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Reportes efectuados por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
en 1999, han establecido que la diabetes mellitus es una de las enfermedades
metablicas crnicas de mayor tendencia de aparicin de nuevos casos
clnicos en los seres humanos, con una prevalencia actual de 5 a 10% entre
la poblacin mundial, y a juicio de un grupo notable de investigadores
proponen que en la misma, los radicales libres derivados del oxgeno juegan
un papel crucial como subproductos nocivos a los tejidos afectados. Dada la
importancia de lo sealado anteriormente, se propuso como objetivo central
el analizar el papel que juegan estas molculas como agentes inductores del
estrs oxidativo evaluando adems, el posible papel protector que pudiera
jugar la hormona melatonina como agente antioxidante. Los objetivos
especficos planteados fueron los siguientes:
.-Evaluacin de algunos parmetros fisiolgicos como peso corporal y
volumen excretado de orina en 24 horas en ratas con diabetes mellitus tipo I
.-Evaluacin de los niveles de glicemia en ratas con diabetes mellitus tipo I.
.-Determinacin de niveles de peroxidacin lipdica en rebanadas de corteza
de riones de rata con diabetes mellitus tipo I.
Este otro estudio fue realizado en la fecha comprendida entre los
meses de Octubre y Noviembre del ao 2004, en las instalaciones del
Laboratorio de Bioenergtica Celular del Centro de Biofsica y Bioqumica
del IVIC, Altos de Pipe, mediante un trabajo conjunto entre ese laboratorio
y la Unidad de Investigacin en Fisiologa del Decanato de Medicina de la
UCLA de Barquisimeto.
Al igual que otros tipos de antioxidantes, caso de la vitamina E, se ha
descrito que la melatonina es capaz de proteger a la clula contra posibles
reducciones en la fluidez de la membrana plasmtica celular y procesos
asociados a la peroxidacin lipdica. En otras palabras, sera capaz de ejercer
efectos estabilizantes sobre la membrana celular. Trabajos muy interesantes
(Haber-Weiss)
H
2
O
2
+ Fe
2+
complejo intermedio Fe
3+
+ OH
?
+ OH
-
(Fenton)
El radical OH
?
Es muy inestable y reacciona con una variedad de
compuestos orgnicos y con componentes diversos de las membranas
biolgicas. En condiciones normales, no se producen o no existen
concentraciones importantes de radicales hidrxilo y no existe sistema
enzimtico capaz de remover cantidades excesivas de este tipo de compuesto,
de all la importancia de la catalasa y la glutatin peroxidasa en la remocin del
H
2
O
2
intracelular. A bajas concentraciones de H
2
O
2
, ste es removido por la
glutatin peroxidasa, en presencia de glutatin reducido (GSH) el cual es
oxidado hasta glutatin oxidado (GSSG):
2 GSH + H
2
O
2
GSSG + 2H
2
O [9]
A altas concentraciones de H
2
O
2
, la catalasa se vuelve primordial en su
remocin:
2 H
2
O
2
O
2
+ 2H
2
O [10]
Entrelos mecanismos celulares no enzimticos de proteccin contra
los radicales libres, se cuentan:
a) El a-tocoferol o vitamina E, que se le ha descrito como antioxidante de
la fase lipdica, ya que por ser liposoluble, se particiona con mucha facilidad
hacia las membranas y transforma especies reactivas como los radicales
hidrxilo o perxilo en componentes menos reactivos. Acta donando H
+
al
radical y por tanto, confinando el efecto del radical; en adicin se produce una
forma de radical estable de vitamina E (Halliwell-Gutteridge, 1989).
b) El cido ascrbico o vitamina C, antioxidante de fase acuosa, lacual se
localiza en altas concentraciones en ciertos rganos, especialmente en el ojo
(Halliwell, 1986). A este compuesto se le ha reconocido por mucho tiempo,
que posee propiedades antioxidantes y protege contra daos oxidativos a
aceites de origen vegetal, grasas animales, alimentos conteniendo grasas, tales
como leche, pescados, margarinas, entre otros. Estas funciones de la vitamina
C son mayormente derivadas de sus propiedades Redox. El compuesto acta
donando hidrogeniones al radical libre, transformandose el cido ascrbico
(AH
2
) en cido dehidroascrbico (A), con la concomitante formacin del
radical ascrbilo (A
?
) como intermediario, molcula que acta como un
radical libre, pero que es normalmente mantenido a una baja concentracin en
el plasma. Se ha demostrado que la vitamina C suprime la oxidacin de
liposomas de fosfatidilcolina de soya y membranas de fantasmas de eritrocitos
en dispersiones acuosas, oxidacin inducida por radicales libres. Por el
contrario, se ha notado que la vitamina C no suprime en forma eficaz, como
lo hace la vitamina E, radicales dentro de las regiones lipdicas de las
membranas (Halliwell-Gutteridge, 1989)
c) Ceruloplasmina, protena circulante portadora de cobre, puede actuar
como antioxidante extracelular (Halliwell, 1986)
d) Otros: Cistena, Manitol, Alopurinol, Tiourea, Hidroxitolueno-butilado,
Desferroxamina, Dimetilsulfxido, Dimetiltiourea, Fosfatidilcolina de soya,
entre otros (Tiskow, 1996)
? El Proceso de Peroxidacin Lipdica:
El ataque a los fosfolpidos de membrana por los radicales libres se
centra fundamentalmente en el proceso de peroxidacin lipdica de los
residuos de cidos grasos de los fosfolpidos.
