INFORME LABORATORIO BIOQUIMICA

CRECIMIENTO MICROBIANO

GRUPO 4 ROLANDO ALZATE ALVAREZ 307501

EDUVIER ARANGO GRISALES 308002 LUISA TRUJILLO TABARES 308549

PRESENTADO A: JUAN CARLOS HIGUITA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MANIZALES 2011

INFORME

Materiales y mtodos

Cultivo en el reactor: para el cultivo en el reactor, tenamos una concentracin de sustrato 1 litro de sustrato, el cual fue inoculado con 100 ml de una solucin que contena la cepa Saccharomyces cerevisiae. Al inicio del experimento se trabaj con temperatura ambiente, mas adelante en el transcurso del experimento se mantuvo una temperatura constante de 35C. Absorbancia: la absorbancia fue realizada con un espectrofotmetro de luz, teniendo como solucin de partida 1 ml de la solucin de cultivo sin inocular, los otros datos de absorbancia fueron medidas en los tiempos presentados con 1 ml de la solucin cultivada. Peso seco: pesamos los tubos de esppendorf numerados en una pesa analtica, despus agregbamos 1 ml de la solucin en el reactor en ese momento, para despus llevarlo a una micro centrifugadora para separar el sustrato de la biomasa; la micro centrifugadora trabajaba a 10000 rpm por 5 minutos. Despus con una micro pipeta extraamos el sustrato para un posterior anlisis de azucares reductores, el tubo de eppendorf con la biomasa fue llevado a un horno a 60C para secado y despus pesado. Cmara de Neubauer: para el conteo en cmara de NB extraemos 1 ml de la solucin de el reactor agregndolo a un tubo de ensayo al cual aadamos un tinte para determinar las clulas viables, del tubo de ensayo con una micro pipeta extraamos 500l que eran puestas en la cmara de NB, para luego ser llevada al microscopio para hacer el conteo de clulas; con el microscopio enfocbamos la cmara de tal manera que pudiramos tener un cuadrante de 4 celdas por 4 celdas. Unidades formadoras de colonias: se introduca 1 ml de la solucin del reactor, en un tubo de ensayo que contena agua pectonada diluida, esto se hace con la necesidad de llevar la muestra a una dilucin adecuada para su posterior cultivo, esto lo hacamos con base en el conteo que nos dada en la cmara de NB. El cultivo lo hacamos al extraer 1 ml de la solucin diluida, para llevarlo a la caja de petri la cual anteriormente era revestida de agar; se reparta la solucin por toda la caja con un rastrillo de vidrio, se tapaba y era llevada al congelador para que se formara las colonias.

Todos los anteriores procedimientos fueron llevados en un ambiente esterilizado, con el uso de mechero en la extraccin de la solucin, as de la esterilizacin de las pipetas y dems instrumentos con alcohol, los procedimientos de esterilizacin fueron eficientes ya que se vio reflejado, por el hecho de no encontrar otros microorganismos, que pudieran haber interferido en el cultivo.

Resultados y grficas

Tabla de datos de laboratorio Tabla 1

HORAS (h) 0 2.5 4.5 6.5 8.5 22.5 24.5 HORAS DE FERMENTACION 09:30 12:00 14:00 16:00 18:00 08:00 10:00 ABSORBANCIA(540nm) 0.041 0.092 0.233 0.478 0.821 1.234 1.268 NB(conteo clulas) 1.20E+00 3.00E+00 6.10E+00 1.10E+01 1.50E+01 2.60E+01 2.89E+01

Tabla 2 PESO TUBO VACIO SECO(g) 0.9544 0.938 0.949 0.9266 0.955 0.8986 0.9406 PESO TUBO+BIOMASA(g) 0.9549 0.9403 0.9503 0.9272 0.9572 0.9005 0.9422 PESO BIOMASA (g) POR LITRO 0.5 2.3 1.3 0.6 2.2 1.9 1.6

UFC/ml 66750 119000 241000 460000 550000 9.36E+06 106800000

UFC/L 66750000 119000000 241000000 460000000 550000000 9360000000 1.068E+11

La tabla 1 y 2 es la recopilacin de los datos obtenidos durante la prctica.

