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DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E TECNOLOGIA DA FERMENTAO

TPICO I: MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL NA PRODUO DE ALIMENTOS E BEBIDAS E FRMACOS


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I.1- MICRORGANISMOS I.1.1- Introduo Microbiologia Microbiologia: o estudo de organismos microscpicos-

palavras gregas: mikros (pequeno), bios (vida) e logos (cincia). estudo da vida microscpica.
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MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL = otimizao de certas reaes para produo de compostos de interesse

Caractersticas dos microrganismos empregados em processos biotecnolgicos: * Crescer in vitro; * Crescer em larga escala; * Crescer mesmo em condies sub-timas; * Ser de fcil manuteno; * No ser patognico; * Ser facilmente manipulvel e geneticamente estvel.

Processos: Produo de frmacos: antibiticos, esterides, insulina; Produo de qumicos: solventes, enzimas; Produo de suplementos alimentares: probiticos, etc; Produo de bebidas alcolicas: cerveja, vinho, destilados, etc; Produo de vacinas (principalmente antivirais); Controle biolgico de pragas e doenas: B. thuringiensis, Beauveria, etc; Uso de microrganismos na minerao; Biorremediao/fertilidade dos solos.
Processos podem ser melhorados engenharia gentica com grande impacto econmico.
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grande potencial

Taxonomia: o sistema formal de organizao, classificao e nomenclatura dos seres vivos. Saccharomyces cerevisiae
gnero espcie

Escherichia
gnero

coli
espcie

microscopia eletrnica de transmisso (anlise bidimensional)

Microsc. ptico= aumenta em at 2.000 x; Microsc. Eletrnico= em at 400.000 x microscopia eletrnica de varredura (tridimensional).
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m= 10 -6 m nm= 10 -9 m

I.1.2- FONTE DOS MICRORGANISMOS a) No Ambiente: - Responsveis pelo ciclo do carbono, azoto (nitrognio) e fsforo; - Eliminao de txicos; - Controle biolgico de doenas animais e de plantas.

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b) Na Medicina: - Causam doenas; - Controlam doenas (antibiticos). c) Na Alimentao: - Fermentaes (po, vinho, queijo); - Deteriorao de Alimentos.

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d) Na Biotecnologia: - Engenharia gentica; - Sntese de qumicos (acetona, metanol, etc); - Organismos modelo de estudo (processos bioqumicos e genticos).

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Classificao: Microrganismos como agentes de deteriorao dos alimentos - deterioradores. Microrganismos como agentes causadores de doenas transmitidos por alimentos - patognicos. Microrganismos como produtores de alimentos benficos.

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a) Microrganismos

como

Agentes

de

Deteriorao dos Alimentos Alimentos deteriorados so aqueles danificados por agentes microbiolgicos, qumicos ou fsicos, de modo que seja inaceitvel para o consumo humano.

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O tipo de deteriorao depende do: - tipo de alimento microrganismo envolvido (bactrias entricas

raramente deterioram frutos) - nmero de microrganismos presentes. Os agentes causadores de deteriorao: - bactrias; - fungos; - leveduras.
Obs* As carnes so os alimentos mais facilmente deteriorados.
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a.1- Classificao dos Alimentos pela Facilidade com que se Alteram 1. Alimentos estveis ou no perecveis: no so alterados facilmente (acar, farinha). 2. Alimentos semi-perecveis: conservando e

manipulando de forma apropriada permanecem sem alterao (batatas, maas, nozes).

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3. Alimentos perecveis: incluem os alimentos mais importantes do consumo cotidiano, os quais se alteram com facilidade (carnes, pescados, a maioria das frutas, hortalias, ovos, leite).

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a.2- Deteriorao Microbiana - Putrefao; - Fermentao; - Rancidez. Putrefao: - Alimentos ricos em protenas (p.ex. carnes); - Bactrias proteolticas; - Protenas putrescina, cadaverina, H2S, NH3.
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Rano: - Alimentos ricos em gordura; Microrganismos lipolticos, principalmente

bactrias; -Quebra das gorduras cidos graxos glicerol.

