal, el transicional y los escamosos (CK 1,5,10 y 14), en carcinomas escamosos pobremente diferenciados y en mesotelio. - CK5/6: positivo en clulas basales, en carcinomas escamosos pobremente diferenciados y en mesotelio. - CK7: se detecta en epitelios simples de pulmn, crvix, mama, ductos biliares, tubos colectores renales, vejiga y mesotelio. - CK19 muy til en carcinoma de pncreas, estmago, colon, tracto biliar, hgado y mama. El Ca papilar tiroideo suele ser positivo frente al 50% de los foliculares. - CK20: se detecta en clulas foveolares gstricas y clulas umbrela de la vejiga. Muy positivo en carcinoma de clulas de Merkel. Positivo en carcinoma de colon. La utilizacin simultnea de CK 7 y CK20 ofrece grandes ventajas en la orientacin de un posible primario:
CK7/CK20 + Pncreas Vejiga Mucinoso de ovario Ca Merkel CK7/CK20 negativas Escamoso pulmn Neuroendocrinos Hepatocarcinoma Rin Prstata CK7+/ CK 20 negativa CK7 negativa/ CK20 +

Timoma Colorrectal Pulmn No oat cell Mesotelioma Mama Endometrio Seroso de ovario

CEA: generalmente positivo en carcinomas de pulmn, hgado y colorrectal. A veces positivo en mama, transicionales y crvix. Generalmente negativos en mesotelioma, rin, endometrio y ovario. p 16- sobreexpresado en carcinomas y displasias asociadas a VPH.
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Otras combinaciones tiles para identificar el origen de los carcinomas son:

34BE12 CAM 5.2 AE1/AE3 CK7 CK 20 TTF-1 C Merkel Oat cell Adc pulm Mama Seminoma Endometr Vejiga Partida Neuroend Pncreas Biliar Gstrico Colorrectal Prstata Renal Germinal Hepatoca Muc ovari No muc ov Tiroides Adrenal Timo Endocrvix N N -/+ -/+ N -/+ -/+ -/+ N -/+ -/+ N N N N N N N N -/+ N -/+ N + + + + N + + + + + + + + + + + + + + + N + + + + + + N + + + + + + + + + + + N + + + N + + + N -/+ + + N + + + + +/+/+/N -/+ N + N + + -/+ N + N N N N N + N N -/+ +/+/+ N N N N + N +/N N N N + +/N N N N N N N N N N N N N N N N + N N N

Algunos anticuerpos son ms rgano-especficos: PSA, tiroglobulina, TTF-1, protena surfactante tipo A. Receptores de estrgenos y/o progesterona generalmente positivos en mama, endometrio, crvix, ovario,
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tiroides, neuroendocrinos y sudorparos. Son siempre negativos en hepatocarcinoma, carcinoma colorrectal y en el pulmonar no oat cell. Tumores indiferenciados
CAM 5.2 Carcinoma Melanoma Linfoma No semino Seminoma + N N + R-N EMA + N N N N S-100 -/+ + N N N ALC N N + N N Fosf Al Plac -/+ N N + +

Reactividad del EMA en carcinomas y tumores no epiteliales.

Tpicamente positivo Generalmente negativo Positividad ms focal

Biliar ductos Tumores germinales Perineuroma Carcinomas sarco- excepto coriocarci- Neurofibrosarcomas matoides noma Sarcoma sinovial Endocrvix Plasmticas Endometrio Eritroblastos Mama Cel L-H Hodgkin Meningioma ALK linfoma Mesotelioma Leiomiosarcoma Pncreas Hist fibroso maligno Piel y anejos Prstata ductos Pulmn Salival Tiroides Urotelio

Mama - Para el diagnstico diferencial entre hyperplasia ductal e hyperplasia atpica-Ca in situ son tiles la citoqueratina 34bE12 y la CK 5/6. - Para valorar la posible invasin estromal se utilizan la p63 y la calponina.
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 Enfermedades neurodegenerativas

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Patologa vascular Cuerpos argirfilos Cambios espongiform Demencia vascular D.C. argirfilos EETH Patologa tau en neuronas y gla de tronco y GB Gliosis en tlamo PrP AMS PSP Demencia talmica SOLO OVILLOS

