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Bioqumic Cincias - Biologia Roteiro da Aula Prtica Nro.

1. Ttulo: Uso do material de laboratrio e medidas de

segurana
Roteiro da Aula Prtica Nro. 2

1. Ttulo: Cur a de Titula!o


Roteiro da Aula Prtica Nro. "

Ttulo: #s$ectro%otometra
Roteiro da Aula Prtica Nro. &

1 . Ttulo: Cin'tica en(imtica


Roteiro da Aula Prtica Nro. )

1.

Ttulo:

#%eito da aria!o de $* na ati idade en(imtica


Roteiro da Aula Prtica Nro. +

1. Ttulo: ,umica de -licdios


Roteiro da Aula Prtica Nro. .

1 . Ttulo: Cadeia Res$iratria


Roteiro da Aula Prtica Nro. /

1 . Ttulo: ,umica de 0i$dios


Roteiro da Aula Prtica Nro. 1

1 . Ttulo: Cromatogra%ia

Bioqumic Cincias - Biologia Roteiro da Aula Prtica Nro. 1

1. Ttulo: Uso do material de laboratrio e medidas de

segurana
2. 2b3eti os: Aprender e reconhecer os diferentes materiais e instrumentais utilizados corriqueiramente no laboratrio.

". As$ectos Tericos:


3.1. Material de laboratrio Todo o material de laboratrio deve ser usado somente para o fim para o qual foi fabricado. 3.2. Instrumentos de volume fixo aquele que apresenta uma nica marca indicando o nvel a que deve chegar o contedo lquido para se obter um determinado volume fixo. 3.2.1. Bales volumtricos S o recipientes de vidro que permitem medir com precis o volumes fixos de lquidos. S o rigorosamente calibrados a determinada temperatura! n o podendo ser aquecidos ou submetidos a mudan"as bruscas de temperatura. #s bal$es volum%tricos s o utilizados para a prepara" o das solu"$es de reagentes em concentra"$es exatas! particularmente de solu"$es padr$es. #s bal$es volum%tricos est o calibrados para um volume exato de um lquido. #s bal$es n o devem ser usados para transferir volumes. 3.3. Instrumentos graduados S o os que apresentam uma escala que permite medir! al%m de um volume determinado! fra"$es deste volume. 3.3.1. Clices graduados S o instrumentos de volume de pouca precis o. Se utilizam !em geral! para preparar solu"$es de concentra" o aproximada ou para obter rapidamente uma primeira aproxima" o da medida que logo ser& a'ustada. 3.3.2. rovetas graduadas S o instrumentos de medida volum%trica de pouca precis o! mas permitem uma aproxima" o maior que a do c&lice! '& que! por sua forma! uma varia" o de volume de seu contedo! pode ser apreciado por um maior desnvel. Serve! portanto! para fazer medidas r&pidas de volumes. (xistem provetas graduadas desde )ml at% v&rios litros! as provetas poder o ter rolhas esmerilhadas ou ser aberta em bico para vaz o.

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3.3.3. i!etas 3.3.3.1. i!etas de vidro *entre deste tipo de pipetas devemos diferenciar entre as pipetas volum%tricas e as pipetas graduadas. As primeiras permitem pipetar um volume nico de lquido! em tanto que as pipetas graduadas permitem a pipetagem de diferentes volumes. Ainda deve ser reconhecida uma diferen"a importante+ as pipetas ,se'a de um tipo ou de outro- possuem uma o duas listras no extremo superior. A exist.ncia de duas listras significa que quando o liquido % despe'ado! o que restar dentro da pipeta n o deve ser extrado ,ou soprado-. # caso contr&rio acontece 'ustamente com as pipetas que possuem uma listra. importante neste ponto considerar que diferentes tipos de solu"$es podem ter distintas viscosidade e/ou tens o superficial! com o qual um especial cuidado deve ser tomado quando se pipeta um lquido viscoso com uma pipeta de duas listras. Se o liquido % despe'ado muito rapidamente! a tend.ncia ser& a que fique maior quantidade deste lquido no interior da pipeta! com o qual o volume pipetado 4#R5 6#N2R A2 7A02R N268NA0 . 0ma pipetagem pr%via do lquido % aconselh&vel para minimizar problemas de tens o superficial. 86P2RTANT#+ Sempre que pipetar &cidos ou bases fortes ,ou qualquer outro lquido que se'a corrosivo-! evitar de colocar a pipeta na boca. #S 12ST304(2T#S *( 5#604( 718# S9# *( 4A1#3 :3(;1S9# <0( #S =3A*0A*#S ( (ST9# ;A61>3A*#S :A3A A 4(*1*A *# 6?<01*# (4 04A T(4:(3AT03A *(T(3412A*A.

