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1|Escola Secundria Dr.

Manuel Gomes de Almeida Cludia Franco | Edgar Couto Actividade Prtica Laboratorial | Laboratrio Aberto IPATIMUP | Porto

Rastreio de Transgnicos
Deteco de OGM positivos atravs da Tcnica de Electroforese

Resumo
Aps concluda a Actividade Prtica Laboratorial Rastreio de Transgnicos no Laboratrio Aberto do IPATIMUP foi elaborado o presente Paper. Este documento tem como objectivo a descrio da actividade bem como elucidar alguns conceitos e tcnicas utilizados para avaliar se os alimentos so OGM negativos ou positicos, como so o caso a Transgenicidade, a Extraco de DNA de clulas vegetais, a amplificao de um troo pretendido de DNA por PCR e a Tcnica de Electroforese. So ainda abordados conceitos associados como os Primers, genes Promotor e Terminador, DNA polimerase, enzimas e cofactores. Como produto final, pretende-se que deste documento resulte uma descrio e explicao cientficas de forma a elucidar quem o ler sobre o foi o Rastreio de Transgnicos e em que se baseou. Palavras-Chave: DNA (cido Desoxirribonucleico), PCR (Reaco de Polimerase em Cadeia), Transgenicidade, Electroforese, Primers, Promotor, Terminador, DNA polimerase, Enzimas, Cofactores.

Abstract
After completing the Practical Laboratory Activity Transgenic Screening at the Open Laboratory of IPATIMUP the present Paper has been written. This document has as purpose the description of the activity, as well as clarifying some concepts and techniques that allow the evaluation of the aliments as negative or positive GMO, such as Genetic Modification, DNA extraction of plant cells, DNA amplification resorting PCR and Electrophoresis Technique. There are also some concepts as Primers, Promoter and Terminator genes, DNA polymerase, enzymes and cofactors. Once finalized, it is hoped that this document gets to be a scientific description and explanation that elucidates the reader about what the Transgenic Screening was and in what it is based on. Key-Words: DNA, PCR, Genetic Modification, Electrophoresis, Primers, Promoter, Terminator, DNA polymerase, Enzimes, Cofactors.

Biologia 12o ano | Cincias e Tecnologias | 2010/2011

2|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida

Introduo
A elaborao deste Paper Cientfico surgiu no mbito da disciplina de Biologia de 12 o ano e tem como finalidade a descrio da Actividade Prtica Laboratorial Rastreio de Transgnicos, realizada no Laboratrio Aberto do IPATIMUP, no Porto, no dia 26 de Abril de 2011. A Actividade teve como objectivo a decifrao de quais os alimentos transgnicos de entre trs (milho, tomate e soja). Para tal seria necessrio estudar a composio do genoma de cada amostra. Procedeu-se extraco de DNA de cada um dos alimentos, para posterior amplificao de um segmento especfico e observao da constituio do mesmo atravs da Tcnica de Electroforese. O presente documento pretende no s descrever todos os passos da experincia prtica, mas tambm aprofundar conceitos vagamente explorados em contexto de aula como o caso da Tcnica de Electroforese ou como se obtm os alimentos transgnicos. O Paper est, ento, dividido em oito partes lgicas: os Fundamentos Tericos, nos quais so tratados todos os assuntos que depois se aplicam na prtica da actividade; o Material; o Mtodo e o Procedimento, que se encontram juntos j que se complementam e descrevem as hipteses propostas e as etapas da experincia; os Resultados, que se encontram de forma grfica j que foi assim que os observmos; a Discusso, na qual se examinam os resultados, sendo estes interpretados e criticados; a Concluso, uma breve considerao de como decorreu a experincia e se os resultados correspondem ou no teoria e porqu; os Agradecimentos, j que sem a disponibilidade das pessoas que nos apoiaram no teria havido a possibilidade de uma aula como a que decorreu e, por fim, as Referncias, todas as fontes de onde foi retirada a informao presente neste trabalho. de salientar que o Laboratrio Aberto uma criao muito inteligente do IPATIMUP (Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto), o qual uma importante referncia em Portugal no campo da Engenharia Gentica, no s devido a descobertas pioneiras mas tambm por teses e artigos publicados nesta rea destacados com grande valor cientfico. Assim sendo, todos os anos so proporcionadas experincias nicas por esta iniciativa do IPATIMUP que no podia ser dispensada, j que traz a oportunidade de aulas totalmente diferentes das que so possveis em recinto escolar, no s pelos materiais especficos, mas tambm pela partilha do conhecimento das instrutoras com os alunos.