ENFERMEDADES DEGENERATIVAS

Cuerpos de Lewy

Placas y ovillos

Parkinson

LBD

vLB-AD

ALZHEIMER

Mixta

Atrofia lobar, vacuolizacin superficial, gliosis subcortical, neuronas abalonadas

Inclusiones tau+, -synuclena + en oligodendrogla y neuronas

Pick+

Pick-

Fam+Park

Placas astrocitarias

Asta anterior

Pick

DF/DFT

DFTP-17

DCB

ELA+D

En la clasificacin es importante la conjuncin de: datos clnicos, distribucin anatmica de las lesiones, tipo de cambios morfolgicos y positividad, segn en tipo de patologa, para los siguientes anticuerpos: - Amiloide- - Protena Glial Fibrilar cida - Sinuclena - Tau - Ubicuitina Tumores de sistema nervioso central Muy importante: en las intraoperatorias hay que estar seguros de que el material es representativo de la lesin. Ojo!: En las biopsias obtenidas con esterotaxia, si se usa toda la muestra para la tcnica de aplastamiento en vez de las improntas, no quedar material para parafina. Hay que tener adems en cuenta que algunos glioblastomas pueden dar positividad para citoqueratinas, por lo que se preferir el CAM 5.2. En general suelen ser tiles para el diagnstico y clasificacin la utilizacin de Ki-67 y p53. - Con clulas claras
PGFAP Oligodendroglioma Xantoastrocitoma Ependimoma T disembriplstico Neurocitoma Meningioma Hemangioblastoma Ca renal Desmialinizacin Infarto + + + + + + + EMA + + Synapt + + Kp-1 + +

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- Con clulas epitelioides

GFAP CAM 5.2 EMA S-100 Cromog Sinapt Oligodendroglioma Ependimoma Papiloma plexos Cordoma Craneofaringioma Carcinoma Adenoma hipofisis Paraganglioma Meningioma Melanoma Hemangioblastoma + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

- Tumores con clulas pequeas/anaplsicas

Viment GFAP Synap S100 Desmi CK EMA CD20 Ependimoblast Medulob/P NET Rabdomios T teratoide Hemangioperic Linfoma Ca cel pequea +/+ + -/+ -/+ +/+/-/+ +/+/+ -/+ + + +/-

Respiratorio - Carcinomas pulmonares: epidermoide vs oat cell

Panqueratin/ CAM 5.2 Ca epidermoide Oat cell 20 + difuso +/- puntiforme Cromogranina A + TTF-1 +

- Mesotelioma epitelial vs carcinoma

Calre- Trombo BerEP DO 4 CK 5/6 CEA CD15 tinina modulin 4 Mesotelioma + +/+/+/Carcinoma -/+ +/+/+

Piel - Enfermedad de Paget vs carcinomas/ melanoma

CK 7 Paget mama Paget vulva Ca recto Ca urotelial Melanoma Bowen + -/+ + Pan CK + +/+ + CK 20 -/+ + CEA + +/+ -/+ S-100 - /+ -/+ + -

Hgado - Carcinomas hepticos primarios

CK AE1AE3 -/+ +/CEA -/+ +/Hepatocito 1 Alfa FP + -/+ +/-/+

Hepatocarcinoma Colangiocarcinoma

Genitourinario - Tumores renales: perfiles inmunohistoqumicos Adenoma metanfrico: WT1 y CD 57 positivos; CK 7 y EMA negativos Angiomiolipoma: HMB 45 y actina positivos; CK negativas Carcinomas con translocacin Xp11.2/TFE3: protena TFE 3 positiva nuclear Carcinoma de clulas claras
Positivos CK 7 EMA Vicentina CD10 Fosfatasa alcalina Negativos CK alto Pm CEA S-100 Inhibina Otros: Mucina, Oil red-O, hierro coloidal Hale 21

 Carcinoma papilar renal

Positivos CK AE1-AE3 CK 7 Vicentina Mucina Negativos CK alto Pm Ulex europeus lectina

Carcinoma cromfobo
Positivos CK AE1-AE3 CK 7 CK alto Pm (a veces negativo) E-Cadherina EMA Hierro coloidal Hale Azul alcin CD10 Vimentina Negativos

