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PERSPECTIVAS CLINICAS Y EXPERIMENTALES EN EL USO

DE LA HORMONA MELATONINA COMO


ANTIOXIDANTE CELULAR











GREGORIO TISKOW DROST








UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL
LISANDRO ALVARADO











BARQUISIMETO, FEBRERO DEL AO 2005


PERSPECTIVAS CLINICAS Y EXPERIMENTALES EN EL USO
DE LA HORMONA MELATONINA COMO
ANTIOXIDANTE CELULAR









Por
GREGORIO TISKOW DROST







TRABAJO DE ASCENSO PARA OPTAR A LA CATEGORA DE
PROFESOR ASOCIADO EN EL ESCALAFN DEL PERSONAL
DOCENTE Y DE INVESTIGACIN



UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL
LISANDRO ALVARADO
DECANATO DE MEDICINA





BARQUISIMETO, FEBRERO DEL AO 2005

PERSPECTIVAS CLINICAS Y EXPERIMENTALES EN EL USO
DE LA HORMONA MELATONINA COMO
ANTIOXIDANTE CELULAR




Por

GREGORIO TISKOW DROST



TRABAJO APROBADO





_________________________ _______________________
RIGOBERTO GUERRERO LUIS BATALLA SOTELO
COORDINADOR





__________________________
AURA LOPEZ DE ORTEGA






BARQUISIMETO, 29 DE MARZO DE 2005

PENSAMIENTOS


Slo 3 frases celebres llenarn este espacio, un espacio de reflexin para
todo aqul que an logra visualizar las maravillas del Universo:

Un plan es cosa real, y las cosas proyectadas son experimentadas. Una vez
hecho y visualizado un plan se convierte en una realidad junto con otras
realidades- nunca se destruir, pero es fcil de ser atacado.
John Steinbeck


En nuestra poca, en la que todo lo sabido est aprendido del ayer, es deber
lgico rememorar y aceptar los orgenes verdaderos de las cosas
Gabriel Rojas


Nos juzgamos por lo que creemos que somos capaces de hacer; en tanto,
que otros nos juzgan por lo que ya hemos hecho
Henry W. Longfellow






IV

AGRADECIMIENTOS


.-Al Laboratorio de Bioenergtica Celular del Centro de Biofsica del
IVIC, en las personas de mis tutores de siempre: Dr. Reinaldo Marn, Dr.
Fulgencio Proverbio y la Sra. Teresa de Proverbio. Siempre juntos.

.-Al personal de Laboratorio de la Unidad de Investigacin en Fisiologa,
empleados, tcnicos y obreros por el apoyo incondicional de siempre

.-Al personal de la Biblioteca Marcel Roche del IVIC, Centro de
Referencia Documental y Cientfico de Latinoamrica, quienes por dos
meses apoyaron con su entusiasmo y colaboracin esta obra

.-Al personal docente de la Seccin de Fisiologa del Decanato de
Medicina, mi segundo hogar, quienes con su apoyo irrestricto me
permitieron consolidar el ao sabtico y la ejecucin de esta obra





A todos ellos. Muchas Gracias.

V

DEDICATORIA






A Nohelli y Flavia, las que siempre han sabido que esta es mi pasin y
que todo este trabajo tendr un beneficio al final
Un beso para las dos