Fundamentos Tericos
Transgenicidade
Os cruzamentos planeados e a polinizao cruzada so tcnicas utilizadas pelos humanos desde sempre. No entanto, apesar de esses processos poderem seleccionar caractersticas convenientes, esto limitados s caractersticas existentes na Natureza. Com a evoluo da Engenharia Gentica passa a ser possvel uma recombinao menos aleatria, mais precisa e que seria muito improvvel de acontecer na Natureza. Exemplo disso so tcnicas desenvolvidas como a do DNA recombinante, que possibilita a combinao de genes de diferentes espcies. , ento, graas a esta Engenharia que existem os OGM Organismos Geneticamente Modificados que, tal como o nome indica, so organismos cujo genoma artificialmente alterado de forma a que passe a codificar a sntese de novas protenas que lhes confiram as caractersticas desejadas. A alterao genmica destes

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3|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida organismos conseguida atravs da insero de genes exgenos (provenientes de uma molcula de DNA dadora) ou atravs da alterao dos seus prprios genes. Esta alterao gnica muito aplicada no que toca sade (indstria farmacutica), mas tambm produo alimentar (animais e vegetais). So produzidas plantaes agrcolas modificadas com o objectivo de criar plantaes resistentes a herbicidas e pesticidas, a condies metereolgicas, para florescerem com mais rapidez, para darem maior rendimento aos agricultores, entre outros. Existem vrios processos para a obteno de Organismos Genticamente Modificados, sero aqui abordados trs muito comuns: Processo Biobalstico, Processo recorrendo a Agrobacterium tumefaciens e Electroporao. O Processo Biobalstico, como o nome indica, consiste na utilizao de microprojcteis (de ouro ou tungstnio), acelerados a velocidades, por vezes, superiores a 1500 km.h-1. Isto para permitir a introduo de cidos nucleicos em clulas e tecidos in vitro. Muito resumidamente, os mecanismos utilizados so baseados na gerao de uma onda de choque com suficiente quantidade de energia que permita o deslocamento de uma membrana, sendo que os microprojectis esto cobertos de DNA. Essa onda de choque pode ser provocada por uma exploso qumica, numa descarga de Hlio a alta presso ou na vaporizao de uma gota de gua atravs de uma descarga elctrica. O procedimento, simplificado, consiste na entrada (no letal) dos microprojectis na clula atravs da membrana celular, e da dissociao do DNA por aco do citoplasma. O gene exgeno acaba por ser integrado no genoma do organismo. Este processo tem a vantagem de poder ser utilizado em qualquer tipo de clula.

Figura 1. Representao de bombardeamento da clula com DNA, atravs de um acelerador de partculas.

A recorrncia Agrobacterium tumefaciens deve-se capacidade desta bactria de transferir parte do seu contedo gentico para clulas vegetais atravs de Plasmdeos (pores de DNA circular que se reproduzem independentemente e no so essenciais sobrevivncia da bactria). Colocam-se as bactrias em contacto com cortes nas superfcies de folhas, por exemplo, de forma a que estas clulas vegetais incorporem o gene de interesse (transgene) atravs dos plasmdeos. So, ento, exterminadas as bactrias atravs de antibiticos. As clulas vegetais modificadas dividem-se descontroladamente, como se de um tumor se tratasse. Essa massa celular removida e cultivada sob controlo de forma a dar origem a uma nova planta, adulta e com as caractersticas desejadas (devido expresso do gene de interesse).

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Figura 2. Representao de duas tcnicas utilizadas na produo de alimentos transgnicos: recorrendo Agrobacteria e recorrendo a microprojectis.