3.3.3.2. i!etas automticas As pipetas autom&ticas tem como vantagem a rapidez de uso. ;uidados especiais! por%m! devem ser considerados. Toda pipeta autom&tica tem dos est&gios no seu .mbolo. 2o momento de sugar o lquido! o .mbolo deve ser colocado no primeiro est&gio. :ara expulsar o lquido das ponteiras! o .mbolo tem que ser levado ao segundo est&gio. 5&rios pontos devem ser

cuidadosamente verificados+

a. 2unca sugar um lquido ou solu" o colocando o .mbolo no segundo est&gio. Se for assim! o volume pipetado seria maior do que o valor nominal. b. <uando selecionar o volume! verificar que o volume escolhido este'a dentro da baixa de volumes da pipeta autom&tica a ser utilizada. #u se'a! se por exemplo uma pipeta tem uma faixa de volumes que vai de @AA a BAAA l! sob nenhuma circunstCncia deve ser pipetado um volume de Dpor exemploE BBAA l. 2a verdade! a elei" o da pipeta adequada depende do volume que se dese'a pipetar e da faixa de volumes na qual cada pipeta trabalha. (xemplo+ num laboratrio tem @ pipetas autom&ticas. A pipeta A! tem uma faixa de volumes de BA a FA l e a pipeta 9 tem uma faixa de volumes de @A a BAA l ,:igura 1a-. Se fosse necess&rio pipetar

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FA l! a escolha certa seria a pipeta 9! devido a que o volume dese'a n o fica num dos extremos da faixa de trabalho da pipeta. c. (speciais cuidados devem ser levados em considera" o quando a solu" o que se quer pipetar % c&ustica ,um &cido ou uma base forte! por exemplo-. 2este caso qualquer gota do liquido ,ou ainda o vapor do composto- que fique dentro da pipeta pode danificar seriamente o instrumental. 0ma solu" o muito simples % colocar um peda"o de algod o dentro da ponteira! verificando que n o se'a atingida pelo lquido no momento de sugar. # algod o absorver& qualquer respingo que houver! impedindo que o lquido fique no interior da pipeta ,:igura 1b-.
;a<

FA l

@A E BAA l

5olume selecionado

7aixas de volumes que podem ser pipetados

:onteira

>ot o para selecionar o volume

;b<

FA l

@A E BAA l

:onteira 5olume selecionado 7aixas de volumes que podem ser pipetados

Algod o

>ot o para selecionar o volume

3.3.". #eci!iente n o volumtrico o material que se usa para conter lquidos durante a sua manipula" o mas n o % um instrumento de medida. (xemplos+ tubos de ensaio! becGers! erlenmeHer! etc.

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3.". $cnicas e medidas de seguran%a no laboratrio 3.".1. $cnicas de !i!etagem &!i!etas de vidro' B. seguraEse a pipeta entre o polegar e os I ltimos dedos da m o. @. ;olocaEse a pipeta no lquido,bem abaixo de sua superfcie- e aspiraE se cuidadosamente at% que a coluna do lquido este'a um pouco acima da marca superior, a aspira" o se faz comumente com a boca! no caso de lquidos vol&teis e/ou txicos! a mesma pode ser feita com p.ras de aspira" o-. I. 7echaEse a abertura com o dedo indicador e retiraEse a pipeta da solu" o. *eixando entrar um pouco de ar vagarosamente pela extremidade superior ,controlar com o dedo indicador-! permiteEse escorrer a coluna de lquido at% a coluna atingir a marca superior ,mantendo em posi" o vertical e a marca ao nvel dos olhos-. F. 3emoveEse ent o o lquido aderente a parede externe da pipeta por um papel absorvente. ). (m seguida! colocaEse a ponta da pipeta 'unto a parede interna do tubo receptor! deixando escoar lentamente o contedo da pipeta at% o nvel dese'ado. 2o escoamento completo % importante remover a ltima gota encostando a pipeta na parede do tubo. R#C26#N=A>?#4+ - Ao pipetar solu"$es cu'o frasco cont%m depsito de soluto! introduzir a pipeta no sobrenadante. - 2unca introduzir pipetas su'as nos frascos que contenham solu"$es ou reativos qumicos puros. - *eveEse sempre usar pipetas secas para n o diluir o lquido. 3.".2. ()uecimento 4uitos materiais s o constitudos de vidro especial que resiste ao aquecimento! mas deveEse ter alguns cuidados como+ 2unca deveEse aquecer um vidro vazio em chama direta. ;uidar que por acidente possa evaporar todo o contedo. Sempre que se aquece um lquido em um recipiente de vidro usar uma tela de amianto. #s tubos de ensaio podem ser aquecidos em banhoEmaria ou diretamente na chama do bico de g&s! cuidando para obter um aquecimento regular ao longo do tubo. (ste tubo dever& conter lquido abaixo da metade do seu volume total. :ara segura o tubo s o usados agarradores apropriados de madeira. # tubo deve ser conservado sobre constate agita" o a fim de evitar superEaquecimento localizado e consequentes esguichos do material. *urante o aquecimento! seguraEse o tubo num Cngulo de F) A ! tendo o cuidado de dirigir a boca do mesmo em dire" o adequada! a fim de evitar danos ou acidentes devido a esguichos. A chama do bico de g&s n o dever& ser amarela e luminosa! o que indicar& combust o incompleta e forma" o de fuligem! mas sim azul! para tal deve se aberta e regulada a entrada inferior de ar.

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1. Ttulo: Cur a de Titula!o 2. 2b3eti os: 3econhecer o efeito tamponante. 1dentificar a composi" o de uma solu" o tamp o. 3econhecer o significado de pGa de um &cido.

". As$ectos Tericos:


*e maneira gen%rica! ao adicionar &cido ou base J solu" o aquosa seu pK diminui ou se eleva respectivamente de forma significante. (ntretanto! ao adicionar &cido ou base Js solu"$es tamp$es estas resistem ou sofrem apenas pequenas varia"$es de pK! dentro de certos limites. (sta propriedade das solu"$es tamp$es % importante n o somente Lin vitroM mas tamb%m para a prpria sobreviv.ncia dos organismos vivos. :or exemplo o pK do sangue humano mant%m uma variabilidade mnima em torno de N!I) D N!F)! e valores pouco distantes dessa faixa de normalidade caracterizam um pK incompatvel com a vida.

