PROGRAMA DE BIOLOGA CURSO: Microbiologa General CDIGO: 20404-20407 PGINA: 42 de 50

GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGA

LABORATORIO No.9. ESTIMACIN DEL CRECIMIENTO Y EL NMERO DE BACTERIAS POR MTODOS INDIRECTOS (TURDIMETRA)

INTRODUCCIN
La determinacin de la turbidez (turbidemetra) es un mtodo prctico para controlar y estimar el crecimiento bacteriano para algunos tipos de trabajo experimental. Cuando las bacterias se multiplican en un medio lquido, ste se torna turbio o nebuloso por las clulas y el instrumento que se utiliza para medir este efecto es un espectrofotmetro o colormetro. En este equipo un haz de luz se transmite a travs de la muestra a una celda fotoelctrica y cuando la cantidad de bacterias aumenta, la luz se dispersa y menos luz alcanza la celda fotoelctrica. Este cambio de luz se registra en el instrumento como porcentaje de transmisin. Tambin se puede determinar como una medicin logartmica del instrumento denominada absorbancia o densidad ptica (D.O), el cual se utiliza para graficar el crecimiento bacteriano. Cuando las bacterias se encuentran en la fase logartmica de crecimiento o de muerte, la representacin de la absorbancia frente al tiempo forma una lnea casi recta. Es importante tener en cuenta para visualizar los primeros puntos o trazas de turbidez de haber ms de un milln de clulas bacterianas por mililitro de muestra y se precisan de 10 a 100 millones de bacterias por mililitro para que la suspensin se vuelvo lo bastante turbia como para ser leda en un espectrofotmetro. Por lo tanto, la turbidemetra no es un mtodo til para medir contaminacin de lquidos con un nmero relativamente pequeo de bacterias.

OBJETIVOS Conocer y estimar el crecimiento bacteriano mediante una curva de cintica de la biomasa celular. MATERIALES
45 mL de caldo nutritivo Espectrofotmetro Gradillas Mecheros Pipetas estriles de 5mL

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Propipeteador Solucin desinfectante Marcador Cultivo de 24-48 horas de E. coli en caldo nutritivo (50 mL).

PROCEDIMIENTO
1. Tome 5 mL del cultivo de E. coli y depostelos en un Erlenmeyer que contenga 45mL de caldo nutritivo, homogenice el cultivo mediante agitacin suave. 2. Tome 3 mL de este cultivo homogneo y depostelos en una celda del espectrofotmetro para leer el valor de densidad ptica (D.O) a 600 nm. Esta lectura corresponder al tiempo 0 (t =0). 3. Incube el cultivo a 37 C. Lea y anote las D.O a las 0,5- 1,0-1,5-2,0-3,0, 4,0 y 6,0 horas pos incubacin, de la misma manera que ley el tiempo cero.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS
1. Elabore una grfica de D.O vs tiempo e identifique las fases de crecimiento y duracin (fase Lag o perodo de adaptacin, fase exponencial, fase estacionaria y Fase de muerte). 2. Determine las generaciones (n) o nmero de divisiones celulares en el cultivo. n= (logN-logNo) / log 2. Tener en cuenta que Log 2= 0,301 3. Calcule la velocidad de crecimiento (Vc): Vc= n/t, es decir el nmero de generaciones (n) que ocurren por unidad de tiempo. 4. Tiempo de generacin (tg): es el tiempo requerido para que se duplique el nmero de clulas de la poblacin bacteriana.tg=1/vc CONSULTAR SOBRE Qu factores biticos y abiticos controlan el crecimiento microbiano?. Que otros tipos de mtodos directos e indirectos hay para valorar el crecimiento bacteriano? Responda las siguientes preguntas de acuerdo a la siguiente grfica. En qu fase de crecimiento se encuentra el cultivo en el punto (a)? Qu eventos metablicos estn ocurriendo en las clulas en el punto (a)? Proponga una hiptesis del porque el nmero de microorganismos no aumenta en el punto (c).

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A qu se debe la disminucin del nmero de microorganismo en el punto (d)?. Justifique su respuesta. Qu tipo de cultivo permite que el microorganismo pase por las cuatro fases de crecimiento?. Justifique su respuesta.