Figura 3. Agrobacterium tumefaciens

Figura 4. Deformao de caule vegetal por aco da Agrobacterium tumefaciens

A Electroporao consiste na criao de poros artificialmente, recorrendo corrente elctrica. As clulas so expostas a um campo elctrico que polariza as regies hidroflicas dos fosfolpidos constituintes das membranas citoplasmticas, casando repulso entre eles. Esta repulso provoca a abertura de poros entre os fosfolpidos, sendo assim introduzido o DNA exgeno. So utilizados protoplastos (clulas s quais se extraiu a parede celular atravs de enzimas), devido a uma maior permeabilidade. Estes so colocados numa soluo juntamente com o DNA exgeno. A Electroporao pode ser aplicada s clulas vegetais em geral, no entanto, o seu sucesso depende da compatibilidade entre a bactria e a clula-alvo.

Figura 6. Representao da entrada de substncias exgenas atravs dos poros criados artificialmente na membrana da clula.

Figura 5. Representao do efeito da Electroporao na Bicamada Fosfolipdica membranar.

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5|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida A Biotecnologia tem vindo a evoluir e a transformar o meio em que vivemos. A mudana nem sempre positiva, e por isso existem vantagens e desvantagens na criao de plantas genticamente modificadas:

VANTAGENS
Possibilidade da utilizao de genes que no poderiam ser obtidos pela hibridao Possibilidade de introduo de um gene especfico sem a necessidade de cruzamentos e retro cruzamentos Possibilidade de diminuio do nmero de geraes e tempo necessrio para o desenvolvimento de um novo cultivo O produtor pode ser beneficiado com o uso de plantas transgnicas principalmente pela diminuio do custo de produo e do uso de agro txicos Resistncia a insectos e pragas e doenas, o que leva a menores aplicaes de herbicidas Melhoria da qualidade dos alimento Colheitas mais abundantes Tolerncia a presses biticas e abiticas, que com o desenvolvimento de plantaes que possuam essa resistncia inata ao stress bitico ou abitico ajudariam a estabilizar a produo anual Uso de terras marginalizadas, visto que grandes reas de terra em todo o mundo, seja nas costas, seja nas reas internas, tm sido marginalizadas por causa de salinidade e alcalinidade excessivas

DESVANTAGENS
As tcnicas de transformao genticas s tm a capacidade de introduzir um ou pouco genes lterao na expresso de outros genes da planta Limitada capacidade de regenerao das espcies Elevao do custo das sementes Aumento da vulnerabilidade gentica Diminuio da diversidade em cultivo Aparecimento muito rpido de indivduos resistentes a insectos e pragas Aparecimento de alergias em pessoas susceptveis Aumento da populao de pragas e micro organismos resistentes e/ou patognicos Aumento ou promoo de plantas daninhas resistentes a herbicidas Diminuio da diversidade em cultivo Contaminao de variedades crioulas mantidas pelos agricultores Dependncia dos agricultores a poucas empresas produtoras de sementes Contaminao de produtos naturais como o mel

Produo de vacinas, anticorpos, protenas e produtos farmacuticos derivados de plantas transgnicas so de mais fcil acesso produo e baixo custo

Produtividade e incerteza dos preos dos produtos transgnicos Potencializao dos efeitos de substncias txicas, visto que muitas plantas possuem substncias txicas naturais para se defenderem e quando so manipulados geneticamente, os nveis dessas toxinas podem aumentar

Tabela 1-Vantagens e Desvantagens dos Alimentos Transgnicos Fonte: http://manipulacaogenetica12g.blogspot.com/2010/03/pros-e-contras-das-plantas-transgenicas.html

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6|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida Enquanto que nos outros pases as pesquisas no campo dos OGM comearam nas dcadas de 70, em Portugal, os primeiros projectos de investigao sobre Organismos Geneticamente Modificados foram em finais da dcada de 80. A prpria populao portuguesa est relativamente mal informada, comparada com os restantes pases da Unio Europeia (Fig.7). de notar que o nico pas com valores abaixo de Portugal Malta, e em Malta no existe cultivo de alimentos transgnicos (da ser aceitvel que a discussso e controversia do tema seja muito menos abordada).

Figura 7. Grfico ilustrativo da percentagem de populao que ouviu falar em transgnicos nos diferentes pases.