Grficas Son las curvas de crecimiento microbiano reportadas a partir de los datos de las tablas anteriores.

Grafica 1.

Abs vs Tiempo
1.4 Absorbancia (540nm) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 tiempo (h) 20 25 30

Grafica 2.

Peso biomasa vs Tiempo

2.5 peso biomasa (g) en un litro 2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 Tiempo (h) 20 25 30

Grafica 3.

Cmara de NB vs Tiempo
3.50E+01

conteo celulas(camara NB)

3.00E+01 2.50E+01 2.00E+01 1.50E+01 1.00E+01 5.00E+00 0.00E+00 0 5 10 15 tiempo (h) 20 25 30

Grafica 4.

tiempo vs UFC/L
1.2E+11 1E+11 8E+10 UFC/L 6E+10 4E+10 2E+10 0 -2E+10 0 5 10 15 Tiempo 20 25 30

Grafica 5.

UFC/L vs Tiempo (omitiendo los ultimos dos datos)

600000 500000 400000 UFC/L 300000 200000 100000 0 0 2 4 Tiempo 6 8 10

Anlisis de azucares reductores: Para tener una curva representativa de crecimiento microbiano, es indispensable tener en esta misma los datos de la concentracin de sustrato para hacer los anlisis comparativos. La determinacin de las concentraciones de sustrato se hacen con base en el anlisis de los azucares reductores (DNS). Determinacin de azucares reductores: el procedimiento consiste en agregar a una solucin que contenga azucares reductores, un qumico por ejemplo acido diniclosalicilico de color amarillo para que los azucares reaccionen, al mezclarse con estas soluciones los
azucares reductores se oxidan lo que hace que la solucin tome un color rojo marrn. Para la determinacin de la concentracin de sustrato, tenemos que construir una curva de solucin patrn como referencia para determinar la concentracin de sustrato con respecto a la absorbancia; la curva de solucin patrn y el anlisis de la muestra problema; se hicieron simultneamente, el primer paso consisti para la curva de solucin patrn, en diluir concentraciones conocidas de solucin (glucosa), en mililitros de agua pectonada, para tener varias concentraciones de referencia, despus de esto se le agrego el qumico acido

diniclosalicilico , inmediatamente despus de esto la solucin fue calentada al bao de mara por
cinco minutos (para que la reaccin se pudiera llevar a cabo) y despus llevadas a enfriar, se le aaden 5ml de agua y se deja reposar por 15 minutos; esto mismo fue hecho y de manera simultnea con la muestra problema, pero todas las muestras fueron diluidas en 1 ml de agua

pectonada. Las muestras problemas fueron obtenidas del mismo procedimiento de anlisis de peso seco, al ser extradas del tubo de eppendorf llevadas a refrigerar y sacadas para el anlisis de azucares reductores. Despus de enfriadas las soluciones, se construyo una curva patrn con base en los datos obtenidos a partir del espectrofotmetros de luz para concentraciones conocidas de glucosa, posteriormente se hizo este mismo anlisis para las muestras problemas, y con base en la curva patrn podemos determinar las concentraciones de glucosa.

Tabla 3. Anlisis DNS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Muestra patrn blanco(g/ml) ABS(540nm) 4 1.78 2 0.889 1 0.454 0.5 0.202 0.25 0.103 Solucin problema muesta6 1.641 muestra5 1.565 muestra4 1.472 muestra3 1.349 muestra2 1.062 muestra1 0.049 muestra0 (tiempo inicial). 0.051

La tabla 3 son los datos de la absorbancia para la muestra problema y la solucin patrn.

