Analisis Instrumental2

ANLISIS INSTRUMENTAL
Presentado por:

GERMN ANTONIO ARBOLEDA MUOZ
ALEJANDRO BUSTAMANTE MURIEL
NATALIA MARCELA FERNNDEZ CRUZ
MARIA PAULA FIERRO CADENA
YERALDIN LUCIO IDROBO

Presentado a:

Mag. JULIE QUINTERO

UNIVERSIDAD DEL CAUCA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
POPAYAN
2011
Anlisis Instrumental

2

TABLA DE CONTENIDO

Pg.

OBJETIVOS 5
INTRODUCCIN 6
MARCO CONCEPTUAL 7
1. ESPECTROFOTOMETRIA 10
1.1 FUNDAMENTO 10
1.2 EQUIPO: ESPECTROFOTMETRO 12
1.3 PRINCIPIO FISICO 12
1.4 RESULTADOS 12
1.5 APLICACIONES 12
1.6 APLICACIONES AGROINDUSTRIALES 13
2. ESPECTROMETRA DE ULTRAVIOLETA-VISIBLE 14
2.1. FUNDAMENTO 14
2.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO DE UV-VISBLE 15
2.3. PRINCIPIO FISICO 16
2.3.1 Electrones , y 17
2.3.1.1 Transiciones * 17
2.3.1.2 Transiciones * 17
2.3.1.3 Transiciones * y * 17
2.4. RESULTADOS 19
2.5. APLICACIONES 19
2.6. APLICACIONES AGROINDUSTRIALES 19
3. ESPECTROMETRA DE INFRARROJO 21
3.1. FUNDAMENTO 21
3.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO DE ABSORCION EN EL INFRARROJO 22
3.3.1 Fuente de Radiacin 23
3.3.2 Sistemas de seleccin de longitudes de onda 23
3.3.3 Compartimiento de la muestra 23
3.3.4 Detector 23
3.4. RESULTADOS 23
4. ESPECTROMETRIA DE MASAS 26
4.1. FUNDAMENTO 26
4.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO DE MASAS 27
4.2.1 Sistema de entrada de muestras 27
4.2.2 Cmara de Ionizacin 27
4.2.3 Acelerador 27
4.2.4 Analizadores 27
4.2.5 Detector 28
4.4. RESULTADOS 29

3

4.5.1 Aplicaciones cualitativas 30
4.5.2 Aplicaciones cuantitativas 31
5. ESPECTROMETRIA DE ABSORCIN ATMICA 33
5.1. FUNDAMENTO 33
5.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO DE ABSORCIN ATMICA 34
5.4. RESULTADOS 35
6. PLASMA ACOPLADO POR INDUCCIN 37
6.1. FUNDAMENTO 37
6.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO DE EMISIN 37
6.4. RESULTADOS 40
7. RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR 42
7.1. FUNDAMENTO 42
7.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO DE RMN 43
7.4. RESULTADOS 45
7.4.1 Espectros de lneas anchas 45
7.4.2 Espectros de alta resolucin 45
7.4.3 Espectros de
13
C del adamantano cristalino 46
7.5.1 Identificacin de Compuestos 47
7.5.2 Anlisis cuantitativo de RMN 47
7.5.2.1 Anlisis cuantitativo de grupos funcionales 47
7.5.2.2 Anlisis elemental 47
8. CROMATOGRAFA DE CAPA FINA 49
8.1. FUNDAMENTO 49
8.1.1 Preparacin de placas de capa fina 49
8.1.2 Desarrollo cromatogrfico 49
8.2. EQUIPO: CROMATGRAFO EN CAPA FINA 51
8.4. RESULTADOS 53
8.5.1 Deteccin cualitativa rpida deanalitos 54
8.5.2 Determinacin semicuantitativadeanalitos 54
8.5.3 Aislamiento y purificacin parcial deanalitos de una muestra 55
9. CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIN 56
9.1. FUNDAMENTO DE LA TECNICA 56
9.2. EQUIPO: CROMATGRAFO HPLC 57

4

9.3.1Cromatografa de fase Normal 57
9.3.2Cromatografa de fase inversa 58
9.3.3 Cromatografa de exclusin por tamao 58
9.3.4Cromatografa de Intercambio Inico 58
9.3.5 Cromatografa de bioafinidad 59
9.4. RESULTADOS 59
9.6.1 Conservantes antioxidantes 60
9.6.2 Anlisis de carbohidratos en bebidas 60
9.6.3 Ismeros de Carotenoides 61
9.6.4 Flavonoides y Fenoles 61
9.6.5 Lpidos 61
9.6.6 Acidoslipoico y cido dihidrolipoico en suplementos alimenticios 61
9.6.7 Medicin de nutrientes liposolubles en tabletas multivitamnicas 61
9.6.8 4-Hidroxinonenal y otros aldehdos 61
9.6.9 Surfactantes no inicos 61
9.6.10 Carbohidratos simples 61
9.6.11Contaminantes triptfanos 61
10. CROMATOGRAFIA DE GASES 62
10.1 FUNDAMENTO 62
10.2 EQUIPO: CROMATOGRAFO DE GASES 62
10.4 RESULTADOS 63
10.5 APLICACIONES 63
11. CROMATOGRAFIA IONICA 65
11.1 FUNDAMENTO DE LA TECNICA 65
11.2 EQUIPO: CROMATOGRAFO IONICO 66
11.3.1 Resinas de Intercambio Inico 66
11.4 RESULTADOS 68
11.4.1 Preparacin de la muestra 68
11.4.2 Costos 69
11.5 APLICACIONES 69
11.5.1 Desionizacin 69
11.6.1 Tratamiento de Aguas duras 70
11.6.1.1 Principio 70
11.6.1.2 Funcionamiento 70
11.3.1.3 Dibujo esquemtico del principio 71
CONCLUSIONES 72
BIBLIOGRAFA 73


5

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar los aspectos ms importantes y sobresalientes de algunos de los mtodos de anlisis
instrumental.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Analizar de forma clara y puntual, los aspectos ms relevantes de distintas tcnicas de anlisis
instrumental.

Interpretar diferencias y similitudes entre las tcnicas de anlisis instrumental.

Deducir las principales aplicaciones de las tcnicas al campo cientfico, en especial en el campo
agroindustrial.


6

INTRODUCCIN

La obtencin de informacin tanto cuantitativa como cualitativa acerca de la composicin y
estructura de la materia, es una de las necesidades ms urgentes de Ingenieros y Cientficos
vinculados al campo de las ciencias exactas como la Qumica, Biologa o Fsica. Para esto han
sido creadas una serie de herramientas para suplir estos requerimientos. Estos instrumentos han
conseguido ser cada vez ms avanzados y proporcionar informacin mucho ms confiable,
adems de facilitar el trabajo para el analizador y brindar mayor credibilidad en sus resultados.

El desarrollo de estos mtodos instrumentales de anlisis ha venido de la mano de la revolucin
tecnolgica producida por el auge de grandes empresas tanto industriales como informticas,
que han permitido mejorar an mucho ms todas las tcnicas instrumentales. Aunque muchos
de los principios en los que se basan se conocan desde hacemucho tiempo, no se contaba con
la suficiente instrumentacin e informacin para desarrollarlas.

Estas tcnicas presentan grandes ventajas, muestra de ello es el campo de accin tan grande
que tienen, abarcando desde las Ciencias tanto Exactas como de la Salud, pasando por las
Ingenieras vinculadas al estudio de materia orgnica, llegando incluso hasta gran parte del
Campo Industrial, destacndose entre este la industria farmacutica y la de alimentos. Siendo
estudiantes de Ingeniera Agroindustrial, el conocimiento de estas herramientas se hace
necesario no solo como parte de la formacin sino adems como parte de la vida profesional,
donde se ve enfrentado a diversos problemas analticos, para los cuales se debe tener los
mejores criterios para desarrollarlos con satisfaccin.

Debido a que muchos analitos pueden ser determinados por diferentes tcnicas, para hacer de
su uso algo correcto y pertinente se requiere de la clara comprensin del principio bsico de
cada una de estas. Esto con el fin de tener el mejor criterio para hacer la eleccin del mtodo a
utilizar, teniendo en cuenta cual brinda la mayor exactitud y precisin, as como cual podra
brindar menos limitaciones para el anlisis.

Es por estas razones, que se ha realizado la presente investigacin, basndose principalmente
en bibliografa acerca de anlisis instrumental. Claro est que aunque no se pretende profundizar
los aspectos relacionados con cada tcnica, si es importante ser muy puntual en los aspectos
ms importantes de cada una teniendo en cuenta su fundamento y sus aplicaciones que pueda
tener para el campo cientfico en general y en especial en el campo agroindustrial, que nos
concierne.
1

1
Autores

7

MARCO CONCEPTUAL

Absorbancia: es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra

Absorcin: de la radiacin electromagntica es el proceso por el cual dicha radiacin es
captada por la materia. Cuando la absorcin se produce dentro del rango de la luz visible, recibe
el nombre de absorcin ptica. Esta radiacin, al ser absorbida, puede, bien ser reemitida o bien
transformarse en otro tipo de energa, como calor o energa elctrica.

Adsorcin: La adsorcin de una sustancia es su acumulacin en una determinada superficie
interfacial entre dos fases. El resultado es la formacin de una pelcula lquida o gaseosa en la
superficie de un cuerpo slido o lquido.

Anisotropa: (opuesta de isotropa) es la propiedad general de la materia segn la cual
determinadas propiedades fsicas, tales como: elasticidad, temperatura, conductividad, velocidad
de propagacin de la luz, etc. varan segn la direccin en que son examinadas.

Atomizacin:Pulverizacin de lquidos

Calor de radiacin: Energa calorfica que se transmite por la radiacin de ondas
electromagnticas. Tambin llamado calor radiante.

Coeficiente de reparto:se define como la relacin de las concentraciones en equilibrio (ci) de
una sustancia disuelta en un sistema bifsico consistente en dos disolventes considerablemente
inmiscibles.

Desorcin: es el fenmeno por el que una sustancia est lanzada o a travs de una superficie.
Proceso es el contrario de absorcin (es decir, adsorcin y absorcin). Esto ocurre en un sistema
que est en el estado del equilibrio de la absorcin entre la fase a granel (lquido, es decir.
solucin del gas o del lquido) y una superficie adsorbente (slido o lmite que separa dos
lquidos).

Efectividad o selectividad de una columna cromatogrfica: Se dice que una columna es
efectiva cuando las especies a separar se eluyen a velocidades relativas suficientemente
diferentes (los picos estn suficientemente separados).

Eficacia de una columna cromatogrfica: Se dice que una columna es tanto ms eficaz
cuanto menos sea el ensanchamiento de los picos. La eficacia ser mayor cuanta ms pequea
sea la altura de plato y mayor sea el nmero de platos.

Elucin:Es un proceso en el cual los solutos son lavados a travs de una fase estacionaria por
el movimiento de una fase mvil.

Eluyente: Se trata de un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a
travs de una fase estacionaria.


8

Espectro:Es la imagen o registro grfico que presenta un sistema fsico al ser excitado y
posteriormente analizado

Espectro electromagntico: distribucin energtica del conjunto de las ondas
electromagnticas.

Espn: se refiere a una propiedad fsica de las partculas subatmicas, por la cual toda partcula
elemental tiene un momento angular intrnseco de valor fijo.

Factor de retencin (k): tambin conocida como la relacin de capacidad, representa la
relacin de tiempo que el soluto pasa en la fase estacionaria con respecto al que pasa en la fase
mvil.

Fase mvil: consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a
travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido

Flama: Se llama flama a la reaccin qumica de oxidacin violenta de una materia combustible,
con desprendimiento de llamas, calor, vapor de agua y dixido de carbono.}

Frecuencia:Es una magnitud que mide el nmero de repeticiones por unidad de tiempo de
cualquier fenmeno o suceso peridico.

Ionizacin: es el proceso qumico o fsico mediante el cual se producen iones, estos son tomos
o molculas cargadas elctricamente debido al exceso o falta de electrones respecto a un tomo
o molcula neutra.

Isoterma: Laisoterma es una curva que une los puntos, en un plano cartogrfico, que presentan
las mismas temperaturas en la unidad de tiempo considerada.
Istopos: diferentes tipos de tomos de un mismo elemento cuyos ncleos difieren en su nmero
de neutrones.

Ley de beer: La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la
intensidad saliente despus de que en dicho medio se produzca absorcin.

Longitud de onda: La longitud de una onda es la distancia que recorre la onda en el intervalo de
tiempo transcurrido entre dos mximos consecutivos. Por ejemplo, la distancia recorrida por la
luz azul (que viaja a 299.792.458 m/s) durante el tiempo transcurrido entre dos mximos
consecutivos de su campo elctrico (o magntico) es la longitud de onda de esa luz azul.

Momento magntico: El momento magntico de espn es una propiedad intrnseca o
fundamental de las partculas, como la masa o la carga elctrica. Este momento est relacionado
con el hecho de que las partculas elementales tienen momento angular intrnseco o espn, para
partculas cargadas eso lleva inevitablemente a que se comporten de modo similar a un pequeo
circuito con cargas en movimiento.

Mufla:Es una especie de horno, con el cual se alcanzan muy elevadas temperaturas. Se usa
generalmente para carbonizar completamente sustancias orgnicas


9

Nebulizador: Un nebulizador es un aparato elctrico que transforma a los lquidos en un vapor
fino o roco.

Planmetro:El planmetro es un aparato de medicin utilizado para el clculo de reas
irregulares. Este modelo se obtiene en base la teora de integrales de lnea o de recorrido.

Reflectancia:Cantidad de energa que es reflejada por un objeto luego de que esta incide sobre
l.

Resolucin de espectrmetros: la capacidad de un espectrmetro de masas de distinguir entre
masas se expresa normalmente en trminos de su resolucin.

Resolucin de una columna: Parmetro que proporciona una medida cuantitativa de su
capacidad para separar dos solutos. Debe ser mayor a 1,5 para que se considere buena.

Tiempo Muerto: (TM) Es el tiempo que tarda en salir de la columna una sustancia no retenida.

Tiempo de Retencin: (TR) Es el tiempo entre la inyeccin de una muestra y la aparicin de un
pico de soluto en el detector de una columna cromatogrfica.

Transmitancia: La transmitancia o transmitencia es una magnitud que expresa la cantidad de
energa que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo (potencia).

Transicin:Una transicin es la accin y efecto de pasar de un modo de ser o estar, a otro muy
distinto del anterior. Representa un cambio de un estado a otro.

Volatilizacin:Es el proceso que consiste en el cambio de estado de la materia slida al estado
gaseoso sin pasar por el estado lquido


10

1. ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotometra se refiere a los mtodos cuantitativos de anlisis qumico que utilizan la
luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas. Se conocen como mtodos
espectrofotomtricos y segn sea la radiacin utilizada como espectrofotometra de absorcin
visible (colorimetra), ultravioleta e infrarroja.

1.1 FUNDAMENTO

La espectrofotometra es una de las tcnicas ms utilizadas para la deteccin especfica de
molculas, y se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de
distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc.

Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, lo cual indica la absorcin y emisin de
luz a travs de ellas en forma de miles de millones de molculas energticas llamadas fotones,
los cuales contienen una energa segn la teora de Planck.