Carcinoma ductos colectores

Positivos EMA CK 7 CK alto Pm Vimentina CEA (focal) Mucina CD15 Negativos

Carcinoma urotelial
Positivos CEA CK alto Pm p63 CK 7 CK 20 (*) _-catenina (a diferencia de colon) Vimentina Negativos

CDX2

(*) CK20 para diag. Dif. Entre Ca in situ (+) e hiperplasia urotelial

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 Cuadro sinptico de neoplasias renales (Clin Lab Med 2005; 25:247)

Cel Claras CD10 Vimentina EMA CK 7 CK 20 CK 15 CD 117 Racemasa CK < Pm CK >Pm ECadherina 81-100% + + ------75% + (tipo1) +/-(tipo 2) 100% Papilar 63-100% 75-96% +/Cromfobo +/- 26% +/- 45% -----+ ---+/- (25%) 57-100% *** -------Oncocitoma +/- 33% -----+/75% +/- (50-80%) 63% 70-100% *** -/+ (15%) + ---100% **** + ----+ +/----Ductos colec -----

RCC marker 75-85%

73-100% * 19-100% **

+/- (15%) +/- (28%) -/+ (25%) + ---5% 100% + -/+

0% (tipo1) 95100% 38% (tipo2)

(*) intenso con refuerzo de membrana; (**) focal y dbil; (***) membrana; (****) citoplsmico. A diferencia del cromfobo: ste patrn en anillo con CK 7-CK 19 y AE1-AE3

- Prstata (Histopathology 2005; 47:1) El AMARCR (antc monoclonal conejo P504S) es til en PIN de alto grado y carcinoma prosttico. Puede resultar positivo en adenosis y en el adenoma nefrognico. PSA- debe utilizarse un policlonal y un carcinoma de alto grado como control. Para diferenciar un carcinoma de prstata de otro urotelial resultan tiles: el PSA para el origen prosttico y las citoqueratinas de alto peso molecular (34 betaE12), p63 y la CK7 para identificar urotelio (puede ser positivo en Gleason altos y lo contrario la CK 20). Para marcar basales resultan igual de eficaces la CK 5/6 y la p63 (sta resiste ms la electrocoagulacin).
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- Tumores testiculares Suelen ser tiles los siguientes anticuerpos: Fosf Alcalina Placentaria (membrana)- Seminoma, neopl germinal intratubular, gonadoblastoma, ca embrionario, TSE. HCG- Clulas sincitiotrofoblasto. Lactgeno placentario- trofoblasto intermedio. Inhibina- T estroma-cordones sexuales, trofoblasto intermedio. EMA-si sale positiva descartar un carcinoma metastsico.
PLAP CD 117 Pan CK CD30 Seminoma Ca embrionar TSE Tcel Leydig** T cel Sertoli + (*) + +/+ -/+ + + -/+ +/+ alfa- Inhi- VimenFeto bina tina -/+ +/+ + + +

(*) negativa en espermatoctico; (**) S-100 y Melan A pueden ser positivos.

- Tumores ovricos
Epitelio Tecom Granu Sertoli Tum Disger TSE CaEm Corio Superf losa Leydig anex minom Wolfi EMA Inhibina MelanA CK AFP HCG CD30 + + -/+ + + -/+ +/+ + + + + -/+ + + + -

- Ca mucionoso ovrico vs Ca colon

CK 7 CK 20 CEA Vimentina 24 Colorrectal + + Ovrico + -/+

- Lesiones trofoblsticas y simuladores

Lugar placen + + + Ndulo placen + -/+ + T trofo blastico + +/+/ Ca escamoso + + -