As implicaes da Engenharia Gentica na Sade, Economia, Ambiente e a at na tica so incontveis. Isto deve-se, em grande parte, ao facto de ainda no serem conhecidos os efeitos que trar a longo prazo. A ignorncia da populao relativamente ao assunto , tambm, um factor contra a investigao destas tcnicas.

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Extraco de DNA
Para a determinao de um alimento como transgnico ou no ser necessrio o estudo do seu contedo gentico. Assim, necessria a extraco do DNA de uma das suas clulas (j que todas elas possuem o genoma completo do indivduo) para posterior anlise, por exemplo, atravs de Electroforese. Socorre-se muitas vezes da Electroforese por ser um mtodo simples e muito eficiente na separao e de DNA, e consequentemente a identificar e purificar fragmentos desta molcula. Este processo separa as molculas ionizadas a partir da sua composio, como a carga elctrica e o peso molecular. As molculas de carga negativa migram para o plo positivo. J as molculas de carga positiva migram para o plo negativo. a esta migrao de cargas, quando submetidas a uma diferena de potencial, que se d o nome de Electroforese. Esta tcnica ser aprofundada posteriormente. Na generalidade, a extraco do DNA de clulas vegetais serve para a utilizao deste cido Nucleico como substractos da reaco de PCR, para estudos filogenticos, por exemplo. Independentemente do fim a que se destina a extraco, as preparaes de DNA devem produzir amostras suficientes para que no haja interferncias com os padres de migrao no gel de Electroforese. H alguns aspectos a ter em conta com o objectivo de obter o menor nmero de erros possvel nos resultados. 1. Independentemente do procedimento a seguir, necessrio quebrar a parede celular das clulas vegetais. Isto possvel atravs da macerao do mesmo com o auxlio de um almofariz. 2. necessrio ter ateno o aprisionamento dos cofactores (substncias activadoras das enzimas), para que a aco das DNAses (enzimas que degradam o DNA) no sejam estimuladas 3. recorrente uma incubao a temperaturas elevadas que visa o desarranjo dos fosfolipdios das membranas celulares da clula. 4. Finalmente, ser necessria a precipitao dos resduos celulares. J que a molcula de DNA menos densa que a gua, bem como que os resduos celulares, uma simples centrifugao far com que o DNA fique sobrenadante, sendo alcanado com uma pipetao do mesmo.

PCR

Figura 8. Microtubo

A PCR (Polymerase Chain Reaction) uma tcnica extremamente importante na biotecnologia molecular, j que se trata de um mtodo que possibilita a sntese de uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Kary Mullis foi quem desenvolveu esta tcnica, tendo ganho o prmio Nobel da Qumica, em 1993, devido a esta descoberta. Esta tcnica inovou e permitiu um avano em vrias reas cientficas como o o caso do diagnstico de patologias, medicina forense e investigao em Biologia. O principal fundamento da PCR o processo de replicao do DNA. Assim sendo, necessrio desnaturar a molcula de DNA de forma a que esta se divida em duas cadeias simples, permitindo a ligao dos Primers (oligonucletidos iniciadores) por complementaridade de bases. So necessarios dois Primers complementares das sequncias para que estes marquem e protejam o segmento de interesse nos seus terminais 3, s assim permitida a aco da DNA polimerase, que sintetiza a cadeia complementar, baseando-se na cadeia simples da molcula de DNA original. A este processo chama-se amplificao.

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8|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida Para executar a tcnica de PCR so precisos constituintes especficos: segmento de DNA alvo, DNA polimerase, Primers, os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Aps todos os constituintes reunidos d-se incio aos ciclos de amplificao: 1. Desnaturao da molcula de DNA alvo atravs de energia na forma de calor (1 minuto a 94 o-96oC) para que a molcula em dupla hlice se divida em duas cadeias simples. 2. Arrefecimento da mistura de reaco (1 minuto a 50o-65oC), para que os Primers estabeleam ligaes de hidrognio com as cadeias de DNA simples. 3. Incio da extenso dos Primers atravs da sntese da cadeia complementar de ambas as cadeias simples. Esta reaco catalisada pela enzima DNA polimerase (1 minuto a 72oC). Este processo, que inclui estes trs passos, pode ser repetido de 25 a 30 ciclos (Fig. 9), aumentando, a cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente. Teoricamente, se forem completos 25 ciclos de amplificao, a concentrao de DNA aumentaria 225 vezes. No entanto, na prtica esse aumento fica por 1 milho de vezes, devido a alguma ineficincia no processo.