Las molculas pueden absorber energa y almacenarla en forma de energa interna (calor) esto
permite que se inicien procesos fsico-qumicos tales como la fotosntesis en plantas. La
mecnica cuntica nos dice que la luz est compuesta como ya se mencion, por fotones; cada
uno de ellos contiene energa especial:
foton
hc
E hv

= =

Donde c es la velocidad de la luz, v es su frecuencia, su longitud de onda y
34
6.6 10 h J s
= - (constante de Planck). Cuando decimos que una sustancia qumica absorbe

luz de longitud de onda , esto significa que las molculas de esa sustancia absorben fotones
de esa longitud de onda.

Generalmente la absorcin de luz en el ultravioleta cercano (325 420 ) nm = y en el visible
(420 900 ) nm = absorbe un fotn en este intervalo espectral, se excita pasando un electrn
de un orbital del estado fundamental a un orbital en estado excitado de energa superior. de esta
manera la molcula almacena la energa del fotn.

( )
( ) ( )
foton
A hv E A
E A E A E
-
-
+
= +

Como la mayora se conserva, la diferencia de energa entre el estado fundamental de la
molcula A y su estado excitado A
-
debe ser exactamente igual a la energa del fotn. Es decir,
una molcula solo puede absorber fotones cuya energa hv sea igual a la energa de un estado
molecular excitado. Cada molcula tiene una serie de estados excitados discretos (bandas) que
dependen de su estructura electrnica y que la distinguen del resto de molculas. Como
consecuencia el espectro de absorcin, es decir la luz absorbida en funcin de la longitud de
onda, constituye una verdadera seal de identidad de cada sustancia o molcula. Por lo tanto se
tiene que la absorcin de luz incrementa la energa de una molcula, y que la emisin de luz
reduce su energa.

11

Po P

b
En la figura anterior se puede apreciar el principio de la medicin espectrofotomtrica. Cuando
una muestra absorbe luz, la potencia radiante del haz de luz disminuye. La potencia radiante P
(intensidad de la radiacin despus de pasar por un medio), se evala como energa por
segundo en una unidad de tiempo por unidad de rea del haz de luz.

La grafica muestra que la luz se hace pasar por un monocromador (un prisma, una rejilla de
difraccin o un filtro) para aislar una sola longitud de onda. Esta ultima de potencia radiante Po,
incide sobre una muestra de espesor b. La potencia radiante del haz emergente es P; la muestra
puede absorber una fraccin de la luz, de manera que
0
P P s .

La transmitancia T, se define como la fraccin de la luz incidente que sale de la muestra.
o
P
T
P
=
Por lo tanto, T varia de cero a uno ( 0 1 T s s ).
La absorbancia A se define como:
10
log log
o
P
A T
P
| |
= =
|
\ .

Cuando no se absorbe luz,
o
P P =
y entonces 0 A = . Cuando se absorbe 90% de la luz,
10% de ella se transmite y
10
O
P
P = . Con esto se tiene 1 A= . Cuando solo se transmite el 1%
de la luz, 2 A= .

La absorbancia tambin se llama a veces densidad ptica, que se abrevia DO y en ocasiones se
representa por E. Tambin conocida como la fraccin o trozo de potencia radiante incidente
que absorbe la muestra.

La importancia de la absorbancia estriba en que es directamente proporcional a la concentracin
de la especie absorbente en la muestra:
A bc c =
(Ley de Beer)
c = Constante de proporcionalidad denominada absorbilidad molar
b = longitud del camino ptico
c = concentracin de la muestra

Detector de
luz
Muestra

Selector de
longitud de onda
(monocromador)

Fuente
de luz

12

1.2 EQUIPO: ESPECTROFOTMETRO

http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometria.htm

1.3 PRINCIPIO FISICO

El principio del Espectrofotmetro est basado en la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la
intensidad de luz incidente y la de la luz transmitida, cuando es atravesada una longitud de onda
de un medio que absorbe. Si se registra la transmitancia cuando lo que realmente se desea es la
absorbancia, se puede utilizar la ecuacin de definicin anteriormente dada para convertir una en
otra y obtener la medida que se desea.

1.4 RESULTADOS

Generalmente los resultados obtenidos en graficas muestran unas respuestas dadas por la
longitud de onda del haz de luz vs la absorbancia (transmitancia deducible por formula), la cual
indica la relacin del medio (coeficiente de absorcin, ndice de refraccin, etc), esto conforme a
la ley de Beer, la cual dice que la absorbancia es proporcional a la concentracin del cromforo
absorbente y al espesor de la celda. Tambin se pueden encontrar respuestas con base en
graficas entre longitud de onda vs ndice de refraccin del medio las cuales hablan de cmo se
desviara o cambiara la longitud de onda
respecto a tipo de material o medio por el cual se

desplace.

Curva de Calibracin: Con los datos de la parte recta de la curva de Ringbom se construye la
curva de calibracin Absorbancia (en la ordenada) vs. Concentracin (en laabscisa) previo ajuste
de los datos por mnimos cuadrados (que incluyen el punto 0.0, 0.0000) revisando que el
coeficiente de correlacin sea estadsticamente significativo. La grfica de la recta de calibracin
debe incluir los puntos experimentales. La recta ajustada tambin se conoce con el nombre de
curva de trabajo.

1.5 APLICACIONES

Para que un compuesto pueda ser analizado mediante espectrofotometra debe absorber luz, y
esta absorcin debe ser distinguible de otras absorciones de especies presentes en la muestra.

13

En vista de que la mayora de los compuestos absorben la radiacin ultravioleta, estos
resultados suelen dirigirse al espectro visible. Sin embargo, cuando no hay especies que
interfieran, la absorbancia ultravioleta suele ser muy til.

Las soluciones de protenas normalmente se analizan en la regin de ultravioleta a 280 nm,
debido a que los grupos aromticos presentes en casi todas las protenas tienen una mxima
absorbancia de 280 nm.El hierro para biosntesis se transporta en el flujo sanguneo unido a la
protena transferrina. El procedimiento que se utiliza para medir el contenido de hierro en esa
protena de transporte. Este anlisis es muy sensible ya que necesita
6
1 10 g g

= de hierro
para obtener una exactitud de un rango entre el 2-5%. La sangre humana contiene normalmente
45% (V/V) de clulas y 55% de plasma (liquido). Si la sangre se colecta sin un anticoagulante, se
coagula, y el lquido que queda se llama suero.

1. El Fe (III) en la transferrina se reduce a Fe (II), y de este modo se separa de la protena. Los
agentes reductores que se emplean normalmente son clorhidrato de hidroxilamina (
3
NH OH Cl
+ ), acidotioglicolico o cido ascrbico Vita. C.

2. Se agrega cido tricloroactico
3 2
( ) Cl CCO H para precipitar todas las protenas, dejando al Fe
(II) en solucin. Las protenas se eliminan por centrifugacin. Si se les dejara en solucin,
precipitaran parcialmente en la solucin final. Las partculas de precipitado serian consideradas
errneamente absorbentes de luz por el espectrofotmetro.

3. Un volumen medido del lquido sobrenadante que se obtuvo en el paso 2 se transfiere a un
recipiente y se trata con un exceso de ferrozina para formar el complejo purpura, y se mide su
absorbancia. Tambin se agrega una solucin patrn para mantener el pH en un intervalo en el
que la formacin del complejo ferrozina-hierro sea cuantitativa.

En la mayora de los anlisis espectrofotomtricos es importante preparar un blanco que
contenga todos los reactivos, pero en que el analito se ha sustituido por agua destilad. Cualquier
absorbancia del blando se debe al color de la ferrozina no complejadamas el color de las
impurezas de hierro en los reactivos y en el material de vidrio. La absorbancia del blanco se
resta se resta de todas las absorbancias antes de hacer cualquier clculo.

1.6 APLICACIONES AGROINDUSTRIALES

El primer uso industrial de la espectrofotometra y colorimetra estuvo en la industria de la
pintura. El objetivo principal era intentar mantener las partidas de pintura lo ms similares posible
entre ellas y as reducir al mnimo las diferencias cuando se deba retocar de nuevo la pintura. Al
final de los aos ochenta, los primeros espectrofotmetros y especialmente la colorimetra se
abrieron camino en las imprentas. La industria qumica, petroqumica, farmacutica, del vidrio,
pinturas, papel, automotriz, textil entre otras, requieren de instrumentos pticos (espectro
colormetros, colormetros y espectrofotmetros) para llevar a cabo las mediciones de color de
manera confiable (anlisis cualitativo, medicin de color, pureza, control de calidad, aceptacin o
rechazo de producto terminado, anuncios y seguridad, uniformidad e igualacin del color, etc.),
por lo que se requiere calibrar los equipos y asegurar su trazabilidad a patrones nacionales y
con ello determinar la exactitud y compatibilidad de los resultados de las mediciones


14

2. ESPECTROMETRIA DE ULTRAVIOLETA-VISIBLE

2.1 FUNDAMENTO DE LA TCNICA

La espectrometra de Ultravioleta Visible utiliza radiacin electromagntica (luz) de las regiones
visible, ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagntico (160nm
- 780nm). La radiacin absorbida por las molculas desde esta regin del espectro provoca
transiciones electrnicas que pueden ser cuantificadas.

Esta se basa en la medida de la transmitancia T o de la absorbancia A de disoluciones que se
encuentran en cubetas transparentes que tienen un camino ptico de b cm. Normalmente, la
concentracin c de un analito absorbente est relacionada linealmente con la absorbancia como
representa la ecuacin:

Esta ecuacin es una representacin matemtica de la Ley de Beer
Trmino y Smbolo* Definicin Nombre y smbolo alternativo
Potencia Radiante P, P0 Energa (en ergios) de la
radiacin que incide en el
detector, por cm
2
y por
segundo
Intensidad de la radiacin I, I0
Absorbancia A

Densidad ptica D; extincin
E
Transmitancia T

Transmisin T
Camino ptico de la
radiacin b
--- l, d
Absortividada

Coeficiente de extincin k
Absortividad molar

Coeficiente de extincin molar
*Terminologa recomendada por la American ChemicalSociety (Anal. Chem., 1990, 62, 91)

Atenuacin de una radiacin con una potencia inicial P0 por una disolucin que contiene c moles
por litro de soluto absorbente y con un camino ptico de b cm P < P0


15

La ley de Beer describe de forma correcta el comportamiento de absorcin de un medio que
contiene concentraciones de analito relativamente bajas; en este sentido es una ley lmite. A
concentraciones altas (generalmente >0.01M), la distancia media entre las molculas
responsables de la absorcin disminuye hasta el punto en que cada molcula altera la
distribucin de carga de las molculas vecinas. Esta interaccin, a su vez, puede alterar la
capacidad de las molculas para absorber la radiacin de una determinada longitud de onda.
Como la magnitud de la interaccin depende de la concentracin, la aparicin de este fenmeno
da lugar a desviaciones de la linealidad entre la absorbancia y la concentracin.

2.2 EQUIPO: ESPECTRMETRO DE UV-VISIBLE

El cientfico interesado en medidas de absorcin en las regiones ultravioleta, visible e infrarrojo
cercano no dispone de cien o ms modelos de instrumentos para elegir. Algunos son sencillos y
baratos (unos cientos de dlares); otros son equipos complejos, informatizados cuyo precio
asciende y supera los 30.000 dlares. Para muchas aplicaciones, los instrumentos ms sencillos
proporcionan informacin tan rpida y satisfactoria como la obtenida con los equipos ms
sofisticados. Por otra parte, los instrumentos ms complejos se han desarrollado para realizar
tareas difciles, que requieren mucho tiempo, o imposibles de realizar con los ms sencillos.

Los instrumentos para medir la absorcin de radiacin ultravioleta, visible y en el infrarrojo
cercano estn compuestos por uno o ms de los siguientes componentes: (1) Fuentes, (2)
selectores de longitud de onda, (3) recipientes para la muestra, (4) detectores de radiacin y (5)
procesadores de seal y dispositivos de lectura.

Espectrmetro de UV-Visible. Fuente: http://ictp.csic.es


16

Diseos instrumentales para fotmetros y espectrofotmetros: (a) instrumentos de Haz sencillo,
(b) instrumentos de doble haz con haces separados en el espacio, (c) instrumentos de doble haz
con haces separados en el tiempo. SKOOG 5 ED

2.3 PRINCIPIO FSICO

Una molcula es capaz de absorber radiacin ultravioleta-visible, causando una excitacin
electrnica. El tiempo de vida de la especie excitada es breve (10
-8
a 10
-9
s), su existencia
termina por un proceso de relajacin. La forma de relajacin ms comn supone la conversin
de la energa de excitacin en calor. Existen tres tipos de transiciones electrnicas y las especies
absorbentes se clasifican dentro de esa base. Dichas transiciones incluyen: (1) electrones , y
, (2) electrones d y f, (3) electrones de transferencia de carga.


17

2.3.1 Electrones , y

Todos los compuestos orgnicos son capaces de absorber radiacin electromagntica porque
todos contienen electrones de valencia que pueden ser excitados a niveles de energa
superiores. A menor longitud de onda, mayor energa absorbida.
La energa para los distintos tipos de orbitales moleculares difiere significativamente. Las
transiciones electrnicas entre los distintos niveles de energa se pueden producir por absorcin
se radiacin. Son posibles cuatro tipos de transiciones: *, *, * y *.

2.3.1.1 Transiciones *

En este caso, un electrn de orbital sigma enlazante de una molcula se excita al
correspondiente orbital antienlazante mediante la absorcin de radiacin. La energa requerida
para esta transicin es grande. El metano, por ejemplo que solo contiene enlaces sencillos C-H y
que solo puede sufrir transiciones se este tipo, presenta un mximo de absorcin a 125nm.

2.3.1.2 Transiciones *

Los compuestos saturados que contienen pares de electrones no compartidos son capaces de
sufrir estas transiciones. Estas requieren menos energa que las anteriores y se pueden producir
por radiacin e la regin comprendida entre 150 y 250nm, apareciendo, la mayora de los picos
de absorcin, por debajo de 200nm.

2.3.1.3 Transiciones * y *

Esta es la ms usada en las aplicaciones de esta espectrometra porque la energa utilizada para
estos procesos produce picos de absorcin dentro de una regin espectral experimentalmente
accesible (200 a 700nm)

18

Caractersticas de absorcin de algunos cromforos comunes. SKOOG 5 ED

La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, stos son promovidos a estados
excitados (de energa mayor). Al absorber radiacin electromagntica de una frecuencia
correcta, ocurre una transicin desde uno de estos orbitales a un orbital vaco. Las diferencias
entre energas varan entre los diversos orbitales. Algunos enlaces, como los dobles, provocan
coloracin en las molculas ya que absorben energa en el visible as como en el UV, como es el
caso del -caroteno.

Cuando un haz de radiacin UV-Visible atraviesa una disolucin conteniendo un analito
absorbente, la intensidad incidente del haz (P0) es atenuada hasta P. Esta fraccin de radiacin
que no ha logrado traspasar la muestra es denominada transmitancia (T). Por aspectos
prcticos, se utilizar la absorbancia (A) en lugar de la transmitancia, por estar relacionada
linealmente con la concentracin de la especie absorbente segn la Ley de Beer.

