GENETICA

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS DE

LABORATORIO

Lic. C. M. Damian Mendez

Ciclo Lectivo 2013

Trabajo Prctico N 1
MITOSIS
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Reconocer microscpicamente las distintas fases de la divisin mittica y
algunas de sus caractersticas.-

MATERIALES A UTILIZAR
Raicillas jvenes de Allium cepa (cebolla), herramientas de laboratorio e
instrumental ptico adecuado. Se utiliza como material biolgico a la cebolla por la
facilidad para obtener sus preparaciones cromosmicas, esto se debe a que posee pocos
cromosomas (2n=16) y los bulbos enrazan fcilmente generando abundante material.-

TRABAJO A REALIZAR EN EL LABORATORIO

1) Obtencin de preparados temporarios que se realizarn durante la clase
prctica de acuerdo a las instrucciones de esta gua.2) En los preparados propios o en los facilitados por el docente, observar y
dibujar clulas en los diferentes estados de la divisin mittica (Interfase, Profase,
Metafase, Anafase y Telofase), destacando las caractersticas de los mismos,
especialmente la aparicin o desaparicin de estructuras cuya presencia o ausencia
caracteriza stas etapas (membrana nuclear, nuclolos, huso acromtico, etc.). Observar
cromocentros o cromatina en interfase y profase. Aclaracin: dibujar los diferentes
estados en su secuencia real para facilitar su estudio y anlisis posterior.
3) Observar la morfologa de los cromosomas, prestando particular atencin a la
posicin de los centrmeros y presencia de constricciones secundarias y satlites.

CICLO MITTICO
Simultneamente a las observaciones que realiza en los puntos anteriores deber
registrar los parmetros necesarios para el anlisis del ciclo mittico.
1) Calcular el ndice mittico a partir de 250 clulas observadas barriendo el
campo ptico de derecha a izquierda y de arriba hacia abajo, de acuerdo con la frmula
siguiente:

IM =

Nmero de clulas en divisin

Nmero total de clulas observadas

x 100

2) Identificar 50 clulas en divisin y registrar las fases en que se encuentran.

3) Con los datos obtenidos en el apartado anterior y los registrados por sus
compaeros, calcule la duracin relativa de cada fase mittica mediante el ndice de
fase:

IF =

Nmero de clulas en esa fase

Nmero total de clulas en divisin

x 100

TCNICA OPERATORIA
Una de las tcnicas mas frecuentemente empleadas en el estudio de cromosomas
mitticos se denominada tcnica de aplastamiento (squashing), mediante la cual se
puede hacer recuentos cromosmicos y estudiar la morfologa de los cromosomas, y
consiste de los siguientes pasos:
1) Poner a enraizar bulbos (o semillas) y cortar las races enteras cuando
alcanzan entre 5 mm y 1 cm, es decir mientras las clulas del pice se hallan en
crecimiento activo.
2) Sumergir las raicillas durante 1 a 4 horas en algn veneno mittico para
inhibir la formacin del huso acromtico. Los venenos mas utilizados son las soluciones
acuosas saturadas de paclosol (Paradiclorobenceno), gamexane y alfa-bromonaftaleno
(Naftalina) y, tambin, solucin de colchicina al 0,05-1% o solucin 0,002 M de 8Hidroxiquinoleina; la eleccin de inhibidor depender del material biolgico en estudio.
Como resultado de dicha inhibicin se acumulan clulas en Metafase, los cromosomas
se distribuyen por toda la clula en lugar de hallarse amontonados en la regin
ecuatorial y, adems, los cromosomas se contraen facilitando el estudio de su
morfologa.
Aclaracin: este paso solo se efecta si se desea estudiar la morfologa de los
cromosomas metafsicos, si el objetivo planteado es estudiar los estados normales de la
mitosis debe suprimirse.
3) Fijar en una solucin de alcohol etlico y cido actico glacial en proporcin
3:1 durante 12 a 24 hs (en caso de apuro se puede reducir el tiempo a 1 2 hs)