Fermentao (azedamento) e coagulao: - Atuam no Leite; - Bactrias do cido ltico; - Lactose cido ltico + outros cidos.
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b - Agentes Patognicos e Conseqncias da sua Presena no Organismo b.1- Doenas Causadas As doenas de origem alimentar surgem quando as funes do aparelho gastrointestinal so perturbadas. Os seus sintomas podem ir de ligeiras indisposies a casos graves que necessitam de cuidados hospitalares.

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Clinicamente, estas doenas apresentam-se sob duas formas: - Infeco causada por microrganismos; - Intoxicao de origem microbiolgica, qumica ou por contacto com toxinas de origem microbiolgica

existentes no alimento.

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As doenas bacterianas de origem alimentar podem ser produzidas por 3 tipos de bactrias: - bactrias toxignicas; - bactrias patognicas; - multiplicao de bactrias habitualmente saprfitas (matria orgnica em decomposio).

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bactrias toxignicas - formam toxinas no alimento durante a sua multiplicao, cuja ingesto provoca no consumidor um quadro patolgico, que est relacionado apenas com a toxina e no com as clulas bacterianas. Ex.: Clostridium botulinum e Staphylococcus aureus.

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bactrias patognicas - que ao contaminar o alimento ingerido podem multiplicar-se ativamente no aparelho digestivo (intestino) provocando uma reao do tipo infeccioso. Ex.: Salmonella, Clostridium perfringens, Bacillus cereus e Vibrio parahaemolyticus.

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multiplicao anormal de bactrias habitualmente saprfitas - pode provocar reaes no consumidor idnticas s causadas por bactrias patognicas. Ex.: Enterococcus

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b.2- Origem dos Microorganismos Patognicos Presentes nos Alimentos Podem ser: Endgenos: J esto presente dentro das estruturas dos alimentos; Podem provocar enfermidades em animais e

vegetais transmitidas ou no ao homem.


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Exgenos: Se incorporam ao alimento durante sua

manipulao e processamento; Podem ser agentes patognicos ou alterantes (saprfitos).

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c - Microrganismos Benficos Leveduras, fungos filamentosos e bactrias

podem ser usados para a obteno direta de alimentos, ou seja, transforma matria-prima,

fazendo parte daquele alimento.

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Bactrias

Leveduras

Fungos

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I.1.3- IMPORTNCIA DOS MICRORGANISMOS NA PRODUO FRMACOS Principais Fontes de Microrganismos Meio Ambiente: solo, gua Alimentos deteriorados: po e frutas. Como isolar? Usar condies seletivas: - pH; - temperatura; - inibidores especficos;
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DE

ALIMENTOS,

BEBIDAS

- fase de pr-cultura (filtrao para remoo de slidos ou de microrganismos indesejveis); - enriquecimento; - cultura propriamente dita (orientando para evidenciar as estirpes com as atividades requeridas).

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Caractersticas Selecionado

de

um

Microrganismo

- Reproduo fcil e rpida em cultura; - Rendimentos elevados (tendo em conta inibio); - Baixos custos de recuperao do produto; - Geneticamente estvel; - Susceptvel de manipulao gentica; - Capacidade de produo quando cultivado em grande escala;
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- No produzir substncias incompatveis com o produto; - No ser patognico (utilizam-se patognicos, por exemplo, para produzir vacinas, isso implica

equipamento especial o que aumenta os custos).

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I.1.3.1- Bolores (Fungos Filamentosos)


- a estrutura
filamentos (hifas) miclio conjunto : o miclio

promover a fixao do bolor ao substrato (miclio vegetativo);

promover a reproduo atravs da produo de esporos (miclio reprodutivo).