19

2.4 RESULTADOS
Las aplicaciones de la espectrofotometra
ultravioleta y visible en el anlisis cualitativo
estn en cierta medida limitadas, ya que el
nmero de mximos y mnimos de absorcin es
relativamente pequeo. Por tanto, una
identificacin inequvoca es a menudo imposible.
En espectroscopia molecular cualitativa existen
diferentes tipos de registros espectrales. Lo ms
habitual es representar en ordenadas el
porcentaje de transmitancia, la absorbancia, el
logaritmo de la absorbancia o la absortividad
molar. En abscisas es habitual representar la
longitud de onda o el nmero de onda, aunque
en algunas ocasiones se emplea la frecuencia.
La figura muestra el efecto de la concentracin
de analito en tres de los modelos de registros
ms comunes. Al comparar los registros (a) y (b)
se observa que en el registro de absorbancia las
diferencias entre las alturas de los picos en
funcin de la concentracin son mayores que en
el registro de transmitancia. Por otra parte, las
diferencias entre las curvas son mayores cuando
las transmitancias son elevadas. Un registro en
el que en ordenadas se representa el logaritmo
de absorbancia, conduce a una prdida de
detalle espectral, pero es conveniente para
comparar espectros de disoluciones de distintas
concentraciones, ya que las curvas se desplazan
la misma magnitud a lo largo del eje vertical para
mltiplos iguales de concentracin.

2.5 APLICACIONES

Las aplicaciones de los mtodos de absorcin
ultravioleta/visible no slo son numerosas sino
que abarcan todos los campos en los que se demanda informacin qumica cuantitativa. Por
ejemplo, se ha estimado que solamente en el campo de la sanidad, un 95% de las
determinaciones cuantitativas de llevan a cabo por espectrofotometra de ultravioleta/visible.


Estudio de estabilidad trmica de aceites vegetales comestibles. Tiene gran importancia con
fines de identificacin, como criterio de pureza o para control de calidad

- Anlisis qumicos y texturales, estudio de aleaciones, soldaduras, etc.

20

- Microanlisis no destructivo de muestras valiosas (joyera, gemologa, etc.)
- Anlisis de pigmentos industriales.
- Determinacin de estructuras moleculares en cristales.
- Identificacin y anlisis de compuestos orgnicos.
- Determinacin de estructuras moleculares en cristales.
- Identificacin de material particulado (ltex, liposomas, arcillas, etc.)
- Determinacin de contaminantes orgnicos, inorgnicos y pesticidas a nivel de trazas.


21

3. ESPECTROMETRA DE ABSORCIN EN EL INFRARROJO

3.1 FUNDAMENTO

Tanto desde el punto de vista instrumental como de sus aplicaciones es conveniente dividir la
regin infrarroja en tres regiones denominadas infrarrojo cercano (NIR), infrarrojo medio (MIR) e
infrarrojo lejano (FIR). La gran mayora de las aplicaciones analticas clsicas de la
espectroscopia infrarroja se basan en el empleo del infrarrojo medio (4000-200 cm
-1
) y el
infrarrojo cercano (12.800-4000 cm
-1
), que proporciona la posibilidad de convertir esta tcnica en
una tcnica cuantitativa. La tcnica de transformada de Fourier supuso una revolucin en la
espectroscopia en general y particularmente en este tipo de espectroscopia, permitiendo la
obtencin de espectros de forma rpida, precisa y con relaciones Seal/Ruido (S/N) elevadas.

El origen de la absorcin de las bandas en el infrarrojo cercano es el mismo que para las bandas
del IR medio: una molcula absorbe radiacin electromagntica en esta regin si la energa de la
radiacin corresponde a la diferencia energtica entre 2 niveles vibracionales, adems de
producirse un cambio en el momento bipolar de la molcula. Cuando se dan stas dos
circunstancias, ocurre una transferencia neta de energa que da lugar a un cambio en la
amplitud de la vibracin molecular y como consecuencia absorbe la radiacin.

El fenmeno espectroscpico que provoca la absorcin de energa por parte de la materia es
debido: a las rotaciones moleculares en el IR lejano, a bandas fundamentales de vibracin en el
IR medio, y finalmente a bandas de combinacin de las bandas fundamentales y a sobretonos en
el IR cercano.

Cuando se trata de especies homonucleares como O2, N2, o Cl2, el momento bipolar no se altera
durante la vibracin o la rotacin y, en consecuencia, este tipo de compuestos no absorben
radiacin en el infrarrojo.

Los movimientos vibratorios que presenta una molcula pueden ser bsicamente de dos tipos:

Estiramiento. Se produce un cambio en la distancia interatmica a lo largo del eje del enlace de
dos tomos durante la vibracin.

Flexin. Adems de la modificacin en la distancia interatmica se produce un cambio en el
ngulo de enlace.

A diferencia del infrarrojo medio, en la regin del NIR no aparecen las bandas de vibracin
fundamentales ( ) 1 u A = .


22

http://www.ehu.es/imacris/PIE06/web/IR.htm

3.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO DE ABSORCIN EN EL INFRARROJO

Los equipos pueden clasificarse bsicamente en dos tipos: dispersivos y no dispersivos. Dentro
de los sistemas dispersivos que descomponen la luz policromtica que proviene de la fuente de
radiacin en longitudes de onda discretas. La radiacin entra en forma de haz estrecho y un
elemento dispersante, que puede ser un prisma o una red de difraccin, la descompone. Los
ms utilizados actualmente son ms baratos, proporcionan mejor separacin de longitudes de
onda y dispersan linealmente la radiacin.

El conjunto de sistemas no dispersivos es ms amplio debido a su mayor utilizacin actualmente.
Dispone de equipos con filtros adicionales, con filtros optoacsticos (AOTF) e instrumentos de
transformada de Fourier (FT), ambos con caractersticas bastante diferentes entre s. La
seleccin de longitudes de onda mediante filtros se realiza interponiendo materiales especficos
entre la muestra y la fuente de radiacin, permitiendo el paso de longitudes de onda selectivas.


23

Espectrmetro BRUKER IFS 66, es capaz de trabajar con una resolucin de hasta 1cm
-1
.
Dispone de una fuente de IR medio (tipo) con un rango de trabajo entre 9000-100 cm
-1
. La
utilizacin de un divisor de haz de KBr y un detector DLaTGS limita la obtencin de espectros de
calidad al rango 7000-400 cm
-1
, aunque existe la posibilidad de aumentar este rango hasta los
200cm
-1
con la utilizacin de distintos divisores de haz.

3.3. PRINCIPIO FSICO

Debido a la baja intensidad de las bandas NIR, el nivel de exigencia de los espectrofotmetros
NIR, en trminos de nivel de ruido permisible y estabilidad instrumental, debe ser mayor que en
otros instrumentos, sobre todo si se pretende aplicar al anlisis cuantitativo. sta es una de las
causas de la tarda aparicin de los primeros espectrofotmetros NIR. El esquema bsico de un
instrumento NIR no difiere de cualquier espectrofotmetro. Sus componentes bsicos son: fuente
de radiacin, sistema de seleccin de longitud de onda, compartimiento de muestra y detector.

3.3.1 Fuente de radiacin

La fuente de radiacin ms utilizada es la lmpara halgena de filamento de tungsteno con
ventana de cuarzo, capaz de proporcionar un espectro continuo en la regin de 320-2500nm.

3.3.2 Sistemas de seleccin de longitudes de onda

Es el componente esencial que permite obtener la informacin espectral a cada longitud de
onda. El selector debe proporcionar un ancho de banda estrecho respecto al ancho de banda
que est midiendo y debe ser preciso y exacto para la longitud de onda analtica.

3.3.3 Compartimiento de muestra

Los instrumentos NIR permiten registrar el espectro tanto de muestras slidas, lquidas y
gaseosas. La ausencia de pretratamiento de muestra para el registro de su espectro, permite
disponer de gran cantidad de accesorios adaptables a cada situacin.

3.3.4 Detector

Es el dispositivo encargado de recibir la seal luminosa que proviene de la muestra y la
transforma en seal elctrica. Detectores habituales en espectroscopia en el infrarrojo prximo
son los construidos con semiconductores (como InGaAs, PbS, InSb, Si,). Hasta 1100nm el
semiconductor ms utilizado en los detectores es el Su, y en la regin entre 1100 y 2500nm el
material fotoconductivo ms utilizado es el PbS.

3.4. RESULTADOS

Como normalmente sucede en la escala se representa una escala lineal de nmero de onda de
unidades de cm
-1
. La mayora de los instrumentos modernos utilizan un microordenador con un
software verstil capaz de producir diversos formatos de seales de salida, tales como

24

transmitancia frente a la longitud de onda, y la absorbancia frente a nmero de onda o longitud
de onda.

La preferencia por la escala lineal de nmero lineal de nmero de onda, en espectroscopia en el
infrarrojo, se debe a la directa proporcionalidad que existe entre esta magnitud y la energa o la
frecuencia. La frecuencia de la radiacin absorbida coincide con la frecuencia de la vibracin
molecular, que en realidad es la responsable del proceso de absorcin.

Se destaca que la abscisa de la figura cambia de escala a partir de 2.000 cm
-1
. Esta
discontinuidad se introduce por comodidad, dado que en los espectros de infrarrojo la mayora
de los detalles tiles, desde el punto de vista cualitativo, aparecen a nmero de onda inferiores a
2.000 cm
-1
.

Espectro de absorcin en el infrarrojo de una pelcula delgada de poliestireno obtenido con un
moderno espectrofotmetro de IR.
(Skoog D., Holler J., Nieman T., 2000, pg. 410,411)

3.5. APLICACIONES

Las tcnicas y las aplicaciones de los mtodos basados en cada una de las tres regiones del
espectro infrarrojo difieren considerablemente. Las medidas de infrarrojo cercano se realizan con
fotmetros y espectrofotmetros similares, en cuanto a su diseo y componentes. Las
aplicaciones ms importantes de sta regin espectral se encuentran en el anlisis cuantitativo
de materiales industriales y agrcolas y en los procesos de control.

La mayora de los instrumentos para la regin de infrarrojo medio o fundamental son del tipo de
transformada de Fourier. Los fotmetros con filtros de interferencias tambin son tiles para
medir la composicin de los gases y de los contaminantes atmosfricos.


25

La aparicin, en la ltima dcada de espectrmetros de transformada de Fourier ha aumentado
el nmero y tipo de aplicaciones de la radiacin del infrarrojo medio; este incremento radica en el
aumento de la relacin seal/ruido, y de los lmites de deteccin, en un orden de magnitud e
incluso mayor, que pueden conseguirse son los instrumentos interferomtricos.

Antes en la espectrometra de infrarrojo medio se utilizaba en su mayor parte para el anlisis
orgnico cualitativo y la determinacin estructural, teniendo como base los espectros de
absorcin. Ahora como contraste, la espectrometra en el infrarrojo medio se est comenzando a
utilizar adems en el anlisis cuantitativo de muestras complejas, mediante espectrometra de
absorcin y emisin. Tambin han empezado a aparecer aplicaciones de esta regin espectral
en los estudios microscpicos de superficies, anlisis de slidos mediante reflectancia total
atenuada y reflectancia difusa, medidas fotoacsticas y otras.

El uso de la regin del espectro del infrarrojo lejano, las pocas fuentes de este tipo de radiacin
disponibles son notoriamente dbiles y adems se ven atenuadas por la necesidad de utilizar
filtros de seleccin de rdenes espectrales para evitar que la radiacin de mayores rdenes que
emerge de la red de dispersin alcance el detector.

3.6. APLICACIONES AGROINDUSTRIALES

El servicio de Espectroscopia Infrarroja en las industrias agroalimentarias es de gran importancia
para llevar a cabo funciones como las siguientes:
- Anlisis de relaciones entre C, N, H y S en suelos agrcolas
- Determinacin de la composicin crnica de embutidos y conservas
- Control de calidad, especialmente en cuanto a adulteraciones de aceite de oliva y
azucares en zumos
- Determinacin de contaminantes orgnicos y pesticidas a nivel de trazas
- Determinacin de cidos grasos y grasas
- Anlisis de aminocidos
- Anlisis de composicin y control de calidad de derivados del petrleo


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4. ESPECTROMETRIA DE MASAS

4.1. FUNDAMENTO

La espectroscopia de masas es una tcnica basada en la posibilidad de separar especies
moleculares y atmicas segn su masa. Los espectros de masas se obtiene por conversin de
los componentes de una muestra en iones gaseosos que se mueven rpidamente y se separan
en funcin de su relacin masa-carga.

La espectrometra de masas atmicas es una herramienta muy verstil y til para identificar los
elementos presentes en una muestra y determinar las concentraciones de cada una de las
materias que la componen. Esta tcnica nos permite determinar prcticamente todos los
elementos del sistema peridico.

Esta tcnica ofrece numerosas ventajas frente a las tcnicas espectromtricas ya que:

- Los lmites de deteccin que son, para muchos elementos, tres rdenes de magnitud
ms sensibles frente a los mtodos pticos.
- No implica la absorcin o emisin de luz
- Espectros notablemente ms sencillos, generalmente nicos y con frecuencia fcilmente
interpretables.
- Capacidad para medir relaciones isotpicas atmicas.
- Es una tcnica universal y especifica
- Permite obtener informacin isotpica, estructural, energias de enlace, cintica,
fisicoqumica etc.
- Es una tcnica rpida

En cambio, tambin tienen una serie de desventajas que no se pueden obviar como:

- El coste del instrumento es de dos a tres veces el de los instrumentos pticos atmicos.
- Es una tcnica destructiva, la muestra no se puede recuperar integra, al haber sufrido la
fragmentacin.
- La deriva del instrumento puede ser del orden del 5 o 10%/hora.
- Contiene unas determinadas interferencias.


27

4.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO DE MASAS

Bsicamente un espectrmetro de masas consta esencialmente de las siguientes partes:

www.espectrometria.com

4.2.1 Sistema de entrada de muestras

En el sistema de entrada de muestras, un micromol o menos de muestra se convierten al estado
gaseoso por calentamiento a unos 400C y se introduce lentamente en la cmara de ionizacin.
La finalidad del sistema de entrada es permitir la introduccin de una muestra representativa en
la fuente de iones con la mnima perdida de vaco.

4.2.2 Cmara de ionizacin

Las fuentes de iones de los espectrmetros de masas, tienen todas unas caractersticas
comunes, pese a la variabilidad de tipos existente y es que todas transforman los componentes
de una muestra en iones. En todos los casos, se obtiene un haz de iones positivos o negativos
(normalmente positivos) que posteriormente se acelera hacia el interior del analizador de masas
o sistema separador a travs del acelerador

4.2.3 Acelerador:

En el sistema acelerador las partculas ionizadas producidas por el impacto de los electrones son
obligados a atravesar una primera ranura aceleradora por una pequea diferencia de potencial.
Entre esta primera y una segunda ranura existe una diferencia de potencial muy elevada que
imprime a las partculas su velocidad final. Una tercera ranura acta como colimador del haz de
partculas

4.2.4 Analizadores

Para la separacin de iones con diferente relacin m/e se dispone de varios dispositivos. Lo ideal
es que el analizador fuera capaz de distinguir entre diferencias muy pequeas de masa.
Adems, los analizadores deberan de permitir el paso del nmero suficiente para producir
corrientes inicas fciles de medir.