Figura 9. Processo de amplificao de DNA atravs da tcnica de PCR.

Devido ao grande nmero possvel de ciclos da tcnica de PCR foi desenvolvido equipamento especfico que permite a programao, de forma contnua, dos vrios ciclos de aquecimento/arrefecimento. Sendo que as enzimas so protenas muito sensveis temperatura, logo, para esta programao ser possvel, necessrio utilizar DNA polimerases termoestveis. Isto foi conseguido atravs do isolamento da DNA polimerase da estirpe Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas, tornando o processo de amplificao mais eficaz. O produto de PCR pode ser observado atravs da Electroforese, podendo ainda descobrir-se o tamanho estimado atravs da comparao com padres lineares de DNA.

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Electroforese
O processo de Electroforese, ou Separao Electrofortica consiste em provocar a migrao de molculas com carga aplicando um campo elctrico. frequentemente utilizado em Bioqumica e em Biologia Molecular (separao de compostos com carga elctrica como aminocidos, cidos nucleicos, protenas, entre outros) com o objectivo de purificar macromolculas, dependendo do seu tamanho, peso molecular, carga ou conformao. necessrio ter em conta que a carga das substncias a separar depende do pH do meio em que so inseridas. Sendo assim, as molculas mover-se-o na direco oposta do campo elctrico, dependendo se so positiva ou negativamente carregadas. Existem vrios tipos de Electroforese que se dividem em dois grandes grupos: Electroforese Livre e Electroforese de Zona. A Electroforese Livre foi introduzida por Tiselius no ano de 1937, e consiste na introduo da substncia que se pretende separar num tubo em forma de U, dissolvida num tampo de pH* adequado. estabelecido um limite entre a soluo proteica e o tampo electrofortico. Ao ser aplicada a corrente elctrica, a frente proteica desloca-se devido aco do campo. Pode ser observada a movimentao da frente por observao luz Ultravioleta.
*

A Electroforese de Zona tornou-se possvel entre 1945 e 1955 devido introduo de suportes inertes que permitiam evitar as correntes de conveco produzidas pelo aquecimento (na Electroforese Livre). Este avano permitiu ainda a aplicao da amostra em bandas finas, originando separaes mais ntidas. A Electroforese de Zona divide-se em trs tipos: Electroforese em Papel, Electroforese em Acetato de Celulose, Electroforese em Gel e Electroforese de Disco. Em experincias prticas laboratoriais utiliza-se, frequentemente o terceiro tipo, que consiste na utilizao do Gel como suporte. A introduo dos gis de amido e poliacrilamida na Electroforese de Zona foi um importante avano, j que estes no so apenas meros suportes. Permitem uma separao, no apenas pela diferena de potencial, mas tambm por diferena de tamanho e peso, devido sua porosidade selectiva. Com esta tcnica podem determinar-se pesos moleculares com uma preciso de, aproximadamente, 10 por 100. Relativamente aos cidos Nucleicos (carregados negativamente devido ao seu grupo fostato, quando o pH neutro), a Electroforese comummente executada em gel de agarose ou poliacrilamida. O gel mais utilizado o gel de agarose devido ausncia de toxicidade deste. Assim, os fragmentos nucleicos migram em direco ao plo positivo do campo elctrico. Os gis de poliacrilamida, apesar de permitirem uma maior resoluo, tm uma menor gama de separao e por isso so mais utilizados em separaes e caracterizaes de misturas de protenas. A resistncia viscosa do meio (gel de Agarose) ope-se fora do campo elctrico. Isto permite que quando ambas as foras se igualam dem origem a uma velocidade constante de partculas. A velocidade de migrao constante e depende do equilbrio de foras e do retardamento por atrito entre a amostra e o meio circundante.