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- o miclio

aspecto caracterstico das colnias

- As colnias podem ter um aspecto: cotonoso; ser secas; midas; compactas; aveludadas; gelatinosas; variadas coloraes.
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- Caractersticas fisiolgicas: so menos exigentes que as leveduras e que as bactrias em relao: umidade; pH; temperatura; nutrientes. So em absoluta maioria aerbios.

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Principais Tipos: Aspergillus: + 100 espcies (so importantes agentes de deteriorao de alimentos) os Aspergillus utilizados beneficamente so: Aspergillus oryzae e Aspergillus Soyae: utilizadas na produo de alimentos; Aspergillus niger- produo comercial de cido ctrico, glucnico e glico, beta-galactosidase,
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glicoamilase, lipases e pectinases;

Mucor: muitas espcies utilizadas na produo de queijos e alimentos fermentados orientais. Encontrados em: solo, esterco, frutas, vegetais, gros e outros alimentos. Penicillium - Muitas espcies empregadas na produo de alimentos, especialmente queijos: gorgonzola e roquefort. * Observao: Algumas espcies so produtoras de antibiticos.
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I.1.3.2- Leveduras no homognea em termos taxonmicos; classificao no estvel; defini-se levedura como fungos cuja forma predominante unicelular; Podem ser: - esfricas e ovides; - cilndricas e triangulares.
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algumas

so

bastante

alongadas

formando

filamentos semelhantes s hifas dos bolores; As leveduras requerem menos umidade que a maioria das bactrias e mais umidade que a maioria dos bolores.

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Condies de Crescimento: 25C e 30C, com algumas excees; pH cido; melhor em aerobiose - anaerobiose; acar: melhor fonte de energia, embora leveduras oxidativas sejam capazes de oxidar cidos orgnicos e lcool.
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Principais Tipos: Candida: apresentam classificao complexa; - utilizadas como fonte de lipdios, vitaminas, invertase, lactose e lisina; - algumas espcies so patognicas, mas no se tem notcias de alimentos como veculos destas espcies patognicas.

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Saccharomyces: grupo bastante heterogneo; - todas as espcies tm intensa atividade fermentativa. - espcie mais importantes: Saccharomyces cervisiae: empregadas para as mais variadas finalidades: produo de pes; bebidas: cervejas, vinhos.... lcool; glicerol; invertase... - A espcie Saccharomyces
cervisiae: uma mistura de inmeras linhagens, muitas especialmente selecionadas e exploradas para fins industriais.

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I.1.3.3- Bactrias Formas: esfricas; cilndricas; espiraladas. As bactrias de forma esfrica denominam-se cocos e as cilndricas, bacilos.

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corpo rgido e apresenta vrias espirais = espirilos; corpo rgido em forma de vrgula ou meia espiral= vibries.

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A morfologia individual e os agrupamentos das bactrias coradas.

O mtodo mais usual de colorao o do Gram- dois grandes grupos: gram-positivas; gram-negativas.

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Observaes Importantes:
Atmosfera Gasosa O dixido de carbono e o oxignio so os dois gases principais que afetam o crescimento de clulas

microbianas. O oxignio um fator que influncia, pois sua presena fundamental em processos aerbios e inibitrios nos processos anaerbios. O oxignio pode funcionar como ltimo aceptor de eltrons em organismos aerbios.
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A classificao dos microrganismos dado de acordo com as relaes com o oxignio: aerbios; anaerbios (estritos); anaerbios (aerotolerantes); microaerfilos; facultativos.