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4.2.5 Detector

Los iones procedentes del sistema acelerador llegan al detector el cual generalmente est
constituido por un ctodo emisor que al recibir el impacto producido por las partculas cargadas
emite electrones. Estos electrones son acelerados hacia un dinodo el cual emite varios
electrones ms al recibir el impacto de cada electrn.

Componentes de un Espectrmetro de Masas. Skoog 4ed pg. 494

Entre las caractersticas del espectrmetro de masas se encuentran:
- Aplicaciones principales: Determinacin de la estructura e identidad de compuestos
orgnicos.
- Fenmeno molecular: Ionizacin y rompimiento de la molcula en fragmentos de iones.
- Ventajas en el anlisis cualitativo: Peso molecular preciso, masas de partes integrantes
de la molcula, muy alta sensibilidad, deteccin de impurezas.
- Ventajas en el anlisis cuantitativo: Alta sensibilidad.
- Muestra promedio deseable: <1 mg
- Limitaciones del mtodo: No siempre puede diferenciar entre estructuras ismeras.
- Limitaciones para la muestra: Ninguna


La espectrometra de masas se fundamenta en la separacin de partculas moleculares o
atmicas por su diferente masa. En la ionizacin por impacto electrnico, se bombardea la
molcula con un haz de electrones de alta energa. Un electrn de este tipo puede arrancar un
electrn de un enlace creando un catin radical (ion positivo con un electrn desapareado). Para
esto se debe hacer un proceso de cuatro pasos en el que se ioniza la muestra para que
posteriormente los tomos formados sean convertidos en un flujo de iones generalmente de
positivos y de carga nica. Dado que estos tienen una sola carga y que el resto de parmetros
se mantienen constantes, la relacin m/e suele ser la masa del in.El ordenador al que est

29

conectado el aparato recoge las distintas seales y las reproduce en forma de espectrograma,
formato de fcil interpretacin.

4.4. RESULTADOS

El espectro de masas se presenta habitualmente como un grfico de barras, en la que cada una
de ellas corresponde a un in. La informacin proporcionada incluye la relacin m/z y la
intensidad relativa de cada seal. A la ms intensa, denominada pico base, se le asigna el valor
100. Como la mayor parte de los iones formados tiene carga unidad, las relaciones m/z se
correspondes con sus masas. El in molecular es el in que resulta tras la prdida de un electrn
por parte de la molcula. Como consecuencia del bombardeo electrnico en la cmara de
ionizacin, las molculas se rompen en una serie de fragmentos, siempre que una misma
molcula se rompa en las mismas condiciones nos dar el mismo tipo y nmero de fragmentos y
constituyen la fragmentacin patrn. Gracias a esto se pueden determinar que es la muestra por
comparacin y por otra parte, la intensidad relativa de los distintos picos, permite deducir la
proporcin en que cada componente se encuentra en la muestra.

El pico del espectrograma que aparece con valor ms elevado de m/e corresponde a la molcula
ionizada sin fragmentar y recibe el nombre de masa patrn. Esta masa patrn nos permite
determinar con rapidez y precisin la masa molecular, siempre que se opere con una tensin de
ionizacin no excesivamente elevada, la cual producira la fragmentacin total de la molcula El
pico mayor del espectrograma de masa se llama pico base. Normalmente la altura de este pico
se toma como valor cien. Las intensidades de los dems picos se expresan en porcentajes de la
intensidad del pico base.

Aspecto clsico de un espectrograma de masas, en el que se sealan su pico base y su in
molecular ms importante. La tabla situada a la derecha nos indica la concentracin y la relacin
m/z de cada uno de los elementos presentes en el analito

http://mural.uv.es/caloan/


30

4.5. APLICACIONES

4.5.1 Aplicaciones cualitativas

- Determinacin del peso molecular de todas las sustancias que pueden volatilizarse por
la posicin del pico correspondiente a la masa patrn.

- Determinacin de la formula molecular. Si el instrumento es de gran resolucin bastar
la determinacin precisa de su masa molecular para poder atribuirle una frmula
emprica. Otras veces puede determinarse por la relacin entre las alturas del pico
correspondiente a la masa patrn y la de los picos de los istopos. Existe una tercera
forma que sera con la regla del nitrgeno, segn la cual todas las sustancias orgnicas
con peso molecular par deben de contener un nmero par o ningn tomo de N y los de
nmero impar deben de contener un nmero impar. Por el contrario los fragmentos
moleculares por rotura de enlace, tienen una masa impar si contienen cero o nmero par
de tomos de N y masa par si el nmero de tomos de N es impar.

- Identificacin de compuestos por su fragmentacin patrn: la fragmentacin de la mayor
parte de las molculas produce un gran nmero de picos que permiten la identificacin
de numerosos compuestos y el reconocimiento de ciertos grupos funcionales de ellos.
Se han descrito una serie de reglas generales que rigen los procesos de fragmentacin,
los cuales son de gran utilidad para la determinacin de los espectros.

- Caracterizacin y anlisis de polmeros: el polmero se piroliza en condiciones
controladas y los productos voltiles se hacen pasar a un espectrmetro para su
anlisis.

- Anlisis de sangre: gracias ala rapidez del mtodo, se puede emplear incluso como
control durante un proceso quirrgico. As se puede determinar a gran velocidad las
concentraciones hemticas de monxido y dixido de carbono, oxgeno, nitrgeno,
gases anestsicos (como el NO).


31

- Estudiar la abundancia de istopos: Esta fue la finalidad con la que fue creada la tcnica
y en la actualidad se usa para anlisis por dilucin de istopos, estudios con trazadores
isotrpicos 5, estudiar la edad de las muestras por su proporcin de istopos con la
ventaja frente a los radiactivos que se pueden medir los istopos no radiactivos.

4.5.2 Aplicaciones cuantitativas

Para la determinacin cuantitativa de los componentes de una mezcla es conveniente que cada
uno de ellos presente por lo menos un pico que difiera claramente de los dems. La calibracin
se realiza por comparacin de los picos con patrones adecuados. Las alturas de los picos son
directamente proporcionales a las presiones parciales de los componentes volatilizados en la
muestra.

Las aplicaciones cuantitativas de la espectrometra de masas para anlisis cuantitativo son de
dos tipos:

- Determinacin cuantitativa de especies moleculares o tipos de especies moleculares en
muestras orgnicas, biolgicas y ocasionalmente inorgnicas: normalmente tales
anlisis se llevan a cabo haciendo pasar la muestra a travs de una columna
cromatrogrfica o de electroforesis capilar y posteriormente por el espectrmetro.

- Determinacin de la concentracin de elementos en muestras inorgnicas y, en menor
medida, de muestras orgnicas y biolgicas: las concentraciones de analito en este caso
se obtienen directamente a partir de las alturas de los picos de los espectros de masas.
Se crean curvas de calibrado que nos permiten el anlisis cuantitativo gracias a la
existencia de picos nicos para cada componente y cada valor de m/z.

Las aplicaciones son tan numerosas y abarcan tantos campos que resulta complicado citarlas
todas, a continuacin veremos las ms caractersticas:

- Elucidacin de la estructura de molculas orgnicas y biolgicas.
- Determinacin del peso molecular de pptidos, protenas y oligonucleicos.
- Identificacin de los compuestos de cromatogramas en capa fina y papel.
- Determinacin de secuencias de aminocidos en muestras de polipptidos y protenas.
- Deteccin e identificacin de especies separadas por cromatrografa y electroforesis
capilar.
- Identificacin de drogas de abuso y sus metabolitos en sangre, orina y saliva.
- Control de gases en enfermos respiratorios durante los procesos quirrgicos.
- Pruebas para confirmar la presencia de drogas en sangre de caballos de carreras y en
atletas olmpicos.
- Datacin de ejemplares en arqueologa.
- Anlisis de partculas en aerosoles.
- Control de compuestos orgnicos voltiles en el agua de suministro


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Se han desarrollado protocolos de anlisis rpidos y fiables que permiten garantizar la calidad y
seguridad alimentaria en alimentos bsicos como la leche y el contenido de especies txicas de
As y Hg en productos de la pesca, alimento que aporta a la dieta uno de los niveles ms altos de
estos dos metales pesados. En el diseo de protocolos siempre se ha buscado minimizar el
tratamiento previo de la muestra, el uso de reactivos menos peligrosos y la mnima generacin
de residuos.

- Determinar la adulteracin de la miel de abeja
- Monitorear fermentaciones en lnea (industria biotecnolgica)
- Determinar contaminantes orgnicos en aire, suelo, aguas y alimentos
- Identificacin de productos de reaccin o de productos metablicos: se usa en cintica
qumica y en farmacologa pudindose llegar a identificar impurezas y metabolitos a
concentraciones de pocas partes por milln.
- Determinacin de residuos de pesticidas en alimentos.
- Caracterizacin de aromas, de protenas de vinos
- Anlisis de procesos industriales, control de calidad de productos de qumica fina e de
industrias alimenticias


33

5. ESPECTROMETRIA DE ABSORCION ATOMICA

5.1 FUNDAMENTO DE LA TECNICA

La espectrometra de absorcin atmica es un mtodo instrumental que se basa en la absorcin,
emisin y fluorescencia de radiacin electromagntica por partculas atmicas. Se emplean
principalmente radiaciones del espectro ultravioleta (UV) y visible y Rayos X.

Consiste en la medicin de las especies atmicas por su absorcin a una longitud de onda
particular. La especie atmica se logra por atomizacin de la muestra. La tcnica de atomizacin
ms usada es la absorcin atmica con flama o llama, que nebuliza la muestra y luego la
disemina en forma de aerosol dentro de una llama de aire de acetileno u xido nitroso-acetileno.

La absorcin de la luz por medio de tomos brinda una herramienta analtica poderosa para los
anlisis cuantitativos y cualitativos. La espectrometria de absorcin atmica se basa en el
principio que los tomos libres en estado fundamental pueden absorber la luz a una cierta
longitud de onda. La absorcin es especfica, por lo que cada elemento absorbe a longitudes de
onda nicas. Es una tcnica analtica aplicable al anlisis de trazas de elementos metlicos en
minerales, muestras biolgicas, metalrgicas, farmacuticas, aguas, alimentos y de medio
ambiente.

La espectrometra de absorcin atmica transforma la muestra problema (que puede encontrarse
en disolucin o slida) en tomos en estado de vapor y medir la radiacin electromagntica
absorbida por dichos tomos.

La mayor parte de la informacin til se obtiene operando en las regiones UV, visible y rayos X.
Los espectros atmicos estn constituidos por picos estrechos y bien definidos que se originan
por transiciones entre los diferentes niveles de energa electrnica, estas lneas de resonancia
tienen origen en el estado basal y un destino en diferentes estados excitados.

La absorcin atmica es el proceso que ocurre cuando tomos de un elemento en estado
fundamental absorben energa radiante a una longitud de onda especfica. La cantidad de
radiacin absorbida aumenta al incrementar el nmero de tomos del elemento presentes en el
camino ptico, esto permite utilizar a la absorcin atmica con fines cuantitativos. Este mtodo
puede detectar cantidades tan bajas como 10-14gramos. La absorcin de radiacin por tomos
libres involucra una transicin de estos tomos desde el altamente poblado estado basal hasta
un estado electrnico excitado.


34

5.2 EQUIPO: ESPECTRMETRO DE ABSORCIN ATMICA

http://www.google.com.co/images?hl=es&q=espectrometria%20de%20absorcion%20atomica&u
m=1&ie=UTF-8&source=og&sa=N&tab=wi&biw=1024&bih=575

Es un mtodo instrumental que est basado en la atomizacin del analito en matriz lquida y que
utiliza comnmente un nebulizador pre-quemador (o cmara de nebulizacin) para crear una
niebla de la muestra y un quemador con forma de ranura que da una llama con una longitud de
trayecto ms larga. La niebla atmica es desolvatada y expuesta a una energa a una
determinada longitud de onda emitida ya sea por una Lmpara de Ctodo hueco construida con
el mismo analito a determinar o una Lmpara de Descarga de Electrones (EDL). Normalmente
las curvas de calibracin no cumplen la Ley de Beer-Lambert en su estricto rigor.

La temperatura de la llama es lo bastante baja para que la llama de por s no excite los tomos
de la muestra de su estado fundamental. El nebulizador y la llama se usan para desolvatar y
atomizar la muestra, pero la excitacin de los tomos del analito es hecha por el uso de
lmparas que brillan a travs de la llama a diversas longitudes de onda para cada tipo de analito.
En AA la cantidad de luz absorbida despus de pasar a travs de la llama determina la cantidad
de analito existente en la muestra. Hoy da se utiliza frecuentemente una mufla de grafito (u
horno de grafito) para calentar la muestra a fin de desolvatarla y atomizarla, aumentando la
sensibilidad.

El mtodo del horno de grafito puede tambin analizar algunas muestras slidas o semislidas.
Debido a su buena sensibilidad y selectividad, sigue siendo un mtodo de anlisis comnmente
usado para ciertos elementos traza en muestras acuosas (y otros lquidos). Otro mtodo
alternativo de atomizacin es el Generador de Hidruros.


Los electrones de los tomos en el atomizador pueden ser promovidos a orbitales ms altos por
un instante mediante la absorcin de una cantidad de energa (es decir, luz de una determinada
longitud de onda). Esta cantidad de energa (o longitud de onda) se refiere especficamente a
una transicin de electrones en un elemento particular, y en general, cada longitud de onda
corresponde a un solo elemento.


35

Como la cantidad de energa que se pone en la llama es conocida, y la cantidad restante en el
otro lado (el detector) se puede medir, es posible calcular cuntas de estas transiciones tienen
lugar, y as obtener una seal que es proporcional a la concentracin del elemento que se mide.

5.4 RESULTADOS

El espectro de AA de un elemento
consta de lneas que son el
resultado de transiciones
electrnicas desde el estado basal a
niveles superiores de energa.
Debido a que las bandas son tan
estrechas, la fuente de radiacin
debe producir bandas muy
estrechas, puesto que si diera
bandas amplias o radiacin
continua, la mayor parte de la luz
pasara sin ser absorbida. Adems
debe emitir radiacin exactamente
de la misma longitud de onda de la
lnea de resonancia del elemento en
estudio.

5.5 APLICACIONES

La absorcin atmica es una tcnica capaz de detectar y determinar cuantitativamente la
mayora de los elementos qumicos, por lo que sus campos de aplicacin son variados. Este
mtodo se puede aplicar para la determinacin de ciertos metales tales como: antimonio,
cadmio, calcio, cesio, cromo, cobalto, oro, plomo, nquel, entre otros. Se emplea en anlisis de
agua, de suelos, bioqumica, toxicologa, medicina, industria farmacutica, alimenticia,
petroqumica, etc.

El instrumental empleado en estos anlisis es un Espectrmetro de Absorcin Atmica. Este
equipo generalmente est compuesto por una lmpara del tipo ctodo hueco, un quemador o
mechero, compuesto a su vez por un nebulizador de la muestra, y dispositivos seleccin de
longitudes de onda (monocromador tipo rejilla de difraccin), transduccin y amplificacin (tubo
fotomultiplicador) y lectura de la seal.