CK Ki-67 HLP PLAP

- Tumores endocrinos/neuroendocrinos (J Histoch 1999; 22:239): cromogranina A (a veces falla en carcinoides hindgut y prolactinomas), sinaptofisina, Leu 7, CD57 (NCAM), inhibina alfa (clulas gonadales productoras de esteroides y corteza adrenal). - Tumores de partes blandas (J Histoch 1999;22:219) CD31 (PECAM-1): endotelio, plaquetas, clulas madre hematopoyticas. CD34: dermatofibrosarcoma protuberans, tumor fibroso solitario, hemangiopericitoma, GIST, endotelio, progenitores hematopoyticos, fibroblastos y lipoma fusocelular. Factor XIII: histiocitoma fibroso. S-100: melanoma, sarcoma de clulas claras, lipoma de clulas redondas. HMB-45: melanomas, PEComas. HHF.35, actina muscular alfa: clulas glmicas, miofibroblastos, mioepitelio y msculo liso. Caldesmn: msculo liso y mioepitelio pero no en miofibroblastos ni rabdo. Calponina: msculo liso, miofibroblastos, mioepitelio y, a veces, en sarcoma sinovial. EMA: perineuromas, meningiomas, carcinoma renal y sarcoma sinovial (en ste focalmente pueden resultar positivos S100 y CD99). Myo D1: en el ncleo para que sea especfico de msculo estriado. -catenina en fibromatosis (negativo en cicatrices). Por tumores son tiles: Sarcoma epitelioide: EMA, vicentina, CD34 (50%), actina (33%). La CK7 es negativa.
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 Sarcoma alveolar: positividad de actina y desmina en el 50% casos. Protena AE3 +. Osteosarcoma: osteocalcina. Swing/PNET: CD99; focalmente CK, neurofilamentos. Neuroblastomas: NSE y sinaptofisina positivos; CD99 negativo. T. cel. redondas pequeas desmoplsico: positividad para CK, vimentina, EMA y desmina. NES +/-. Tumores de clulas pequeas azules redondas (J Histoch 1999;22:289).
ALC Vim Des Act MyoD CK CD NF CrA Sy- TdT Inhib S 99 nap 100 Leuc/linf Rabdo Neurobl Swing S sinovial DSRCT Cond ms Granulosa Melanoma Carcinoma + + + + + + + + + -/+ + + -/+ + + + +/+ + + -/+ + -/+ + + + -/+ + -/+

-/+ +/- -/+ +/- +/+ -/+ -

-/+ -/+

+/- +/-

Algoritmo resultados IHQ con MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2 en Carcinoma colorrectal (Rev Esp Patol 2006;39:201-8). Modificado
No prdidas expresin No CCR espordico S Mutacin BRAF No No Criterios Bethesda revisados Anlisis germinal S Sndrome Lynch Criterios Bethesda revisados S Inestabilidad Microsatlites BAT-26 S No

CCR Familiar NO Lynch

Prdida MLH1 +/- PMS2

Prdida PMS2

Prdida MSH6

+/-

Prdida MSH2

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 Hematopoyticos y afines: - Antgeno leucocitario comn (ALC: CD45RB/CD45): clulas originadas en la mdula sea, incluyendo linfocitos y monocitos. Son negativos en 50% casos: linfoma ALK y linfoblsticos. Suelen ser negativos: cel Hodgkin y plasmticas. - ALK: varias localizaciones celulares. - CD1a: cel Langerhans, timocitos corticales (inmaduros) y, a veces, Rosai-Dorfman. - CD3: policlonal. Si monoclonal usad psilon (7S1). - CD5: timocitos, linfos T, Carcinomas tmicos, LLC y linfoma del manto. - CD10: LLA, centro germinal, linfoma folicular, linf Burkitt. - CD15 (LeuM1): granulocitos, algunos macrfagos y cel Reed-Sternberg (Golgi y membrana). - CD20: linfocitos B. - CD23: LLC, cel dendrticas. - CD30: marcador de activacin linfocitario, linfoma ALK, Carcinoma embrionario y cel Reed-Sternberg (Golgi y membrana). - CD38: linfos activados y plasmticas. - CD43: linfos T, granulocitos (LMA), monocitos, megacariocitos, mastocitos y un 30% de linfomas B. - CD45RO (UCHL1): linfos T, monocitos y granulocitos (LMA). - CD63: plasmticas (marca retculo endoplsmico). - CD68 (KP-1): positividad citoplsmica en monocitos, SER, osteoclastos, precursores mieloides y algunos linfos B. - CD79a: linfocitos B. - CD99: timocitos corticales y timomas, PNET/Ewing y LLA. - CD123: precursor dendrtico hematodrmico. - CD138: plasmticas. - Mum 1: plasmticas. - Pax-5: diferenciacin lnea B. - Bcl-2: linfomas de bajo grado y linfocitos T. - Bcl-6: origen centro germinal. - Ciclina D1: linfoma del manto.
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- S100 (nuclear y citoplsmico): cel Langerhans, cel interdigitantes,Rosai-Dorfman, leucemia mieloide, melanomas y cel Schwann. - TdT: leucemias linfoides agudas. - Triptasa: mastocitos. - MIB-1 (Ki-67): marcador de proliferacin. - ZAP70- indicador de peor pronstico en LLC y, probablemente, en linf manto. Controles externos recomendados (www.ihcworld.com).
Anticuerpos
Actina msculo-especifica AE1/AE3 AFP ALK Beta amiloide Beta Catenina BerEP4 CD (varios), bcl-2/bcl-6 CD15 CD30 CD99 CD117