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-Microrganismos aerbios obrigatrios: requerem oxignio para sua multiplicao. Ex: Bolores, leveduras oxidativas e bactrias (Pseudomonas, Moraxella etc..); - Microrganismos anaerbios obrigatrios: no requerem oxignio para sua multiplicao e na presena deles no multiplicam. Ex: Clostridium.
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-Microrganismos anaerbios aerotolerantes: no requer oxignio e cresce melhor na sua ausncia, mas pode sobreviver em atmosferas que contenham o mesmo. -Microrganismos anaerbios facultativos: Crescem tanto na ausncia como na presena de oxignio. Ex:

Enterobactrias; - Microrganismos microaerfilos: Crescem em pequena concentrao de oxignio (+/- 10 %) Ex: Lactobacilos e Estreptococos.
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Os genros bacterianos importantes para alimentos podem ser agrupados em seis categorias: 1- bactrias Gram-negativas, aerbias e microaerbias; 2- bactrias Gram-negativas, aerbias estritas; 3- bactrias Gram-negativas, anaerbias facultativas; 4- cocos Gram-positivos; 5- bacilos Gram-positivos produtores de esporos; 6- bacilos Gram-positivos no esporulado.
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Ex:

Bactrias

Gram-Negativas

aerbias

estritas

importantes em alimentos: Famlia Pseudomonadaceae: Pseudomonas; Xanthomonas campestris.

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a- Pseudomonas -Exigncias nutritivas muito simples; - Grande versatilidade; - Intensa atividade metablica; - Habitante gua, solo, alimentos, plantas; - Capacidade aderir; - Metabolismo essencialmente respiratrio; - Baixa resistncia trmica.
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b- Xanthomonas sp. Patognicas para as plantas; Amplamente utilizada na produo de goma xantana. Goma Xantana: um polissacardeo natural e um biopolmero industrial: aditivo em alimentos; indstria petroqumica;
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de

alimentos,

farmacutica

elevada viscosidade a baixas concentraes; tem estabilidade em ampla faixa de temperatura e pH; utilizado como estabilizante, espessante e emulsificante.

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C35H49O29
Goma Xantana

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I.1.4- CRESCIMENTO MICROBIANO I.1.4.1- Medidas de Crescimento aumento de massa resultante de um acrscimo ordenado de todos os componentes de protoplasma; aumento de tamanho decorrentes de fenmenos como absoro de gua ou acmulo de material de reserva no podem ser considerados como crescimento; o mais comum em microbiologia estudar o crescimento da populao, exprimindo-se em termos da massa total;
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As

medidas

de

crescimento

da

populao

microbiana em meio lquido: a) Determinao do Peso Seco ou mido: Processos: - centrifugao da suspenso; - separao do sedimentado e sobrenadante; - anlise da massa sedimentada (em vidro de relgio tarado). Aplicaes: - amostras relativamente grandes so necessrias; - realizada na fase inicial e final do processo.
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Desvantagens:
- a lavagem das clulas antes da secagem pode conduzir a perdas de material, alm disso,

componentes celulares solveis so retirados; - o mtodo no pode ser aplicado quando o meio de cultura contm partculas slidas em suspenso.

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b)

Determinao

Qumica

de

Componentes

Celulares: Processo:

- a massa microbiana dosada atravs de certos


componentes celulares, como protenas e cidos nuclicos; - esses mtodos podem ser muito sensveis podendo ser aplicados a amostras pequenas;
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Desvantagens: - o grande inconveniente do mtodo est relacionado a composio qumica das clulas microbianas serem altamente varivel de acordo com as condies de crescimento: composio do meio de cultura; idade da cultura; velocidade de crescimento; isto acontece principalmente com bactrias.
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c) Turbidimetria
Processo: - consiste na medida da turvao de uma suspenso microbiana; pode-se medir a absorbncia em um

espectrofotmetro; - a turvao est relacionada diretamente com a massa de microrganismos presente;

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neste

processo

pode-se

construir

curvas

paralelamente ao desenvolvimento do processo; fatores como: tamanho das clulas; composio qumica; presena de material particulado interferem com a preciso do mtodo; - curvas de calibrao, com base em determinaes de peso seco, para cada conjunto de condies

experimentais so importantes para gerar bons 65 resultados.

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d) Determinao do Nmero de Microrganismos So utilizados 2 mtodos gerais: d.1- Contagem do nmero total de indivduos; Camra de Neubauer (clulas/mL)

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d.2- Contagem de microrganismos viveis:

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I.1.4.2- Fases do Crescimento Microbiano Ao construir um grfico global do crescimento microbiano em cultura descontnua em meio lquido, observa-se que a curva representativa desse crescimento apresenta vrias fases.