36


El servicio de espectroscopia de absorcin atmica en las industrias agroalimentarias es de gran
importancia para llevar a cabo funciones como las siguientes:
- Estimacin de contaminaciones por oligoelementos
- Anlisis de elementos qumicos mayores (Fe, Ca, Al, etc.) en vinos y aceites
- Estimacin de contaminacin de alimentos por microorganismos
- Determinacin de la composicin crnica de embutidos y conservas
- Estudios de citotoxicidad de conservantes y aditivos
- Anlisis de composicin y control de calidad de derivados del petrleo


37

6. PLASMA ACOPLADO POR INDUCCIN

6.1 FUNDAMENTO

Por definicin un plasma es una mezcla gaseosa conductora de electricidad que contiene una
concentracin significativa de cationes y electrones (la concentracin de ambos es tal que la
carga neta se aproxima a cero). La ICP, es quizs la fuente que ofrece mayores ventajas en
relacin con la sensibilidad y la ausencia de interferencias.

Tal vez la ms importante de las ventajas que ofrece las fuentes de plasma es la mayor
reproducibilidad de las condiciones de atomizacin, lo que con frecuencia da lugar a precisiones
mejores por un factor de 10 o ms. Este procedimiento requiere de la descomposicin de las
muestras que permitan la obtencin de disoluciones normalmente acuosas para la inyeccin en
la fuente.

El plasma de acoplamiento inductivo es un tipo de flama que alcanza temperaturas mucho ms
altas que las de las flamas de combustin ordinarias, y es til para la espectroscopia de emisin.
Su alta temperatura y gran estabilidad eliminan muchas interferencias y fuentes de error que se
tiene con las flamas ordinarias. Debido a estas caractersticas deseables, el plasma de
acoplamiento inductivo empieza a sustituir a las flamas de mechero ordinario. L desventaja
principal de los equipos de plasma es el costo de adquisicin y de operacin.

EL mtodo analtico de Induccin de Plasma Acoplada es una tcnica usada para detectar las
trazas de metales en muestras provenientes del medio ambiente. La meta del ICP es hacer que
los elementos emitan su onda especfica de luz la cual puede ser medida. La tecnologa para el
mtodo ICP fue empleada por primera vez en 1960 con la intencin de mejorar el estudio de
crecimiento de cristales.

6.2 EQUIPO: ESPECTRMETRO DE EMISIN

Los instrumentos para la espectroscopia de emisin son bsicamente de dos tipos, secuenciales
y multicanal. Los primeros que son menos complejos y en consecuencia a menudo ms baratos,
miden las intensidades de lnea una por una. Los instrumentos secuenciales, con frecuencia se
programan para ir de la lnea de un elemento a otro. Por el contrario los instrumentos multicanal
se disean para medir simultneamente las intensidades de las lneas de emisin de un gran
nmero de elementos a veces hasta 60.

Los instrumentos de emisin caractersticos tienen dispersiones que van desde 0,1 a 0,6 nm
/mm y longitudes focales de 0,5 a 3 m


38

http://www.google.com.co/images?hl=es&q=plasma acoplado por induccion&um=1&ie=UTF-
8&sou

Este constituye un esquema de una fuente de plasma acoplado inductivamente denominado
antorcha. Consiste en tres tubos concntricos de cuarzo a travs de los cuales fluye una
corriente de argn con un caudal total comprendido entre 11 y 17 L/min. El dimetro del tubo
ms grande es aproximadamente de 2,5 cm.

Tpica fuente de plasma acoplado inductivamente. SKOOG 4ED PG. 275


39

Esquema de un policromador de ICP SKOOG 5 ED PAG 254

6.3 PRINCIPIO FSICO

Se puede generar un plasma acoplado por induccin al dirigir la energa de un generador de
frecuencia de ondas de radio hacia un gas apropiado, comnmente argn ICP.Este inductor
genera rpidamente un campo magntico oscilante orientado al plano vertical (axial o
perpendicular) de la espiral. La ionizacin del gas argn entrante se inicia con una chispa de la
llamada espiral de Tesla. Los iones resultantes y sus electrones asociados luego interactan con
el campo magntico fluctuante. Esto genera energa suficiente para ionizar tomos de argn por
excitacin de choque. Los electrones generados en el campo magntico son acelerados
perpendicularmente hacia la antorcha. A altas velocidades, los cationes, aniones y electrones
conocidos como corriente turbulenta (Corriente de Eddy), colisionarn con los tomos de argn
para producir mayor ionizacin, lo que produce un gran aumento de temperatura.

En 2 microsegundos, se crea un estado estable con alta densidad electrnica. Se produce
plasma en la parte superior de la antorcha. La temperatura en el plasma vara entre 6000-10000
K, usualmente 8.000 K. Una larga y bien definida cola emerge desde la parte superior de la
antorcha. Esta antorcha de alta intensidad luminosa es la fuente espectroscpica que permite la
tcnica analtica. La misma contiene todos los tomos del analito y los iones que fueron
excitados por el calor del plasma. Las ventajas analticas del ICP -Plasma Acoplado por
Induccin yace en su capacidad de analizar una gran cantidad de analitos en un perodo corto
con muy buenos lmites de deteccin para la mayora de los elementos.

Los elementos pueden ser analizados en forma axial para bajos lmites de concentracin, o
radial para elevadas concentraciones. La variante de anlisis axial est definida en el rea del
ptico perpendicular a la antorcha

40

6.4 RESULTADOS

Un plasma caracterstico tiene un ncleo no transparente, blanco brillante y muy intenso, que
termina en una cola en forma de llama. El ncleo, que se extiende algunos milmetros por
encima del tubo consiste en una emisin continua a la que se superpone el espectro atmico del
argn. El origen de la emisin continua proviene aparentemente de la recombinacin de los
electrones con el argn y otros iones. En la zona situada entre 10 y 30 mm por encima del
ncleo, la emisin continua se desvanece y el plasma es pticamente transparente. Las
observaciones espectrales por lo general se hacen a una altura de 15 a 20 mm por encima de la
boina de induccin.

En esta zona de radiacin de fondo est claramente libre de las lneas del argn y resulta
adecuada para el anlisis. La mayora de las lneas ms sensibles de los analitos en esta zona
del plasma provienen de iones tales como Ca
+
, Ca
+2
, Cd
+
, Cr
+2
y Mn
+2

Las curvas de calibrado en ICP, consisten la mayora de las veces en una representacin grfica
de la intensidad de corriente o de la tensin de salida del detector en funcin de la concentracin
del analito. Con frecuencia las curvas de calibrado son lineales, sin embargo se encuentran
desviaciones de la linealidad cuando se cubren intervalos grandes de concentracin

Dado que los espectros de ICP para muchos elementos son muy ricos en lneas, se producen
interferencias espectrales debido a solapamiento de lneas. Evitar este error requiere conocer
todos los componentes que previsiblemente estn presentes en la muestra. Es de destacar que
para niveles de diez partes por billn o menos se pueden detectar ms elementos mediante
excitacin con plasma que con otros mtodos de emisin o absorcin.

Curva de calibracin con una fuente de plasma acoplado inductivamenteSKOOG 4ED PAG 285


41

6.5 APLICACIONES

Las fuentes de plasma presentan algunas ventajas con respecto a los mtodos de llama y electro
trmicos. Entre estas se encuentra la menor interferencia entre elementos, que es una
consecuencia directa de sus temperaturas ms elevadas. Tambin se pueden obtener buenos
espectros para la mayora de los elementos con unas mismas condiciones de excitacin; en
consecuencia es posible registrara simultneamente los espectros para decenas de elementos.

Esta propiedad tiene especial importancia en el anlisis multielemental de muestras muy
pequeas. Otra ventaja de esta tcnica, es que permite la determinacin de bajas
concentraciones de elementos que tienden a formar compuestos refractarios (esto es,
compuestos que son muy resistentes a la descomposicin trmica o por tratamientos rigurosos)
tales como boro, fosforo, tungsteno, uranio, circonio y niobio. Por otra parte las fuentes de
plasma permiten la determinacin de no metales como cloro, bromo, yodo y azufre.

El ICP se puede usar para el anlisis cuantitativo en las siguientes reas:

Materiales naturales como rocas, minerales, tierra, aire sedimentado, agua, tejidos de planta y
animales, en las reas de geoqumica, mineraloga, agricultura forestacin, cra de animales,
ecologa qumica, ciencias ambientales, industrias alimenticias, distribucin y purificacin de
agua, para identificar Sulfuro, Boro, Fsforo, Titanio, y Zirconio, que no se pueden identificar por
el mtodo AAS.

En las Matrices Ambientales, las cuales pueden contener bajas concentraciones y pocos
elementos interferentes, han presentado dificultades histricas al determinar anlisis de
muestras. El ICP - MS fue desarrollado en 1980 y ha sido utilizado de manera exponencial en el
medio ambiental gracias a su alta sensibilidad y a sus capacidades multielemental. El ICP ofrece
la posibilidad de determinar de manera simple y directa algunos de los elementos de la tierra,
como el boro, el fsforo, y el molibdeno, a niveles no accesibles usando otros mtodos. .

El ICP - AES ha sido grandemente utilizado desde 1970 por su anlisis mltiple simultneo de
muestras provenientes del rea biolgica y del medio ambiente, despus de la disolucin. Su
excelente sensibilidad y su amplio rango de trabajo para demasiados elementos, as mismo en
conjunto con su interferencia de bajo nivel, lo hacen al mtodo ICP - AES un mtodo ideal. El
muestreo va lser en conjunto con el ICP, hacen una forma de burlar los procedimientos de
disolucin necesarios de muestras slidas antes de determinar los elementos.


Las fuentes de plasma son ricas en lneas de emisin caractersticas, lo que hace que sean
tiles para el anlisis elemental tanto cualitativo como cuantitativo. Esta se utiliza principalmente
para el anlisis cuantitativo y cualitativo de muestras que estn disueltas o en suspensin en
disolventes acuosos u orgnicos tales como gelatinas, salmueras, aceites, encurtidos,
emulsiones y dems que son aplicables bsicamente en la industria alimentaria, en la
preparacin y conservacin de productos alimentarios de origen animal y vegetal.


42

7. RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

7.1. FUNDAMENTO DE LA TCNICA

La espectroscopia de RMN es una de las principales tcnicas empleadas para obtener
informacin fsica, qumica, electrnica y estructural sobre molculas. Es una poderosa serie de
metodologas que proveen informacin sobre la topologa, dinmica y estructura tridimensional
de molculas en solucin y en estado slido.

Las bases tericas de RMN se propusieron en 1942 por W. Pauli, quien sugiri que ciertos
ncleos atmicos podran tener espn y momento magntico y que como consecuencia al
exponerlos a un campo magntico se producira un desdoblamiento de sus niveles de energa.

La espectroscopia de resonancia magntica nuclear se basa en la medida de la absorcin de
radiacin electromagntica en la regin de las radiofrecuencias aproximadamente de 4 a 600
MHz Es una de las tcnicas ms potentes con las que se dispone para la elucidacin de
estructuras, tanto especies orgnicas como inorgnicas. As como para la determinacin
cuantitativa de las especies absorbentes.

Son tres las condiciones esenciales:
1) Existencia de subniveles energticos.
2) Suministrar energa a los ncleos en estado de ms baja energa en forma de radiacin
electromagntica capaz de ser absorbida.
3) Una manera de disipar la energa absorbida.

Existen cuatro tipos de RMN:

1) Espectroscopia de RMN con onda contina

En la RMN de CW las seales del espectro se registran como seales en resonancia. La
espectroscopia CW est limitada por su baja sensibilidad, ya que cada seal se registra una sola
vez por cada barrido y la tcnica de resonancia magntica nuclear ya es de por s no demasiado
sensible; esto quiere decir que la tcnica sufre de una baja relacin seal-ruido.

2) Espectroscopia de RMN de pulsos y transformada de Fourier

La tcnica de RMN con transformada de Fourier (FT-NMR) es la que se utiliza en los
espectrmetros actuales. FT-NMR permite disminuir drsticamente el tiempo que requiere
adquirir una acumulacin (scan) del espectro completo de RMN. En vez de realizar un barrido
lento de la frecuencia, una en cada instante, esta tcnica explora simultnea e instantneamente
todo un rango de frecuencias.

3) RMN multidimensional

En un experimento de RMN multidimensional la secuencia de pulsos debe constar de al menos
dos pulsos y stos deben separados por un periodo de espera incrementable. La secuencia de
pulsos se repite un nmero de veces adquirindose una FID en cada ocasin

43

7.2. EQUIPO: ESPECTRMETRO RMN

Los espectrmetros de resonancia magntica nuclear que se comercializan son de dos tipos: de
lneas anchas y de alta resolucin. Los instrumentos de lneas anchas tienen imanes con fuerzas
de unas pocas dcimas de tesla y son considerablemente mas simples y mas baratos que los
instrumentos de alta resolucin. Los instrumentos de alta resolucin emplean imanes con fuerzas
que oscilan entre 1.4 y 14 T, que corresponden a frecuencias de 60 a 600 MHz

www.wikipedia.com

Un espectrmetro de RMN consta de las siguientes partes fundamentales:

1. Un imn que genere un campo magntico estable, el cual puede ser de una intensidad
variable, definiendo la frecuencia de resonancia de cada ncleo. Generalmente se
identifica cada espectrmetro por la frecuencia de resonancia del protn.
2. Una sonda, que se sita dentro del imn, en la que se introduce la muestra y que consta
de las bobinas responsables de emitir y recibir las radiofrecuencias (RF). El nmero de
bobinas y su disposicin determinan el tipo y las aplicaciones de cada sonda.
3. Una consola en la que se generan los pulsos de RF y se controla el resto de la parte
electrnica del espectrmetro
4. Un ordenador que sirve de interfaz con el espectrmetro y con el que se analiza toda la
informacin obtenida.

44

Diagrama de bloques de un espectrmetro RMN con transformada de Fourier


El trmino resonancia magntica nuclear procede del hecho de que los ncleos estn en
resonancia con la radiofrecuencia o la radiacin rf. Es decir, los ncleos pasan de un estado de
espn a otro como respuesta a la radiacin rf a la que son sometidos.(ESPECTROSCOPIA)

Cuando se sitan dentro de un campo magntico, los ncleos activos de RMN (como el 1 H, o el
13 C) absorben a una frecuencia caracterstica del istopo. La frecuencia de resonancia, la
energa de la absorcin y la intensidad de la seal son proporcionales a la fuerza del campo
magntico.

El campo magntico se mantiene constante mientras un breve pulso de radiacin rf excita a
todos los ncleos simultneamente. Como el corto pulso de radiofrecuencia cubre un amplio
rango de frecuencias los protones individualmente absorben la radiacin de frecuencia necesaria
para entrar en resonancia (cambiar de estado de espn). A medida que dichos ncleos vuelven a
su posicin inicial emiten una radiacin de frecuencia igual a la diferencia de energa entre
estados de espn. La intensidad de esta frecuencia disminuye con el tiempo a medida que todos
los ncleos vuelven a su estado inicial. Un ordenador recoge la intensidad respecto al tiempo y
convierte dichos datos en intensidad respecto a frecuencia, esto es lo que se conoce con el
nombre de transformada de Fourier (FT-RMN).