Figura 10. Marcador de Peso Molecular

Soluo Tampo - soluo que atenua a variao do valor de pH, mantendo-o aproximadamente constante, independentemente da adio de cidos ou bases.

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10|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida Assim sendo, obtm-se o valor da velocidade das partculas atravs da frmula:

Voltando ao caso particular dos cidos Nucleicos, a electroforese realizada em gel de agarose que forma uma matriz porosa (o tamanho do poros controlvel) atravs da qual estas biomolculas migram dependendo a velocidade dessa migrao, neste caso, principalmente da sua massa e conformao. Outro factor que influencia esta velocidade a composio nucleotdica das molculas, da concentrao da matriz de agarose, do campo elctrico aplicado (V/cm) e da composio do tampo utilizado no processo. Devido sua porosidade, o gel de agarose funcionar como uma rede selectiva dependendo do tamanho das molculas. Sendo assim, os cidos Nucleicos migram para o plo positivo, sendo que molculas mais pequenas migram por maiores distncias que molculas de maiores dimenses. Preparado todo o processo, inicia-se a Electroforese. So aplicados no poos as amostras e o padro de pesos moleculares, a aplicao do campo elctrico consegue-se atravs de dois elctrodos que esto paralelos fileira de poos. Concludo o processo, necessrio imergir o gel de agarose numa soluo de Brometo de Etdeo, pois para alm deste composto se intercalar entre as bases de cadeia dupla do DNA, um corante fluorescente e quando observado luz Ultravioleta permite ver as marcas do DNA no gel. , assim, possvel a deteco das biomolculas a serem testadas os cidos Nucleicos que, comparandos ao padro de pesos, possibilita a determinao do seu peso molecular.
Figura 11. Esquema Representativo da Electroforese

Conhecendo os padres de peso molecular, em bp*, (Fig. 10), comparam-se as distncias percorridas pelos fragmentos, sendo possvel estimar o peso molecular de cada um dos fragmentos.
*

bp Unidade utilizada como marcador do peso molecular.

A Electroforese tem um vasto campo de utilizao principalmente no que toca Engenharia Gentica e Gentica Clnica e Forense. bastante utilizada em processos to comuns como a identificao de pessoas atravs de teste de paternidade, a identificao de criminosos, na indstria Farmacutica (vacinas, reagentes) e na Agropecuria como o caso dos Animais e Plantas transgnicos.

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Figura 12. Esquema Representativo das Foras actuantes no processo de Electroforese.

Material e Reagentes1
Soluo de DNA Geneticamente Modificada InstaGeneTMmatrix Microtubo Bloco Trmico Centrifugadora Tubos de PCR MasterMix Plant PSII primers MasterMix GMO primers Micropipetas Termociclador Agarose Tampo TBE Tina de Electroforese Corante Fast Blast DNA Stain(100x)

1- A lista de Material referente apenas experincia que englobava o Controlo Positivo.

Mtodo/Procedimento
A Actividade Laboratorial Rastreio de Transgnicos teve o objectivo de dar a conhecer um pouco mais sobre transgnicos, tema bastante actual e presente nos dias de hoje. Com esta Actividade seria possvel testar o DNA de trs alimentos com o objectivo de descobrir se eram OGM. Elaboraram-se, ento, as seguintes hipteses: Todos os alimentos e os controlos tm de ter presentes o primer PS2 (Fotossistema II).

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12|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida Os alimentos que forem OGMs tero a marca correspondente aos primers CAM 35S, bem como o controlo positivo. Sendo o PS2 o constituinte com maior nmero de pb (pares de base), este corresponder marca mais prxima do plo negativo. 1.Micropipetao de 500l de InstaGeneTMmatrix ao microtubo e colocao do mesmo no suporte. 2.Micropipetao de 50l de Soluo de DNA Geneticamente Modificado para o mesmo microtubo. 3.Identificao do microtubo com o smbolo + (=positivo). 4.Agitao do microtubo 5.Incubao do mesmo no Bloco Trmico a 95oC durante 1 minuto. 6.Centrifugao dos microtubos durante 2 minutos a 13 000 rpm. 7.Insero de 20l de MasterMix Plant PSII primers num tubo de PCR e 20l de MasterMix GMO primers. 8.Transferncia de 20l de sobrenadante para cada tubo de PCR. 9.Colocao dos microtubos de PCR no Termociclador durante 3.30h a 4h. 10.Preparao do Gel de Agarose a 2% 11.Colocao do Gel na tina de Electroforese. 12.Carregar as amostras. 13.Ligar a fonte de alimentao da Tina de Electroforese. 14.Programao da fonte para 100V durante 40min. 15.Desligar a fonte de alimentao e proceder colorao do gel de agarose com o Corante. 16. Observao e Interpretao dos resultados.