&. Procedimento:
A1 D ;olocar em um >ecGer BAml de K @# destilada e com o auxlio de papel indicador determinar o valor do pK. (m seguida adicionar K;l D A!)4 em fra"$es de A!)ml! agitando e medindo o ph a cada adi" o anotando os valores conforme descrito na tabela abaixo.
5olume adicionado 5olume total pK K@# BAml BAml K;l A!)ml BA!)ml K;l A!)ml BBml K;l A!)ml BB!)ml K;l A!)ml B@ml K;l A!)ml B@!)ml

A2 D 3epetir AB! por%m utilizando 2a#K A!)4


5olume adicionado 5olume total pK K@# BAml BAml 2a#K A!)ml BA!)ml 2a#K A!)ml BBml 2a#K A!)ml BB!)ml 2a#K A!)ml B@ml 2a#K A!)ml B@!)ml

91 D ;olocar em um >ecGer BAml de solu" o tamp o acetato A!@4 e com o papel indicador medir o pK. Adicionar K;l A!)ml! agitando e medindo o pK a cada adi" o anotando os valores conforme descrito na tabela abaixo.

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5olume adicionado 5olume total pK

Tamp o Acetato BAml BAml

K;l A!)ml BA!)ml

K;l A!)ml BBml

K;l A!)ml BB!)ml

K;l A!)ml B@ml

K;l A!)ml B@!)ml

92 D 3epetir >B! por%m utilizando 2a#K A!)4


5olume adicionado 5olume total pK Tamp o Acetato BAml BAml 2a#K A!)ml BA!)ml 2a#K A!)ml BBml 2a#K A!)ml BB!)ml 2a#K A!)ml B@ml 2a#K A!)ml B@!)ml

). Resultados:
;ada aluno dever& construir um gr&fico em papel milimetrado colocando na abscissa as quantidades de K;l adicionadas em ordem decrescente e as de 2a#K em ordem crescente. 2a ordenada colocar os respectivos valores de pK. *ever o ser construdas duas curvas! uma referente ao item A e outra ao item >! no mesmo gr&fico. Analisando o gr&fico descrever o valor do pOa do &cido ac%tico. (m cada por" o da curva >,tamp o acetato- representar as formas predominantes do Pcido de >ronsted ,&cido ac%tico- e de sua base con'ugada , acetato -.

C26P248>@2 =A 420U>@2 TA6P@2 =# AC#TAT2

(m negrito as formas predominantes na solu" o quando em equilbrio.

CH3COOH CH3COONa H2O

H+ + CH3COONa+ + CH3COO -

(cido fraco. reac. 1) (base conjugada. reac. 2)

H+ + HO-

(reac. 3)

Ao adicionar K;l ,KQ- na solu" o tamp o! este on tende a se associar com o on acetato ,C*"C22A- produto da dissocia" o do acetato de sdio

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,rea" o @- formando &cido ac%tico ,rea" o B-. Assim o equilbrio % mantido! e mesmo com adi" o de KQ na solu" o este n o permanece livre e portanto o pK n o diminui. (sse equilbrio % mantido at% que n o exista mais acetato disponvel ,proveniente da dissocia" o do sal-. Ao adicionar 2a#K ,#K E- na solu" o tamp o! este on tende a se associar com o on KQ produto da dissocia" o do &cido ac%tico ,rea" o B- formando mol%culas de &gua ,rea" o I-. (ssa associa" o desloca a rea" o reversvel do &cido ac%tico para a direita! suprindo a demanda de K Q! e o pK n o % elevado. (sse equilbrio % mantido at% que n o exista mais on K Q disponvel ,proveniente da dissocia" o do &cido ac%tico-! a partir da o pK come"a a aumentar.

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Ttulo: #s$ectro%otometra 1. 2b3eti os: Treinamento na utiliza" o de t%cnicas espectrofotom%tricas. *etermina" o da concentra" o de protenas totais numa amostra biolgica.

2. Parte eB$erimental: 2.1. (s!ectos tericos


*iversas biomol%culas absorvem luz em comprimentos de onda , caractersticos por este motivo podemos usar um espectrofotRmetro para fazer medi"$es da capacidade de absor" o de luz. (ste m%todo % usado para+ 1dentifica" o de mol%culas o 4edir a concentra" o de solu"$es

0embremos alguns conceitos


# espectro eletromagn%tico

2a espectrofotometria vamos trabalhar na regi o ultravioleta e na regi o do visvel. ;ores complementares


amarelo laranja verde

vermelho violeta

azul

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:ara fazer uma determina" o em uma solu" o de cor azul terei que fazer incidir um feixe de luz cor laran'a ,cor complementaria do azul-! assim vou ganhar precis o na leitura. 1sto pode ser feito com um monocromador. # monocromador % utilizado para se obter uma luz monocrom&tica ,com uma nica banda espectral-. =eralmente os monocromadores n o conseguem isolar um nico comprimento de onda , -! eles isolam uma banda espectral que quanto menor se'a esta banda mais precis o vou obter. ;omo funciona um fotocolormetro e/ou em espectrofotRmetro

FOTOCOLORMETRO
7iltro colorido 6ente 1A 1
-al anEmetro AFGHG2)