45

7.4. RESULTADOS

Existen varios tipos de espectros de RMN, en funcin de la clase de instrumento utilizado, del
tipo de ncleo implicado, del estado fsico de la muestra, del entorno del ncleo en el analito y
del uso que se vaya a hacer de los datos. Sin embargo, la mayora de los espectros de RMN se
pueden clasificar como de lnea ancha o bien de alta resolucin.

7.4.1 Espectros de lneas anchas

Los espectros de lneas anchas son aquellos en los que la anchura de banda de la fuente de
lneas es suficientemente grande como para enmascarar la estructura fina debida al entorno
qumico. Los espectros de lneas anchas son tiles para la determinacin cuantitativa de
isotopos y para estudiar el entorno qumico de las especies absorbentes. Los espectros de lneas
anchas se obtienen por lo general en campos magnticos relativamente bajos.

7.4.2 Espectros de alta resolucin

Los espectros RMN mas utilizado son los de alta resolucin, en los cuales se utilizan
instrumentos capaces de distinguir diferencias de frecuencia muy pequeas (0.01 ppm o menos).
En consecuencia para un isotopo determinado, se encuentran por lo comn varios picos como
consecuencia de los efectos del entorno qumico.


46

7.4.3 Espectros de
13
C del adamantano cristalino:

a) Sin rotacin ni desacoplamiento del
protn
b) Sin rotacin pero con desacoplamiento
dipolar y polarizacin cruzada
c) Con rotacin de ngulo mgico pero sin
desacoplamiento dipolar ni polarizacin
cruzada
d) Rotacin con ngulo mgico,
desacoplamiento dipolar y polarizacin
cruzada.

7.5. APLICACIONES

Puede utilizarse, entre otras cosas, para estudiar mezclas de analitos, para comprender efectos
dinmicos como el cambio en la temperatura y los mecanismos de reaccin, y es una
herramienta de valor incalculable para la comprensin de la estructura y funcin de las protenas
y los cidos nuclecos. Este tipo de espectrometra se puede aplicar a una amplia variedad de
muestras, tanto en solucin como en estado slido.

47

7.5.1 Identificacin de compuestos

La aplicacin ms importante de la espectroscopia de RMN es la identificacin y la elucidacin
estructural de molculas orgnicas, organometlicas y bioqumicas. Adems, este mtodo
constituye muchas veces un procedimiento til para la determinacin cuantitativa de las especies
que absorben. La RMN pocas veces se basta de si misma para la identificacin de un compuesto
orgnico. Sin embargo, si se utiliza junto con otras informaciones tales como, el anlisis
elemental, y los espectros ultravioleta, infrarrojo y de masas, la RMN es un instrumento
importante para caracterizar a los compuestos puros.

7.5.2 Anlisis cuantitativo de RMN

Una singularidad de los espectros de RMN es la directa relacin entre las reas de los picos y el
nmero de ncleos responsables de la aparicin del pico. Por lo tanto para la determinacin
cuantitativa de un compuesto especfico no requiere muestras puras del compuesto para la
calibracin. Siempre que se conozca el rea de la seal por protn se puede establecer
directamente la concentracin de la especie.

El uso de la resonancia magntica nuclear para el anlisis cuantitativo no se ha generalizado por
el coste de los instrumentos. Adems, la probabilidad de que los picos de resonancia se
superpongan se hace mayor al aumentar la complejidad de la muestra. En muchas ocasiones los
anlisis que son posibles por RMN pueden hacerse mas cmodamente por otras tcnicas.

7.5.2.1 Anlisis cuantitativo de grupos funcionales

De las aplicaciones con mayor utilidad de la resonancia magntica nuclear ha sido la
determinacin de grupos funcionales tales como los grupos hidroxilo en alcoholes y fenoles,
aldehdos, cidos carboxlicos, olefinas, hidrgenos acetilnicos, aminas y amidas. Los errores
relativos encontrados han sido del orden del 1 al 5%.

7.5.2.2 Anlisis elemental

La espectroscopia de RMN se puede emplear para determinar la concentracin total de un tipo
dado de ncleo magntico en una muestra. Para el anlisis se puede emplear un espectrmetro
de baja resolucin o de lnea ancha.

Ms de 200 isotopos poseen momentos magnticos y por tanto en principio, pueden estudiarse
por RMN. Entre los ncleos mas frecuentemente estudiados se encuentran
31
P,
15
N,
19
F,
2
D,
11
B,
23
Na,
15
N,
29
Si,
109
Ag,
199
Hg,
113
Cd y
207
Pb; los tres primeros son especialmente importantes en
los campos de la qumica orgnica, la bioqumica y la biologa.

Las aplicaciones de la RMN de estado slido suelen utilizarse en investigaciones sobre protenas
de la membrana, fibrillas de protenas, todo tipo de polmeros, anlisis en qumica inorgnica, y
tambin otras ms "exticas" como las hojas de plantas y las pilas de combustible.


48


El servicio de Resonancia Magntica Nuclear en las industrias agroalimentarias es de gran
importancia para llevar a cabo funciones como las siguientes:
- Anlisis de elementos qumicos mayores (Fe, Ca, Al, etc.) en vinos y aceites
- Determinacin de metanol en vinos
- Determinacin de cidos grasos y grasas


49

8. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

8.1. FUNDAMENTO

Las separaciones en capa fina caractersticas se realizan en placas de vidrio o plstico que se
recubren con una capa delgada y adherente de partculas finamente divididas; esta capa
constituye la fase estacionaria. Las partculas son semejantes a las descritas cuando se ha
tratado de la cromatografa en columna de absorcin, de reparto en fase normal y en fase
inversa, de intercambio inico y de exclusin por tamao. Las fases mviles tambin son
similares a las empleadas en la cromatografa de lquidos de alta eficacia en columna.

8.1.1 Preparacin de placas de capa fina

Una placa de capa fina se prepara extendiendo una suspensin acuosa de un slido finamente
dividido sobre la superficie de una placa limpia de vidrio o de plstico o un porta de microscopa.
A menudo se, se aade a la suspensin un ligante para aumentar la adhesin de partculas del
solido al vidrio y entre s. La placa se deja luego en reposo hasta que se forme una capa
adherente en su superficie; algunas veces se debe calentar en un horno durante varias horas.

8.1.2 Desarrollo cromatogrfico

El desarrollo cromatogrfico en una placa es el proceso por el cual una muestra migra a lo largo
de la fase estacionaria por accin de la fase mvil; es semejante a la elucin en cromatografa de
lquidos. El modo ms habitual de llevar a cabo el desarrollo cromatogrfico en una placa es
depositando una muestra cerca de un extremo de la placa (la mayora de las placas tienen
dimensiones de 5x20 20x20cm) y marcar su posicin con un lpiz. Despus que se ha
evaporado el disolvente de la muestra, se introduce la placa en un recipiente cerrado saturado
con vapores del eluyente. Se sumerge un extremo de la placa en el eluyente, cuidando que la
muestra no est en contacto con el eluyente. Cuando el eluyente ya ha recorrido la mitad o dos
tercios de la placa, se saca ste del recipiente y se seca. La posicin de los componentes se
puede determinar a continuacin de diferentes formas.

Figura 28-12
(a) cmara de desarrollo de flujo ascendente.
(b) cmara de desarrollo de flujo horizontal:

50

Se ponen muestras en los dos extremos de la placa y el desarrollo es hacia el centro, con lo que
se duplica el nmero de ensayos posibles.

Figura 28-13
Cromatografa bidimensional (slica gel) de
algunos aminocidos. Disolvente A:
tolueno/2-cloroetanol/piridina. Disolvente B:
cloroformo /alcohol benclico/cido actico.
Aminocidos (1) cido asprtico, (2) cido
glutmico, (3) serina, (4)-alanina, (5)
glicina; (6) alanina, (7) metionina, (8) valina,
(9) isoleucina (10) cistena.

51

8.2. EQUIPO: CROMATGRAFO EN CAPA FINA

Equipo para desarrollo de Cromatografa en capa fina

http://www.laseqa.org/instal_cromacf.html

8.3. PRINCIPIO FISICO

Una de las ventajas de la cromatografa en capa fina es que no requiere un gran dispositivo
instrumental.

Dispositivo de cromatografa en capa fina en modalidad ascendente.


52

Vista frontal de una placa de TLC en el momento de inicio de la cromatografa (a), durante el
desarrollo (b) y al final de la misma (c).

El punto donde se deposita la muestra se denomina origen. A continuacin, la placa se pone en
contacto con la fase mvil dentro de un recipiente cerrado. La fase mvil ha de contactar con la
placa por debajo del punto donde se deposit la muestra. La fase mvil asciende por capilaridad
por la placa y cuando llega al origen arrastra la muestra. Los diferentes analitos de la muestra
tendrn diferentes afinidades por la fase estacionaria. Los analitos ms afines a la fase
estacionaria sern ms retenidos y avanzarn ms despacio que los analitos menos afines, que
se movern ms rpidamente. Al final del proceso, los componentes de la muestra se habrn
separado sobre la base de las diferencias de afinidad por la fase estacionaria.

Tambin existe la TLC descendente. Bsicamente se opera de manera similar, pero en este
caso la placa con la fase estacionaria se coloca entre dos soportes con un ngulo de unos 45.
La parte superior de la placa est en contacto con el papel filtro sumergido en un depsito de
fase mvil. El disolvente pasa por capilaridad a la placa y baja a travs de de ella por gravedad.

Dispositivo de cromatografa en capa fina modalidad descendente.

Las fases estacionarias ms utilizadas son: a) gel de slice (utilizada aproximadamente el 80%
de las separaciones de TLC); b) almina; c) silicato de magnesio; d) tierra silcea o Kieselguhr; y
e) poliamidas.

Podemos resumir la situacin de una separacin en TLC diciendo que la fase estacionaria es
ms polar que la fase mvil, que estar compuesta por mezclas de disolventes orgnicos de
diferente polaridad. Los analitos ms polares quedarn ms retenidos por la fase estacionaria
que los menos polares. No es posible alterar el orden de elucin de los analitos sin cambiar su
afinidad por la fase estacionaria.

53

Para anlisis cualitativos de las posiciones de los analitos tras una separacin de TLC se utiliza
el parmetro denominado factor de retencin o
. El
se calcula como:

El
se utiliza para definir la posicin de las bandas y comparar diferentes condiciones de

trabajo.

Concepto de factor de retencin.

Cada sustancia presenta un factor de retencin caracterstico para unas condiciones dadas, por
lo que la comparacin del
de las manchas de la muestra con los de sustancias patrones

conocidas podr servir para identificar la presencia de sustancias en las muestras analizadas. No
obstante una de las limitaciones de TLC es que presenta relativamente baja resolucin y varias
sustancias pueden tener valores de
muy similares, por lo que nunca debe usarse el

como nico factor para asegurar la presencia de un compuesto en una mezcla.

8.4. RESULTADOS

La figura muestra el aspecto ideal que puede presentar una placa tras el desarrollo. La muestra 1
estaba constituida por dos componentes, mientras que la 2 slo uno. En muchas ocasiones, las
manchas reales sobre una placa presentan colas, lo que origina manchas que no son tan
simtricas.

54

Cromatogramas de capa fina.
(SKOOG D., HOLLER J., NIEMAN T., 2000, PG. 826)

8.5. APLICACIONES

La cromatografa en capa fina (TLC) ha sido aplicada para analizar analitos como productos
farmacuticos, lpidos, cidos orgnicos, carbohidratos, amino-cidos, pptidos, fenoles, ndoles,
purinas, esteroides, vitaminas, compuestos quirales, etc. Ello hace que se utilice con frecuencia
para anlisis qumicos en campos como toxicologa, qumica orgnica, Bioqumica, Biologa,
Industria, agricultura, medioambiente, alimentacin, farmacia, estudios clnicos, productos
naturales, etc.

La tcnica de TLC se aplica sobre todo a: a) Deteccin cualitativa rpida de analitos; b)
Determinacin semicuantitativa de analitos; c) Aislamiento y purificacin parcial de analitos o
familias de analitos de una muestra.

8.5.1 Deteccin cualitativa rpida de analitos

La TLC no permite habitualmente separaciones de alta resolucin ni de alta especificidad. Sin
embargo; es una tcnica muy til para el control de los contenidos de una muestra de forma
rpida y sencilla.

8.5.2 Determinacin semicuantitativa de analitos

El anlisis cuantitativo de TLC no es tan preciso como el de la cromatografa de lquidos o de
gases. El mayor factor de error en la cuantificacin de la muestra es la aplicacin de la misma.
Se ha de aplicar la muestra (unos pocos L) con la suficiente precisin como para que la
cuantificacin sea fiable.


55

Una aproximacin que mejora la cuantificacin consiste en cortar con una cuchilla la porcin de
gel de slice donde se halla el analito. Tras ello, la superficie cortada se trata con disolvente para
liberar el compuesto y la mezcla se centrfuga para eliminar el gel de slice. De sta manera se
obtendr el analito en disolucin separado de la slice. Sobre sta preparacin se puede medir
con ms precisin fluorescencia, absorbancia o cualquier otra propiedad. De cualquier modo, la
precisin y la reproducibilidad de la cuantificacin continan condicionada por la aplicacin de la
muestra.

8.5.3 Aislamiento y purificacin parcial de analitos o familias de analitos de una muestra

La TLC se puede utilizar para fraccionar la muestra y separa un analito (o familia de analitos) de
una matriz compleja. Para ello, se procede de manera idntica a lo descrito en el prrafo
anterior. Para asegurar la extraccin del componente que queremos extraer es muy importante la
seleccin de la zona del gel sobre la que se acta. No podemos hacer revelados que destruyan o
modifiquen el analito, por lo que la visualizacin de sustancias fluorescentes con una lmpara de
luz UV ser una tcnica apropiada de deteccin. En caso de no disponer de una tcnica de
identificacin de la zona de inters, se dividir la placa en varias zonas y el tratamiento se
aplicar a cada una de ellas.


Algunas de las aplicaciones que tiene la cromatografa de capa fina en alimentos son la
determinacin de sulfonamidas en hgado y msculo de bovinos, ovinos, equinos, porcinos y
aves por cromatografa capa fina-densitometra, se establece con el fin de asegurar a los
consumidores el suministro de alimentos que no rebasen los lmites mximos permisibles de este
tipo de productos.

Ciertas funciones se realizan con el fin de tener en cuenta que el consumo de alimentos
contaminados de origen animal implica diversos riesgos para la salud humana que dependen de
la presencia de los residuos nocivos, que entre los beneficios que reporta el hecho de aplicar las
pruebas que permiten la deteccin de este tipo de residuos, se encuentra el de participar con
mayor confianza en el comercio internacional de alimentos, contando de esta forma con las
bases suficientes para certificar la inocuidad de los productos alimenticios crnicos, tanto
importados como exportados.

