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Option : Produits Naturels DIntrts Biologiques Mmoire en vue de lobtention de DIPLME DETUDES APPROFONDIES (D.E.A) En Chimie organique des Produits Naturels dIntrts Biologiques B

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Soutenu et Prsent publiquement le 17 Janvier 2012 Par : SAENDIA Ahmed Hanafi Devant les membres du Jury compos de : Prsident Examinateur Examinateur Encadreur

: Dr LEZO Hugues Doyen D de la a facult des sciences : Dr RASOLONDRATOVO Benoit Matre de confrences : Dr RANDRIANTSOA Jean Matre de confrences : Dr FATIANY Pierre Ruphin Matre de confrences

DEDICACE

A Dieu tout puissant

A toute ma famille

REMERCIEMENTS Tout dabord, je rends grce leternel Dieu pour les bienfaits, la misricorde, la bont et la protection dont jai t lobjet durant mes tudes et surtout lors de la prparation du prsent mmoire. Ce travail a t ralis au laboratoire de phyto-Chimie des Substances Naturelles lInstitut Malgache de Recherches Appliques. Ensuite, je tiens adresser mes sincres remerciements Monsieur le Professeur, DINA Alphonse, Prsident de lUniversit de TOLIARA. Jadresse mes vifs remerciements Monsieur LEZO Hugues, Doyen de la Facult des Sciences de lUniversit de TOLIARA, de bien vouloir prsider cette soutenance de mmoire, malgr ses multiples occupations au sein de lUniversit. Jexprime mes profondes reconnaissances Monsieur FATIANY Pierre Ruphin, Maitre de confrences la Facult des Sciences de lUniversit de TOLIARA, Chef de Laboratoire de Phytochimie lInstitut Malgache de Recherches Appliques qui ne connait aucun rpit dapporter sa main forte pour la professionnalisation de la qualit des recherches en acceptant humblement de diriger nos travaux de recherche avec son inestimable soutien. Je tiens galement remercier vivement Monsieur RASOLONDRATOVO Benoit, Maitre de confrences et responsable de la formation doctorale en Option des Substances Naturelles lUniversit de TOLIARA, qui nous a permis de nous inscrire au sein du dpartement de chimie. Et d' accepter encore dexaminer ce mmoire. Je tiens exprimer mes remerciements Monsieur RANDRIANTSOA Jean, Maitre de confrences la Facult des Sciences de lUniversit de TOLIARA, qui a bien voulu accepter dtre examinateur de ce mmoire et de prsenter ses critiques constructives. Je tiens exprimer ma reconnaissance Monsieur Le Chef de Dpartement de chimie et tous les enseignants de lUniversit de TOLIARA, en particulier ceux qui nous ont prodigus leurs connaissances et les personnels universitaires. Mes vifs remerciements vont galement : Madame Le Professeur Suzanne Urverg-RATSIMAMANGA, Prsidente de lIMRA, qui nous aimablement accepte laccs dans son institut et qui nous a autoriss effectuer dans les meilleures conditions ces travaux. Soyez sure de notre reconnaissance et de notre profonde gratitude. Toute lquipe de lIMRA plus particulirement IHANDRIHARISON Harilala, technicien au sein de Laboratoire danalyse des huiles essentielles, RAZAFINDRAZAKA Ren technicien de Laboratoire de Pharmacologie Exprimentale, R. Aubin technicien de Laboratoire de Phytochimie et lquipe de Laboratoire de Microbiologie dirig par Docteur RAKOTONIRINA Erick Francisco. A mes parents (monsieur Ahmed hanafi et madame soahona Alihamidi) pour quil trouve ici lexpression de ma reconnaissance et de ma profonde respect pour les sacrifices, le soutien moral et matriel quils nont cesse de mapporter tout au long de mes tudes. Que cet ouvrage et ma russite soient le couronnement de leurs efforts. A mes frres, surs, cousines et cousins pour quils sachent qu cur vaillant, rien nest impossible. Je leur souhaite succs, russite et plnitude dans tout ce quils entreprendront.

A toute ma famille : en tmoignage de ma gratitude pour laide que vous mavez accorde dans tous les moments difficiles de mes tudes. A ma promotion de la facult de lettres et des sciences humaines : En souvenir des tendres et dures annes que nous avons passes ensemble. A monsieur samedine : toute mon affection En fin, je rends hommage a tous ceux qui ont contribue de prs ou de loin la ralisation de ce mmoire.

Saendia Ahmed hanafi

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS % 0c N0 R K M S H L g M Kg PH

13

: Pourcentage : Longueur donde : degr Celsius : numro : rendement : potassium : mole : seconde : heure : litre : gramme : Mtre : kilogramme : potentialit dhydrogne : Carbonne 13 : mille-mtre : centimtre : Ultra-violet : iode : nanomtre : millilitre : milligramme : minute : aluminium : chlorhydrique

Mm Cm UV I2 Nm ml mg mn Al HCl

NaCl : chlorure de sodium KCl O2 CO2 HE SM IR : chlorure de potassium : oxygne : dioxyde de carbone

H KI: Iodure de potassium : extrait Henrique : Spectre de masse : infra- rouge

RMN : Rsonance Magntique Nuclaire Mm Hg: millimtre de mercure EtOH : Ethanol Na3 CO3 : Carbonate de sodium Na2 SO4 : sulfate de sodium Na OH : soude CE50 KOH CO2
: concentration

efficace correspondant 5O0 C deffet

CH3 H : Mthanol : Hydroxyde de potassium : Dioxyde de Carbonne

MgCl2 : chlorure de magnsium Na HC03 : bicarbonate de sodium Ca Cl2 : chlorure de calcium HTA : Hypertension Artrielle C5 H8 : Isoprne H2O : Eau DCM : dichloromthane ACO Et : Actate dthyle CCM : chromatographie sur couche mince CHCl3 : chloroforme NH4 0H: Ammoniaque CH3OH: mthanol H2 S04 : Acide sulfurique HCOOH: Acide formique OMS : Organisation Mondiale de la Sant

IMRA : Institut Malgache de Recherches Appliques PNBZT : Parc National Botanique et Zoologique de Tsimbazaza

INTRODUCTION A laube du 3eme millnaire, malgr le progrs spectaculaire, des techniques de recherches scientifiques qui taient les domaines la mode de nos jours, la sant publique reste un problme mondial majeur. Parmi les maladies courantes et enregistres tels que, le paludisme, le cancer , la diarrhe, les infections respiratoires et les atteintes cardio-vasculaires constituent aussi depuis quelque lune des proccupations de lOrganisation Mondiale de la Sant.[1] Les maladies cardio-vasculaires (lhypertension, dfaillance vasculaire et

arthrosclroses)

reprsentent actuellement une des premires causes de la mortalit et

deviennent de plus en plus menaantes dans le monde. [2] A cause de la difficult ou /et la disponibilit de laccs aux mdicaments, les plantes mdicinales deviennent de plus en plus importantes pour la lutte contre des diffrentes pathologies y compris les maladies cardio-vasculaires quon rencontre aussi bien dans les milieux ruraux que dans les villes. [3] Les plantes constituent, certes, une source inoubliable et importante des molcules visions thrapeutiques. Leurs utilisations en mdicine populaire demandent une trs grande vigilance cause demplois sous forme de mlanges complexes dont, on ignore dans la majorit, les molcules actives et ventuellement leur toxicit. [4]

En effet, dans un pays moins avanc comme Madagascar, le prix dachat des mdicaments est trs faible cause de la pauvret et sil tait possible dacheter, il y a aussi linsuffisance ou/et labsence de linfrastructure mdicale. [5] Pour ces raisons, lhomme cherche de moyens pour gurir ou /et soulager ses souffrances. Or, Madagascar est rput par ses richesses endmiques en faune et en flore : sur 14 milles despces des plantes rcences dans le monde, 80% se situent Madagascar. [6] Aprs les renseignements recueillis auprs de la population et les donnes fournies par les gurisseurs, nous avons choisi dtudier la plante connue localement sous le nom

vernaculaire de Feka qui est inclue dans la famille des Apocynaces. Par ailleurs, les rsultats prliminaires de la cardiovasculaire sur laorte isole de rat montrent une activit trs intressante vasorelaxant. Ces derniers nous ont pousss dentreprendre des tudes plus approfondies sur cette plante.

En ce sens, le travail intitul recherche, isolement et mise en vidence de mcanisme daction de principes actifs antihypertenseurs de la plante Roupellina boivini (Apocynace) a pour objet disoler les molcules actives sincarnant dans la plante Roupellina boivini.

La prsentation de notre travail se fera selon le plan ci-dessous : Introduction Premire partie : Recherche et isolement des principes actifs antihypertenseurs ds lextrait hexanique de Roupellina boivini(Apocynace). Deuxime partie : Recherche, analyse et isolement des constituants alcalodiques actifs et recherche des mcanismes daction antihypertenseur de cet alcalode dans lcorce de tige du Roupellina boivini (Apocynace). Troisime partie : Rsultats et Discussions Conclusion Rfrences

 Recherche et isolement des principes actifs antihypertenseurs d lextrait hexanique de Roupellina boivini(Apocynace).

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I.1-Gnralit sur la maladie de lhypertension artrielle I.1.1-Dfinition [7]
L'hypertension artrielle se dfinit comme une hypertension, pression artrielle systolique suprieure 14(140 mm Hg) et/ou pression diastolique suprieure 9(90 mm Hg). Lhypertension artrielle (HTA) est donc un facteur de risques daccidents cardiovasculaires.

I 1.2- Description et volution de la maladie

Depuis trs long temps, lhypertension artrielle reprsente un problme majeur de sant publique lchelle mondiale. En raison de sa frquence et des complications qui lui sont attaches, elles reprsentent un facteur de risque. [8] Comme les problmes rnaux, visuels et cardiaques, l'hypertension artrielle est une maladie asymptomatique (la plupart du temps sans symptme clair) qui touche une grande partie de la population. Dans de nombreux pays, on estime qu'en moyenne 30% de la population souffre d'hypertension. [9, 10] Daprs lorganisation mondiale de la sant, en 2001, plus de millions de personnes sont hypertendues dans les rgions africaines. La prvalence de lhypertension artrielle est comprise entre 25% et 35% chez les adultes de 25 64 ans et la tendance saccentue nettement avec le temps [11]. Daprs la statistique de lanne 2004, la frquence de la mortalit hospitalire relative lHTA sleva 15 pour 1000 Madagascar entre 2000 et2003. [12] Lhypertension peut agir dans des cas particuliers, tels que : la femme enceinte, le sujet g et le sujet diabtique [13,14]

I.1.2.2- complications [10,13, 15]

On a pu slectionner trois sortes de complications : Complication cardiaque, neurologique et rnale La premire implique l'augmentation de la pression artrielle, entrane une insuffisance cardiaque, un infarctus du myocarde et une hypertrophie. La seconde entraine des modifications rtiniennes pouvant tre observes au fond de l'il . La troisime est l'altration de la fonction rnale est souvent trs prcoce et modre.

I.1.2.3-traitement [7, 9,13]

Le but du traitement est de viser la normalisation des chiffres tensionnels, tout en diminuant le risque de complication cardiovasculaire. Pour traiter une hypertension artrielle il n'est pas suffisant d'absorber des mdicaments antihypertenseurs c'est--dire destins faire baisser la pression du sang

l'intrieur des vaisseaux. Il est galement ncessaire d'associer ce traitement mdicamenteux, des rgles hygino-dittiques. Le traitement mdicamenteux commence par une monothrapie faiblement dose dans lHTA lgre, en tenant compte des indications et contre-indications lies aux pathologies associes. Une association fixe dantihypertenseurs doses faibles peut galement tre propose afin daugmenter lefficacit sur la baisse tensionnelle, sans atteindre le seuil des effets indsirables. En deuxime intention, une bithrapie sera instaure dans un dlai dau moins 4 semaines, en cas de rponse tensionnelle insuffisante au traitement initial. La bithrapie pourra tre propose plus rapidement chez les patients prsentant un risque cardiovasculaire lev. Voici quelques exemples des mdicaments lHTA : - Les btabloquants qui, en dehors de leur action hypotensive, diminuent le rythme du cur. - Les diurtiques permettent l'limination du sodium et de l'eau. - Les inhibiteurs de l'enzyme possder le pouvoir d'augmenter le calibre des vaisseaux. - Les inhibiteurs calciques agissent sur de l'angiotensine et diminuent la scrtion d'aldostrone - Les vasodilatateurs priphriques agissent au niveau du systme nerveux central - Les antihypertenseurs centraux permettent l'ouverture des vaisseaux et augmentent ainsi le dbit de la circulation sanguine au niveau du cur et des reins.