1A 7onte de luz

-al anEmetro AFGHG2)

6Cmpada de tungst.nio! deut%rio ou mercrio

:risma 7enda

;ubeta 7otoc%lula com amostra

ESPECTROFOTMETRO
(stes equipamentos consistem basicamente em+ :2T2C202RC6#TR2 >ranca ,Tungst.nio7iltros coloridos Tubos fotoel%tricos =alvanRmetro ;ubeta #4P#CTR2:2TD6#TR2 >ranca ,Tungst.nio-T deut%rioT mercrio :risma e fenda 7ototubos =alvanRmetro ;ubeta

7#2T( *( 60S 4#2#;3#4A*#3 4(*1U9# *A 12T(2;1*A*( *A 60S 3(;1:1(2T( :A3A S#60U9#

A absor" o de radia"$es eletromagn%ticas obedece aos seguintes dois princpios+ B- A rela" o entre a luz absorvida e o nmero de mol%culas de soluto numa solu" o ,concentra" o- % exponencial. @- A absor" o de luz relacionaEse exponencialmente com o comprimento da distCncia que a luz percorre atrav%s da amostra

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(stes dos princpios foram integrados na 0ei de 0ambertA9eer+


0ei de 0ambertA9eer. Absor!o de lu( $elas mol'culas. log I0IIF cl onde! I* % a intensidade da luz incidenteT I % a intensidade da luz transmitidaT % o coeficiente de extin" o molar ,em unidades litro por molEcentmetro-T c % a concentra" o da solu" o a ser analisada ,moles/litro-T l % a largura da cubeta ,em centmetros-. A 6ei de 6ambertE>eer assume que a luz incidente % paralela e monocrom&tica e que a distribui" o das mol%culas na solu" o % ao acaso. A express o log I*/I % chamada de absorbJncia ,extin" o ou densidade tica- % se designa com a letra A! ficando ent o AF cl # coeficiente de extin" o molar % caracterstico de cada substancia sobre uma serie de condi"$es definidas tais como comprimento de onda! solvente e temperatura.

L<uando uma faixa de luz monocrom&tica atravessa uma solu" o colorida! a quantidade de luz absorvida % diretamente proporcional J concentra" o da solu" o colorida e J espessura da camada atravessada.M # espectrofotRmetro informa quanta luz foi transmitida ,T- ou quanta luz foi absorvida ,A-. Sendo T a percentagem de radia" o que atravessa uma solu" o homog.nea. A escala de transmitCncia % decimal e vai de A a BAAV e a de absor" o % logartmica e vai de A a @. A absorbCncia ,A- tem a vantagem de que varia em forma linear com a concentra" o da amostra. ;omo a absorbCncia % a quantidade de luz que uma solu" o absorve e a transmitCncia % a quantidade de luz que uma solu" o deixa passar! ou se'a n o absorve! % lgico que as duas escalas s o inversamente proporcionais. # que fa"o se a mol%cula que quero dosar n o tem corW B- :ode se transformar a biomol%cula em um composto corado por liga"$es especficas com um corante ,ex. m%todo de >iureto para dosar protenas-. @- :oso usar radia" o da regi o 05 4(T#*# *( >103(T# X um m%todo para a determina" o de protenas totais. 2este m%todo os ons cobre em meio alcalino ,reagente de >iureto- reagem com as liga"$es peptdicas das protenas formando uma cor prpura! que tem absorbCncia m&xima em )F) nm! proporcional a concentra" o das protenas na amostra. ;#4# #>T(3 A ;#2;(2T3AU9# *A A4#ST3AW #btida a absorbCncia no aparelho! podeEse obter o valor da concentra" o da amostra atrav%s da frmula+ ;Y A/ l. K& duas maneiras de se fazer a an&lise colorim%trica+ :elo m%todo gr&fico ou ;urva :adr o :elo m%todo matem&tico ou 7ator de ;alibra" o

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4T#*# =3P71;# #0 ;035A :A*39# :reparamEse alguns padr$es de concentra"$es conhecidas e fazEse a leitura das abs ;olocaEse os dados de concentra"$es no eixo das abcissas e os valores de abs no eixo das ordenadas! em um gr&fico feito em papel milimetrado! unindoEse os pontos obtidos temos a ;urva :adr o dessa substCncia. Se a substCncia segue exatamente a 6ei de 6ambertE>eer! a curva % uma reta de F)Z que passa pela origem e s o necess&rios poucos marcadores para sua elabora" o. <uando a substCncia n o segue exatamente a 6ei de 6ambertE>eer! obtemEse uma curva qualquer e s o necess&rios muitos marcadores para sua elabora" o.

". Procedimentos:
3.1 Constru%+o de uma Curva adr+o 0tilizando albumina bovina como protena de refer.ncia! ser o feitas solu"$es de concentra" o de [AT FAT @A e BA mg/ml. ;om esse intuito! ser& feito B ml de uma solu" o de [A mg de albumina bovina. As seguintes concentra"$es ser o feitas diluindo J metade a solu" o de concentra" o imediatamente superior. 3.2 ,etermina%+o da concentra%+o de !rote-nas totais. #s seguintes passos devem ser seguidos+ B. Tomar \ tubos de ensaio e marcaElos B! @! I! F! Am e > e preench.E losde acordo com o seguinte esquema+ 8m$ortante+ esta solu" o % c&ustica! logo deve existir cuidado na manipula" o.
Tubos ensaio marcados Pgua destilada Solu" o :adr o :rotena Amostra 3eagente >iureto de B @ I F Amostra [Amg/ml FAmg/ml @A mg/ml BA mg/ml Am >ranco > 0ma gota de 0ma gota 0ma gota 0ma gota 0ma gota 0ma gota de B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml

8m$ortante+ o 3eagente de >iureto % uma solu" o c&ustica! logo deve existir cuidado na manipula" o. *evido ao pequeno volume! esta pipetagem tem que ser realizada cuidadosamente.
3.3. *eixar incubar B) minutos a IN A;! para dar tempo J forma" o do complexo colorido.