Resultados

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Discusso
Uma vez concluda a experincia, observaram-se os resultados. Como se esperava, todas as amostras apresentaram a marca relativa sequncia amplificada com a utilizao do primer PS2 (Fotossistema II), j que todas consistiam em DNA de clulas vegetais. O primer CAM 35S apenas se verificaram presentes no controlo positivo (o qual se tinha a certeza de ser OGM, facto que foi confirmado pelos prprios resultados), e no teste 2, o DNA proveniente da soja, o que permite concluir que apenas esse alimento, de todos os que foram testados, OGM positivo. Tanto o tomate como o milho verificaram-se OGM negativos. Terminadas as concluses sobre as hipteses explicativas proposta passa-se, ento, anlise e compreenso de todo o protocolo experimental. Foram utilizados trs alimentos teste. A razo pela qual esses trs alimentos foram o Milho, a Soja e o Tomate a frequncia da sua utilizao na produo de transgnicos. No entanto, no caso estudado apenas a Soja se identificou como OGM positivo. Para o teste do genoma destes organismos foi necessria a extraco do DNA das mesmas. usado, no incio da experincia, o InstaGeneTMmatrix, que aprisiona os cofactores de maneira a que estes no activem as enzimas responsveis pela degradao do DNA, as DNAses. A incubao do microtubo no bloco trmico tem como objectivo a degradao do invlucro nuclear das clulas para que a molcula de DNA possa ser libertada para o citoplasma. No entanto, sendo que a macerao dos elementos quebrou a parede celular e as membranas, o citoplasma j no se encontrava aprisionado. Assim, aps o rompimento da membrana nuclear, o DNA fica disperso na soluo e a extraco concluda e bem sucedida. Aps este processo centrifugou-se o microtubo de forma a que os resduos celulares (mais densos que a gua) precipitassem, o DNA fica, ento, suspenso. Da que para a recolha de uma amostra desta biomolcula apenas necessria uma pipetao do sobrenadante. Devido capacidade de programao do termociclador possvel deixar que este faa o processo de PCR sem qualquer monitorizao da parte do investigador. Tal como j foi descrito na tcnica de PCR, este vai aumentar as temperaturas e depois baix-las para partir as pontes de hidrognio fazendo, assim, com que os primers se possam ligar s cadeias simples de DNA. Assim, a tcnica de PCR pode fazer-se correctamente e com muito menos erros. Utilizaram-se dois tipos de primers, um identificado com corante vermelho e outro identificado com corante verde. O primeiro identifica as sequncias do promotor CAM 35S e do terminador NOS, sequncias essas que apenas se encontram presentes em alimentos transgnicos. Ou seja, se ao adicionar o primer vermelho este identificar essas sequncias significa que a amostra da qual se retirou o DNA OGM positiva. No entanto, apenas se pode ter 95% de certeza, j que os restantes 5% dos OGM podem no ter estes promotores e terminadores. Os primers identificados a verde identificam a sequncia promotora PS2 (Fotossistema II). Esta sequncia encontra-se em todas as clulas vegetais, servindo de controlo para que haja a certeza de que o DNA foi correctamente extrado e se encontra na amostra. Assim, todas as amostras (1, 2, 3, controlo positivo e negativo) tm de ter, no gel de agarose, uma marca correspondente ao promotor PS2. Sendo que este promotor tem mais pares de base que o CAM 35S a sua migrao mais lenta, ficando a marca relativa a este mais perto do plo negativo que do positivo. Na experincia laboratorial em causa, em todas as amostras se identificou a marca mais prxima do plo negativo, correspondente a PS2. No entanto, apenas a soja e o controlo positivo tm a marca relativa a CAM 35S e NOS. Conclumos que apenas a soja OGM positivo de entre os trs alimentos testados.