Grafica 6.
4.5 4 3.5 Blanco (g/ml) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5 2 ABSORBANCIA (540nm) Linear (Muestra patron) Muestra patron y = 2.2481x R = 0.9997

La grafica 6 es la curva de la solucin patrn: con base en esta obtuvimos una ecuacin de la lnea recta que nos permite determinar a una absorbancia de la muestra problema su concentracin de sustrato

Tabla 4. horas (h) 0 2.5 4.5 6.5 8.5 22.5 24.5 SUSTRATO (g/ml) 3.6891321 3.5182765 3.3092032 3.0326869 2.3874822 0.1101569 0.1146531 SUSTRATO (g/l) 3689.1321 3518.2765 3309.2032 3032.6869 2387.4822 110.1569 114.6531

Grafica 7.

Sustrato vs Tiempo
4 3.5 3 Sustrato (g/ml) 2.5 2 1.5 1 0.5 0 -0.5 0 10 Tiempo (h) 20 30 Sustrato vs Tiempo

La grafica 7 es la concentracin de sustrato en el tiempo.

Como ya tenemos la grafica de concentracin de sustrato, ahora podemos construir una curva de crecimiento microbiano, comparativa para cada una de las tcnicas de clculo de biomasa.

Grafica 8.

Curva de crecimiento bacteriano (sustrato, absorbancia contra tiempo)

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 -0.5 0 5 10 15 Tiempo (h) 20 25 30 Sustrato (g/ml) Abs (540nm)

Grafica 9.

Curva de crecimiento bacteriano (peso seco, sustrato contra tiempo)

2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 Tiempo (h) 20 25 30 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 -500 Peso seco (g) sustrato (g/l)

Grafica 10.

Curva de crecimiento bacteriano (sustrato, camara de NB contra tiempo)

3.50E+01 3.00E+01 2.50E+01 2.00E+01 1.50E+01 1.00E+01 5.00E+00 0.00E+00 0 5 10 15 Tiempo (h) 20 25 30 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 -500 NB(conteo celulas) sustrato (g/l)

Grafica 11.

Curva de crecimiento bacteriano (sustrato, UFC contra tiempo) omitiendo los ultimos dos datos
600000000 500000000 400000000 300000000 200000000 100000000 0 0 2 4 Tiempo (h) 6 8 10 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

UFC/L sustrato (g/l)

Clculos
rendimientos rendimiento 0.000307737 135194.5277 0.007749381

peso seco (g) UFC/l NB sustrato

inicial 0.5 66750000 1.20E+00 3689.1321

final 1.6 550000000 2.89E+01 114.6531

rendimiento % 0.030773716 13519452.77 0.77493811

tiempo de generacin total peso seco (g) 0.5 UFC/l 66750000 NB 1.20E+00 tiempo de fermentacin (h) 0

1.6 1.07E+11 2.89E+01 24.5

tg (h) 14.6000895 2.301797353 5.337733448

tiempo generacin fase exponencial peso seco (g) 0 0 UFC/l 120000000 5.00E+08 NB 3.00E+00 1.50E+01