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3.". :assar o contedo dos tubos para cubetas pl&sticas. 6er no espectrofotRmetro a )FA nm. Tendo como refer.ncia o tubo >! para zerar a leitura. 3... 1nformar os resultados no quadro. ;om os resultados de todos os grupos ser& feita uma reta comum. 3./. Achar a concentra" o da solu" o problema.

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1 . Ttulo: Cin'tica en(imtica 2. 2b3eti os: (studar o efeito da concentra" o do substrato sobre a velocidade das rea"$es enzim&ticas! determinando o Om. ". Parte eB$erimental: 3.1.(s!ectos tericos
2esta aula pr&tica ser& utilizada a invertase ,>.*. frutoEfuranosideE frutohidrolase! I.@.B.@\-. (sta enzima % de grande importCncia no desenvolvimento da cin%tica enzim&tica por ter sido a que Kenri e 4ichaelis determinaram o efeito da concentra" o do substrato sobre a velocidade da rea" o enzim&tica. # trabalho pr&tico se realizar& em duas etapas+ :rimeira etapa+ 3ea" o (nzim&tica A" o da invertase sobre o substrato ,sacarose- dando como produtos frutose e glicose. enzima SA;A3#S( Q K@# =61;#S( Q 730T#S( (sta rea" o dever& ocorrer em exatos ) min para que se possa avaliar a atividade da enzima. 2este intervalo de tempo a velocidade da rea" o para uma mesma concentra" o % constante. Segunda etapa+ 3ea" o ;olorim%trica Aps interrompida a rea" o enzim&tica com o reativo I!)*2S! iniciaEse simultaneamente a rea" o colorim%trica! ou se'a! os produtos da rea" o enzim&tica ,glicose e frutose- reagir o com o I!)*2S para formar o I!)*AS. I!)*2S EEEEEEEE Pcido I!) *initrossaliclico I!)*AS EEEEEEEE Pcido I!) *iaminossaliclico

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3.2. 0x!erimentos
:reparar N tubos seguindo o quadro abaixo+
T0>#S 3eagentes Tamp o Acetato pK F!N Sol. Sacarose B)m4 Sol. Sacarose IAm4 Sol. Sacarose BAAm4 Sol. Sacarose @AAm4 Sol. Sacarose IAAm4 Sol. Sacarose FAAm4 K@# destilada B A!]ml A!)ml @ A!]ml A!)ml A!)ml A!)ml A!)ml A!)ml B!)ml I A!]ml F A!]ml ) A!]ml \ A!]ml > A!]ml

:ara obter um tempo de incuba" o de ) min! adicionar em cada tubo A!B ml da enzima invertase e interromper a rea" o com B ml de I!)*2S segundo o quadro abaixo+ ,agitar cada tubo aps a adi" o das solu"$es-.
T0>#S Tempo Tempo para a adi" o da invertase ,A!BmlTempo para interrup" o da rea" o com Bml de I!)*2S Tempo inicial A^ )^ IA^^ B^ B^IA^^ @^ @^IA^^ EEEEEEE B @ I F ) \ >

)^IA^^

\^

\^IA^^

N^

N^IA^^

<ualE quer

;olocar todos os N tubos em banhoEmaria a BAAA; por )mim. 3etirar do banhoEmaria e adicionar a cada tubo N!) ml de K @# destilada Komogeneizar 6er no espectrofotRmetro contra o branco a ))Anm Anotar as absorbCncias lidas no quadro abaixo+
T0>#S B @ I F ) \ _sacarose` B) IA BAA @AA IAA FAA AbsorbCncia

;onstruir o gr&fico em papel milimetrado! com a concentra" o de sacarose nas abcissas e a absorbCncia nas ordenadas. *eterminar o Km segundo 4ichaelisE4enten.

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1.

Ttulo:

#%eito da aria!o de $* na ati idade en(imtica

2. 2b3eti os:
Avaliar a influ.ncia do pK nas rea"$es catalisadas por enzimas.

". Parte eB$erimental: 3.1.(s!ectos tericos


# pK afeta o estado de ioniza" o dos resduos de amino&cidos das protenas. (m valores extremo de pK! existir o resduos de amino&cidos na forma ionizada que pode pre'udicar a intera" o entre o stio ativo e o substrato! diminuindo a atividade enzim&tica.