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14|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida Depois da tcnica de PCR recorre-se Electroforese para a obteno de resultados interpretveis. A preparao da tina. Preparou-se o gel de agarose com uma concentrao de 2% (V/V) na soluo-tampo TBE. Foi necessria a utilizao de um pente para criar os poos onde se colocaram as amostras de sobrenadante. A ligao da corrente elctrica permite uma diferena de potencial que provoca a migrao do DNA no sentido do plo negativo para o positivo, j que esta molcula tem carga negativa devido ao grupo fosfato. Seguidamente necessria a colorao do gel de agarose para que seja possvel a visualizao das marcas da migrao da molcula de DNA.

Figura 13. Estrutura da molcula de DNA (Grupo Fosfato de carga negativa)

Concluso
O presente documento tinha como objectivo a descrio da Actividade Prtica Laboratorial Rastreio de Transgnicos, realizada no mbito da disciplina de Biologia de 12o ano. Esse objectivo foi concludo, e a elaborao deste paper cientfico permitiu a construo e sedimentao de conhecimentos associados no s gentica como cincia que estuda a biomolcula responsvel pela hereditariedade, mas tambm como meio para atingir um fim h muito procurado pelo ser humano como o controlo das caractersticas alimentares. A elaborao deste mesmo documento permitiu alargar os nossos horizontes e ter uma melhor percepo do funcionamento, no s de como se identificam Organismos Geneticamente Modificados (OGM), mas tambm a experimentao das regras, material e tipo de procedimentos que so requeridos num laboratrio, o que ser um trunfo se o futuro exigir trabalho num espao destes. Possibilitou tambm adquirir novos conhecimentos que nos ajudaram na percepo da matria leccionada, j que as componentes prtica e terica do mtodo cientfico so complementares e dependentes uma da outra. Apesar do tempo que certos procedimentos requeriam impossibilitarem a sua observao em tempo real, esta limitao no privou o conhecimento e a aprendizagem de como fazer e que resultado obter, isto a explicao destes mesmos passos era muito esclarecedora e permitia a construo de um maior conhecimento sobre estes processos. Assim, terminada esta actividade laboratorial o produto final consiste em vrias aplicaes, como por exemplo, a entrega de um relatrio que nos permite investigar e aprofundar cada parte da actividade e um consequente enriquecimento das componentes prticas laboratoriais dos alunos.

Biologia 12o ano | Cincias e Tecnologias | 2010/2011

15|Escola Secundria Dr. Manuel Gomes de Almeida

Agradecimentos
Agradecemos ao Laboratrio Aberto do IPATIMUP por se ter disponibilizado e possibilitado uma aula laboratorial to interessante, que no seria possvel em meio escolar, e, ainda, ao professor Manuel Leite que se disponibilizou para nos acompanhar durante a visita.

Referncias
Fialho, A., Moreira, L., Leito, J., S-Correia, I., Protocolos das Aulas Laboratorias de Bioqumica e Biologia Molecular, 1 Semestre, Instituto Superior Tcnico, 2010/2011 http://www.e-escola.pt www.laboratorioaberto.pt/actividades_L.php#transgenicos www.cientic.com/portal/index.php?view=article&catid=42%3Amaterial-genetico&id=66%3Apcr-eelectroforese-em-gel&option=com_content&Itemid=112 http://www.dbio.uevora.pt http://www.mn.uio.no/bio/tjenester/kunnskap/plantefys/ http://www.science.leidenuniv.nl http://www.bio-rad.com http://www.ag.ndsu.edu/pubs/plantsci/crops/a1219w.htm http://www.advicemaster.com.br/website/conteudo.asp?cod=1302&idi=1&id_website_categoria_conteudo =2628 http://manipulacaogenetica12g.blogspot.com/2010/03/metodos-de-transformacao.html http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio09/extracao.pdf http://www.molecularstation.com/pt/protocol-links/DNA-Protocols/DNA-Extraction-Protocols/

Protocolo fornecido pelo La IPATIMUP

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