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Este comportamento verificado, pois em uma cultura descontnua, as condies no

permanecem ideais por muito tempo. a quantidade de nutrientes comea a diminuir e produtos do metabolismo microbiano vo se acumulando cada vez mais; estas condies tm considervel influncia sobre o crescimento dos microrganismos.
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a) Fase lag : Caractersticas: - a contagem no revela aumento de nmero; - h aumento, que est diretamente relacionado ao tamanho dos indivduos; - verificada quando os microrganismos semeados provm de uma cultura velha, no mais em crescimento exponencial;
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-conseqncia da necessidade de renovao dos microrganismos

culturas velhas enzimticos em cidos

perda de certos sistemas

esgotamento do substrato/deficincia nuclicos e outros componentes

importantes do protoplasma;
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- microrganismos

novo meio de cultura

antes de iniciarem sua multiplicao

fase de renovao

aumento de tamanho em conseqncia da sntese de material novo.


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Questes: 1- Microrganismos crescendo exponencialmente, semeados em meio idntico apresentam fase lag? Justifique. Resp: 2- Se o meio for mais pobre do que o original estes microrganismos crescendo exponencialmente apresentaro fase lag? Justifique. Resp: 3- Microrganismos, mesmo velhos, em meio mais rico do que o original apresentam fase lag? Justifique. 74 Resp:

b) Fase de crescimento exponencial (fase log) Caractersticas: as clulas os esto plenamente adaptadas, seus

absorvendo

nutrientes,

sintetizando

constituintes, crescendo e se duplicando; - os microrganismos se encontram na plenitude de suas capacidades, num meio cujo suprimento de nutrientes superior s necessidades do organismo semeado; - a velocidade especfica constante;
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- a fase mais importante do crescimento microbiano

fornece dados fundamentais para os estudos: fisiologia; cintica, para os quais a velocidade especfica um parmetro de mxima importncia; - a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda pequena; - taxa de crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo em questo.
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c) Fase estacionria: Caractersticas: - os nutrientes esto escasseando e os produtos txicos esto tornando-se mais abundantes; -so sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem: antibiticos; enzimas;
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- no h um crescimento lquido da populao= nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem diminuindo a velocidade de crescimento. A influncia do acmulo de metablitos txicos particularmente evidente em meios contendo carboidratos fermentveis; o acmulo de cidos orgnicos rapidamente inibe o crescimento. O tamponamento do meio permite um rendimento 78 maior.

d) Fase de declnio: Caractersticas: - o nmero de microrganismos que morre torna-se progressivamente superior aos que surgem; - a cultura se esteriliza; - a durao da fase extremamente varivel.

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CADERNO

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Exemplo 1:
Tempo (h) N. Clulas totais Tempo (h) 0 1 0 1 2 1 1,5 4 1,5 2 8 2 2,5 32 2,5 3 32 3 3,5 64 3,5 4 128 4 4,5 256 4,5 5 512 5 5,5 1024 5,5 Log X 0 0,301 0,602 0,903 1,505 1,505 1,806 2,107 2,408 2,709 3,010

y = 0,568x - 0,146 R = 0,988


3,5

Forma Grosseira: = 1,26 h-1 Forma Grfica (precisa)= = 1,305 h-1


L O G x

2,5

1,5

0,5

0 0 1 2 3 4 5

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6

Tempo (h)

Exemplo 2: Comparao do crescimento de Saccharomyces boulardii em fermentador por batelada tipo air lift e shaker

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EXERCCIO EXTRA: Candida subtilis cresce em glicerol com velocidade especfica de crescimento mxima de 0,095 h-1. Qual o tempo necessrio para esse microrganismo duplicar a sua massa na fase exponencial de crescimento em um processo batelada?

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