VI


RESUMEN

La melatonina (N-acetil-5-metoxi-triptamina) es una hormona producida
por la glndula pineal cerebral y otras estructuras del cuerpo, que fue aislada
por vez primera en 1959 por Lerner y su equipo de trabajo. Desde esa fecha
ha sido aislada en numerosos organismos, desde vertebrados hasta
unicelulares y plantas superiores. La produccin de la hormona en todas las
especies, incluyendo a los humanos, es regulada por el entorno cclico
fotoperidico, con la fase diurna de luz asociada a bajos niveles de
melatonina y la fase de oscuridad, a elevados niveles de la misma. A causa
de su mecanismo regulatorio dependiente de la luz, la melatonina es
producida y liberada bajo un esquema circadiano. Tiene como caracterstica
fundamental la de ser liposoluble e hidrosoluble, lo que la hace una
molcula que puede difundir con facilidad a travs de los compartimientos
celulares. Entre las principales funciones que se han atribuido a la hormona
se encuentran, la de control de los ritmos biolgicos, el ciclo sueo-vigilia,
ser inmunoestimulador, intervenir en el control del inicio de la pubertad,
agente oncosttico y una, que en la ltima dcada ha cobrado elevado
inters entre los pineallogos, la de ser un antioxidante celular, es decir un
agente que puede neutralizar a los radicales libres derivados del oxgeno.
Segn numerosos autores, la melatonina reduce el estrs oxidativo de
distintas maneras; en forma directa, removiendo los radicales libres y en
forma indirecta, estimulando los otros mecanismos defensivos contra la
accin nociva de los radicales libres. En ensayos realizados in vitroe in vivo, la
VII

melatonina ha sido utilizada en dosis farmacolgicas, encontrndose que es
efectiva para reducir el dao ocasionado a diversas estructuras celulares por
los agentes oxidativos. La melatonina carece de toxicidad a dosis elevadas,
suministradas inclusive a diario, sin mayores efectos colaterales, econmica
y de fcil administracin. Otra accin que se est investigando con
insistencia, es el de la funcin de la melatonina en el envejecimiento celular;
el papel de los niveles fisiolgicos de la hormona, que decaen
progresivamente con la edad, est siendo evaluada por su importancia en la
capacidad de defensa antioxidante total del organismo. Otros autores por su
parte, han criticado fuertemente el hecho que esta hormona sea propuesta
como un antioxidante celular, ya que no cumple los requisitos para tal fin;
proponen que la melatonina puede actuar como un removedor de radicales
libres de tipo preventivo, pero de la clase catalogada como desactivadores
de iones metlicos favorecedores de la generacin de radicales libres. Los
datos experimentales aportados por el autor del presente trabajo, favorecen
la idea que la melatonina si se comporta como un agente neutralizador de la
peroxidacin lipdica, requirindose ms investigaciones para confirmar si
efectivamente la melatonina puede ser clasificada bajo los esquemas actuales
como un clsico y efectivo antioxidante celular.

Palabras Claves: Melatonina, Antioxidante Celular, Radicales Libres,
Peroxidacin Lipdica, Glndula Pineal, Ritmos Biolgicos, Neurociencias


VIII

INDICE

Cpitulo Pag.

Pensamientos IV
Agradecimientos V
Dedicatoria VI
Resumen VII
Lista de Figuras XII
Lista de Tablas XIII
Lista de Grficos XIV
Lista de Cuadros XV

I. MARCO TEORICO (Antecedentes, Introduccin,
Planteamiento del Problema, Objetivos) 1

II. LA GLANDULA PINEAL (Anatoma, Fisiologa y
Bioqumica) 12
A.-Anatoma de la Glndula Pineal 12
1.-Dimensiones, ubicacin, peso 12
2.-Situacin anatmica-conformacin-relaciones 12
3.-Embriologa-Evolucin 14
4.-Inervacin 16
B.-Fisiologa de la Glndula Pineal 18
1.-Control del inicio de la pubertad 19
2.-Regulacin de ritmos biolgicos 21
3.-Regulacin de la temperatura corporal 22
4.-Induccin del sueo 23
5.-Influencia en el crecimiento corporal 23
IX

Cpitulo Pag.