3.2. 0x!erimentos
:reparar N tubos seguindo o quadro abaixo+
T0>#S 3eagentes Sol. Tamp o pK I!A Sol. Tamp o pK F!A Sol. Tamp o pK F!N Sol. Tamp o pK )!A Sol. Tamp o pK N!A Sol. Tamp o pK ]!A Sol. Sacarose FAAm4 K@# destilada B A!]ml A!]ml A!]ml A!]ml A!]ml A!)ml A!)ml A!)ml A!)ml A!)ml A!]ml A!)ml B!)ml @ I F ) \ >

:ara obter um tempo de incuba" o de ) min adicionar em cada tubo A!Bml de invertase e interromper a rea" o com Bml de I!)*2S! seguindo o quadro abaixo+ ,agitar cada tubo aps a adi" o das solu"$esT0>#S Tempo Tempo para a adi" o da invertase ,A!BmlTempo para interrup" o da rea" o com Bml de I!)*2S Tempo inicial A^ )^ IA^^ B^ B^IA^^ @^ @^IA^^ EEEEEE B @ I F ) \ >

)^IA^^

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\^IA^^

N^

N^IA^^

<ualE <uer

;olocar todos os N tubos em banhoEmaria por ) minutos.

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3etirar do banho e adicionar a cada tubo N!) ml de K @# destilada Komogeneizar 6er no espectrofotRmetro contra o branco a ))Anm Anotar as absorbCncias no quadro abaixo+
T0>#S B @ I F ) \ :K I!A F!A F!N )!A N!A ]!A AbsorbCncia

;onstruir o gr&fico em papel milimetrado! com os valores de pK nas abcissas e a absorbCncia nas ordenadas. *eterminar o valor do pK timo.

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1. Ttulo: ,umica de -licdios 2. 2b3eti os:


#bservar a idrlise &cida e enzim&tica do amido at% sua ose fundamental! a glicose.

". Parte eB$erimental: 3.1.1idrlise 2cida. (s!ectos tericos


# amido % um homopolisacardeo n oEredutor que! quando tratado com &cido sulfrico J quente! sofre uma sucess o de hidrlises at% se converter totalmente em mol%culas de sua ose fundamental! a glicose. A comprova" o da hidrlise &cida do amido se d& pela positividade da rea" o de >enedict realizada! '& que a glicose % um a"car redutor! pois possu uma nica hidroxila livre. 2o tubo ;B! que % tomado como testemunha da prova! a rea" o de >enedict foi negativa! pois n o houve degrada" o do amido.

3.2. 0x!erimentos
B. (m I tubos marcados A! > e ;! colocar+ Tubo A D ) ml de amido Bg V e ) ml de K@S#F @2. Tubo > D pequenas partculas de gr o de milho! ) ml de K @# destilada e ) ml de K@S#F @2. Tubo ; D ) ml de amido BgV e ) ml de K@#. @. ;olocar os tubos em banhoEmaria por IA minutos. I. *epois de retirar os tubos do banho! resfriar os mesmos. F. 2os tubos A e >! adicionar )ml de 2a#K @2,para neutralizar o K @S#F @2 da hidrlise-. ). 2o tubo ; adicionar mais ) ml de &gua. \. 3eservar os tubos. (fetuaEse agora a rea" o de >enedict! para demonstrar que o amido! por hidrlise &cida! se degradou at% glicose! conforme a seguir+ B. Tomar outros I tubos e marc&Elos como AB! >B e ;B! adicionando em cada o seguinte+ Tubo AB D @ml do tubo A ,da etapa da hidrlise- e @ ml do reagente de >enedict. Tubo >B E @ml do tubo > ,da etapa da hidrlise- e @ ml do reagente de >enedict.

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Tubo ;B E @ml do tubo ; ,da etapa da hidrlise- e @ ml do reagente de >enedict. @. Aquecer os tubos em banhoEmaria fervente por ) minutos. I. #bservar a redu" o ,cor alaran'ada com precipitado vermelho- nos tubos AB e >B! no tubo ;B n o ocorre redu" o.

3.3.1idrlise 0n3imtica. (s!ectos tericos


# amido quando tratado com saliva! se degrada totalmente at% glicose! sua ose fundamental. 1sso ocorre por que encontramos na saliva a enzima E amilase! que atua sobre o amido! realizando sua hidrlise enzim&tica. 2essa hidrlise! o amido passa pelas seguintes etapas intermedi&rias+ A68=2 Cor a(ul com lugol ;iodo< Cor roBa com lugol Cor ermelMa com lugol 8ncolor com lugol Rea!o de 9enedict N Rea!o de 9enedict N

A6802=#LTR8NA #R8TR2=#LTR8NA ACR2=#LTR8NA 6A0T24# -08C24#

Ao colocarmos a saliva em contato com o amido! no tubo 8! se inicia a hidrlise enzim&tica! por a" o da Eamilase. ;onforme vamos adicionando volumes do contedo deste tubo 8 nos outros tubos que cont%m lugol! podemos observar todas as etapas do processo de hidrlise+ amilodextrina! eritrodextrina! acrodextrina! maltose e glicose ,conforme a mundan"a de cor-. <uando colocamos o reagente de >enedict no tubo 8! ocorre uma colora" o alaran'ada que indica redu" o. # amido inicial colocado no tubo! '& foi hidrolizado pela enzima chegando at% maltose e glicose. 2o experimento @ a alta temperatura inativa a enzima Eamilase pesente na saliva assim n o h& hidrlise do amido! isso % comprovado pela rea" o de >enedict negativa.