tg (h) 2.91E+00 2.58E+00

tiempo de fermentacin (h) 6 6

velocidad especifica peso seco (g) UFC/l NB

tg (h) 0 2.91E+00 2.58E+00

indeterminado 2.38E-01 2.69E-01

Anlisis de datos
Para el anlisis de datos omitimos la curva de crecimiento microbiano que relaciona la absorbancia, sustrato contra tiempo ya que esta se hace a partir de un mtodo analtico fsico, lo cual no nos hace representativo los datos de la absorbancia como puntos de referencia para un anlisis del comportamiento de los microorganismos, lo que si nos es til si la tomamos de referencia como una curva patrn para anlisis similares. La curva de crecimiento microbiano que relaciona el peso seco, sustrato contra tiempo, es una curva de poca ayuda para los anlisis del comportamiento de los microorganismos, por que presenta saltos y puntos de inflexin que la hacen totalmente descartable, sin embargo suponiendo que el dato inicial y final son factibles y no errneos es posible hacer el anlisis de rendimiento global, lo que no es posible es hacer un anlisis de la fase exponencial, en esta curva no est definida la fase exponencial. Las graficas que reportan los mejores datos son las de UFC/l y NB, sustrato contra tiempo, con un pequeo inconveniente, los ltimos dos datos que fueron los que estaban separados por el mayor lapso de tempo presentan un crecimiento que no corresponde en la grafica con su respectiva concentracin de sustrato, el sustrato ya se haba acabado. Sin embargo es de destacar que en la fase exponencial representan los mejores datos para el anlisis de tiempo de generacin y la velocidad especifica, en ambas graficas durante esta fase el tiempo de fermentacin fue de aproximadamente 6 horas, de las cuales aproximadamente 2.5 horas fue el tiempo de generacin, lo cual nos indica que en la fase exponencial casi la mitad del tiempo se dedico a la produccin de microorganismos; as mismo al observar la velocidad especifica de generacin durante esta fase, representan igualmente una gran similitud en dichas graficas. La velocidad fue de aproximadamente 0.25/h, que es igual a 14.3 /minutos, lo cual son velocidades relativamente buenas, nos indica que las condiciones presentadas en el reactor, y el sustrato fueron buenas para el microorganismo a tratar. Lo que si es de resaltar es que para el anlisis de rendimiento no fue posible hacer un anlisis apropiado de las unidades formadoras de colonias porque son valores muy altos, lo cual modifica el rendimiento drsticamente, pero si comparamos las curvas de peso seco y la cmara de NB vemos que el porcentaje de rendimiento no alcanza la unidad, por lo tanto pensaramos que los microorganismos no estuvieron tan afines hacia el sustrato o a la forma que fue suministrado el sustrato, lo que nos indica que este microorganismo tiene poco rendimiento con las condiciones dadas de cultivo.

CONCLUSIONES

Una conclusin importante es que al utilizar los mtodos de cultivo es importante tener en cuenta que el mtodo de unidades formadoras de colonias puede ser engaoso, en las graficas vemos que se dispara el crecimiento de microorganismos, bajo el hecho de que ya se les acabo el sustrato lo cual puede ser confuso si suponemos de que manera van a crecer si se les acabo el alimento, lo que nos pone a pensar que los microorganismos en la caja de petri encontraron condiciones mucho ms favorables para crecer que en el propio reactor, por eso en algunas de estas graficas omitimos estos ltimos valores para observar una curva que tuviera sentido para nuestro experimento. Otra concusin que salta a la vista es que las curvas de peso seco son totalmente incoherentes para nuestro experimento por lo tanto es importante recomendar para futuros trabajos que al hacer este tipo de anlisis la pesa este totalmente calibrada y sea la misma para todos los experimentos, y adems el grupo de trabajo que empieza a hacer el anlisis de peso seco sea el mismo durante todo el laboratorio de tal manera que puedan percatarse si durante el laboratorio cometieron errores al pesar la muestra o al pesar el tubo de eppendorf. La curva de la cmara de NB es una de las curvas que mejores datos nos puede arrojar sobre el crecimiento microbiano, sin embargo para nuestro caso los ltimos dos datos tendan a errar igualmente, esto podra ser por la dificultad que se presenta algunas veces de distinguir los organismos vivos de los muertos o de hacer otra toma de muestra y verificar que en ausencia total de sustrato el microorganismo este muriendo o de no ser as de que otro sustrato se est alimentando el organismo en ausencia de glucosa. Se demuestra nuevamente que los mtodos fsicos como la absorbancia son los mejores indicadores de la concentracin de biomasa, presentan las curvas ms coherentes, sin embargo son ineficientes a la hora de determinar la fase muerta de las curvas de crecimiento microbiano, estos mtodos fsicos no tienen en cuenta cuales clulas estn vivas y cuales muertas, pero a partir de estos se pueden disear curvas patrn que sern muy tiles para la determinacin y comparacin de otras propiedades durante los laboratorios.