I-2 GENERALITES SUR LES TERPENES I-2-3-Les terpnodes [16, 17, 18] I-2-3-1-Dfinition
Les terpnes sont des mtabolites secondaires des vgtaux et des animaux. (Ruzicka, 1953) a tabli la rgle suivante chaque groupe de terpnes est issu de la condensation tte--queue dun nombre variable dunits isoprniques (2-mthylbuta-1,4-dine ou C5H8)

Isoprne C5H8 Qui ne se dpend pas leur vritable prcurseur dans la synthse qui en effectue la nature

I-2-3-2- Les diffrentes classes des terpnodes

Tableau I : Les diffrentes classes des terpnodes Nom hemierpenes monoterpnes sesquiterpnes diterpnes triterpenes tetraterpenes politerpenes unite 5 x C 1 2 3 4 6 8 >8 Isoprne Camphre, limonne, ocimne Cadiene,santoninezingibrne Acide colophne, vitamine A Lanosterol,lsaqualne -carotne,lycopne plastoquinones, ubiquinones, polymere(latex) Exemple de la molcule

Les terpnodes prsentent la plus vaste ensemble connue de mtabolites secondaire dans le rgne vgtal. Cest un assemblage dun nombre entier dunit 5 carbones ramifis appels units isoprniques. On distingue les classifications suivantes : Les hmiterpenes C5 :

Isoprne

Les monoterpnes C10 : Souvent appels simplement terpnes, ils ont une fonction biologique dans la nature. Par leur odeur forte, ils repoussent certaines espces animales, comme les moustiques, on les rencontre dans les huiles essentielles.

Camphre

Limonne

Ocimne

Les sesquiterpnes C15 Certains sesquiterpnes ont un emploi en pharmacie comme la santonime utilise comme antihelminthique (contre les vers intestinaux)

O O

Cadienne

Zingibrne

Stantonine
O

Les triterpnes C30 Ils constituent la famille des terpnes les plus importantes car ils comprennent les groupes des strodes qui drivent de certains triterpnes par dgradation oxydative dans les organismes suivants.

HO

Lanostrol

Squalne

Les tetraterpnes C40 Ils Sont les plus importants et possdent une chaine aliphatique avec onze doubles liaisons conjugues. Comme par exemple Bta carotne donnant sa couleur aux carottes et aux feuilles jaunes, joue un rle essentiel dans la croissance et la vision. Son oxydation dans lorganisme provoque la coupure de la liaison centrale de la chaine et la formation de deux molcules daldhydes.

-Carotne

Lycopne La biosynthse des terpnes La biosynthse est une manire dont les tres vivant synthtisent un produit ; cest en 1922 que RIZICKA a propos lhypothse que les terpnes proviennent dun prcurseur commun, qui est isoprne suivant un enchainement tte queue En 1956 cette hypothse a t confirme exprimentalement : Cest lhypothse isoprnique. Le vritable prcurseur universel de tous les terpnes est lacide mvalonique qui nest connu que depuis 1956. LAcide mvalonique se transforme partir de lActyl COA (actate activ) selon le processus gnral suivant Tous le diffrent types de terpnes

Figure I: Condensation des units isoprniques

II-MATERIEL ET METHODE II.1-MATERIEL II.1.1- Matriel vgtales

Les feuilles de Roupellina boivini qui ont fait lobjet de notre tude, ont t rcoltes le 11 novembre 2010 au sud de Madagascar puis identifies au Parc National Botanique et Zoologique de Tsimbazaza (PNBZT) Antananarivo. Cest une plante endmique de sud de Madagascar.

II.1.1.1-La famille des apocynaces [19]

Lapocynace est une famille de plante latex, de prfrence ligneuses, suivant grimpantes. Cest une famille feuilles simples et opposes. Ses fleurs sont rgulires, actinomorphes, pentamres Madagascar. Ses ovules peu nombreux ou en plus grandes nombres, ses fruits apocarpes, plus rarement ex-albumins. La famille des Apocynaces riche en alcalode et en glucosides steroidiques est repartit surtout dans la zone tropicale. Elle prsente une grande importance sur le plan pharmacologique (tonicardiaques, hypotenseur, anti leucmiques etc.). La famille des Apocynaces est compose denviron 220 genres et 1300 espces ; 23 genres (dont 10 endmiques) et 146 espces (dont 140 endermiques) et quelques espces introduites Madagascar et aux Comores.

II.1.1.3-Espces Roupellina boivini II.1.1.3.1Classification systmatique de Roupellina boivini

Rgne : vgtale Embranchement : dicotyldone-angiosperme Chasse : dosideae Ordre : gentianales Famille : apocynace Nom scientifique : pandaca Nom vernaculaire : feka Groupe : apocynoideae Sous-groupe : strophathirae Genre : Roupellina Espce : boivini Photo I : Espces Roupellina boivini II.1.1.3.2-Description botanique de Roupellina boivini Le Roupellina boivini est un arbre jusqu 12m de hauteur et parfois plus en foret (20-30m), bois mou, aux feuilles groupes vers lextrmit des rameaux, ou arbuste dress, tiges un peu charnues .Les feuilles membraneuses subcoriaces, caduques dans les rgions sches, plus ou moins persistantes dans les rgions pluvieuses. Avec de petites stipules laisselle ; limbe elliptique lancol, aigu aux deux bouts, comportant 15 paires de nervures latrales assez droites, distantes de 5-8mm, donnant des inflorescences submersibles ; pdicelles longues de 1,5-2cm.

II.1.1.4-Utilisation en mdecine populaire

Madagascar tant un pays essentiellement rural, la plupart des habitants de campagnes qui vivent loignent des hpitaux et des centres de soins de sant primaire. Ils traitent empiriquement leurs malades avec les remdes traditionnels et les plantes mdicinales. Daprs les enqutes ethnobotaniques que nous avons faites au niveau de la

population locale de la rgion Sud-ouest de lle, donne que la partie arienne de cette plante est utilise pour soigner lhypertension par linfusion ou la dcoction.

II.1.1.5-Etude scientifique accompli

Aucune tude scientifique na t signale sur cette plante

II-1-2 Matriels techniques -balance de prcision -balance analytique -Rotavapor, associe un bain marie de temprature variable de 0 200C. -La cuve chromatographique un ou / et deux chambres -Lampe UV deux bandes de longueurs dondes 254nm et 365nm -Colonnes en verre de longueur variable et de diamtre variable -Etuve qui varie une temprature de 0 c La verrerie utilise dans laboratoire 1500 c Eprouvettes gradues Ballons Pose-ballon Erlenmeyers vide Entonnoirs Bchers Tube capillaires Fioles vide Ampoule dcanter Pipette Micropipette Micro-Seringue Spatule Bocal Poire

II.2-METHODOLOGIES II.2.1 Criblage phytochimique [20]

Le criblage phytochimique est une mthode chimique utilise pour mettre en vidence les principales classes de mtabolites secondaires que la plante a labors au cours de son volution. Diffrents tests de caractrisation sont effectus lors du criblage phytochimique. Pour la ralisation du criblage ,5g dextrait hexanique a t dilu avec de 100l de solvant hexanique .Elle seffectue en utilisant une plaque de silice, la sparation des constituants chimiques sobserve par leur migration sur la plaque partir de la polarit du solvant et celle de lextrait teste. Lobservation se fait lil nue, au rayon ultraviolet diffrentes longueurs dondes (254nanometres, 365nanometres) et au finale laide rvlateurs chimiques des diffrentes spcificits par exemple : le ractif de Dragendorff, Anisaldhyde sulfurique, vanille sulfurique et potassium hydroxyde

II.2.2 Mthode dextraction [21]

La mthode dextraction consiste obtenir la plus grande quantit possible dune substance extraire. Il nexiste que trs peu de mthodes gnrales dextraction de substances

naturelles. Chaque quipe de chercheurs utilise la technique qui lui convient pour aboutir aux principes actifs purs. Mais le choix de solvant doit respecter les conditions suivantes : le solvant doit tre pur, inerte vis--vis du compos extraire il doit tre utilis par polarit croissante Il doit tre volatile et non toxique pour faciliter lvaporation de la filtration obtenue

.2.2.3 Extraction par solvant [22]

La similitude polarit le solvant dextraction et les composs existant dans une plante joue un rle trs important, il doit avoir une polarit voisine entre le solvant utilis et les chantillons extraire. Par exemple les solvants apolaires comme lther de ptrole extrait les produits apolaires tels que les acide gras, les pigments ; les moyennement polaires comme le dichloromthane extrait les alcalodes et les solvants polaires comme le mthanol pour les produit polaires tels que les flavonodes, les sucres et les htrosides.

II.2.2.3.1-prparation des extraits

Aprs la rcolte de la plante, Les feuilles ont t dabord sches lombre et lair libre pendant quelques jours, puis rduites en poudre laide dun broyage mcanique. Les feuilles ainsi conditionnes ont t extrait, la temprature du laboratoire sous lagitateur mcanique, raison 2fois, 24heures dans 2 litres de solvant hexanique. La marc1 a t alors reprise et extrait de la mme manire par le dichloromthane, la marc2 par lactate dthyle et en fin la marc3 par Mthanol. Aprs vaporation sous pression rduite laide dun rotavapeur associe un bain-marie de temprature variable en fonction de lvaporation des solvants. Quatre extraits bruts de poudre feuilles sont obtenus par extraction due la variation de la polarit du solvant : extrait hexanique, dichlomethane, dactate dthyle et mthanoque

10

Poudre m= 1,5 Kg

Macration dans lhexane 12hx3

Filtration

Marc1
DCM 12hx3

Filtrat hexanique Evaporation Extrait Hexanique EH

Filtration

Marc2
Actate dthyle 12hx3
Filtration

Filtrat du DCM

Evaporation
Extrait du DCM

Marc3 MeOH 12hx3 Filtration

Filtrat dactate dthyle

Evaporation Extrait dactate

dthyle

Marc4

Filtra du MeOH

Evaporation
Extrait du MeOH

Figure II : Protocole dextraction des feuilles de Roupellina boivini

11

II.2.3-Analyse chromatographie II.2.3.1- Dfinition [23, 24]

La chromatographie est une technique de sparation des constituants dun mlange, dans le but didentifier ou de doser certains constituants du mlange, bass sur les diffrentes daffinits des substances analyser lgard de deux phases, lune stationnaire ou fixe lautre mobile.

II.2.3.2-Principe gnrale de la chromatographique [21, 25]

La mthode chromatographique est une des mthodes les plus appropries pour la sparation, lisolement et la purification de molcules. Elle dpend de deux phases : lun stationnaire et lautre mobile. Les sparations dun mlange en ses diffrents constituants sont le but de toute chromatographie.

II.2.3.3-Chromatographie sur couche mince [21, 23, 25]

La Chromatographie sur couche mince est une excellente rsolution, une sensibilit pousse et une grande rapidit. Elle constitue une des premires approches pour ltude de la composition des constituants chimique dun extrait. Elle repose principalement sur des phnomnes dadsorption : la phase mobile est un solvant ou un mlange de solvants. Les principaux lments dune sparation chromatographique par couche mince sont : La cuve chromatographique, la phase stationnaire, lchantillon et lluant. Le comportement dun constituant dans un systme chromatographique dtermin est repr par le rapport frontal dfini comme suit :

Rf : dx : distance parcourue jusquau centre de la tache du constituant considr depuis la ligne de dpts. ds : distance parcourue par lluant depuis la ligne de dpts jusquau front du solvant. La CCM est la mthode la plus utilise pour les raisons suivantes : Simplicit du matriel utilis Rapidit pour la dtermination plus ou moins approximative du nombre des constituants dun mlange

12

Dtermination de la puret dune substance Identification dune substance inconnue par comparaison de Rf avec celle de composs connus Recherche des solvants dlution utiliss pour la sparation en chromatographie sur colonne : chromatographie liquide basse pression On a utilis des plaques constitues de matire en verre, en plastique ou en aluminium, recouverte de gel de silice, que nous avons dcoups avec une hauteur de 6,5 7cm, et de largeur correspondantes au nombre dchantillons dposer. Cette mthode est utilise pour la chercher de solvants utiliser en chromatographie sur colonne, la simplicit de la matrielle dtermination de la puret des molcules. Les chantillons ont t dissouts dans un solvant volatil, puis dposs laide dun micropipette sur la couche dabsorbant a environ 1cm du bord inferieur de la plaque .La plaque sur laquelle, aprs avoir dpos lchantillon la plaque a t place dans le cuve en verre de forme rectangulaire deux chambres, lluant appropri monte travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarite. Les composants de lchantillon se dplace sa propre vitesse derrire le front de la plaque .cette vitesse dpend dune part, des forces lectrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et dautres part, de sa solubilit dans la phase mobile.