Tejidos

Localizacin
Citoplasma Citoplasma Citoplasma Variable nuclear/citopl Citoplasma Ncleos Citoplasma Membrana Membrana-Golgi Membrana/Golgi Membrana

Colon, bazo Colon, piel, pncreas Hgado fetal Linfoma anaplsico Cerebro Alzheimer Ductos,dctulos biliares Mama, colon Amgdala Hodgkin Hodgkin, pncreas Timo Piel, cerebro, pulmn, bazo CEA (monoclonal) Colon CK AE1-AE3 Colon, piel, pncreas CK7 Mama, pulmn CK20 Colon, pncreas Caldesmon Msculo liso Calretinina Mesotelio, timo teste, cerebelo COX2 Colon, rin Cromogranina A Pncreas, adrenal, ovario Desmina Colon, bazo E-Cadherina Mama EGF R Placenta EMA Amgdala, rin Estrogeno R Mama, tero Fosfatasa alc placentaria Placenta Hepar 1 Hgado normal hCG Placenta HMB-45 Melanoma Inmunoglobulinas Amigdala Inhibina Ovario Ki-67 (MIB1) Piel, timo, amigdala Lactgeno placentario Placenta, amgdala Melan A Melanoma Mieloperoxidasa Mdula sea

Membrana/citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Ncleo-citoplasma

Granular citoplasma Citoplasma Citoplasma Membrana Membrana Nuclear Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Nuclear Citoplasma Citoplasma granular

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Anticuerpos
Pax-5 p53 p63 PDGF R Progesterona R Protena Glial fibrilar PSA Racemasa S-100 Sinaptofisina Tau TdT Tiroglobulina TTF-1 Triptasa Vimentina WT-1

Tejidos
Hodgkin nodular linf Ca seroso, Ca mama Mama Mama Mama, tero Cerebelo Prstata Prstata Piel Cerebro, adrenal Alzheimer Timo Tiroides Tiroides Mdula sea Ca de colon Rin

Localizacin
Ncleo Nuclear Nuclear Membrana Nuclear citoplasma Citoplasma Citoplasma Ncleo + citoplasma Citoplasma Citoplasma Ncleo Citoplasma Nuclear Citoplasma Citoplasma Nuclear

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Peticin de estudios inmunohistoqumicos

N de la muestra Urgente Dr/Dra. Fecha peticin: Fecha entrega:

Observaciones para el tcnico: Valoracin tcnica (1 a 10) TEAP: Patlogo: Problemas tcnicos observados:
Actina musc esp ALK protena Alfa1-antitrip Alfa-fetoprot Alfa sinuclena Amiloide AA Amiloide beta Anti HH3 Bcl-1 Bcl-2 Bcl-6 Bcl-10 BerEP 4 Caldesmn Calmodulina CD1a CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD10 CD15 CD20 CD23 CD30 CD31 CD34 CD43 CD45RA (ALC) CD45RO/UCHL CD56 CD57 CD68 CD79a CD99 CD117 CD123 CEA c-erb-2 Cromogranina A Citoq AE1-AE3 Citoq 5/6 Citoqueratina 7 Citoqueratina 19 Citoqueratina 20 Citoq 34 B E12 Desmina DO 4 D2-40 EBER e-cadherina Enolasa NE Estrgeno recept Factor XIII a Fosfatasa cida Fosfat alcalina Granzima B HCG-beta Hepatocito 1 HMB-45 Inhibina alfa Inmunoglob A Inmunoglob D Inmunoglob G Inmunoglob M Kappa Ki-67 Lactgeno plac Lambda LMP-1 Melan A Mieloperoxidasa Myo-D1 MUM-1 MLH1-MSH2-MSH6PMS2 Neurofilamentos p16 p53 p63 Pax-5 Perforina Progesterona recep Prot glial fibrilar PSA Racemasa alfa S-100 Sinaptofisina Surfactante pr A Tau TdT TIA-1 Tiroglobulina Triptasa Trombomodulin TTF-1 Vimentina ZAP-70