3.". 0x!erimentos
(xperimento B+

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(m N tubos de ensaio marcados A! >! ;! *! (! 7 e = colocar F gotas de lugol em cada tubo. Tomar um tubo de ensaio J parte! marc&Elo como 8 e colocar neste tubo BA ml de solu" o de amido BgV. 3etirar B ml deste tubo 8 e adicionar no tubo A. #bservar a cor azul ,neste tubo n o h& hidrlise! permanece amido puro-. ;olocar [ gotas de saliva ,recolhida previamente em um >ecGer- no tubo 8. 4isturar bem! por invers o do tubo. 4arcar o tempo! e aps um minuto! colocar B ml do contedo do tubo 8 no tubo >. Aps mais um minuto! colocar B ml do contedo do tubo 8 no tubo ;. Suceder desta forma at% o tubo =. (m seguida! colocar em um tubo de ensaio @ ml da solu" o do tubo 8. Adicionar @ ml do reagente de >enedict. ;olocar em banhoEmaria fervente por ) minutos. (xperimento @+

;olocar [ gotas de saliva ,recolhida previamente em um >ecGer- no tubo a com I!A ml de K@#. *eixar no banho maria fervente por BA minutos. Adicionar B!A ml de solu" o de amido BV esperar ) minutos. 3etirar B!A ml da solu" o do tubo a e adicionar @ gotas de lugol. Retirar 1HG ml da solu!o do tubo O e adicionar 2HG ml do reati o de 9enedict.

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Roteiro da Aula Prtica Nro. .

1 . Ttulo: Cadeia Res$iratria 2. 2b3eti os:


*emonstrar o transporte de el%trons na cadeia respiratria. Avaliar o efeito de um inibidor e um descapolador do transporte de el%trons. Avaliar o efeito de diferentes substratos no transporte de el%trons.

". Parte eB$erimental:


".1. 6aterial utili(ado E *issecar fgado de rato! camundongo ou peixe. Aps a extra" o do rg o! secar em papel de filtro e pesaElo. # fgado ser& homogeneizado em solu" o fisiolgica numa propor" o de I ml de solu" o por cada B g de tecido. # homogeneizado deve ser centrifugado ,)AA x g durante BA min! a F o;- e mantido no frio. E 2H+ =C:8: ;dicloro%enol indo%enol<+ 0tilizar numa concentra" o de B m4. # @! *;717 % um composto de cor azul que quando % reduzido perde esta cor. comumente utilizada na determina" o da atividade da succinato desidrogenase. #bserve que um fluxo maior de el%trons acontecendo ao longo da cadeia respiratria deveria aumenta a taxa de descoramento do @!\ *;717

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E 4ubstratos+ succinato numa concentra" o de BAA m4. E 8nibidor da cadeia res$iratria+ O;2! numa concentra" o de BA m4. ".2. Procedimento ;a< ;ada grupo dever& preencher tr.s tubos! segundo o indicado na tabela+ Tubo 1 ,1- Tamp o ,11- Pgua ,111- KomogeE neizado ,15- 1nibidor ,5- ;orante ,51- Substrato 2bser aPes im$ortantes: E B@) l E E B@) l B@) l @)A l B@) l B@) l )AA l [N) l B@) l Tubo 2 )AA l N)A l B@) l Tubo " )AA l )AA l B@) l

# inibidor % um composto #LTR#6A6#NT# TQL8C2. A manipula" o fica

por conta dos docentes a cargo.

Aps colocar o inibidor ,passo 15-! esperar ) 68NUT24 antes de colocar

o corante e o substrato ,passos 5 e 51-.

#bserve que o Tubo 1 constitui o branco dos Tubos 2 e ".

;b< ;ada grupo dever& registrar o tempo que leva descoramento em cada tubo. Alternativamente podeEse registrar numa escala qualitativa que tubo ou tubos apresentaram cor mais intensa e quais apresentaram menor cor. ;c< #s dados ,tempo ou intensidade de descoramento- obtidos por cada grupo ser o registrados numa tabela+

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Tratamento

Tem$o ou intensidade de descoramento

Tubo B Tubo @ Tubo I 2o relatrio! deveram ser interpretados os resultados obtidos em cada tubo! discutindo os efeitos do inibidor utilizado.

Roteiro da Aula Prtica Nro. /

1 . Ttulo: ,umica de 0i$dios 2. 2b3eti os:


*iferenciar &cidos graxos saturados e insaturados. ;aracterizar lipdios saponific&veis ,complexos-. 3econhecimento da lecitina a partir da detec" o do seu grupo fosfato e da colina.

". Parte eB$erimental:


".1. =i%erencia!o entre cidos graBos saturados e insaturados ;teste de iodo $ara cidos graBos<.

3.1.1. (s!ectos tericos


#s &cidos graxos insaturados adicionam o iodo Js liga"$es duplas tornandoE se saturados. # vermelho rseo que se observa no tubo que cont%m clorofrmio % a cor caracterstica das solu"$es em que o iodo se encontra na forma livre.