II.2.3.4-Chromatographie par colonne [21, 26, 27,28]

La chromatographie liquide ordinaire repose principalement sur les phnomnes dadsorption le dispositif sparateur de deux phases. une phase stationnaire de fine granulomtrie, dispose dans une colonne cylindrique verticale de longueur et de section variable. Une phase mobile qui progresse par gravit et entraine les substances sparer des vitesses diffrentes Ainsi, une phase mobile polaire entraine facilement les substances polaires. Si la phase mobile est constitue par plusieurs solvants, ces derniers devront tre totalement miscibles et soluts sparer devront y tre solubles. Les phases stationnaires les plus utilises sont lalumine, le sephadex et la silice, le remplissage de la colonne se fait, soit par voie sche, soit par voie humide. Un petit volume de solvant est maintenu au-dessus de la surface de la phase stationnaire pour viter sa dessiccation et sa fissuration.

13

Lchantillon analys est dpos au sommet sous forme de dpt liquide ou solide le dveloppement de la chromatographie est suivi par CCM et les fractions recueillies sont groupes en fonction de leur profil chromatographique. La chromatographie sur colonne est une mthode qualitative permettant la sparation et la purification de faible quantit de produit. Elle est galement une mthode prparatoire car elle permet de sparer les constituants dun mlange et leur isolement partir dun chantillon de plusieurs grammes. Pour le fractionnement, on a utilis la mthode qui prconise llution soit par

llution isocratique dans le cas dun seul systme de solvant, soit par grandient dlution c'est--dire varier le systme lluant. Les luants utiliss sont les suivants : hexane en gradient avec l actate dthyle pour lequel on augmente au fur et mesure de lavancement de sparation la proportion du solvant de polarit plus leve, pour notre part l dactate dthyle.

II.2.3.5-Fractionnement de lextrait hexanique

Lchantillon de solution concentre a t introduit tout doucement au sommet de colonne pralablement monte, de faon uniforme sur toute la surface de la colonne, laide dune pipette. On a aliment la colonne en continu laide dune ampoule ou bien ajout manuellement lluant. Dans tous les cas, la surface de ladsorbant ne doit jamais tre au contact de lair. Aprs avoir recueilli les fractions. Les fractions sont suivies par CCM aprs concentration afin davoir leur profil puis vapores laide dun bain-marie. Les diffrentes fractions sches ont t peses et stockes au rfrigrateur.

II.2.3.6- Isolement et purification

Lisolement et purification ont t faits par la technique chromatographique par plaque prparative.

II.2.3.7-Chromatographie sur couche mince prparative

Cette mthode de sparation est applicable des quantits de substances inferieures 1g. Elle consiste dposer lchantillon en bande large sur une plaque recouverte dun couche de phase stationnaire de 12, 5 mm dpaisseur. La plaque est dveloppe dans une cuve deux chambres avec une luant adquat et les bandes sont observes la lumire ultra violet. Une petite bande verticale de la plaque est pulvrise avec un ractif si ncessaire. La partie

14

correspondante au compos recherch est gratte. Le compos est ensuite extrait avec un solvant adquat, sous agitation magntique. Aprs filtration est vapore pour rcuprer le produit.

II.2.4 -Tests pharmacologiques

Comme notre travail repose sur la mthode du fractionnement bio- guid on donne ici les principes de base des tests utiliss quand bien mme ces tests ont t effectus par les biologistes de lIMRA. Les tests pharmacologiques ont t focaliss sur ltude de lactivit antihypertenseur de lextrait hexanique

II.2.4.1 Animaux de test

Vingt rats des deux sexes pesant en moyenne 200 250 grammes ont t utiliss pour les tests pharmacologiques. Ces animaux proviennent lanimalerie du laboratoire de pharmacologie exprimentale de lIMRA Avarabohitra ITOSY.

II.2.4.2- Test in vitro

Ils sont effectus sur des animaux daorte prleves chez les rats. Les rats ont t sacrifis par dcapitation aprs anesthsie lther thylnique. Aprs ouverture du thorax, laorte thoracique a t prleve, nettoye, et dcoupe en anneaux de 3 mm de longueur. Chaque anneau a t mont dans une cuve organe isol sous une tension isomtrique de base de 2 grammes et contenant de solution physiologique de KREBS dont la composition en mm est la suivante : NaCl 122, KCl 5,9, NaHCO3 15, MgCl2 1,25, CaCl2 1,25 et glucose 11. La solution a t are avec du carbogne (95% dO2 + 5% de CO2) et maintenue 37c laide dun bain thermostat et un PH de 7,4 pour conserver la vitalit de lorgane durant le test. Les anneaux daortes ont t lavs toutes les 30 minutes pendant une priode dquilibration de 2 heures avant de les sensibiliser avec une solution physiologique dpolarisante (NaCl 27, KCl 100, NaHCO3 15, MgCl2 1.25, CaCl2 1.25, et glucose 11).La tension a t rajuste 2 g et au plateau de la concentration, linjection dactylcholine 106

M pour relcher laorte, ce qui permet de vrifier la prsence dendothlium fonctionnel. Les

variations de tension des organes sont amplifies et enregistres avec lappareil << BUXCO >>

15

Cuves organe

Amplificateur et Enregistreur Photo II : Appareil organe isol BUXCO (IMRA)

Le droulement de cette tape de sensibilisation, la prparation a t lave au moins trois fois pour remettre la tension la valeur initiale. Trente minutes aprs le dernire rinage, laorte a t de nouveau stimule mais cette fois ci avec la phenylifrine 10-6M. Au plateau de contraction, toute fraction issue de lextrait hexanique est inject dans chaque cuve organe des concentrations croissantes et cumulatives. La valeur CE50 de relaxation de fraction a t calcule partir de courbe effet concentration et par mthode de rgression linaire

16

III- RESULTATS III.1- Rsultats chimiques III.1.1- Criblage phytochimique

Pour dterminer les diffrentes classes chimiques prsents dans lextrait hexanique, ce dernier est soumis un test de criblage phytochimique. Par chromatographique par couche mince, on a effectue 6 dpts sur la plaque, puis la coupe en fonction des nombres de dpts. La tranche n 1 sert de tmoin La tranche n 2 est rvle avec le ractif de Dragendorff, labsence dune coloration jaune indique labsence des alcalodes. La tranche n 3 est rvle avec potassium hydroxyde lapparition dune faible couleur jaune indique la prsence de trace danthraquinone. La tranche n 4 est rvle avec vanille sulfurique plus ou moins positives indique la prsence des phnols et des terpnique. La tranche n 5 est rvle avec Anisaldhyde sulfurique est positive indique la prsence des terpnes. Tableau II : Criblage phytochimique de lextrait hexanique de la poudre des feuilles Classes chimiques Alcalodes Anthraquinone Phnols, terpnes terpnes Ractifs Dragendorff Potasse vanille sulfurique Anisaldhyde sulfurique + ++ Rsultats

III.1.2-Extraction
2Kg de poudre de feuille a t extraite par macration laide de la technique dextraction en cascade et les rsultats sont consigns dans le tableau-3. Tableau III : Rendement des extractions de la poudre des feuilles de Roupellina boivini Extrait Extrait hexanique Extrait dichloromethane Extrait dactate dthyle Extrait mthanolique Masse(g) 48 16 10 20 Rendement 2.4 0.8 0.5 1

Ce tableau montre que la feuille de Roupellina boivini est riche en produits apolaires

17

III.1.3-Rsultats des CCM des extraits de la feuille de la plante

Une tude pralable sur CCM a t faite pour dterminer le bon systme du solvant adquat pour faire la sparation en chromatographie sur colonne. Les quatre extrais dus la solubilit des produits suivant de la polarit des solvants ont t passs aux analyses par CCM, rsultats ont donn une meilleure sparation des taches vue au profil chromatographique avec le systme hexane / dactate dthyle (70/30) (voir la photo3).

Photo III : CCM de lextrait de la feuille

III.1.4-Fractionnement, isolement et purification

Comme, on travaille sur la mthode des fractionnements bio-guids, on a poursuivi le(s) principe(s) actifs jusquavoir du produit purement actif.

III.1.4.1-Fractionnement par chromatographie sur colonne de lextrait hexanique

Comme la phase mobile, le mlange de lhexane et de lactate dthyle lue les 25,43g de lextrait hexanique par chromatographie sur colonne ouvert de gel de silice 60mesh en mode par graduant de lactate. Aprs cette colonne, toutes les fractions collectes laide des tubes essai ont t passes lanalyse par CCM (voir Photo-III) pour faire le regroupement. Enfin on a eu six fractions. Tableau IV : Systme de solvant en graduant de lactate dthyle Hexane (%) 100 70 50 40 10 Actate dthyle (%) 0 30 50 60 90 Volume utilis (ml) 500 400 400 400 500

18

Photo IV : CCM des fractions hexanique aprs rvler par Anisaldhyde sulfurique Tableau V: Fractionnement de lextrait hexanique Fractions F1 F2 F3 F4 F5 F6 Erlenmeyers 13 46 78 911 1214 1518 Masse(g) 8,21 3,95 2,49 3,87 3,12 3,48 Rendement (%) 32,28 15,53 9,84 15,21 12,26 13,68

Fractionnement par chromatographie sur colonne de fraction F (4+5)

6,99g de F
(4+5)

ont t spars par chromatographie sur colonne de gel de sephadex LH-20

considr comme phase stationnaire et phase mobile pour luer la colonne avec le mlange mthanol et dichloromthane (V/V) en mode isocratique. Lanalyse par CCM (Photo IV) effectue sur les fractions a permis lobtention de trois fractions (tableau-VI).

Photo V : chromatogramme des fractions dues F dAnisaldhyde sulfurique

(4+5)

sous rvlation

19

Tableau VI : Fractionnement de la fraction F (4+5) N des tubes 127 2836 37 97 Fraction F (4+5)-1 F (4+5)-2 F (4+5)-3 Masse(g) 0,67 0,72 4,98 Rendement (%) 9, 58 10,30 71,24

Fractionnement par chromatographie sur colonne de fraction F (4+5) La masse de la fraction F

(4+5)

a t fractionne par colonne chromatographique. Le gel de

silice de 40 mesh a t utilis comme phase stationnaire et la phase mobile le graduant dlution hexane-actate dthyle. Lanalyse par CCM effectu sur les fractions collectes dans les tubes essai (Photo-V) ont permis de regroups les fractions en neuf (tableau-VIII).

Photo VI : CCM de neuf fractions dues la fraction F (4+5) 3 Tableau VII : Fractionnement de la fraction (F4+5)-3 Fractions F (4+5)-31 F (4+5)-32 F (4+5)-33 F (4+5)-34 F (4+5)-35 F (4+5)-36 F (4+5)-37 F (4+5)-38 F (4+5)-39 Tubes 1 26 27 48 49 69 70 121 122 143 144 162 163 197 198 231 232 249 Masse(g) 0,610 0,090 0,243 1,020 0,541 0,328 0,814 1,062 0,300 Rendement (%) 12,24 1,80 4,87 20,52 10,86 6;58 16,34 21,32 6,02

20

III.1.4.2-Isolement et purification
120mg de la fraction F
(4+5)-37

est donc fait lobjet de ltape de purification

supplmentaire. Elution par colonne chromatographie de gel de silice de 35mesh suivi par la chromatographie sur couche preparative en deux fois successives a permis disole un produit. Afin ?ce produit a t pass lanalyse par CCM pour confirmer la puret de produit. Aprs la CCM, une molcule pure de code AKB-28, la quantit suffisante pour pouvoir dterminer leur structure et leur activit biologique.

Photo VII : CCM de produit pur AKB-28

21

2 Kg de poudre de feuille
123macration par hexane filtration vaporation

Extrait hexanique

Marc1

45-

Test de criblage biologie active Sparation laide de colonne de silice

F1

F2

F3

F4=3,87g

F5=3,12g

F6

678-

Analyse par CCM Sparation laide dune colonne de gel de silice hexane/actate dthyle (100%-0%)(70%-30%)(50%-50%)

F (4+5)3=4,98 g
F(4+5)1 F(4+5)2 9 - Analyse par CCM 10- Sparation laide de sephadex 11hexane/actate dthyle (V/V)

F (4+5)3=4,98g

22

F (4+5)3=4,98g

12 - Analyse par CCM 13- Sparation laide dune colonne de silice 14hexane/actate dthyle (70%-30%)/( 50%50%)/(30%70%)

F V-31

F V-32

F V-33 F V-34 F V-35

F V-36

F V-38

F V-39

F V-37 15 - Analyse par CCM 16- Sparation laide dune colonne de sephadex 17- hexane/actate dthyle (70%-30%)/( 50%50%)/(30%70%)(/0%-100%) 18-chromatographie sur couche Prparative deux fois successive

Produit pur cod AKB-28

Figure-III : Diagramme de protocole dtude de la feuille de plante de Roupellina boivini

23

III.2-Rsultats de test biologique III.2.1-test in vitro

Rsultats de test de lextrait hexanique
Tableau-VIII : Rsultat du test effectu sur les six fractions de lextrait hexanique Fraction Concentration 0.01mg /ml 0.025mg /ml 0.05mg /ml F1 28.23 75.17 85.41 Pourcentage de relaxation(%) F2 30.68 42.09 78.12 F3 60.56 60.56 80.42 F4 90.75 100 100 F5 78.36 93.75 94.52 F6 70 85.7 89.7

Figure IV: Courbe effectue par concentration des six fractions sur l'aorte isole de rat avec endothlium pr contract par la phenylifrine 10- 6 M de rat hypertendu.