6.-Efectos sobre diversos rganos endocrinos 25
a.-Corteza adrenal 25
b-Glndula tiroides 26
c.-Otras glndulas 26

C.-Biosntesis, Secrecin y Metabolismo de las Hormonas
Pineales 27
1.-Sitios de produccin de melatonina 28
a.-Sntesis de melatonina en la pineal 28
(1).-Melatonina en los fluidos corporales 34
b.-Produccin de melatonina en otros tejidos 36
c.-Regulacin neuro-farmacolgica de la
sntesis de melatonina 37
d.-Distribucin y metabolismo de melatonina 43
e.-Regulacin de la sntesis de melatonina 46

D.-Estructura y Propiedades Fisicoqumicas de la Melatonina 49

E.-Receptores Celulares de la Melatonina 52

F.-Accin de la Melatonina en Clulas y Tejidos Corporales 59
1.- A nivel cerebral 59
2.- A nivel de sistema inmunolgico 61
3.- A nivel endocrino y sistemas de control y
retroalimentacin 62
4.-Otras acciones 65


X

Cpitulo Pag.

III. MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE CELULAR 67
A.-Papel de los Radicales Libres en el Proceso de Salud
y Enfermedad 72
B.-Por qu la Melatonina como Antioxidante Celular? 73
C.-Qu Caractersticas Bioqumicas de la Melatonina han
Permitido Postular a esta Molcula como Antioxidante? 81

D.-Acciones protectoras de la melatonina en su papel de
Antioxidante a nivel de rganos y tejidos corporales 83

1.-Sistema nervioso central 83
2.-Sistema gastrointestinal 87
3.-Piel 89
4.-Otras acciones antioxidantes 89

E.-Evaluacin del Estrs Oxidativo en Ratas con Diabetes
Mellitus tipo I Inducida por Estreptozotocina:
Posible Papel Protector de la Melatonina 96

F.-Niveles de Peroxidacin Lipdica en Fantasmas de
Glbulos Rojos Sometidos a Radiacin Ultravioleta
Tratados o no con Melatonina 109

G.-Otras Acciones de la Melatonina 117



XI


Cpitulo Pag.


IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 119


BIBLIOGRAFIA 124


ANEXOS 137














XII

LISTA DE FIGURAS

Pag.
Fig. 1 Visin de Descartes acerca de la glndula pineal la
sede del alma 3


Fig. 2 Ubicacin anatmica de la glndula pineal cerebral 13


Fig. 3 Ruta de biosntesis de la hormona melatonina 31


Fig. 4 Mecanismos de transduccin de seales intracelulares
para la sntesis de melatonina 33


Fig. 5 Esquema de la inervacin de la glndula pineal y
un ejemplo de su accin a nivel endocrino 39


Fig. 6 Estructura qumica de la melatonina 50


Fig. 7 Representacin tridimensional de la unin de la
melatonina asu receptor 53


Fig. 8 Modelo propuesto de accin inhibitoria de la melatonina
sobre clulas gonadtropas neonatales de ratas 58


Fig. 9 Representacin esquemtica del proceso de peroxidacin
lipdica 146
XIII


LISTA DE TABLAS

Pag.

Tabla I Valores de melatonina en fluidos corporales humanos 35


Tabla II Propiedades fisicoqumicas de la melatonina 51


Tabla III Clasificacin de los receptores de melatonina 56


Tabla IV Niveles de peroxidacin lipdica en rebanadas de corteza
de riones de animales controles y experimentales 107


Tabla V Niveles de peroxidacin lipdica en membranas de glbulos
rojos sometidos o no a radiacin U.V., tratados o no con
melatonina 0 hidroxi-tolueno-butilado 115








XIV


LISTA DE GRAFICOS


Pg.

Grfico 1 Parmetro fisiolgico analizado: peso corporal 102


Grfico 2 Parmetro fisiolgico analizado: volumen de orina 105


Grfico 3 Parmetro bioqumico analizado: nivel de glicemia 106











XV

LISTA DE CUADROS


Pg.