4) Si las preparaciones cromosmicas no se realizan inmediatamente, conservar

en etanol al 70% a 4C, donde el material puede conservarse en buen estado durante
varios meses.
5) Transferir las raicillas a un vidrio de reloj con cido clorhdrico (HCl 1N) a
temperatura ambiente durante diez a treinta minutos, dependiendo del material, para
disolver el cemento pctico de la pared celular.
6) Colocar las raicillas sobre el portaobjetos; con ayuda del instrumental ptico
adecuado retirar la cofia y cortar los meristemas apicales que se distinguen ms blancos.
7) Colocar una pequea gota del colorante utilizado (Orcena Actica 2%,
Orcena Lactopropinica 2%, Carmn Actico 2%, etc.), disgregar los tejidos apicales
con una barra metlica de extremo plano y colocar el cubreobjetos. Agregar colorante
por los bordes si es necesario.
8) Si es necesario, flamear en mechero para aclarar el citoplasma y aumentar el
contraste de los cromosomas, de esta manera se diferencian mejor. El calentamiento no
debe superar los 50C aproximadamente. La temperatura debe controlarse con la mano;
el colorante no debe hervir y bastan unos pocos y breves pasajes por la parte superior de
la llama.
9) Realizar un squash (aplastado). Para ello se colocan los preparados entre
papeles absorbentes, se sostiene con los dedos de una mano y se hace presin
verticalmente con el pulgar de la otra mano en el centro del cubreobjetos. Evitar el
deslizamiento del cubre sobre el portaobjetos ya que rompen o enrollan las clulas.
10) Examinar al microscopio ptico convencional con el objetivo de menor
aumento. Si no se observan grandes agrupaciones de tejido y las clulas estn
suficientemente aplastadas, se sella la preparacin solucin de goma comercial. De lo
contrario, si faltara aplastamiento se instilan 1 o 2 gotas del colorante por los bordes del
cubre y se un nuevo squash.
11) Recorrer completamente el preparado con el objetivo de 10x, siguiendo un
movimiento ordenado de la platina de derecha a izquierda y de arriba hacia abajo, y
contar las clulas para calcular el ndice mittico e ndice de fases. Ubicar las mejores
clulas en cada una de las fases y anotar su posicin leyendo el Vernier de la platina
para estudiarlas posteriormente a mil aumentos con objetivo de inmersin.

Fotografa de las fases de la mitosis de Allium cepa


Cerutti, J. C. 2009. Gua de laboratorio de Gentica General de la
Licenciatura en Gentica. Universidad Nacional de Misiones.
Griffiths, A.; Miller, J; Suzuki, D.; Lewontin, R. y Gelbert, W. 2003.
Gentica. 7ma Edicin. Traducido de la sexta edicin en ingls de la obra An
introduction to Genetic Analysis. McGrawHill. Interamericana. Madrid.
Espaa.
Griffiths, Anthony. 2004. Gentica Moderna. Ed. Mc Graw Hill. Espaa.
Lacadena, J. R.1999. Gentica. Ed. Sntesis Madrid.
Snchez Monge, R. y Jouve, N. 1989. Gentica. Ed. Omega. Barcelona.
Saiman B.; Mola L.; Hopp, E. 2008. Gua de laboratorio de Gentica I.
Universidad Nacional de Buenos Aires.
Strickberger, M. 1982. Gentica. Ed. Omega. Barcelona.
Klug, W. S.; Cummings, M. R. 1999. Essentials of Genetics. 3 Edition.
Pearson Prentice Hall. New Jersey.
Klug, W. S; Cummings, M. R. y Charlotte, A. Spencer. 2006. Conceptos de
Gentica. Ed. Pearson Prentice Hall. Espaa

Trabajo Prctico N 2
MEIOSIS

OBJETIVO
Reconocer las distintas fases de la divisin meitica y algunas de sus
caractersticas ms sobresalientes. Comprender la importancia de cada una de las etapas
de este proceso biolgico.
MATERIALES A UTILIZAR
Gnadas masculinas de ortpteros de distintos gneros y especies. Se utiliza este
material biolgico dado que posee slo cromosomas telocntricos y facilita la
interpretacin de las configuraciones cromosmicas observadas. Instrumental ptico y
herramientas de laboratorio adecuadas.
TRABAJO A REALIZAR EN EL LABORATORIO
1) Obtener preparados temporarios que se realizarn durante la clase prctica
siguiendo las instrucciones de la tcnica operatoria que se detalla a continuacin.
2) Observar y dibujar, en forma esquemtica, clulas en diferentes fases de
divisin (Interfase, Leptotene, Cigotene, Paquitene, Diplotene, Diacinesis, Metafase I,
Anafase I, Telofase I, Metafase II, Anafase II, y Telofase II). En cada uno de los
esquemas remarcar las caractersticas sobresalientes de la etapa, por ejemplo:
a) Dibujar detalladamente un bivalente (II) en paquitene, donde se vea la
organizacin cromomrica y el apareamiento crommero a crommero. Observar la
heteropicnosis positiva del univalente sexual X.
b) En diplotene temprano observar y dibujar la repulsin precoz de los extremos
del bivalente y la heteropicnosis positiva del cromosoma X. Notar que ste ltimo est
compuesto por dos cromtidas hermanas.
c) En diplotene avanzado observar la repulsin de los homlogos y dibujar un
bivalente en el que sean notorias las 4 cromtidas que lo componen. Dibujar el X
hetrocromtico.
d) En diacinesis graficar la configuracin de los bivalentes y destacar la
heterocromaticidad del X con respecto a los autosomas.
e) En diplotene, diacinesis y metafase I marcar los quiasmas proximales,
intersticiales y distales, sealndolos con una flecha y colocando las iniciales qp, qi y
qd. En las clulas dibujadas calcular el coeficiente de terminalizacin de quiasmas, que
es la proporcin de quiasmas distales (qd) con respecto al total de quiasmas en la clula.