F1 F2 F3 F4 F5 et F6 provoquent un effet vasorelaxant dos sur l'aorte isole de rat par le phenylifrine partir de 0,05mg /ml. Daprs le tableau-VIII on constate que les fractions f4 et f5 sont plus actives que les autres fractions sur laorte isole de rat.

24

Rsultats de test dus aux fractions de la fraction F (4+5)

Tableau-IX : Rsultat du test effectu sur les trois fractions de la fraction F(4+5) Fraction Concentration 0.01mg /ml 0.025mg /ml 0.05mg /ml 0.075mg /ml 0.1mg /ml Pourcentage de relaxation(%) F (4+5)-1 20.32 16.41 17.53 19.27 32.94 F (4+5)-2 28.12 30.43 32.25 35.73 48.91 F (4+5)-3 57.31 35.42 55.57 73.71 89.45

Figure V: Courbe effectue par la concentration des fractions F(4+5)-1, F(4+5-)2 et F(4+5)-3 sur l'aorte isole de rat avec endothlium prcontracte par la phenylifrine 10-6M de rat hypertendu. F (4+5)-1, F(4+5-)2 et F(4+5)-3 provoquent un effet vasorelaxant dos sur l'aorte isole de rat par la phenylifrine. A partir de 0,5mg /ml on constante que la fraction F(4+5)-3 provoque un effet de vasorelaxant 55.57%, alors que lactivit antihypertenseur se localise dans la fraction F(4+5)-3.

25

Rsultats de test dues aux fractions de la fraction F(4+5)-3

Tableau-X: Rsultat du test effectu sur les neuf fractions de la fraction F(4+5)-3 Fraction Concentration F V-31 0.05mg /ml 3.12 F V-32 43.34 F V-33 11.62 Pourcentage de relaxation(%) F V-34 40.90 F V-35 45.25 F V-36 41.86 F V-37 92.02 F V-38 F V-39

48.505 48.7

Figure VI: Courbe effectue sur la concentration des fractions de 1 jusqu 9 sur l'aorte isole de rat avec endothlium prcontracte par la phenylifrine 10-6M de rat hypertendu. Ces fractions provoquent un effet vasorelaxant dos sur l'aorte isole de rat par le phenylifrine. A partir de 0, 5mg /ml on constante que la fraction F activit.
V-37

emporte la meilleure

26

 Recherche, analyse et isolement des constituants alcalodiques actifs et recherche des mcanismes daction antihypertenseur de cet alcalode dans lcorce de tige du Roupellina boivini (Apocynace).

I- GENERALITES SUR LES ALCALOIDES I.1-HISTORIQUE SUR LES ALCALODES

Le terme alcalode (driv dalcalin) rappelle qu l origine ce nom avait t donn par W.MEISSNER, en 1819, aux substances vgtales. Ses caractres basiques contenant un atome dazote [28]. La plupart des alcalodes possdent une action biologique et plus souvent sur le systme nerveux. Exemple : la cocane

CH3

H3C

N O

O
Figure-VII : Structure de la cocane

Lhistoire des alcalodes dbute en 1804, lorsque le chimiste allemand PADERBORN dcouvre lactivit somnifre de lopium. Il faudra cependant attendre en 1817 pour que la communaut scientifique sintresse la question avec lisolement de la morphine contenue dans lopium par SERTURNER. Par la suite, la Strychnine, puis la Cafine furent dcouvertes respectivement en1818 et 1819. A partir de ce moment, les chercheurs sur lisolement des alcalodes vont se dvelopper et, en 1837, le chimiste Sudois JONS JACOB BERZELIUS [29], dans son dictionnaire de chimie, accorde une partie aux sels des bases vgtales o les alcalodes taient dsigns sous forme des symboles [30]. Du point de vue danalyse, partir de 1950, les diffrentes techniques danalyse (IR, RMN, SM) feront progressivement leur entre dans les laboratoires et permettront, ainsi, aux

chimistes de proposer plus facilement les structures chimiques de ces substances naturelles. Le dveloppement des techniques chromatographiques a galement jou un rle majeur dans lvolution des connaissances sur le sujet, principalement lisolement des composs purs. Notons toutefois quencore actuellement, et mme en utilisant les rcentes techniques danalyses, on considre comme dfinitivement admise la structure dun produit naturel quune fois sa synthse acheve.

27

O O NH H3C CH3 CH3 H3 C OCH3 O H 3C OCH3 H3 C N OH

Stucture propose en 1992

Structure corrige en 2002 Valide par synthse en 2004

Figure-VIII : Quelques erreurs de dtermination structurale et structure rassigne Il est gnralement admis que le point culminant de la synthse des alcalodes a t atteint avec la prparation de la quinine par ROBERT BRUNS WOODWARD en 1944 [33,34]. Cest une dcouverte qui a fait couler dencre, encore rcemment, o certains remettaient en cause certaines conclusions de WOODWARD [35, 36,37, 38]. Mais une reprise rcente des derniers tapes de la synthse de la quinine, en utilisant uniquement les techniques disponibles lpoque, ont permis dasseoir dfinitivement la paternit de la synthse totale de la quinine [39, 40, 41]

Il est gnralement que le point culminant de la synthse des alcalodes a t atteint

OCH3 O

1-NaOBr, NaOH, HCl, Et2O 2-NaOEt, EtOH 3-Al, NaOEt, EtOH

N

OCH3 N

N H

d- Quinotoxine

Quinine

Figure-IX : Synthse de la quinine par RABE et KINDLER, partir de d-Quinotoxine

Bien que majoritairement dorigine animale, soulignons le fait que les alcalodes ne forment les peaux de certain batracien.

28

I-3. LES DIFFERENTES FAMILLES DALCALODES

Parmi les familles des alcalodes, on retrouve les familles chimiques suivantes ; quelques molcules sont reprsentes ci-dessous :
-Pyrrolidine
Exemple
H3 C O OCH3 OCH3

N CH3

H N H3C H OH

(R)-Hygrine

Msembrenol -Indoles
CH3 H N H NH2CH3 N H O OH P O

Gramine

Psilocybine

Piperidines
O H N H CH3 O N

Piperine

(+)Coniine

Pyridine
CH3 H N N CH3 N N H N H

H3 C

Actinide

nicotine

Anabasine

Tropanes
H H3 C N OH O O O O N OH

Atropine

Scopolamine

29

Imidazole
CH3 HN N N H3 C N O H2N CH3 CH3 Alchorine N CH3 H2C H3C N N H CH3 CH3

O N,N, diisopentenyguanidine

Glochidine

-Isoquinolines
HO H3CO H3CO N OCH3 O HO H N CH 3 O H O N HO OH

Papaverine

OCH3

Morphine

Licorine

-Quinoline
O CH3 H OCH3CH3 CH3 N OCH3 OH N

Lunacrine

Quinine
O N O N OH

-Quinazolines
N N

Vasicine

OH

Febrifugine

-Benzoxazine et benzoxazole
O OH

-Pyrrozidines
HO H CH3

N OH Diboa

Rtroncanol

- Purine
O H 3C O N N CH3 N N

16
O H N O N H CH3 N N H 3C N N CH3 O H N N

CH3

Cafine

Thobromine

Thophylline

30

-Indolizidines
CH 3 H 3CO O H O H N H 3CO OCH 3 H N OCH 3

Tylophorine Elaeocarpine

-Quinolizidines
H H NH N H O N H H H N

Spartine

Cytisine

- Pyrazines
N CH 3 C H3 N CH 3

-Ptridines
H H 2N N N N N OH OH

H 3C

OCH 3

3-Ethyle-2,5-dimethylpyrazine

2-Methoxy-3-imethylpyrazine

Leucoptrine

-Phenylalkylamines
H 3 CO NH 2 HO OH

-Benzylzmines
O N H CH 3 CH 3

Ephedrine

Capsacine

- Cathedolidines
O CH 3 H 3C

-Muscarines
C H3 N CH 3 CH 3

NH 2

H3C

Cathinone Epimuscarine

-Terpenodes et Strodes
O O CH 3 H H3C N H H H

Paravallarine

31

-La famille des alcalodes dimriques

La famille des peptides

Les familles des putrescine, spermidines et Spermines

I-4. Quelques exemples des alcalodes bioactifs

La morphine, mescaline, cocane, strychnine, curare, codine, cafine, atropine, thobromine, vinblastine, quinine et lacide lysergique, sont de substances naturelles base des alcalodes, rputes pour leurs activits biologiques.

32

II-MATERIELS ET METHODOLOGIES II-1 MATERIELS

II-1.2- Matriel vgtal

La description et lidentification botaniques de Roupellina boivini ont t dj faites dans la premire partie de notre manuscrite, de mme pour les bibliographies concernant de cette plante. La partie quon a tudi est lcorce de tige. Celle-ci a t sche et broye pour la transformation en poudre.

II-1.3- Matriel technique

II-2 METHODOLOGIES

II-2-1. Prparation des chantillons

Dans les plantes, les alcalodes se trouvent dissoudre dans le suc cellulaire, rarement ltat libre, mais plutt sous de sels dacide. Dans certains cas, ils sont combins des inorganiques [HIGUSHI.T, BODIN.J.I-1961].Dans le milieu naturel, les alcalodes sont

accompagns par des gommes de protines, de glucosides, de pigments, de sels minraux, qui doivent tre limins des extraits alcalodes. En plus, certaines plantes alcalodiques contiennent dautres bases organiques comme des amines aliphatiques simples, des indoles, cholines et glutamines. Une bonne mthode dextraction doit pouvoir liminer tous ces composs indsirables. Lextraction alcalodique est base sur les proprits suivantes : Les alcalodes se trouvent dans la plante sous forme de combinaison saline faible qui peut tre dplace par des bases fortes. Les sels simples de la plupart des alcalodes sont plus solubles dans le solvant organique polaire, gnralement insoluble dans le solvant organique peu polaire. Linverse tant vrai pour les alcalodes libres.

II.2.1-1. Traitement du matriel vgtal

Lextraction solide-liquide est une opration de transfert de plusieurs constituants dune phase solide une phase liquide jusqu un tat dquilibre. Le renouvellement du liquide reproduit le processus, ralisant ainsi lpuisement. Lopration comprend trois tapes : Imbibition du solide par le solvant, Passage ou transfert du solut dans le solvant, cest--dire lextraction proprement dite, Diffusion du solut depuis la solution intracellulaire forte concentration vers le solvant dextraction.

33

II.2.1-2. Raction de dtection des alcalodes

Les ractifs utiliss pour dtecter la prsence dun alcalode se divisent en deux groupes, savoir les ractifs de prcipitation et ceux de coloration.

II.2.1.2-1. Ractifs de prcipitation

Le mcanisme de raction entre lalcalode et le ractif dpend du caractre acidobasique de Lewis. Les ractifs de cette premire catgorie ragissent avec les alcalodes pour donner des sels complexes insolubles. Ces ractifs se rattachent trois groupes principaux : Les ractifs forms de minraux lourds tels les ractifs de Mayer-Valser (iodomercurate de potassium) et de Dragendorff-Ivon (iodobismuthate de potassium). Les ractifs de Bouchardat et Wagner, forms de proportion variables diode et diodure de potassium. Les solutions dacides complexes phosphomolibique (ractif de Sonnenschein), phosphotungstique (ractif de Scheilber) et silicotungstique (ractif de Bertrand)

II.2.1.2-2. Ractifs de coloration

Dans la seconde catgorie, les ractifs de coloration sont constitus par des solutions en milieu acide sulfurique du type : sulfomolybdique (ractif de Froehde), sulfovanadique (ractifs de Mandelin), sulfoselenieux(ractifs de Lafon), ou daldhydes : aldhyde formique (ractifs de Marquis), p-dimethylaminobenzaldehyde (ractifs de Wasicky). La caractrisation se fait par lobservation des couleurs immdiates obtenues par laction de ces ractifs sur des alcalodes, ainsi que leur volution en fonction du temps. Dans notre travail, nous avons utilis trois ractifs gnraux des alcalodes que nous avons prpars dans notre laboratoire. Ces ractifs sont :

II.2.1.2-2.1 Ractifs de DRAGENDORFF

Une solution (1) est prpare en dissolvant 0.425g de nitrate de bismuth(III) basique trs pur dans un mlange compos de 5ml dacide actique glacial et de 20ml deau distille. Une solution (2) de 4g diodure de potassium dans 10ml deau distill galement prpar. Au moment de lemploi, 5ml de (1) sont mlangs a 5ml de (2) et 20ml dacide actique glacial et tout complt a 100ml avec de leau distille.