Cuadro 1 Peso de los animales control y experimental 102


Cuadro 2 Volumen de orina excretado en 24 horas en
animales controles y experimentales 105


Cuadro 3 Niveles de glicemia en animales control y
experimental 106








XVI



I.- MARCO TEORICO
(ANTECEDENTES, INTRODUCCIN GENERAL,
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA, OBJETIVOS)


La glndula pineal (Epiphysis cerebri), ubicada cerca del centro de
nuestro principal rgano de control y pensamiento, el cerebro, es la
encargada de producir la hormona denominada Melatonina. La glndula
pineal o cuerpo pineal, ha sido estudiada con insistencia por los fisilogos y
bioqumicos desde hace ya varias dcadas y an, la misma no se comprende
del todo. Ha sido siempre un tpico de especulacin filosfica y
controversia cientfica. Por mucho tiempo, se tena la idea errada que la
pineal en mamferos representaba apenas un rgano vestigial de la evolucin
de las especies, considerndola como un mero apndice epitlamico. La
funcin de la glndula pineal y su principal hormona, la melatonina, es uno
de los misterios ms subyugantes en la fisiologa de los rganos de los
mamferos, aunque con los adelantos actuales de la biologa molecular y
celular, este misterio pudiera tener una pronta solucin y est a la vuelta de
la esquina. Se ha planteado con slidos argumentos experimentales que lo
apoyan, que la glndula pineal es un complicado y sensible Reloj
Biolgico encargado de convertir informacin proveniente del ambiente,
en este caso, seales fticas, en actividad cclica nerviosa que
posteriormente se traduce en informacin hormonal, orquestada por el
sistema endocrino.


Se conoce la existencia de la glndula pineal desde hace ms de dos
mil aos, cuando Galeno de Pergamon en el Siglo II escribi que a los
anatomistas griegos les haba llamado la atencin la situacin particular de
dicho cuerpo, concluyendo que serva de drenaje o regulador del flujo de
pensamiento, que se crea almacenado en los ventrculos laterales del
cerebro. En el Siglo XV, Berengario da Carpi, relacion este rgano con la
idea de un filtro del lquido cerebroespinal. En el Siglo XVII, Ren
Descartes propuso que la glndula pineal era la sede del alma racional del
hombre, cuando postul su Teora Mecanstica de la Percepcin. En la
misma, Descartes propona que el ser humano perciba con sus ojos los
eventos reales que se sucedan en el entorno y se transmitan a la pineal por
medio de cordones o haces en el cerebro. La pineal respondera permitiendo
que los humores secretados pasaran a los msculos donde se produciran las
respuestas adecuadas (Wurtmann, 1965). Por lo menos, los estudios han
demostrado en ste, como en otros aspectos de su pensamiento, la gran
intuicin del filsofo. Ver Fig. No. 1

Hacia finales del Siglo XIX y comienzos del Siglo XX a la glndula
pineal se le dio mayor relevancia con un enfoque ms cientfico que
metafsico. En 1898 Otto Heubner, mdico alemn, public un caso clnico
de un adulto joven que tena como antecedente una pubertad precoz
correlacionndolo con un tumor de la pineal (pinealoma). En aos sucesivos
continuaron describindose ms casos de nios con pinealomas, casi todos
varones y desarrollo de pubertad precoz. En 1954 Julian Kitay de la Escuela







Figura No. 1
Visin de Descartes acerca de la Glndula Pineal como la
sede del alma




Mdica de Harvard hall en su trabajo descriptivo de tumores pineales que
la gran mayora de casos clnicos de retraso en la pubertad eran
consecuencia de tumores pineales con una actividad incrementada de la
glndula. Descubrimientos histopatolgicos posteriores describieron que la
pineal despus de la pubertad, comenzaba un proceso de calcificacin
progresiva.

En 1918 Nils Holmgren, anatomista sueco, examin la regin pineal
de ranas mediante microscopia de luz y advirti que la pineal contena
clulas sensoriales de diferente naturaleza, que asemejaban a los conos de la
retina y estaban enlazados a clulas nerviosas. A partir de entonces se
sugiri que, la pineal pudiera funcionar como un rgano fotorreceptor o
tercer ojo en los vertebrados inferiores.