3.1.2. 0x!erimento
*istribuir os reagentes em F tubos de ensaio conforme o esquema abaixo+
S#60Ub(S :adr o de cor ,clorofrmioSol &cido #l%ico @!A ml T0># B @!A ml T0># @ T0># I T0># F B!) ml

Bioqumic Cincias - Biologia Sol &cido este&rico Sol 8 ,'& pipetada@!A ml A!) ml

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#s &cidos graxos est o dissolvidos em clorofrmio. Adicionar aos F tubos B gota de reativo de Kubl ,1 etanol-. Agitar e observar. Adicionar mais B gota aos F tubos de reativo de Kubl! agitar e observar. 3epetir at% que se'am adicionadas mais ) gotas de reativo em cada tubo. Anotar o que foi observado no quadro de respostas. Q Kg;l@ Q

".2. 4a$oni%ica!o 3.2.1. (s!ectos tericos #s lipdios complexos quando hidrolizados em meio alcalino produzem glicerol e sais de &cidos graxos. (xemplo+

H2C | HC | H2C

OCO-R 1 OCO-R 2 OCO-R 3 + 3 NaOH

H2C | HC | H2C

OH OH OH Sal do cido graxo + 3 R-COO -Na+

Triacilglicerdio
3.2.2. 0x!erimento

Glicerol

(m tubo de ensaio que '& cont%m I!A ml de lipdio! acrescentar ,com pipeta de )!Aml- @!Aml de 2a#K BA2 e BA ml de etanol absoluto. 7echar o tubo com algod o. ;olocar em banho mara fervente! agitando ocasionalmente at% a forma" o de uma pasta.

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#bservar o produto formado e anotar na folha de respostas.

".". Caracteri(a!o da 0ecitina 3.3.1. (s!ectos tericos A lecitina quando hidrolisada totalmente produz+ glicerol! &cidos graxos! &cido fosfrico ,KI:#F- e colina ,K#D;K@D;K@D2QE,;KI-I-. # fosfato reage com o molibdato de amRnio formando fosfomolibdato de amRnio. ;om a adi" o do reagente redutor formamEse xidos de molibd.nio que determinam a colora" o azul! o que evid.ncia indiretamente a presen"a de fosfato inorgCnico. 7osfato Q 4olibdato de AmRnio 7osfomolibdato de amRnio cxido de molibd.nio,azul-

7osfomolibdato de amRnio Q reagente redutor

3.3.2. 0x!erimento4 ,etermina%+o dos gru!os fosfatos # material a ser utilizado % o hidrolisado completo de lecitina.

3eagentes K@# Kidrolizado Sol fosfato inorgCnico ,:i- D padr o de cor Sol molibdato de amRnio A<0(;(3 3eagente redutor

T0># B B!A ml

T0>#@ B!A ml

T0>#I

B!A ml

B!A ml (4 >A2K#E4A31A A!F ml

B!A ml :#3 A!F ml

B!A ml B min A!F ml

3egente redutor+ &cido aminonaftol sulfRnico Q bissulfito de sdio Q sulfito de sdio. Agitar aps adi" o deste reagente e assinalar com ,Q- no quadro da folha de resposta o aparecimento da cor azul.

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3.3.3. 0x!erimento4 ,etermina%+o dos cristais de 5lorence E ;olocar B gota de hidrolisado sobre uma lCmina. E Adicionar B gota de lugol concentrado. E ;olocar a lCmina no refrigerador durante o tempo de execu" o dos demais testes. E (xaminar ao microscpio o produto da rea" o entre iodo e a colina! a qual precipita sob a forma cristalina ,cristais de 7lorence- J temperatura inferior a B)o ;.

Bioqumic Cincias - Biologia Roteiro da Aula Prtica Nro. 1

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1 . Ttulo: Cromatogra%ia 2. 2b3eti os:


(studar os princpios b&sico da cromatografia e suas aplica"$es na identifica" o de compostos executando o processo de cromatografia em papel.

". Parte eB$erimental:


3.1. (s!ectos $ericos4 A cromatografia % um m%todo fsicoEqumico de separa" o e identifica" o de substCncias baseado na diferen"a de afinidade de duas ou mais substCncias em rela" o a um material estacion&rio e uma fase mvel. A fase mvel pode ser lquida ou gasosa e a fase estacion&ria pode ser lquida! slida ou fase ligada. A cromatografia em papel possui fase mvel lquida. 0m eluente que % escolhido conforme os compostos a serem analisados na pr&tica de aula % composto por >utanol/ Acetona/ Pcido Ac%tico/ Pgua ,I)/I)/N/@I v/v-. A fase estacion&ria % slida representada pelo papel. 3.2. 0x!erimento4 B. ;om auxlio de um tubo capilar de vidro aplicar uma gota de cada uma das solu"$es de amino&cidos ,glicina! alanina! creatina e a mistura- nos respectivos pontos indicados no papel! as gotas devem estar a B!) D @!A cm da borda inferior e B!A cm entre cada gota. @. =rampear as extremidades do papel conforme orienta" o. I. 1mergir o papel no eluente que est& no >ecGer de modo que a extremidade do papel que cont%m os pontos fique em contato com o lquido. F. Tampar o >ecGer. ). *eixar proceder a cromatografia por aproximadamente FA minutos. \. 3etirar o papel. N. 4arcar a altura do solvente. [. *esgrampear. ]. Secar o papel com secador. BA. >orrifar o papel com reativo revelador ,solu" o de ninidrina-. BB. ;olocar o papel na estufa J FAZ B@. 4arcar com l&pis as manchas formadas delimitando o seu contorno e centro geom%trico. BI. #bservar a separa" o das substCncias da solu" o 4.

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3.3. Clculo do #f &5ator de #eten%+o'4 3f % uma constante fsica importante para determinar um composto. 3f Y distCncia de migra" o percorrida pela amostra / distCncia de migra" o percorrida pelo eluente =istJncia de migra!o $ercorrida $ela amostra + % a distCncia entre o ponto de aplica" o at% o centro geom%trico da mancha. =istJncia de migra!o $ercorrida $elo eluente + % a distCncia entre o ponto de aplica" o e a frente percorrida pelo eluente.