34

II.2.1.2-2.2 Ractifs de WAGNER

Le ractif de Wagner est prpar en dissolvant 2g de lI2 et 6g de liodure de potassium dans deau distille.

II.2.1.2-2.3 Ractifs de MAYER

Solution (a) : 1.358g de HgCl2 dans 60ml deau distille Solution (b) : 5g de KI dans 10ml deau distille Les solutions (a) et (b) sont mlanges et on complte 100ml de leau distille

II.2.1.3- Elimination de peroxydes

Les peroxydes sont mis en vidence par loxydation de liodure de potassium. Selon le protocole exprimental de CHAVANNE.M et all en 1986, dans le cas gnral, durant lextraction des alcalodes, loxydation ne peut pas se sparer avec des alcalodes ; alors que la prsence des peroxydes peuvent donner de faux rsultats positifs durant le test de mis en vidence des alcalodes. Pour liminer la peroxyde, nous avons adopt une mthode qui consiste traiter un litre dther dans une ampoule, dcanter avec 20ml dune solution concentre de sulfate de fer-II. Ce dernier ractif est prpar en dissolvant 60g de sulfate de fer-II dans un mlange compos dacide sulfurique concentr et 110ml deau. Aprs agitation, dcantation et sparation, on procde un nouveau dtection des peroxydes. Lther est ensuite sch une fois. un test de

II.2.1.4- Mis au point dune mthode dextraction des alcalodes de Roupellina boivini II.2.1.4-1. Mthode dextraction des alcalodes dans la littrature
Il y a deux mthodes dextraction pour les alcalodes : Extraction en milieu acide : ltat libre, les alcalodes non quaternaires sont solubles dans les solvants organiques. Par extraction de la solution alcaline, par un solvant organique non miscible, les alcalodes libres passent en solution dans le solvant dextraction et cette solution dj relativement pure, dcante, filtre, lave, sche et vapore, laisse un rsidu dalcalodes libres.

Extraction en milieu basique : la poudre de la plante pulvriser par lammoniaque jusqu

ce quil soit sous forme de pate. Aprs, on a fait une macration laide du solvant organique

35

chlor. Aprs la filtration suivie de lvaporation sec, le rsidu a t repris par de leau acidifie de 12% dHCl et alcalinise jusqu lobtention du pH10, puis partage avec la Dichloromthane. Ensuite par dcantation, la phase organique a t sche par NaCO3 anhydre et vapore sec. Do lextrait des alcalodes totaux. Ces deux mthodes ne peuvent pas tre appliques lextraction des alcalodes de Roupellina boivini.

II.2.1.4-2. Protocole exprimental de la mthode adopte lextraction des alcalodes de Roupellina boivini
Durant les recherches des mthodes dextraction des alcalodes dans lcorce de tige de Roupellina boivini, on a trouv deux techniques dextraction. 1kg de poudre de lcorce macre dans du mthanol 90% pendant 48 heures ; aprs filtration et vaporation, le rsidu obtenu a t repris par acide formique concentration de 5.10-2M pendant cinq minutes. Sous une ultrason, le rsidu insoluble est rejet puis la solubilit dans lacide est dilue par de leau dminralise jusqu lobtention du pH = 7. Cette solution neutre a t partage avec du chloroforme puis dcante et on a deux phases : la phase chloroformique et la phase aqueuse-I. La phase chloroformise a t lave par eau acidifie de HCOOH 5.10-2M et ensuite dcante. La partie chloroformique a t rejete. La phase aqueuse-II tant rassemble avec la phase aqueuse-I. Puis alcalinise par lammoniac aqueux de 25% jusqu pH 10 et on le partage avec du chloroforme puis dcanter. La phase aqueuse est rejete, puis la phase organique rcupre passe leau dminralise et sche par le sulfate de sodium anhydre. Ensuite reprise par du mthanol absolu, la partie soluble du mthanol a t vapore sec. Do lextrait dalcalodes totaux

36

1Kg de la poudre

1-Macrer par mthanol 90% pendant 48H Rsidu 3-Reprise par HCOOH 5.10-2 Rsidu insoluble rejet Phase aqueuse acide

Lavage par acidifie de HCOOH de 5 10-2M

Phase chloroformique-I
Lavage par acidifie de HCOOH de 5 10-2M

Phase aqueuse acide-I

Phase chloroformique-II (Rejet)

Phase aqueuse acide-II

-Rassembler - Alcalinise par NH4OH -Partager avec CHCl3

Phase aqueuse acide-III (Rejet) - Lavage par eau -Schage par Na2SO4 -Reprise par CH3OH -Evaporation

Phase organique

Alcalodes totaux

Figure-X : La premire mthode dextraction des alcalodes de Roupellina boivini

37

Dans la deuxime mthode , dbute un 1kg de la matire vgtale en poudre macr dans le mlange de lthanol et de lammoniac aqueux de 25% de proportion volumique 90/10 sous ultrason pendant 15 minutes. La suite de lextraction seffectuait, en procdant dabord une centrifugation de la solution obtenue par macration pendant de 10minutes avec une vitesse de rotation 3850 tours par minute. Aprs la filtration sur millipore et suivie de lvaporation sec, le rsidu obtenu est dissout par de lHCl de concentration de 0.1M. Ensuite la partie insoluble est rejete, puis la partie soluble est alcalinise par la soude concentration 1M jusqu lobtention de pH = 9. La solution alcalinise est passe par une extraction par partage avec de la dichloromthane. Le test sur le ractif de Dragendorff est ngatif. Toutes les solutions organiques rcupres sont vapores sec. Do les extraits des alcalodes totaux. 1Kg de la poudre

-Macrer par EtOH/Ammoniaque (9/1) - Centrifugation - Filtration -Evaporation Extrait brut Reprise par HCl de 0.1M Solution acide Rsidu insoluble

-Centrifugation - Alcalinise par NaOH jusqu pH = 9 - Partage avec CH2Cl2 jusqu au test sur Dragendorff est (-)

Solution organique Phase aqueuse rejete -Concentre - Evapore

Alcalodes totaux Figure-XI : La deuxime mthode dextraction des alcalodes de Roupellina boivini

38

II-2.3. Fractionnement et isolement de(s) principe(s) actif(s)39 II-2.3.1- Analyse par CCM [47, 48, 49]39
La chromatographie sur couche mince est largement utilise pour rechercher le systme de solvant qui donne la bonne sparation des taches produites dans un extrait ou/et dans une fraction. Le systme chromatographique que nous avons test pour avoir la bonne sparation des taches des alcalodes de Roupellina boivini est repris ci-aprs. Plaque de gel de silice 60F254(Merck), SILG/UV254 et la plaque dalumine 60F254neutre (type E.Merck) Les phases mobiles Dichloromthane/Mthanol/Ammoniaque Chloroforme/Mthanol/Ammoniaque Ether diethylique/Mthanol Ether de ptrole/Actate dthyle Chloroforme/actone/thanol/ammoniaque

Au cours de cette tude, diffrents systmes de migration ont t essays sur les trois types de chromatoplaque. Les chromatoplaques utilises sont de 20cmx20cm recouvertes dpaisseur de 0.25mm. La dtection des alcalodes de Roupellina boivini par UV nest pas totalement sensible cause de sa faible absorptivit 254nm. Nous avons alors t amens utiliser un autre rvlateur dalcalodes savoir le ractif de Dragendorff, prpar dans notre

laboratoire. Ce ractif a, en plus, lavantage de rvler les alcalodes slectivement que labsorption dans lUV. Prparations des dpts : 10mg dalcalodes ont t dissouts dans le mthanol absolu de 3ml, puis un prlvement laide de la micropipette puis dposer sur la ligne de dpt de la chromatoplaque et la distance entre deux spots est de 0.5cm. Chaque dpt de la solution sur la chromatoplaque correspond la quantit se situant entre de 1 5 .

La plaque contenant des dpts du produit a t dvelopp dans le cuve chromatographique a deux chambres jusqu la migration du solvant atteint la ligne frontale. Apres la migration, la plaque a t examine laide dune lampe UV longueur donde 254 et 365nm, pour observer si le systme du solvant est bon. La rvlation des spots a t ralise par pulvrisation du ractif Dragendorff, aprs lexamen par UV et sil tait pulvris, on va chauffer ltuve 100C pendant 5minutes.

39

II-2.3.2. Sparation a laide de la colonne chromatographique de gel de sephadex

Au cours de cette tude, on utilise cette mthode pour raliser des analyses qualitatives rapides des alcalodes de Roupellina boivini pour but de sparer les produits laide de poids molculaire de la molcule [51] Les conditions chromatographiques adoptes : 1- Colonne de verre = 9,8 m x 2,5 cm 2- Phase stationnaire : sephadex LH- 20 3- Phase mobile : CH2Cl / CH3OH / NH3 aqueuse de 25 % 4- Volume inject par 30 muntes : 450 m1.

II-2.3.3 Fonctionnement sur colonne chromatographique de gel de silice 60 mesh

La prparation de la colonne a t identique que le paragraphe II-2.3.2, mais la phase stationnaire quon a t utilise pour la deuxime colonne est de gel de silice 60 mesh. La silice a pour formule chimique Si O2 est obtenue par prcipitation acide de silicates mtallique. Elle se prsente sous forme dune poudre blanche est de trs fin granulomtrie. Le gel de silice convient la fixation des substances polaires, mais retient fortement les composs caractres basiques.[52] Alors le fractionnement chromatographique sur le gel de silice pour objectifs de fonctionner les produits suivants des polarits croissantes. Les produits apolaires sort en premier suivi de moyennement polaire jusquau produit trs polaire Mode opratoire 720 mg de la fraction F3 due la sparation sephadex a t solubilise dans une petite quantit de mthanol absolue, sil est dissouts, c'est--dire devient une solution homogne, on ajoute quelque milligramme de la quantit de gel de silice La bouillit obtenue a t vapore sec pour liminer le solvant mthanol, sil est sec. Lextrait mlang avec de gel a t transform la poudre fine laide dune moule. La poudre fine de ce mlange a t dpose avec prcaution en dessous de la colonne chromatographique pour viter le bulle daire et la perturbation de la surface de la colonne. Cette dposition sappelle remplissage par voie sche .La phase mobile quon a t utilise pour luer cette colonne est le mlange de CHCL3 / CH3OH de proportion volumique 95 /5, en plus de quelques microlitres de lammoniac aqueux de 25 %.

40

Le mode dlution se fait par isocratique et lluant utilis a pour volume totale de 850 ml Dposition de lchantillon analyse

Lchantillon analys a t dissout dans la plus faible quantit possible de la phase mobile, puis dpos en une seule fois au sommet de la colonne de sephadex lorsque lon pratique une chromatographie descendante. La phase mobile est ensuite introduite par coulement partir de rservoirs placs au dessus de la colonne et dont les dbits sont rgles afin de rester constant pendant toute lopration. Le produit sorti de la colonne a t collect dans le tube essai, de quantit 5ml par tube. Le contenu de chaque tube est identifi au moyen de lanalys par CCM, pour mettre rassembler les fractions similaires.

II.234.Isolement de(s) produit(s) laide de la technique de la chromatographie sur colonne de gel de silice 40mesh41 II.234.1.Chromatographie sur colonne de la fraction F36.
La prparation de la colonne est identique la deuxime colonne dans le paragraphe II.233. Daprs le test biologique in-vitro sur laorte isole de Rat effectu dans le six(6) due la fraction F3, montre que la F36 prsente une meilleure activit biologique.100ml de la fraction F36 a t lue dans la colonne chromatographique. Le gel de silice 40mesh a t utilis comme la phase stationnaire. Cet gel de silice 40 mesh est spcial pour la purification de(s) produit(s),puis la phase mobile quon a utilise pour luer cette colonne est le mlange de lther diethylique et du mthanol, avant dinjecter la phase mobile, on ajoute 5ml de lammoniac aqueuses de 30%.Aprs les analyses par CCM des fractions dans le tube suivi de regroupement que nous a permis davoir trois(3).Toue les trois ont t tests sur le test de vasorelaxant laide de laorte isol de Rat et ce qui montre que la fraction F363 est plus active alors que la suite de notre travail disolement seffectue sur la fraction F363.[53]

II.234.2.Chromatographie sur colonne de la fraction F363.

Les protocoles de mode opratoire de cette colonne est la mme du paragraphe II.234.1, mais ils diffrent partir de la phase mobile. La phase mobile qua t utilise pour luer la colonne de la fraction F363 est le mlange du CHCl3/(CH3)2CO/ [C2H50H/ NH4OH :4/3] de proportion volumique 85/15. Daprs lanalyse par CCM effectue sur les fractions collectes dans les tubes suivis de regroupement ont permis disoler quatre fractions.