Curiosamente en 1917, Carey McCord y Floyd Allen del Johns
Hopkins University (citado en Bardasano-Rubio, 1978), observaron que
extractos de glndula pineal de bovinos adicionados a un medio en el cual se
sumerga piel de batracios, lamisma blanqueaba, perda color. A comienzos
de los aos sesenta, Eberhardt Dodt en Alemania, demostraba que la pineal
de sapo, es un autntico discriminador de longitudes de onda de luz,
convirtiendo energa lumnica en impulsos nerviosos. No estaba lejos de la
propuesta de Descartes. En esa misma dcada, Johannes Ariens Kappers,
neuroanatomista alemn (citado en Bardasano-Rubio, 1978), public un
estudio detallado de las conexiones nerviosas de glndula pineal en ratas,
hecho interesante que demostr que a pesar que este rgano se originaba

embriolgicamente en el cerebro, perda todas las conexiones nerviosas con
el mismo luego del nacimiento. De esta forma, quedaba claro que no
existan conexiones o tractos nerviosos procedentes del cerebro y que
tuvieran influencia neural sobre la glndula, al menos en ratas. Este autor
demostr tambin que la pineal estaba intensamente inervada por fibras
procedentes del sistema simptico, originados en el ganglio cervical superior
ubicado en el cuello.

Pero, a juicio crtico del autor del presente trabajo, es a finales de los
aos cincuenta cuando se produce el descubrimiento ms importante
relacionado con la glndula pineal y su funcin. En 1958, Aaron Lerner,
dermatlogo, y su equipo de trabajo de la Escuela Mdica de la Universidad
de Yale, identificaron un componente qumico nico, aislado de la glndula
pineal de bovinos, la cual denominaron posteriormente Melatonina
1
(N-
acetil-5-metoxitriptamina) con la propiedad de aclarar la piel de anfibios,
mediante la agregacin de los grnulos de melanina dentro de los
melanocitos (Lerner, 1959)

Posteriormente Nicholas Giarman, farmaclogo de la Universidad de
Yale, analiz extractos pineales de mamferos encontrando la presencia de
serotonina, una amina de estructura molecular parecida a la melatonina. Ese
mismo ao, Julius Axelrod y Hebert Weissbach caracterizan
bioqumicamente la accin metoxilante de la enzima hidroxi-indol-O-metil
transferasa (HIOMT) que convierte la N-Acetilserotonina en melatonina.

1
Melatonina: su nombre se debe a que la hormona tiene la propiedad de actuar sobre los
MELAnforos, aclarando la piel en anfibios, y de sero TONINA, su precursor inmediato.

En 1960 Virginia Fiske del Wellesley Collage, report que la exposicin de
ratas a iluminacin continua por varias semanas, conduca a una
disminucin en el peso de sus pineales y cambios en la funcin gonadal
(incrementos en el peso de los ovarios y aceleracin del ciclo estral). Sobre
la base de estos datos y otros estudios, Richard Wurtmann, William Roth y
Elizabeth Chu, postularon que la melatonina era una hormona y que se
comportaba como el elemento clave de un transductor neuroendocrino
como lo es laglndula pineal (Wurtmann, 1965). Despus de dilucidar la
cascada enzimtica que produce la melatonina en la pineal, Hoffman y
Reiter en 1965, comprobaron que la disminucin en los pesos de las
gnadas de hamsters inducido por exposicin de los mismos a perodos
largos de oscuridad, era completamente bloqueado por la pinealectoma
(Lerchi, 2002). Finalmente, Wurtmann y Axelrod presentaron dos hiptesis
magistrales para la investigacin en esta glndula: una que, la pineal era un
transductor neuroendocrino y que la melatonina era la hormona que
mediaba los efectos del fotoperodo (ciclos de luz-oscuridad) a nivel
sistmico. En los aos 80, se demostr que la melatonina no slo estaba
presente en animales, sino tambin en plantas y hasta en organismos
unicelulares (Lerchi, 2002)