TCNICA OPERATORIA
Introduccin Terica
Se estudiar la meiosis en gnadas masculinas de distintas especies de Acrdidos
(Orthoptera) de la provincia de Misiones. Los testculos de estos insectos, si bien de

morfologa general variable, presentan una estructura folicular tpica. Los folculos son
sacos ciegos ms o menos alargados que desembocan en un conducto deferente comn.
En cada folculo la meiosis es cstica, y en la regin apical del folculo se encuentra la
zona germinal en donde se producen las espermatogonias. Un cisto consiste de un grupo
de espermatogonias que provienen por mitosis de una nica clula original, que entran
simultneamente en meiosis y la cumplen en forma sincrnica. Por tal motivo en un
cisto todas las clulas se encuentran en el mismo estado de divisin; cuanto ms distal
es un cisto dentro del folculo ms avanzado es el estadio meitico en que se encuentran
las clulas.
Obtencin de preparaciones citogenticas temporarias
1) Despus de eterizar al animal, extraer los testculos practicando una incisin
dorso lateral a la altura del 2 segmento abdominal y ejercer una presin leve sobre el
abdomen para que los testculos emerjan.
2) Pegar los testculos a un papel de filtro debidamente rotulado; fijarlos en una
solucin 3:1 de metanol absoluto : cido actico glacial durante 30 a 120 min como
mnimo. El material fijado se puede conservar a 4 en el mismo fijador o en etanol al
70%.
3) Colocar entre 2 y 6 folculos (de acuerdo a su tamao) sobre un portaobjetos,
agregar una gota de hematoxilina frrica u orcena lactopropinica al 2%. Dilacerar el
material con una barra de metal (hierro) de extremo plano.
4) Colocar un cubreobjetos, no flamear. Realizar el squash de la manera habitual
y sellar el preparado con solucin de goma o cera depilatoria, segn el tratamiento que
se practique posteriormente. Los preparados pueden hacerse permanente transcurridas
dos horas como mnimo.
Obtencin de preparaciones permanentes
a) Por congelacin:
1) Retirar el sellador con ayuda de un bistur u hoja de afeitar. Evitando los
deslizamientos del cubreobjetos, limpiar los restos de sellador con papel absorbente
embebido con xilol.
2) Congelar el preparado colocndolo sobre un trozo de hielo seco (30 seg), por
exposicin a un flujo continuo de CO2 o por inmersin en nitrgeno lquido.
3) Saltar el cubreobjetos con ayuda de un bistur u hoja de afeitar.
4) Sumergir el portaobjetos y el cubreobjetos en alcohol absoluto durante 1
minuto.
5) Lavar el portaobjetos con alcohol absoluto 2 3 veces.
6) Colocar una gota de medio de montaje soluble en alcohol (Euparal). En el
caso de utilizar un medio montaje soluble en xilol (Xam o DePeX), realizar un pasaje
por xilol antes del montaje definitivo.
7) Colocar un nuevo cubreobjetos limpio y seco.
8) El cubreobjetos original se trata de manera similar al portaobjetos y se asocia
con un nuevo portaobjetos limpio y seco.
9) Si se observa alguna turbidez generada por hidratacin, calentar suavemente a
la llama hasta que desaparezca. Nunca debe hervir el medio de montaje definitivo.

10) Estacionar durante 24 hs. a 37C antes de observar para que se seque el
medio de montaje.
Aclaracin: es aconsejable el uso de cubreobjetos siliconados para evitar que las
clulas se adhieran a l y, de esta forma, trabajar nicamente con el portaobjetos al
hacer permanente la preparacin.
b) Desprendimiento del cubreobjetos por inversin:
1) Retirar el sellador con ayuda de un bistur u hoja de afeitar evitando que se
deslice el cubreobjetos.
2) Limpiar los bordes del cubreobjetos con xilol y luego con cido actico 45%
para eliminar los restos de sellador.
3) Colocar el preparado de manera invertida (con el cubreobjetos hacia abajo)
dentro de una Caja de Petri y sobre una varilla de vidrio doblada en U, agregar cido
actico al 10% y esperar hasta el desprendimiento del cubreobjetos.
4) Lavar dos veces el portaobjetos con alcohol 96, 1 minuto cada vez, dejando
gotear el alcohol desde el borde del vidrio.
5) Repetir el procedimiento anterior con alcohol etlico absoluto. Evitar la
desecacin.
6) Agregar una gota de Euparal y continuar el procedimiento como en la tcnica
anterior. En caso de utilizar medios de montajes solubles en xilol, realizar previamente
un lavado con este hidrocarburo.

Meiosis en ortpteros: clulas en diplotene, diacinesis y metafase I de diferentes

especies de orthoptera y sus correspondientes esquemas de interpretacin. c:
Centrmero; ch: Quiasmas; x: cromosoma x monovalente.