41

Toutes les quatre fractions ont t testes, et les rsultats ceux qui donnent que la fraction F363.3 est la plus active. La F363.3 nest pas pure. Or, le but de nos travaux est disoler le(s) principe(s) alcalodique(s) pur et actif sur la maladie hypertension artrielle, alors nous passons la CCP pour le purifier la fraction F3633.

II.235.Chromatographie sur couche premptoire de la fraction F3633.

Labsorbant a t une plaque en verre imbib de gel de silice 60H254 silanis, de dimension 20x20cm et dpaisseur 0,25mm que nous luons par deux systmes de solvants -Q mg de F3633 a t dpos sur la ligne de spots dans la plaque contient de la fraction F3633 a t`dvelopp dans la cure chromatographique a une chambre (q/ 0.qq5/ 0.005). Aprs la premire migration, la plaque a t sch ltuve pendant 5min, puis dvelopp dans le second mlange de systmes de solvant et cet mlange est : Ether de ptrole/ Actate dthyle(8,5/ 1,5). Ensuite la plaque a t sche laide schoir puis observe laide dune lampe U.V 254 nm et 365 nm, ce qui a permis de limiter de deux(2) zones diffrentes que lon a prlev par grattage de la silice laide dune Spatule mtallique, puis la silice a t trempe dans du mthanol sous agitation pendant 45min. Les solutions obtenues sont filtres laide du Sephadex pour sparer les autres impurets puis vapores sec, do on deux(2) produits purs actifs cods : RN7-01 et RN7-02.

II.24.I. Test de cytotoxique sur la cellule cancreuse P388. Culture cellulaire

Les souches des cellules P388 conserves sous forme de cryostabilisat dans lazote liquide -196C sont dcongeles 37 C. Les cellules ont t laves avec une quantit de milieu RPMI. Elles ont t disperses par pipetages rptes, ensuite centrifuges pendant 5 mn 120 tours/mn. Aprs avoir limin le surnageant, le culot cellulaire a t rcupr dans un nouveau milieu complet et mis en culture dans des flacons striles de 75 cm3.. Les flacons sont incubs dans un incubateur 5% de CO2 et temprature 37 C. La croissance cellulaire est surveille quotidiennement en valuant le facteur multiplicatif (F) en fonction du temps

F=

(2)

42

Lorsque la phase stationnaire de la croissance cellulaire est atteinte, les cellules en cultures sont en confluences. Lobservation microscopique est ncessaire pour prciser la concentration cellulaire dans le flacon de culture. 50 l de suspension cellulaire ont t ajoutes avec le mme volume de bleu de trypan et tale sur une lame de Thoma (10-4ml). La numration cellulaire a t ralise immdiatement au microscope optique de grossissement x 10 [ANNEXE 3].

Mode opratoire
Prparation des extraits A partir dune solution mre de 2 mg/ml dextrait dissous dans du DMSO (100%), des dilutions avec le milieu de culture iRPMI sont effectues afin dobtenir une concentration dextrait 20 g/ml avec 1% de DMSO. Test Dans une microplaque de 96 puits fond rond, les puits sont rpartis en puits essai, tmoin ngatif, tmoin positif et blanc dont les compositions sont les suivantes (figure 10): Essai : 100 l dextrait + 100 l de suspension cellulaire Contrle ou Tmoin ngatif : 100 l de iRPMI 1%DMSO + 100 l suspension cellulaire Tmoin positif : 100l de Camptothcine + 100 l de suspension cellulaire Blanc : 200l diRPMI

Blanc positif Contrle ESSAIS Photo VIII : Plaque 96 puits

Tmoin

43

Le volume final des solutions dans chaque puits est 200 l dont 100l fixs la suspension cellulaire 200 000 Cellule/ml soit 20 000 cellules/puits. La concentration finale de lextrait tester est de 10g/ml avec 0,5% de DMSO aprs addition dun volume gal de 100l de suspension cellulaire. Le test est ralis en triple. Les microplaques sont ensuite incubes 37C et 5% de CO2 pendant 72 heures. Les microplaques sont centrifuges 1200 tours/mn pendant 5 mn. Les surnageant sont aspirs puis 100l de rouge neutre sont ajouts dans chaque puits. Seule les cellules vivantes incorporent le rouge neutre et absorbent 540 nm. La valeur de densit optique est donc proportionnelle au nombre des cellules vivantes contenues dans chaque puits Incuber les microplaques 37C pendant 60 mn. La mme opration est rpte en remplaant le rouge neutre par le PBS puis par le lauryl sulfate la place du PBS mais sans incubation. Les microplaques sont agites pendant 10 mn. Les densits optiques de chaque puits sont mesures la lumire UV laide dun spectrophotomtre la longueur donde de 540 nm. Dtermination du pourcentage dinhibition et survie cellulaire

Le pourcentage dinhibition (% I) est calcul suivant la formule :

% I= 100 x 100

Avec DO relle= DO mesure DO blanc La survie cellulaire est obtenue partir de la valeur de % dinhibition : Survie cellulaire = 100 - % I Dtermination de la CI50

(5)

Une courbe est tablie partir de la viabilit cellulaire ou % dinhibition en fonction de la concentration. La CI50 est obtenue par projection de cette courbe. Il consiste mettre les cellules en cultures en prsences dun extrait alcalodique de la plante concentration diffrente et connue. Le taux de survie cellulaire ou le pourcentage dinhibition de la prolifration cellulaire est ensuite valu afin de dterminer la valeur de la CISO. Lactivit cytotoxique potentielle des alcalodes est caractrise par la valeur de la CI50 -Dtermination du pourcentage dinhibition et suivie cellulaire Le pourcentage dinhibition (%1) est calcul suivant la formule : %1=100- Do relle essai/ Do relle contrle x 100 (3) Avec Do. Relle= Do mesure- Do blanc.

44

La survie cellulaire est obtenue partir de la valeur de % dinhibition : survie cellulaire=100- %1. -Dtermination de la CI50. Une courbe est tablie partir de la viabilit cellulaire ou % dinhibition en fonction de la concentration. La CI50 est obtenue par c)Mode opratoire Opration de lextrait alcalodique.

A partir dune solution mre de 2mg/ ml dalcalode dissous dans du DM50(100%),des dilutions avec le milieu de culture IRPMI sont effectues afin dobtenir une concentration dextrait 20ng/ ml avec 1% de DM50. Dans une microplaque de 96 puits fond rond, les puits sont rpartis en puits essai, tmoin ngatif, tmoin positif est blanc dons les compositions sont suivantes (fig-8) Essai : 100ng dextrait+100nl de suspension cellulaire Contrle on tmoin ngatif : 100nl de IRPMI 1% DM50 +100nl suspension cellulaire Tmoin positif : 100ng de Camptothcine +100nl de suspension cellulaire Blanc : 200nl dIRPMI.

Le volume final des solutions dans chaque puits est 200nl dont 100nl fixs la suspension cellulaire a 200.000 cellules/ ml soit 20.000 cellules/ puits. La concentration finale de lextrait tester est de 10ng/ ml avec 0,5% de DM50 aprs addition dun volume gal 100nl de suspension cellulaire. Le test est ralis en triple. Les microplaques sont ensuite incubes 37oC et 5% de CO2 pendant 72 heures. Les microplaques sont centrifuges 1200 tours/ mn pendant 5mn. Les surnageant sont aspirs puis 100nl de Rouge neutre sont ajoutes dans chaque puits. Seules les cellules vivantes incorporent le Rouge neutre et absorbent 540nm. La valeur de densit optique est donc proportionnelle au nombre des cellules vivantes contenues dans chaque puits [16, 17, 18,19].Incuber les microplaques 37oC pendant une heure. La mme opration est rpte en remplaant le Rouge neutre par le PBS puis par le lanryl de Sulfate(L.F) la place du PBS mais sans incubation. Les microplaques sont agites pendant 10mn. Les densits optiques de chaque puits ont t mesure`s la lumire UV laide dun spctrphomtre la longueur donde de 540nm. -Dtermination du pourcentage dinhibition et suivie cellulaire

45

Le pourcentage dinhibition (%1) est calcul suivant la formule : %1=100- Do relle essai/ Do relle contrle x 100 (3) Avec Do. Relle= Do mesure- Do blanc. La survie cellulaire est obtenue partir de la valeur de % dinhibition : survie cellulaire=100- %1. -Dtermination de la CI50. Une courbe est tablie partir de la viabilit cellulaire ou % dinhibition en fonction de la concentration. La CI50 est obtenue par

III.11.10.Protocole disolement dalcalode anti- hypertenseur dans lcorce de tige de Roupellina boivini
1Kg dcorce de tige
1-Macration par C2H5/NH4OH(25)[9/1] 2-Centrifugation 3-Filtration 4-Evaporation 5-Reprise par HCl( 0,1M)

Extrait brute Rsidu insoluble (rejet) Solution acide

6-centrifugation 7-alcalinisation laide NaOH jusqu' pH =9 8-Extraction au CH2Cl2jusqu raction de dragendorff ngatives

Solution organique
9-Sche Na2SO4 anhydre 10-Evaporation sec

Phase aqueuse (rejet)

Extrait alcalodes taux

11-Test de criblage biologique active 12-Sparation laide de la colonne sephadex LH-20

F1=918,43mg

F2=627,53mg

F4=743,19mg

F3=872,59m g

13-CCM 14-colonne gel de silice (CHCl3/CH3OH) +NH4

F31=53,46mg

F32=185,79mg

F33=63,41mg

F34=276,85mg F35=81,93mg

F36=103,81mg

46

F36=103,81mg

15-Analyse par CCM 16-Colonne sur gel de silice 17-Ether dithylique MeOH(9 /1)+ NH4 aqueuse 25%

F361

F363=50,69mg+activit F362 18- Analyse par CCM 19-Colonne sur gel de silice (Ether du ptrole CHCl3/CH3OH 1) +NH4 (1,5 /8/0,5)

F3633 = 8,96mg F3631 F3632 20- Analyse par CCM 21-chromatographie sur C.P 22-Colonne disolement

+activit

F3634

Produit pur -actif

Produit n1 RN7- 01 P=3,25mg

Produit n2 RN7- 02 P=3,17mg

Figure-XII : protocole dtude phytochimie de lalcalode dans lcorce de tige de Roupellina boivini

47

 Rsultats et Discussion

III RESULTATS DES ETUDES DALCAODES DE LECORCE DE TIGE DE Roupellina boivini III.1- rsultats des tudes chimiques III.1.1.Extraction des alcalodes totaux dans l corce de tige de Roupellina boivini
Tableau XI : Rendement dextraction Mthode Solvant Matire dextraction dextraction vgtale Premire CH3OH(90) 1kg mthode Deuxime CH3CH2OH/NH4OH 1kg mthode (9.1) Extrait brute 45 ,78g 40,96g Extrait alcalodes 8,078g 8,103g Rend% 0,8078 0,8103

III.1.1 .2.Rsultat des analyses par chromatographie sur couche mince effectuent sur Extrait brut alcalodiques

Photo sous UV-365n m

Photo de la CCM aprs pulvrisation de ractif de Dragendorff

Photo IX : chromatogramme

III.1.1. 3.Rsultat de la colonne de sparation laide de sephadex LH 20

Colonne en verre : Hauteur : 380m. Diamtre : 2,5m Sephadex LH 20 : 500g Poids dalcalode analyse : 5g Systme de Solvant : CH2Cl2/CH3OH (50/50) +NH4OH Mode dlution : Isocratique Produit dgrad durant de la colonne : 36,75% Tableau XII : Regroupement de la colonne de sephadex N des tubes 1 32 33 52 34 70 71 Fractions F1 F2 F3 F4 Poids des fractions 918,43 627,53 872,59 743,19 Rendements % 18,3694 12,5500 17,4518 14,8638

48

III.1.1.4 Rsultats des analyses par CCM avant de regroupement

Aprs pulvrisation du ractif de Dragendorff Photo X : chromatogramme

Sous UV 254nm

III .1.1.5-Rsultats de fractionnement par chromatographie sur colonne de gel de silice de F3

Gel de Silice : 40g Systme de solvant : CHCl3 / CH30H+ quelque Ammoniaque Mode dlution : par graduant Perte durant de la colonne : 4,44625% Volume de Solvant : 850ml Ponds de la fraction F 3 :800mg Regroupement de la colonne de fractionnement sur gel de Silice 60mesh.

III .1.1.5.-1 Rsultat des analyses par CCM des fractions de la fraction F3

Sous UV 365nm

Sous UV 254nm

Aprs pulvrisation du ractif de Dragendorff

Photo XI : chromatogramme
Tableau XIII: Regroupement de la colonne de fractionnement sur gel de Silice 60mesh. Nombre de tube Fractions Poids de chaque fraction (mg) Rendement (%) 1-24 F31 53,46mg 6,68250 25-90 F32 185,79 23,22375 91-108 F33 62,41 7,80125 109-169 F34 76,85 34,51625 170-200 F35 81,93 10,24125 201-Fin F36 103,81 12,97625

49

III .1.1.6. Rsultat des analyses par chromatographie sur couche mince de la fraction F36

Aprs pulvrisation du ractif de Dragendorff Photo-XII : chromatogramme

III.1.1.6.1. Rsultat de la colonne de purification laide de gel de Silice 40mesh.