Una de las aplicaciones de la cromatografa de capa fina al campo textil es en el campo de los
colorantes, en los cuales se logran separaciones insospechadas y en tiempos de 15-30 minutos,
pero su utilidad no se cie a la separacin de colorantes sino tambin a productos auxiliares de
todo tipo, hidrolizados de fibras naturales del tipo de Mohair, Lana, etc. productos naturales
extrados de la lana (lanolina, colesterol, lanosterol), fungicidas bactericidas, blanqueadores
pticos, etc.


56

9. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

En una primera etapa, la cromatografa de lquidos se realizaba en columnas de vidrio con
dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500cm; en este tipo de columnas realiz Tswett sus
trabajos originales. Para asegurar unos caudales razonables, el dimetro de las partculas de la
fase estacionaria slida por lo general era de 150 a 200m. Incluso as, los caudales eran bajos,
llegando a unas pocas dcimas de milmetro por minuto. En consecuencia, los tiempos de
separacin eran largos. Los intentos para acelerar el procedimiento clsico mediante la
aplicacin del vaco, o por bombeo no resultaron efectivos puesto que el aumento de caudal
originaba un aumento de la altura de plato por encima del mnimo caracterstico.

En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se dieron
cuenta de que se podan conseguir grandes aumentos en eficacia de la columna disminuyendo
el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta finales de los aos
sesenta cuando se desarroll la tecnologa adecuada para producir y utilizar rellenos de tamao
de partcula del orden de los 3 a 10m. Esta tecnologa requiere una instrumentacin sofisticada,
que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografa de lquidos clsica. Para
distinguir estos procedimientos de los mtodos bsicos, que todava se utilizan con fines
preparativos, se emplea la denominacin de Cromatografa de lquidos de alta resolucin
(HPLC).

9.1 FUNDAMENTO DE LA TCNICA

El HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o Cromatografa liquida de alta
resolucin, es una tcnica cromatogrfica usada para separar componentes usando una
variedad de interacciones qumicas entre el analito y la columna cromatogrfica.

Bsicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase mvil, bomba, inyector, columna
de separacin y detector. El analito se pasa a travs de una columna de la fase estacionaria
bombeando la fase mvil liquida con alta presin. La muestra se introduce en pequeos
volmenes a la corriente de la fase mvil y all se retarda por medio de interacciones qumicas
con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna.El retardo se conoce como tiempo de
retencin, nico para cada analito. Depende de la naturaleza del analito, de la fase estacionaria y
de la composicin de la fase mvil.

Los solutos ms comunes usados en la fase mvil son combinaciones de agua purificada con
lquidos orgnicos, los ms comunes son Metanol y Acetonitrilo, tambin suelen usarse sales y
bufferes para contribuir a la separacin de componentes. Tambin se usa el cido
Trifluoroacetico para actuar como formador de pares inicos.

Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elucin. Consiste en la variacin de
la composicin de la fase mvil, para adaptarse a los diferentes analitos y conseguir mejores
resultados. El gradiente separa la matriz del analito en funcin de la afinidad del analito por la
composicin de la fase mvil. Cada analito tiene un gradiente de elucin ptimo para obtener la
mxima separacin de picos en el detector.


57

9.2 EQUIPO: CROMATGRAFO HPLC

Esquema de un aparato de HPLC. (Cortesa de Perkin-HelmerCorporation, Norwalk, CT)

Equipo para cromatografa de lquidos de alto rendimiento: (a) Integrador y graficador
computarizados. (b) Dispositivo de control del detector. (c)Detector de UV. (d) Modulo de control,
que incluye la bomba, la columna y el inyector. (e)Sistema de suministro programable con tres
depsitos para solventes. (Cortesa de SpectraPhysics, Santa Clara, Calif.)

9.3 PRINCIPIO FSICO

Existen varios tipos de HPLC:

9.3.1 Cromatografa de fase normal

Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basndose en la polaridad. Este mtodo usa una
fase estacionaria polar y una fase mvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El

58

analitopolar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorcin aumenta con la polaridad del
analito y la interaccin entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elucin. La
fuerza de interaccin depende no solo de los grupos funcionales, sino tambin de factores
estricos e ismeros estructurales. El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de
retencin, mientras que disolventes hidrfobos aumentan el tiempo de retencin. Algunos solutos
polares interaccionan con la fase estacionaria y desactivan la columna.

9.3.2 Cromatografa de fase inversa

Este tipo de HPLC es el ms comn. En esta tcnica se usa una fase estacionaria no polar y una
fase mvil moderadamente polar. La fase estacionaria tpica es silicio tratado con RMe2SiCl,
donde R es una cadena lineal con un grupo alcalino.La adicin de disolventes polares
incrementa el tiempo de retencin y aadir disolventes hidrofbicos lo disminuyen. El tiempo de
retencin es mayor para molculas no polares. El principio bsico de este mtodo est basado
en las interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no polar.

Las caractersticas del analito son importantes para sus propiedades de retencin. Las molculas
muy grandes pueden causar que la interaccin no sea completa. El tiempo de retencin aumenta
con el rea hidrofobicidad, que es inversamente proporcional al tamao del soluto. Los
componentes ramificados eluyen ms rpido porque el rea total esta disminuida.

Hay otros modificadores de la fase mvil que afectan a la retencin del analito. Aadir sales
inorgnicas causa incremento lineal en la tensin superficial de soluciones acuosas,
incrementando el tiempo de retencin.

El pH tambin es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso se suele usar un
buffer como fosfato sdico para controlar el pH. Un cido orgnico como cido frmico o cido
trifluoracetico. Sirven para muchas cosas, controlan el pH, neutralizan cualquier carga residual
del silicato en la fase estacionaria y acta como formador de pares inicos para neutralizar la
carga del analito. Los efectos varan pero aumentan la calidad de la cromatografa.

9.3.3 Cromatografa de exclusin por tamao

Tambin conocida como cromatografa de gel permeante o cromatografa de gel filtrante. Separa
las partculas en funcin del tamao. Es una cromatografa de baja resolucin y sirve para
determinar estructuras terciarias y cuaternarias de protenas y es la tcnica comn para
averiguar el peso molecular de polmeros sintticos y naturales.

9.3.4 Cromatografa de intercambio inico

La retencin est basada en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la
fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son
excluidos.Los intercambiadores de iones favorecen la unin de iones de mayor carga y radio
inferior. Un incremento en el contra-in (con respecto a los grupos funcionales de resinas)
reduce el tiempo de retencin. Un incremento del pH reduce el tiempo de retencin en el
intercambio catinico, pero bajar el pH reduce la retencin en intercambio aninico.


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9.3.5 Cromatografa de bioafinidad

Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos estables,
especficos y reversibles. La formacin de los complejos implica fuerzas moleculares como Van
der Waals, electrosttica, dipolo-dipolo, hidrofbicas y puentes de hidrogeno. Una unin
bioespecfica se forma por accin simultnea de estas fuerzas en los sitios de unin.

9.4 RESULTADOS

La cromatografa de lquidos de alta resolucin, ofrece resultados mediante el equipo, de tipo
grfico. En este tipo de anlisis, se grafica en el eje X el tiempo de retencin de la fase mvil por
la fase estacionaria, y en el eje Y, una seal obtenida por un equipo que puede ser un
espectrofotmetro, un espectrofotmetro de masas, o cualquier otro de los detectores. Este
grfico es llamado, cromatograma, el cual es el resultado de la cromatografa, y en el caso de
que se haya hecho una ptima separacin, los picos de la grfica corresponden a los
componentes de la mezcla separada.

Cromatogramas de una misma muestra, obtenidos con partculas de slice, de (a)10m y (b)5m
de dimetro. (Tomado de R.E. Mayors, J. Chromatogr. Sci., 11,88 (1973))

9.5 APLICACIONES

Es incuestionable que la cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de separacin
ms ampliamente utilizado con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la
cifra del billn de dlares. Las razones de la popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su
fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de
especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de
primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.
Algunos ejemplos de esos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibiticos esteroides, especies
organometlicas y una cierta variedad de sustancias inorgnicas.

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Aplicaciones de la cromatografa de lquidos, SKOOG 4 ED, 1994.

La figura anterior pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utiliza la cromatografa
de lquidos, tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de aplicacin se refiere. As,
para solutos con masas moleculares superiores a 10000, a menudo se utiliza la cromatografa de
exclusin, aunque ahora tambin es posible tratar estos compuestos con cromatografa de
reparto en fase inversa. Para especies inicas de baja masa molecular se utiliza con frecuencia
la cromatografa de intercambio inico. Los mtodos de reparto de aplican a las especies poco
polares pero no inicas. Adems, este procedimiento se utiliza muchas veces para la separacin
de los integrantes de una serie homloga. La cromatografa de adsorcin se elige con frecuencia
para separar especies no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos como por
ejemplo, los hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos.


9.6.1 Conservantes antioxidantes

Se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimtrico para medir simultneamente los
nueve antioxidantes ms comunes.

9.6.2 Anlisis de carbohidratos en bebidas

La adicin de mono y disacridos a bebidas y zumos sirve como propsito de enriquecer el
sabor. Para determinar si la cantidad aadida es correcta se miden los azucares usando HPLC
de intercambio inico con deteccin de pulso amperomtrico con detectores de refraccin o
ultravioletas.


61

9.6.3 Ismeros de carotenoides

El HPLC en combinacin con detectores calorimtricos permite el anlisis de los carotenoides
dietticos en tejidos animales y vegetales.

9.6.4 Flavonoides y fenoles

En el vino la medicin de estas sustancias permite la determinacin del color, la edad y las
variedades de uva usadas. El HPLC en combinacin con colormetros, permiten la determinacin
de hasta 22 compuestos diferentes simultneamente.

9.6.5 Lpidos

La determinacin de lpidos animales y vegetales como: colesterol, triglicridos, glicridos y
esteroles, se basa en el uso del HPLC y un detector de Dispersin de Luz Evaporativa (ELS).

9.6.6 cidoslipoico y cido dihidrolipoico en suplementos alimenticios

An en estudio pero su deteccin combinando HPLC con detectores colorimtricos es importante
ya que estos dos compuestos parecen importantes como antioxidantes y reguladores del ciclo
celular.

9.6.7 Medicin de nutrientes liposolubles en tabletas multivitamnicas

El uso del HPLC permite la deteccin de mltiples vitaminas en alimentos suplementarios para
neonatos.

9.6.8 4-Hidroxinonenal y otros aldehdos

Se forman como resultado de peroxidacin de lpidos, durante la coccin o podredumbre. Se usa
HPLC con detectores de fluorescencia para detectar estas sustancias que son citotxicas.

9.6.9 Surfactantes no inicos

La deteccin de estas sustancias es crucial puesto que estn altamente reguladas debido a
problemas medioambientales, se usa HPLC combinado con dispersin de luz evaporativa.

9.6.10 Carbohidratos simples

Usar HPLC con ELSD elimina la necesidad de usar bases fuertes o alto pH, convirtindose en un
mtodo no destructivo.

9.6.11Contaminantes triptfanos

El HPLC con ELSD y detectores colorimtricos permiten la deteccin de esta sustancia txica
proveniente de plaguicidas


62

10. CROMATOGRAFIA DE GASES

10.1 FUNDAMENTO

La idea de esta tcnica se basa en la volatilizacin de la muestra y su posterior inyeccin en la
cabeza de una columna cromatogrfica. Para la elucin de la muestra se usa un gas inerte como
fase mvil, de esta manera la fase mvil no interacciona con las molculas del analito,
simplemente transporta el analito a travs de la columna.

Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC):

Cromatografa gas-slido (GSC): la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos se
produce mediante adsorcin.

Cromatografa gas-lquido (GLC): la fase estacionaria son molculas de lquido inmovilizadas
sobre

GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el
proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha
provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del
analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica
aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular.

La GC es un sistema compuesto de gas portador, sistema de inyeccin de muestra, columna
(Generalmente dentro de un horno), y detector

10.2 EQUIPO: CROMATGRAFO DE GASES

http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatografia_de_gases


63

10.3 PRINCIPIO FSICO

El analito se inyecta usando una microjeringa en una cmara de vaporizacin instantnea
sellada poruna junta de silicona (Septum). El analito debe ser introducido en pequeas
cantidades para asegurar elmejor anlisis, si la columna es ordinaria el volumen es de unos 20
microlitros; si la columna es capilar elvolumen es menor de 10
-3
microlitros. Se usan divisores de
flujo a la entrada de la columna para desecharanalito hasta alcanzar estos volmenes. Las
muestra slidas deben introducirse en forma de disolucin, eldisolvente se pierde en la cmara
de vaporizacin y as no interfiere en la elucin.

10.4 RESULTADOS

La cromatografa de gases permite obtener resultados tanto cualitativos como Cuantitativos. Se
utilizan fundamentalmente estas alternativas de separacin:
A mayor disolucin, la separacin de compuestos con estructura qumica similar se consigue
utilizando tiempos relativamente largos. A menor disolucin se realiza la separacin rpida de
mezclas de compuestos sencillos conocidos

10.5 APLICACIONES

La cromatografa de gases tiene amplia aplicacin, en las industrias se enfoca principalmente a
evaluar la pureza de los reactantes y productos de reaccin o bien a monitorear la secuencia de
la reaccin, para los fabricantes de reactivos qumicos su aplicacin para la determinacin de la
pureza es lo ms importante.

En la investigacin es un auxiliar indispensable para diversas tcnicas de evaluacin, entre las
principales estn los estudios cinticos, anlisis de adsorcin a temperatura programada,
determinacin de reas especficas por adsorcin de gas y determinacin de isotermas de
adsorcin.

En la industria del petrleo juega una funcin primordial, por medio de la cromatografa se
pueden analizar los constituyentes de las gasolinas, las mezclas de gases de refinera, gases de
combustin, etc.

Las aplicaciones de la cromatografa son mltiples y la convierten en la tcnica de anlisis ms
poderosa que existe, su utilizacin requiere principalmente de constancia y entusiasmo.


Caracterizacin de aceites esenciales: se basa en la deteccin de sustancias terpenicas
responsables de propiedades aromticas en los alimentos.

Anlisis de nitrosaminas en agua potable: las nitrosaminas son sustancias carcingenas
potenciales, se debe controlar su presencia en agua potable. Para esto se usa extraccin de la
fase slida y GC con columna capilar.

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Controles de alcoholemia: la GC se puede usar para determinar el volumen de alcohol en
sangre.

Determinacin de trazas de pesticidas organo-fosforicos (OPP) en aceite de oliva: el GC en
combinacin con los detectores de ionizacin de llama permiten la deteccin de estos pesticidas,
que a pesar de ser baratos y de amplio espectro, son causantes de problemas irreversibles en la
actividad de los neurotransmisores.

Contaminacin por dioxinas: usando detectores de conductividad electroltica, permite el anlisis
de residuos de dioxinas muy perjudiciales para la salud humana.


65

11. CROMATOGRAFIA IONICA (CI)

11.1 FUNDAMENTO

La cromatografa inica es una vertiente de la cromatografa lquida. Es una tcnica de
separacin basada en el principio de adsorcin selectiva cuyo objetivo es separar los distintos
iones en una solucin y preparar el compuesto, molcula o iones a ser retenidos. las molculas o
compuestos cargados

En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase
estacionaria y una fase mvil que fluye permanente durante el anlisis.

