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possono avvenire fenomeni diversi : assorbimento fluorescenza o fosforescenza (assorbimento e riemissione) reazioni fotochimiche (assorbimento e trasformazioni chimiche) riflessione diffusione
Lo spettro elettromagnetico nel vuoto costituito da onde di varia e ,in movimento con la stessa velocit c ( 300.000 Km /sec) pertanto la frequenza e la lunghezza d'onda non sono indipendenti, ma sono legate tra loro attraverso la velocit dell'onda:
c=x
e quindi
=c/
=c/
E = h x
ossia la sua frequenza per la costante di Plank (h = 6.6 x10-27 erg /sec) quindi lenergia di una radiazione elettromagnetica inversamente proporzionale alla sua lunghezza donda
E = h x c/
Lassorbimento di una radiazione porta un atomo o una molecola ad un livello energetico superiore. Radiazioni elettromagnetiche di diversa lunghezza donda ed energia interagiscono con la materia provocando transizioni energetiche a livelli diversi di struttura
Quando un atomo o una molecola assorbono una radiazione UV o visibile gli elettroni esterni passano da uno stato fondamentale (E0) ad uno stato eccitato (E1)
Livelli energetici di un atomo (sodio) Livelli energetici molecolari
questa transizione si verifica quando latomo di sodio assorbe una radiazione di = 589 nm
lo spettro di assorbimento un grafico che definisce il tipo e la quantit delle radiazioni elettromagnetiche assorbite da un atomo o da una molecola: riporta in ascisse le assorbite ed in ordinata una misura dellassorbimento.
Per un atomo SPETTRO A RIGHE Per una molecola SPETTRO A BANDE
LA FOTOMETRIA MISURA LA QUANTIT DI LUCE ASSORBITA DA MOLECOLE IN SOLUZIONE Le sostanze colorate assorbono luce visibile Le sostanze incolori possono assorbire luce ultravioletta
La presenza di legami di tipo (insaturazione) e di doppietti elettronici liberi sono responsabili dellassorbimento nel UV/VIS
La della luce assorbita aumenta con laumentare del grado di delocalizzazione elettronica
MONOCROMATORE: dispositivo che permette di isolare fasci di luce monocromatica da luce policromatica
PRISMA RETICOLO DI DIFFRAZIONE
RETICOLO DI DIFFRAZIONE
superficie metallica riflettente sulla quale sono incisi numerosi tratti rettilinei equidistanti la luce incidente sul reticolo subisce il fenomeno della diffrazione e viene quindi deviata in diverse direzioni in funzione della distanza tra le incisioni e della lunghezza donda
CUVETTE
Sistema di rivelazione Cellula fotoelettrica IL fotone colpisce il catodo che ricoperto di una superficie metallica fotosensibile che emette elettroni
M0 + h M+ + e-
LA QUANTIT DI LUCE ASSORBITA [ASSORBANZA, A] DIPENDE DAL NUMERO DELLE MOLECOLE PRESENTI IN SOLUZIONE, e quindi dalla concentrazione della soluzione e dalla lunghezza del cammino ottico LEGGE DI LAMBERT - BEER
I0
A=klc
I
I0 luce incidente I0 I
I luce trasmessa I0
Variazione di c
variazione di l
A=klc
k=A/lc
k=A c = 1 M e l = 1 cm
In un fotometro non si misura direttamente lassorbanza, ma si ricava dalla misura delle radiazioni trasmesse, non assorbite LA TRASMITTANZA (T) LA FRAZIONE DI RADIAZIONE CHE ATTRAVERSA UN MEZZO ASSORBENTE data dal rapporto tra luce trasmessa (I) e luce incidente (I0)
T = I/I0
0 T 1
Variazioni della Assorbanza e della Trasmissione in funzione della concentrazione della sostanza assorbente
Devo azzerare lapparecchio tarando la trasmissione al 100% su un Blank che contenga tutte le molecole diverse dal campione di interesse ma capaci di assorbire
S1 ed S2 in posizione a : alla fotocellula arriva il raggio che ha attraversato il Blank (R) S1 ed S2 in posizione b : alla fotocellula arriva il raggio che ha attraversato il campione (C)
Analisi qualitative
Lo spettro di assorbimento diverso da molecola a molecola e ne permette il riconoscimento
Assorbanza
Analisi quantitative
La legge di Beer valida per soluzioni diluite. Ad alte concentrazioni si osservano deviazioni positive (2) o negative (3)
Permette la determinazione della concentrazione di una sostanza in soluzione tramite il confronto della sua assorbanza con lassorbanza di una soluzione della stessa sostanza a concentrazione nota. Posso determinare la concentrazione anche dal valore del coefficiente di estinzione, se lo si conosce
Analisi quantitatitiva: Misura della concentrazione di molecole che assorbono la luce come le proteine e gli acidi nucleici Misura della concentrazione di molecole che non assorbono la luce, dopo derivatizzazione con un cromoforo o conversione chimica in un composto che assorbe la luce Studio delle cinetiche di reazione (cinetica enzimatica)
i nucleotidi e gli acidi nucleici assorbono a 260 nm La denaturazione del DNA rende le basi pi accessibili e provoca un aumento della assorbanza a 260 nm. Questo effetto ipercromico pu essere utilizzato per seguire la denaturazione, valutando la frazione di DNA denaturato come incremento di assorbanza.