Hauteur : 5,5m. Diamtre : 1,5m Gel de Silice : 20g Poids de F36 :100mg Systme de Solvant : Ether diethylique/ Mthanol (9-1)+NH4OH. Mode dlution : Isocratique sous pression de 852mmbar Perte : 3,38%.

III1.1.8. Analyse par CCM des fractions due F36

Sous UV 365nm

Sous UV 254nm

Aprs pulvrisation du ractif de Dragendorff

Photo XIII : chromatogramme 50

Tableau XIV : Rsultat de l colonne de F36 Nombre de tube 1-8 9-29 30-Fin F361 F362 F363 Fractions Poids de chaque fraction (mg) 18,96 26,47 50,69 Rendement (%) 18,96 26,47 50,69

III1.1.9. Rsultat de la colonne disolement de la fraction F363.

Hauteur : 60cm. Diamtre : 1,5cm Gel de Silice : 10g Poids de F363 :45g Systme de solvant : Ether de Ptrole/ Chloroforme/Mthanol .(1,5/8/0,5)+NH40H. Mode d lution : isocratique. Tableaux XV : Colonne disolement de la fraction F36352 Nombre de colonne 1-6 7-18 19-28 23-Fin F3631 F3632 F3633 F3634 Fractions Poids de chaque fraction (mg) 9,83 11,41 8,96 11,50 Rendement (%) 21,845 25,356 19,912 25,556

Aprs lanalyse par CCM effectu la fraction F3633, le rsultat (voir le photo-XI) montre quelle comporte deux taches seulement. La fraction F3633 a t passe a la CCP, aprs dimbib des produit grate suivi de la filtration et lvaporation sc. Ces deux produits ont t analyses par la CCM pour justifier la puret des produits. Aprs cet analyse, on a deux produits purs (voir la photo-XII)

Photo XIV : CCM de la fraction F3633

51

Photo XV : CCM de deux produits isols III -2. RESULTATS DES ETUDES BIOLOGIQUES III-2.1 Rsultat de test de cytotoxique sur la cellule P388
Daprs les processus de test sur P388 lextrait alcalode nest actif avec de CI50= 12mg/ml ETUDES DE LACTIVITE VASORELAXATE DE RN7 Effet relaxant de RN7 (alcalodique ou RN7A et non-alcalodique ou RN7NA) sur laorte isole de rat prcontracte avec la phnylephrine 10-6M. Tableau XVI : relaxation produite par RN7A et par RN7NA 0.3mg/ml. Extraits de RN7 % de relaxation RN7A 66.88 12.26 (n=5) RN7NA 08 05.41 (n=4)

Figure-XIV: relaxant de RN7A et RN7NA sur laorte isole de rat prcontracte avec la phnylephrine 10-6M. RN7A est plus active que RN7NA. Etude de lactivit vasorelaxante de RN7A.

Figure-XV : effet-concentration de RN7A sur laorte isole de rat prcontracte avec la phnylephrine 10-6M.

52

RN7A relche laorte isole de rat stimule avec la phnylephrine 10-6M de faon concentration-dpendant, avec une valeur de CE50 = 0.191 0.065 mg/ml (n=5). Recherche de(s) fraction(s) la (les) plus active(s)

Figure-XVI : Effet relaxant des fractions non cytotoxiques de RN7A sur laorte isole de rat prcontracte avec la phnylephrine 10-6M. Tableau XVII : valeurs de CE50 de relaxation des fractions actives. Fractions Valeurs de CE50 (mg/ml) F1 0.69 F2 0.187 F3 0.057 F4 0.067

Les fractions F1, F2, F3 et F4 montrent une activit vasorelaxante importante. De point de vue rendement, F3 prsente une quantit suffisante ; donc, elle assurera la suite des tudes pharmacologiques. Etude de lactivit vasorelaxante des 06 fractions issues de F3.

Figure -XVII : activit vasorelaxante des 06 fractions issues de F3.

53

Tableau XVIII : valeurs de CE50 des 02 fractions les plus actives. Fractions de F3 Valeurs de CE50 (mg/ml) F32 0.032 F36 0.019

La figure 4 montre que, la concentration de 0.1mg/ ml, F32 et F36 sont les fractions actives par rapport aux autres. Cependant, aprs les calculs leurs valeurs de CE50 de relaxation (tableau 3), F36 parat la fraction la plus active. Trois fractions des alcalodes issus de F36

Figure- XVIII : activit vasorelaxante des 03 fractions issues de F36. Tableau XIX : Valeurs de CE50 des fractions testes Fractions actives CE50(en mg/ml) Ecart-type et n 0.056 0.015 (n=4) F 361 F 362 0.0275 0.0092 (n=4) F363 0.0085 0.006 (n=4)

Etude de lactivit vasorelaxante des 04 fractions issues de F363.

Figure-XIX: activit vasorelaxante des 04 fractions issues de F363

54

Etude de lactivit vasorelaxante de deux produits purs.

Figure-XX : activit vasorelaxante de deux produits purs Tableau XX: Valeurs de CE50 des purs Produit pur CE50 de relaxation en g/ml RN7-01 0.0845 0.0332 (n=2) RN7-02 0.161 0.076 (n=3)

ESSAIS A LELUCIDATION DU MECANISME DACTION DE DEUX PRODUITS PURE .

Implication de lendothlium produit pur RN7-01

Figure-XXI : Effet relaxant de RN7-01 pure sur laorte isole de rat avec et sans endothlium stimule avec la NA 10-6M. Tableau- XXI: Valeurs de CE50 de relaxation de RN7-01 pure . Aorte Valeurs de CE50 en mg/ml avec endothlium 0.116 0.012 (n=4) sans endothlium 0.103 0.015 (n=4)

RN7-01 pure relche laorte isole de rat pourvue et dpourvue dendothlium. Donc, son mcanisme dactivit relaxante ne passe pas par production de NO.

55

Implication des rcepteurs -adrnergique avec de propranolol 10-6M produit pur RN7-01

Figure- XXII: Effet inhibiteur de propranolol 10-6M sur lactivit relaxante de lisoprnaline sur laorte isole de rat prcontracte avec la NA 10-6M. En absence et en prsence de propranolol 10-6M, RN7-01 pure relche laorte isole de rat dpourvue dendothlium. Tableau-XXII: valeurs de CE50 de relaxation de RN7-01 pure en absence et en prsence de propranolol. Propranolol Valeurs de CE50 en mg/ml Sans propranolol 0.0163 0.005 (n=4) 10-6M 0.128 0.005 (n=4)

Ainsi, le mcanisme de relaxation de RN7-01 pure nimplique pas la stimulation des rcepteurs bta-2. Implication de lendothlium de produit pur RN7-02

Figure-XXIII : Effet relaxant de RN7-02 pure sur laorte isole de rat avec et sans endothlium stimule avec la NA 10-6M.

56

Tableau-XXIII : Valeurs de CE50 de relaxation de RN7-02 pure . Aorte Valeurs de CE50 en mg/ml avec endothlium 0.0285 0.009 (n=4) sans endothlium 0.0203 0.009 (n=4)

RN7-02 pure relche laorte isole de rat pourvue et dpourvue dendothlium. Donc, son mcanisme dactivit relaxante ne passe pas par production de NO. Implication des rcepteurs -adrnergique avec de propranolol 10-6M de produit pur RN7-02

Figure-XXIV : Effet inhibiteur de propranolol 10-6M sur lactivit relaxante de lisoprnaline sur laorte isole de rat prcontracte avec la NA 10-6M. En absence et en prsence de propranolol 10-6M, RN7-02 pure relche laorte isole de rat dpourvue dendothlium. Tableau-XXIV: valeurs de CE50 de relaxation de RN7-02 pure en absence et en prsence de propranolol.60 Propranolol Valeurs de CE50 en mg/ml Sans propranolol 0.021 0.015 (n=4) 10-6M 0.0179 0.014 (n=4)

Ainsi, le mcanisme de relaxation de RN7-02 pure nimplique pas la stimulation des rcepteurs bta-2.

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Implication des canaux calciques membranaires de produit pur RN7-02

Figure-XXV : Effet-concentration de CaCl2 sur laorte isole de rat en absence et en prsence de diffrentes concentrations de RN7-02 pure . Les rsultats rapports sur la figure 25 montrent que RN7-02 pure inhibe de faon concentration-dpendante avec une valeur de CI50 = 0.0198 0.009mg/ml. Il se peut que lactivit vasorelaxante de RN7-02 pure implique linhibition de linflux calcique travers les canaux calciques de type VOC. Implication des canaux calciques membranaires de Produit pur RN7-01

Figure-XXVI : Effet-concentration de CaCl2 sur laorte isole de rat en absence et en prsence de diffrentes concentrations de RN7-01 pure . Les rsultats rapports sur la figure 8 montrent que RN7-01 pure inhibe de faon concentration-dpendante avec une valeur de CI50 = 0,00229 0.0018mg/ml. Il se peut lactivit vasorelaxante de RN7-01 implique linhibition de linflux calcique travers les canaux calcique.

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DISCUSSION
La plante Roupellina boivini (APOCYNACEE) est une plante endmique dans la rgion Sud de Madagascar, elle prsente dix varits dont 08 sont localise dans le Sud et le Sud-ouest de Madagascar. A ce qui concerne de cette plante, elle tient des places importantes dans les mdecines traditionnelles, car le Roupellina boivini est utilis pour soigner des plusieurs maladies par exemple lhypertension artrielle, lasthme, la maladie destomac et le paludisme. Cest une espce trs rare mais grce Madame DENIZY tradithrapeute que nous avons trouv cette espce de Roupellina boivini. Le premier point saillant qui ressort de notre travail est lisolement des principes actifs antihypertenseur sur les deux parties de la plantes (la feuille et lcorce de tige) qui besoin de deux diffrentes mthodes dextraction surtout lcorce de tige. Les tudes phytochimiques effectus sur les feuilles de Roupellina boivini a t commenc par de lextraction en cascade par solvant de polarit est choisi pour cette tude car cette mthode constitue dj un fractionnement grossier des constituants de la plante. Les solvants utiliss ont t des solvants organiques trs volatiles pour que ces derniers soient faciles liminer la fin de chaque extraction pour viter des ractions entre les solvants dextractions et les produits extraire. Le but, cest extraire les constituants chimiques dans la matire vgtale. Le mode dextraction en cascade par des solvants ^polarits ascendante permet dobtenir la quasi-totalit des produits solubles cest--dire lapplication des principes dextractions que le semblable dissout dans le semblable ; il est fond sur laffinit des soluts lgard dun solvant donn. Cette mthode dextraction a permis davoir des quatre extraits diffrents suivant des polarits dextractions. En ce qui concerne des activits biologiques, la fraction hexanique qui lemporte de la molcule qui responsable antihypertenseur en appliquant le test sur laorte isol de rat. Or, lhexane sert de solvant pour extraire les terpnodes et les matires grasses. Alors les principes qui sont responsables de lactivit antihypertenseur dans les feuilles de cette plante sont des molcules base de terpnodes parce que les matires grasses sont lune des sources de la maladie hypertension artrielle. Pour isoler le(s) principe(s) actif(s) due la fraction hexanique de la feuille de Roupellina boivini, on utilise les mthodes des fractionnements bio-guids par des tests