Se considera que el proceso de peroxidacin lipdica ocasiona cambios
en la composicin qumica y deterioros en la organizacin ultraestructural de
las membranas celulares, disminuyendo la fluidez de las mismas, alterando su
permeabilidad e inactivando receptores y enzimas unidas a la membrana.
(Halliwell-Guteridge, 1989), (Tiskow, 1996)
El proceso de peroxidacin lipdica como tal es complejo y puede
entenderse como un mecanismo por el cual los lpidos insaturados reaccionan
con el oxgeno para producir hidroperxidos lipdicos:
LH + O
2
LOOH [11]
donde LH es un lpido y LOOH es el hidroperxido resultante.
El mecanismo intrnseco de peroxidacin lipdica puede describirse
como sigue: la reaccin es iniciada por el ataque de radicales libres, los cuales
sustraen un tomo de hidrgeno de un carbono metileno en la cadena lateral
de un cido graso de un fosfolpido (ver Fig. No. 9). El tomo de hidrgeno
es un radical libre de por s (puesto que tiene un electrn singlete desapareado)
y su remocin deja un electrn desapareado en el tomo de carbono
atacado. A este proceso descrito se le ha denominado iniciacin de la
peroxidacin lipdica.
El radical carbonilo (L?) resultante sufre rearreglos moleculares
originando un dieno conjugado, y en presencia de oxgeno molecular da lugar
al radical perxilo.
R? + LH RH + L
?
(Fase de Iniciacin)
El radical carbonilo resultante (L) sufre rearreglos moleculares originando un dieno conjugado, y en
presencia de oxgeno molecular da lugar al radical perxilo (LOO):
L
?
+ O
2
LOO
?
El radical perxilo puede sustraer un tomo de hidrgeno de otra molcula vecina (LH), la cual puede ser
otro cido graso insaturado, formndose as un hidroperxido (LOOH) y un nuevo radical lipdico (L),
entrando la peroxidacin en una Fase de Propagacin:
LOO
?
+ LH L
?
+ LOOH (Fase de Propagacin)
LOOH LO
?
+ OH
?
(Fase de Ramificacin)
Reacciones de Terminacin:
L
?
+ L
?
P* P + h?
LOO
?
+ L
?
P* P + h?
LOO
?
+ LO
?
P* P + h?
Figura No. 9
Representacin esquemtica del proceso de peroxidacin lipdica.
Los radicales perxilo pueden sustraer un tomo de hidrgeno de otra
molcula vecina (LH), la cual puede ser otro cido graso poliinsaturado,
formndose as un hidroperxido (LOOH) y un nuevo radical lipdico (L
?
),
entrando la peroxidacin lipdica en un proceso de propagacin. El grado de
propagacin de la reaccin depende de muchos factores, entre ellos, la
relacin lpido/ protena en la membrana (la oportunidad de reaccionar un
radical con una protena se incrementa cuando el contenido de protena
aumenta), de la composicin de cidos grasos, concentracin de oxgeno y de
la presencia dentro de la membrana de antioxidantes que inhiban la
propagacin de la reaccin. El hidroperxido lipdico puede en adelante
degradarse a una variedad de productos. Adems, en presencia de metales de
transicin, como Fe
++
, Cu
+
, el hidroperxido produce un radical alcxilo
(LO
?
) y un radical hidrxilo (OH
?
), los cuales causan la ramificacin de la
reaccin, involucrando un mayor nmero de molculas del sustrato en el
proceso de peroxidacin. Cuando la concentracin de molculas de sustrato
se hace pequea, los radicales libres comienzan a reaccionar entre s, en
distintas combinaciones provocando la formacin de productos excitados
(P
*
). El paso de estos productos excitados a su estado estable (P) ocurre con la
emisin de cuantos de luz visible. Estas reacciones reciben el nombre de
reacciones de terminacin y con ellas concluye la reaccin en cadena mediada
por radicales libres (Halliwell-Gutterige, 1989), (de Zwart, 1999)
ANEXO 2
Determinacin de Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbitrico
mediante la cuantificacin de malondialdehdo producido
Mtodo de Ohkawa et.al
Para determinar los niveles de peroxidacin lipdica, se cuantificaron los
niveles de Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbiturico (SRAT), por el
mtodo de (Ohkawa, 1979). A los tubos experimentales se les agreg 700 l
de agua destilada, 200 l de SDS al 8,1%, 1500 l de cido actico (pH 3.5)
al 20%, 1500 l de cido tiobarbitrico al 0,8 % y 100 l del homogenizado.
Los tubos se colocaron en un bao de agua hirviendo por 45 minutos.
Luego los tubos fueron enfriados en bao de agua a temperatura ambiente
por unos 5 minutos, y se les aadi luego 1 ml de agua destilada y 5 ml de
butanol. La suspensin fue agitada vigorosamente y sometida a
centrifugacin a 4000 rpm por 10 minutos en centrfuga clnica. El
sobrenadante se removi con sumo cuidado y se determin su absorbancia
a 532 nm en contra de un blanco tratado de igual manera, pero que no
contena la suspensin de membranas. Se prepar una curva de calibracin
usando como estndar 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP). Los resultados
fueron expresados como nanomoles de malondialdehdo (MDA) por mg de
protena.