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ANEXO

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Anticuerpos REFERENCIA DILUCIN REC.ANTIGENOS. VISUALIZACION CONTROL

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M 613 AM 390 M 760 M 7157 M 880 MU 126-UC M 785 M 7018 M0821 08-1211 M 3557 M 3509 A 193 A 192 M 0630 A 0485 MU-187-UC MIC2 NCLCD84B11 M 7050 NDLCD7272 M 0876 M 814 1/2500 PREDILUIDA 1/100 1/100 1/50 1/100 1/50 1/500 1/300 1/10 1/50 1/250 1/30000 1/30000 1/600 1/1500 1/350 PREDILUIDO 1/20 1/200 1/50 1/500 1/500 OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISON ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION

ANTICUERPO NOTAS

CLON

LABORATORIO

EMA E29 E CADHERINA AM 390SH DESMINA D33 DENTRITICAS CNA.42 D B A 44 congelado DBA 44 CROMOGRANINA LK2H10 COLAGENA IV CIV 22 CK 7 OV-TL12-30 CITOKERATINA CAM 5.2 MNF116 CALRETININA POLI CALDESMON H-CD CALCITONINA congelado CA-3-F5 CADENAS LAMBDA congelado POLI CADENAS K KAPPDA POLI C K 34-12 C erb B2 POLI CEA TF3H8-1 C D 99 CD8 4B11 C D 79 a JCB117 CD7 CD7-272 C D 68 PG-M1 C D 68 KP1

DAKO MENARINI DAKO DAKO DAKO MENARINI DAKO DAKO DAKO ZIMED DAKO DAKO DAKO DKO DAKO DAKO BIOGENEX MENARINI NOVOCASTRA DAKO NOVOCASTRA DAKO DAKO

C D 57 CD5 C D 43 CD4 C D 38 C 1 C D 34 C D 31congelado CD3 C D 23 C D 21 congelado C D 20 C D 15 C D 138 C D 117 C D 10 C D 1 congelado BCL6 BCL2 ANTIGENO EPITELIAL AMIELOIDE ACTINA ACTH ALK ALC AFP

NK1 4C7 MT1 IF6 VS38 c Qbend/10 JC/70 POLI 1B 12 IF8 L 26 MMA ML 15 CKIT 56C6 010 PG-B6p 124 VER EP4 MC 1 HHF 35 02 A31 ALK1 PD7/26

NOVOCASTRA NOVOCASTRA BIOGENEX NOVOCASTRA DAKO NOVOCASTRA DAKO DAKO NOVOCASTRA DAKO DAKO BDICKINSO DAKO DAKO NOVOCASTRA M-D DAKO DAKO DAKO NOVOCASTRA DAKO DAKO DAKO DAKO DAKO

NCL-NK1 CD5 4C7 MU 155 UC NCLCD41F6 M 7077 NCL-END M 823 M-7254 NCLCD23 1B1 M 784 M 755 347420 M 7228 A 4502 NCLCD10270 0781 B M 7211 M 887 N 1531 NCL-AAC M635 N 1531 M 7195 M 833 A 0008

1/50 1/5 1/150 1/20 1/25 1/500 1/50 1/200 1/40 1/20 1/3500 1/20 1/100 1/150 1/15 PREDILUIDO 1/10 1/350 1/25 1/400 1/200 1/15 1/25 1/1000 1/1500

OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA ENZIMA 10'40 OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA Ph.8 OLLA M.300 10' PEPS OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA OLLA

ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISIOLN ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION ENVISION

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