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biologiques parce que dans un extrait ou/et une fraction est gnralement constitu par un mlange complexe partir duquel il est difficile disoler tous les constituant. Parmi ces milliers de substances, une ou quelques-unes seulement sont responsables de leffet thrapeutique dans une plante. Cette mthode de fractionnement bio-guid ; cest lensemble des processus des sparations par chromatographie sur colonne suivie des analyse par CCM, CCP et du test biologique selon de lactivit cibl si les fractions obtenues la de la colonne chromatographique soit sec. Ce processus a t rptitif jusqu lobtention de(s) principe(s) actif(s) pur(s). Le produit actif isol dans la feuille de la plante est un produit minoritaire alors la quantit isol est trs insuffisant pour la dtermination structurale et llucidation de la mcanisme daction vis--vis des rcepteurs a propos de lhypertension artrielle sauf le test de vrification de lactivit de ce principe et les criblage chimique pour savoir la famille chimique. Do la famille chimique du principe actif dans la feuille de Roupellina boivini est attribue au strode. Dans la deuxime partie de notre tude sera focalis lisolement des principes actifs dans lcorce de tige de Roupellina boivini. Cette plante est appartiennent la famille des Apocynaces, aprs les bibliographies cette est riche en alcalode et la plupart des alcalodes possdent une activit biologique, a cause de cette impotence biologique qui ma pouss disoler les alcalodes actifs dans le Roupellina boivini. Les extractions des alcalodes possdent une mthode trs spciale cause des

proprits spcifiques des molcules alcalodiques, soit une extraction en milieu alcalin acide ou/ et en milieu basique. Ces deux nest pas adopt sur lextraction des alcalodes de Roupellina boivini car la fin de chaque extraction il y la prsence de la peroxyde qui donne a chaque fois le faut rsultat positif sur les tests des alcalodes a partir de la pulvrisation de ractif de Dragendorff ou sur lacide phosphpomolibidique. Pour cela que nous adaptons deux mthodes dextraction (voir le paragraphe II.2.1.4 dans la deuxime partie) pour faire lextraire les alcalodes dans lcorce de tige de cette plante. Ces mthodes dextractions qui ont t mis au point sont spcifiques pour les alcalodes des types tropaniques. Dans le cas gnral, les alcalodes a pour structure de base tropaniques possdent une activit cytotoxique. Les alcalodes totaux de lcorce de tige de Roupellina boivini cod RN7 sont passs aux tests des criblages biologiques sur les cellules cancreuses P388 pour justifier les donns bibliographiques et sur le test de vasorelaxante laide de laorte isol de pour confirmer les

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utilisations dans les mdecines traditionnelles. Aprs les rsultats des tests biologiques invitro lextrait alcalode dans lcorce de la plante possde une activit vasorelaxante alors lutilisation dans la mdecine populaire sera confirme. Il ny pas des activits cytotoxique alors que les donns bibliographique sur les alcalodes tropaniques sont fautes si la plante Roupellina boivini qui a t observ. Donc, notre travail va orienter vers lisolement des principes alcalodiques antihypertenseurs. Lisolement des principes actifs ont t raliss par les fractionnements bio-guids. A la fin des applications des processus de cette mthode permis disoler deux (02) alcalodes antihypertenseurs. Ces deux principes actifs ont t passs un autre test pour rechercher les mcanismes dactions de ces principes actifs. A propos de llucidation du mcanisme de deux principes actifs ont t dtermins partir des tests suivants: En absence et en prsence de lendothlium, aprs ces tests les principes isols sont toujours actifs donc les deux molcules responsables des activits dans lcorce indpendantes de lendothlium. Sur le rcepteur -adrnergiques par utilisation de propranolol, les produits purs sont actifs donc le mcanisme de relaxation de deux produits pure ne sont pas impliqus dans la stimulation des rcepteurs -adrnergique. Afin sur effet-concentration de CaCl2 sur laorte isole de rat en absence et en prsence de diffrentes concentrations des produits pure . : ce test est au contraire que le deux premiers, parce que le but ici pour observer la contraction musculaire en absence du calcium par test de leffet des concentrations, aprs les rsultats du test le produit ne donne pas la contraction musculaire donc lactivit de ce principe dpend du Ca2+. Do lactivit vasorelaxante de deux produits pure sont impliqus linhibition de linflux calcique travers les canaux calciques de type VOC avec de CI50 = 0,00229 0.0018mg/ml pour RN7-01 et CI50 = 0.0198 0.009mg/ml RN7-02 et ces valeurs de CI50 une dose dpendante entre les produits et le Ca2+. sont

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CONCLUSION
Les travaux phytochimiques sur la plante Roupellina boivini ont montr que lextrait issu des la feuille et les alcalodes totaux de lcorce de tige ont une activit importante sur le vasorelaxant laide dune aorte isol de Rat. Dans un premier temps nous avons saisi que le Roupellina boivini est trs utiles en mdecine traditionnelle. Lactivit antihypertenseur sur laorte isol de Rat confirme ce rsultat. De plus, lextrait issu la feuille et les alcalodes totaux de lcorce de tige ne sont pas actifs sur la cellule cancreuse P388 qui appui limportance de la plante Roupellina boivini sur les utilisations dans la mdecine traditionnelle pour traiter lhypertension artrielle car il ny pas de toxicit. Le fractionnement par chromatographie sur colonne ouvert avec phase stationnaire gel de silice montre que les fractions polaires dues lextrait hexanique apportent lactivit vasorelaxant de cette fraction (F4 et F5). Lisolement par application de la technique de fractionnement bio-guid a permis disoler un produit pur actif. Les criblages phytochimiques effectus sur le principe actif a permet de connaitre la famille chimique de ce compos isol. Il est appartient la famille des strodes. Dans un deuxime temps, la mis au point de la mthode dextraction des alcalodes de lcorce a permis de connaitre le type structurale dalcalode dans la tige de Roupellina boivini qui tait attribu la famille des alcalodes tropaniques. Ensuite la sparation par chromatographie sur colonne de gel de sephadex a permis de localiser la fraction alcalode active sur laorte isole (F3). Lisolement des principes actifs alcalodes seffectuent par lapplication de la mthode par fractionnement bio-guid. Cette application a permis disoler deux alcalodes purs et actifs sur le test vasorelaxante. Les deux produits isols ont t passs aux diffrents tests sur : implication de

lendothlium, le rcepteur de 2-adrnergique avec de propranolol 10-6M et Implication des canaux calciques membranaires. Les rsultats montrent les produits purs sont indpendant de NO, ne sont pas impliqus dans la stimulation de rcepteur de 2adrnergique. Ils sont inhibs de faon concentration-dpendante avec respectives CI50 = 0.0198 0.009mg/ml pour RN7-02 et CI50 = 0,00229 0.0018mg/ml pour RN7-01.

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Ils ne peuvent que des activits vasorelaxants impliqus dans linhibition de linflux calcique travers les canaux calciques de type VOC. Aprs les tudes chimiques et biologiques effectus sur le Roupellina boivini (Apocynace), nous constatons que cette plante comporte des familles chimiques des composs trs intressantes dans les domaines de la chimie et chaque famille chimique de compos possde une activit biologique sans toxicit. Alors elle peut tre apportera un avenir pour la dcouverte scientifique propos de la molcule bioactive. Do le Roupellina boivini (Apocynace) possde la signature de la nature

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III.11.10.Protocole disolement dalcalode anti- hypertenseur dans lcorce de tige de Roupellina boivini46 III RESULTATS DES ETUDES DALCAODES DE LECORCE DE TIGE DE Roupellina boivini...49 III.1- rsultats des tudes chimiques49 III.1.1.Extraction des alcalodes totaux dans l corce de tige de Roupellina boivini...49 III.1.1 .2.Rsultat des analyses par chromatographie sur couche mince effectuent sur Extrait brut alcalodiques.49 III.1.1. 3.Rsultat de la colonne de sparation laide de sephadex LH 20.49 III.1.1.4 Rsultats des analyses par CCM avant de regroupement.....49 III .1.1.5-Rsultats de fractionnement par chromatographie sur colonne de gel de silice de F3 ...50 III .1.1.5.-1 Rsultat des analyses par CCM des fractions de la fraction F350 III .1.1.6. Rsultat des analyses par chromatographie sur couche mince de la fraction F36 51

III.1.1.6.1. Rsultat de la colonne de purification laide de gel de Silice 40mesh....51

III1.1.8. Analyse par CCM des fractions due F36 52

III1.1.9. Rsultat de la colonne disolement de la fraction F36352

III -2. RESULTATS DES ETUDES BIOLOGIQUES..53 III-2.1 Rsultat de test de cytotoxique sur la cellule P388.53 DISCUSSION..62 CONCLUSION...65

Listes de figures
Figure I: Condensation des units isoprniques Figure II : Protocole dextraction des feuilles de Roupellina boivini Figure-III : Diagramme de protocole dtude de la feuille de plante de Roupellina boivini Figure IV: Courbe effectue par concentration des six fractions sur l'aorte isole de rat avec endothlium pr contract par la phenylifrine 10- 6 M de rat hypertendu Figure V : Courbe effectue par la concentration des fractions F(4+5)-1, F(4+5-)2 et F(4+5)-3 sur l'aorte isole de rat avec endothlium prcontracte par la phenylifrine 10-6M de rat hypertendu Figure VI: Courbe effectue sur la concentration des fractions de 1 jusqu 9 sur l'aorte isole de rat avec endothlium prcontracte par la phenylifrine 10-6M de rat hypertendu Figure-VII : Structure de la cocane Figure-VIII : Quelques erreurs de dtermination structurale et structure rassigne Figure-IX : Synthse de la quinine par RABE et KINDLER, partir de d-Quinotoxine Figure-X : La premire mthode dextraction des alcalodes de Roupellina boivini Figure-XI : La deuxime mthode dextraction des alcalodes de Roupellina boivini Figure-XII : protocole dtude phytochimie de lalcalode dans lcorce de tige de Roupellina boivini Figure-XIV : relaxant de RN7A et RN7NA sur laorte isole de rat prcontracte avec la phnylephrine 10-6M Figure-XV : effet-concentration de RN7A sur laorte isole de rat prcontracte avec la phnylephrine 10-6M Figure-XVI : Effet relaxant des fractions non cytotoxiques de RN7A sur laorte isole de rat prcontracte avec la phnylephrine 10-6M Figure -XVII : activit vasorelaxante des 06 fractions issues de F3 Figure- XVIII : activit vasorelaxante des 03 fractions issues de F36 Figure-XIX: activit vasorelaxante des 04 fractions issues de F363 Figure-XX : activit vasorelaxante de deux produits purs Figure-XXI : Effet relaxant de RN7-01 pure sur laorte isole de rat avec et sans endothlium stimule avec la NA 10-6M Figure- XXII: Effet inhibiteur de propranolol 10-6M sur lactivit relaxante de lisoprnaline sur laorte isole de rat prcontracte avec la NA 10-6M Figure-XXIII : Effet relaxant de RN7-02 pure sur laorte isole de rat avec et sans endothlium stimule avec la NA 10-6M Figure-XXIV : Effet inhibiteur de propranolol 10-6M sur lactivit relaxante de lisoprnaline sur laorte isole de rat prcontracte avec la NA 10-6M Figure-XXV : Effet-concentration de CaCl2 sur laorte isole de rat en absence et en prsence de diffrentes concentrations de RN7-02 pure Figure-XXVI : Effet-concentration de CaCl2 sur laorte isole de rat en absence et en prsence de diffrentes concentrations de RN7-01 pure

LISTES DE TABLEAUX
Tableau I : Les diffrentes classes des terpnodes Tableau II : Criblage phytochimique de lextrait hexanique de la poudre des feuilles Tableau III : Rendement des extractions de la poudre des feuilles de Roupellina boivini Tableau IV : Systme de solvant en graduant de lactate dthyle Tableau V: Fractionnement de lextrait hexanique Tableau VI : Fractionnement de la fraction F (4+5 Tableau VII : Fractionnement de la fraction (F4+5)-3 Tableau-VIII : Rsultat du test effectu sur les six fractions de lextrait hexanique Tableau-IX : Rsultat du test effectu sur les trois fractions de la fraction F(4+5) Tableau-X: Rsultat du test effectu sur les neuf fractions de la fraction F(4+5)-3 Tableau XI : Rendement dextraction Tableau XII : Regroupement de la colonne de sephadex Tableau XIII: Regroupement de la colonne de fractionnement sur gel de Silice 60mesh Tableau XIV : Rsultat de l colonne de F36 Tableaux XV : Colonne disolement de la fraction F363 Tableau XVI : relaxation produite par RN7A et par RN7NA 0.3mg/ml Tableau XVII : valeurs de CE50 de relaxation des fractions actives Tableau XVIII : valeurs de CE50 des 02 fractions les plus actives Tableau XIX : Valeurs de CE50 des fractions testes Tableau XX: Valeurs de CE50 des purs Tableau- XXI: Valeurs de CE50 de relaxation de RN7-01 pure Tableau-XXII: valeurs de CE50 de relaxation de RN7-01 pure Tableau-XXIII : Valeurs de CE50 de relaxation de RN7-02 pure Tableau-XXIV: valeurs de CE50 de relaxation de RN7-02 pure en absence et en prsence de propranol

LISTES DE PHOTOS Photo I : Espces Roupellina boivini Photo II : Appareil organe isol BUXCO (IMRA) Photo III : CCM de lextrait de la feuille) Photo IV : CCM des fractions hexanique aprs rvler par Anisaldhyde sulfurique) Photo V : chromatogramme des fractions dues F sulfurique) Photo VI: CCM de neuf fractions dues la fraction F (4+5) 3 ) Photo VII : CCM de produit pur AKB-28) Photo VIII : Plaque 96 puits) Photo IX : chromatogramme Photo X : chromatogramme
(4+5)

sous rvlation dAnisaldhyde

Photo XI : chromatogramme
Photo-XII: chromatogramme

Photo XIII: chromatogramme Photo XIV : CCM de la fraction F3633 Photo XV : CCM de deux produits isols