La fase estacionaria consiste en resinas de intercambio inico las cuales son matrices slidas
que contienen sitios activos con carga electrosttica (positiva o negativa). De esta forma, la
muestra queda retenida sobre el soporte slido por afinidad electrosttica. Dependiendo de la
relacin carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern retenidos con mayor fuerza sobre
el soporte slido que otros, lo que provocar su separacin.

Las sustancias que permanecen ms tiempo libre en la fase mvil, avanzan ms rpidamente
con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan
menos y por tanto tardarn ms en salir o fluir.

Curva de calibracin: grafico que representa el valor de alguna propiedad frente a la
concentracin (ppm, mg/L) del analito. Cuando se examina estas graficas se puede obtener o
aproximar a la concentracin del analito a partir del grafico o curva de calibracin.

Para el caso de (CI) se deber construir una curva de calibracin para cada analito en el
intervalo de concentraciones de 1 a 20 ppm teniendo en cuenta las reas y las alturas de las
seales obtenidas para cada concentracin.

La (CI) en una variante tambin de la conocida cromatografa liquida de alta precisin (HPLC).
Es un mtodo eficaz para la separacin y determinacin de iones, basado en el uso de resinas
de intercambio inico. Cuando una muestra inica atraviesa estas columnas, los iones presentes
sufren una separacin debido a las diferentes retenciones llevadas a cabo al interactuar .con la
fase fija de las columnas analticas. Una vez separada, la muestra pasa a travs de un detector
(conductimetrico, amperometrico, UV, etc.) donde se registra la seal obtenida al tiempo de
retencin.

El resultado son una serie de cromatogramas donde la posicin se los mximos indica el ion
presente (carcter cualitativo) y su rea indica la cantidad existente de dicho ion (carcter
cuantitativo).

El Servicio de Anlisis del ICB dispone de un cromatgrafo inico Metrohm con columna
Metrosep A Supp 5 y detector conductimtrico, que se emplea en la determinacin de fluoruros,
cloruros, nitritos, nitratos, bromuros fosfatos y sulfatos.

- Anlisis de Cationes (Li
+
, Na
+
, NH4
+
, K
+
, Mg
2+
, Ca
2+
) en matrices acuosas.


66

- Anlisis de Aniones (F
-
, Cl
-
, NO2
2-
, Br
-
, NO3
3-
, PO4
3-
, SO4
2-
) en matrices acuosas.

11.2 EQUIPO: COMATGRAFO INICO


11.3.1 Resinas de intercambio inico

Los intercambiadores inicos son usados para la separacin de sales (cationes y aniones) del
agua. Las resinas de intercambio son materiales sintticos, slidos e insolubles en agua, que se
presentan en forma de esferas o perlas de 0.3 a 12 mm de tamao efectivo, aunque tambin las
hay en forma de polvo para preparar en solucin.

Estn compuestas de una alta concentracin de grupos polares, cidos o bsicos, incorporados
a una matriz (contenedor cromatogrfico) de un polmero sinttico (resinas estirnicas, resinas
acrlicas, etc.) y actan tomando iones de las soluciones (generalmente agua) y cediendo
cantidades equivalentes a otros iones. La principal ventaja de las resinas de intercambio inico
es que pueden recuperar su capacidad de intercambio original ya que es una reaccin de
intercambio de iones en las molculas o sustancias; por lo tanto se pueden tratar y recuperar
mediante la adicin de una solucin especial.

El intercambio por lo tanto es una reaccin reversible, que tiene lugar cuando un ion de una
disolucin se intercambia por otro ion de igual carga que se encuentre unido por enlace inico a
una partcula solida inmvil. Este proceso ocurre constantemente en la naturaleza, tanto en la
materia inorgnica como en las clulas vivas. Por sus propiedades como disolvente y su
utilizacin en diversos procesos industriales, el agua normalmente tiene muchas impurezas
(aguas duras) y contaminantes. Las sales metlicas se disuelven en el agua separndose en
iones, cuya presencia puede ser indeseable para algunos usos del agua.

Las resinas de intercambio inico poseen un radical fijo y un mvil (ion de sustitucin). El ion
mvil es intercambiado por iones que desean eliminarse de la solucin y este intercambiado solo
funciona entre iones de igual carga elctrica; cationes por cationes y aniones por aniones.

67

En general, las resinas de intercambio inico operan en columnas, para as favorecer el proceso
de intercambio, parecido a la destilacin o la destilacin en bandejas. la reaccin de intercambio
se desplaza en el lecho de resina.

Al producirse el intercambio inico, la capacidad de resina comienza a decrecer debido a que
posee una capacidad limitada para la remocin de iones de las soluciones y muestras analizadas
y debido a esto, en un momento dado habr cedido la mayora de sus iones de sustitucin y se
producir un cierto pase de iones no deseados en el agua producida y se dice que esta resina
est agotada o saturada de los iones que ha atrapado. Por este motivo, cuando se disea una
columna de intercambio inico, se establece a priori la concentracin mxima admisible de iones
indeseables en la salida del proceso. Cuando se llega a la concentracin pre establecido se
debe proceder a regenerar la resina, para reutilizarla en un nuevo ciclo.

El tiempo de elusin (dato conocido), o tiempo que tarda un ion en pasar a travs de la columna,
vara para cada especie, lo cual implica que saldrn de la columna en momentos diferentes. En
el extremo de la columna hay un sensor que mide la conductividad provocado por los iones que
van saliendo, lo que est relacionado directamente a la concentracin de cada especie.

Finalmente, los datos son entregados en un grfico tiempo v/s voltaje, en donde la concentracin
de iones en un momento determinado est representada por la altura y la anchura de los picos
del grfico, y puede ser correlacionada con la concentracin de una especie en particular en la
solucin de muestra.


68

11.4 RESULTADOS

En estos grficos se visualizan los datos de salida tpica de una cromatografa de iones:

Esta cromatografa de iones muestra datos de un anlisis de cationes de aguas glaciales. Cada
pico representa la concentracin de cada catin. Las concentraciones de iones pueden ser
calculadas usando el rea bajo cada pico, donde un rea ms grande tiene correlacin con una
concentracin ms alta de una especie de ion particular. La mayora de las mquinas de
cromatografa inica proporcionan el software que calcula esta rea, luego los usuarios pueden
convertirla a partes por milln (ppm) u otra cantidad.

11.4.1 Preparacin de la muestra

Muestras lquidas: antes del anlisis el lquido de muestra debe ser filtrado para eliminar los
sedimentos y otras partculas, as como para limitar las posibilidades de alteracin microbiana.
Las muestras acuosas deben ser recolectadas con una jeringa estril o con una botella la cual
debe ser enjuagada tres veces con la muestra de agua y luego ser filtrada a travs de un filtro de

69

0.45um (o menos). El frasco de coleccin, de la misma manera debe ser enjuagado tres veces
con el lquido filtrado antes de llenarlo con la muestra. Las muestras deben ser almacenadas el
fro hasta que ellas puedan ser procesadas. La muestra mnima requerida para el anlisis es
aproximadamente 5mL, sin lmites mximos.

Muestras slidas y lquidos orgnicos: Muestras slidas se pueden extraer con agua o cido
(cationes) para eliminar los iones de la superficie. Muestras lquidas tambin deben ser filtrada y
almacenada en fro hasta el anlisis se puede realizar. El mnimo de la muestra necesaria para
una slida muestra es de aproximadamente 2-3cm en el caso de los slidos, sin lmites
mximos.

11.4.2 Costos

Un estudio de aniones, visto en la pgina del SERNAGEOMIN, cuesta alrededor de 0,65 UF. El
costo de la mquina, por otro lado puede estar alrededor de US$ 40.000, para los equipos ms
bsicos, pero un equipo de ltima generacin puede costar ms de US$ 100.000

11.5 APLICACIONES

11.5.1 Desionizacion: (Aguas desionizadas o desmineralizadas)

La desionizacin supone la eliminacin de sustancias disueltas cargadas elctricamente
(ionizadas) sujetndolas a lugares cargados positiva o negativamente en una resina al pasar el
agua a travs de una columna rellena con esta resina. Este proceso se llamaintercambioinicoy
se puede usar de diferentes maneras para producir agua desionizada de diferentes
calidades.Las impurezas inicas del agua pueden eliminarse haciendo circular el lquido a travs
de una resina intercambiadora de aniones en la forma OH
y de una resina intercambiadora de

cationes en la forma H
+
. Supngase por ejemplo que se encuentra
3 2
( ) Cu NO en la solucin. La
resina intercambiadora de cationes fija
2
Cu
+
y lo sustituye por 2H
+
. La resina in intercambio
anionico fija
3
NO

y lo sustituye por OH
. El eluato es agua pura o desionizada.

2
2
2
3
2
2 2
OH
Cu H pura H O
NO OH
+
+ +

intercambio del ion por H
intercambio del ion por

El agua tratada de esta manera se llama agua desionizada.

11.6 APLICACIONESAGROINDUSTRIALES

Se utiliza para el anlisis de la qumica del agua. Los cromatgrafos inicos son capaces de
medir las concentraciones de los principales aniones, como el fluoruro, cloruro, nitrato, nitrito,
sulfato y, as como los principales cationes como el litio, el sodio, de amonio, potasio, calcio y
magnesio. Tambin pueden medirse las concentraciones de cidos orgnicos a travs de
cromatografa de iones.


70

Las muestras (soluciones) se hacen pasar a presin por una columna cromatogrfica. All los
iones son adsorbidos por los componentes de la columna (resina). Luego se agrega un lquido
de extraccin inica, conocido como eluente, el cual al traspasar la columna hace que los iones
absorbidos comiencen a separarse de sta.

11.6.1 Tratamiento de aguas duras

Esta tcnica se aplica para eliminar la dureza de las aguas tanto domesticas como industriales
para el posterior tratamiento por escaldado de alimentos vegetales y preparacin de productos
en conservas.

11.6.1.1 Principio:

Ciertos compuestos tienen la propiedad de fijar los iones alcalinotrreos (Ca, Mg, etc.)
sustituyndolos por iones de sodio. Anteriormente se les daba el nombre de zeolicos.

Cuando se hace pasar en agua por lecho de estos intercambiadores de iones de sodio, las sales
alcalinotrreas que contiene esta agua se transforma en sales de sodio. El lecho permutante se
hace cada vez ms activo a medida que el contenido en calcio y magnesio del intercambiador
aumenta. En estas instancias, ablandado cierto volumen hay que proceder a una regeneracin
ya mencionada anteriormente que se efecta por el paso de una solucin de cloruro de sodio a
travs del lecho de intercambio. Despus del tratamiento, la resina generada recupera su
actividad inicial y el ciclo puede volver a repetirse cclicamente.

Actualmente, la resinas de intercambio inico ms empleadas son las resinas orgnicas de
sntesis, del tipo poliestireno y divinilbencenosulfonado. Estas resinas, destinadas para el
ablandamiento del agua son llamadas catinicas fuertes, y se presentan en granos de pequeo
dimetro y en el mercado existen diversas marcas y composicin.

11.6.1.2 Funcionamiento

Actualmente los ablandadores se construyen de Polister Reforzado de Fibra de Vidrio (PRFV).
Con recubrimiento interno de polietileno, resistente a la corrosin por el cloruro de sodio y a la
presin. Y en su interior contienen el lecho de resina.Los dispositivos de control varan, para
asegurar y verificar la secuencia de trabajo, es decir, ablandamiento, contra-lavado
regeneracin, lavado final, etc. sea por control manual, automtico o semiautomtico. Llevan
tambin un recipiente (tanque salero), en el cual se disuelve la solucin concentrada de cloruro
de sodio necesaria para la regeneracin.

Las distintas etapas del proceso de ablandamiento son:
1. Durante una primera fase, el agua atraviesa el lecho de resina, donde pierde sus iones
de calcio y magnesio, sustituyndolos por iones de sodio.
2. Cuando la resina est saturada, se favorece su desbloqueo por una corriente de agua a
fin de facilitar la regeneracin.
3. En esta tercera etapa, se hace pasar lentamente la salmuera a travs del lecho de
resinas, se obtiene una solucin salina de sales de calcio y magnesio, y la resina se
encuentra nuevamente cargada de sodio.

71

4. En una cuarta etapa, un lavado permite eliminar la salmuera remanente en el lecho y
deja el aparato preparado para un nuevo ciclo.

11.6.1.3 Dibujo esquemtico del principio.

Las partculas cargadas negativamente se unen a la matriz solida positivamente y son retenidas.
Mientras tanto, las partculas con carga positiva son rechazadas de la matriz y son
eluyndose.Para regenerar la matriz, se eluyen las partculas retenidas haciendo circular una
solucin salina.


72

CONCLUSIONES

Las diferentes tcnicas instrumentales que existen en la actualidad, permiten disponer de una
gama amplia de opciones para afrontar de manera integral un problema analtico en la
agroindustria.

Las tcnicas cromatogrficas individualmente, no son capaces de suministrar una identificacin
inequvoca de un compuesto particular y la confirmacin por tcnicas especficas como la
espectrometra de masas es a menudo obligatoria.

Las tcnicas cromatogrficas tanto en fase gaseosa como lquida, solas, combinadas, o
acopladas con otros equipos, son las ms utilizadas para la identificacin y cuantificacin de
compuestos aromticos de la atmsfera.

Las tcnicas espectromtricas tienen gran aplicabilidad en la determinacin de compuestos
orgnicos e inorgnicos, y son las ms utilizadas entre todas las tcnicas de anlisis cuantitativo.

Los mtodos de anlisis instrumental, hacen parte fundamental de mltiples operaciones
unitarias en el campo agroindustrial.


73

BIBLIOGRAFIA

SKOOG, HOLLER NIEMAN. Principios de Anlisis Instrumental, Quinta edicin, Mc Graw Hill
Interamericana, Madrid, 2001

SKOOG, LEARY. Principios de Anlisis Instrumental, Cuarta Edicin, Mc Graw Hill
Interamericana, Madrid, 1994

HARRIS, D.C. Anlisis Qumico Cuantitativo, Grupo editorial Iberoamrica, Mxico,2000

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http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-0110110-200438//mbm1de1.pdf

http://scsie.uv.es/1004/espectrometria/campos_de_aplicacion.html

http://www.quiminet.com/ar5/ar_vcdarmadvcAAss-la-espectrometria-de-absorcion-atomica.htm

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matografia+en+capa+fina&hl=es&ei=D0wWTcLJLYG8lQexyK2oDA&sa=X&o

http://www.pucpr.edu/marc/facultad/mrodriguez/PDF/Q420/Capitulo%2027.pdf

http://www.sagarpa.gob.mx/Paginas/Paginanoencontrada.aspx?oldUrl=http://www.sagarpa.gob.
mx/Dgg/NOM/011zoo.pdf

www.espectrometria.com

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ANLISIS INSTRUMENTAL

= - (constante de Planck). Cuando decimos que una sustancia qumica absorbe

respecto a tipo de material o medio por el cual se

+ ), acidotioglicolico o cido ascrbico Vita. C.

se utiliza para definir la posicin de las bandas y comparar diferentes condiciones de

de las manchas de la muestra con los de sustancias patrones

muy similares, por lo que nunca debe usarse el

y de una resina intercambiadora de

. El eluato es agua pura o desionizada.

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