Por ms de 30 aos luego de su descubrimiento, la melatonina ha
sido evaluada ampliamente en referencia a sus efectos, fundamentalmente
sobre el sistema neuroendocrino, en especial el sistema reproductor. Desde
1990 los estudios se han ido extendiendo, evaluando el efecto de la
hormona sobre otros sistemas fisiolgicos y adjudicndole otras

propiedades. Como dato curioso, se puede mencionar que el creciente
conocimiento acerca de la pineal y la melatonina, es reflejado en un
incremento en el nmero de publicaciones relativas a las mismas, pasando
de unas cuantas en 1960 a ms de 4000 en el ao 2001 (Lerchi, 2002)

En adicin a los efectos mencionados, la melatonina est envuelta en
el control de los ritmos biolgicos en organismos superiores e inferiores de
la escala evolutiva; en muchas especies la hormona regula los ciclos
estacionales de reproduccin, alimentacin, termorregulacin e hibernacin.
La melatonina tradicionalmente ha sido vista como la hormona de la
oscuridad, ya que se secreta en mayor cantidad en la fase de oscuridad del
fotoperodo. Esta seal es usada por muchos organismos para ajustar sus
relojes internos y sus sistemas fisiolgicos al tiempo real del da o aciclos
estacionales.

Otras funciones que se han atribuido recientemente a la melatonina
incluyen control del metabolismo celular, efectos oncostticos, estimulacin
del sistema inmunolgico, control del apetito, induccin del sueo, control
del inicio de la pubertad, efectos anti-envejecimiento, y una que desde 1993
se ha venido manejando con insistencia, encontrando apoyo entre los
investigadores, pero tambin con muchos detractores, aquella por la cual, la
melatonina puede actuar como sustancia removedora de radicales libres, es
decir, comportarse como un antioxidante celular. Los radicales libres son
molculas o agentes qumicos, que poseen un electrn desapareado en su
orbital ms externo, altamente reactivos con componentes celulares y que

generan alteraciones o daos, reversibles eirreversibles a nivel celular y
tisular. Se ha propuesto que la melatonina es capaz de remover o neutralizar
estos radicales libres. La hormona es una sustancia natural cuyas
concentraciones requeridas para ejercer esta accin podran ser del rango
fisiolgico (picogramos), pero hay muchas discrepancias a este respecto, ya
que todos los ensayos realizados al presente han empleado dosis
farmacolgicas (en el rango micromolar o milimolar), lo que a juicio de
muchos autores, no podra catalogarse a la melatonina a este respecto como
un verdadero antioxidante.

La melatonina a dosis farmacolgicas se ha demostrado ejerce
proteccin importante contra la accin de los radicales libres en diversas
situaciones patolgicas como, diabetes mellitus, toxicidad por metales
pesados, asbestosis, toxicidad por pesticidas, colitis ulcerativa, enfermedad
de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, procesos inflamatorios, enfisema
pulmonar, catarata senil, degeneracin macular, iniciacin y crecimiento
neoplsicos, daos por isquemia-reperfusin, entre otros (Reiter, 2000)

Numerosas evidencias apuntan a que la melatonina puede
comportarse como un verdadero antioxidante celular; los hallazgos han
sugerido entre otros postulados que, la eficacia de la hormona como
antioxidante pudiera estar relacionada a la facilidad con la cual cruza la
membrana celular. Otras investigaciones han sugerido que la melatonina
remueve y detoxifica selectivamente oxidantes altamente reactivos, por lo

menos in vitro, donando un electrn a estos compuestos electroflicos
(Poeggeler, 1994)

Otros investigadores han postulado que la melatonina promueve la
estabilizacin de la membrana celular. De inters particular es que, la
melatonina slo influye sobre la fluidez de la membrana cuando se
acompaa de estrs oxidativo. Esta accin estabilizante pudiera ser otro
factor importante por el cual la hormona reduce el dao oxidativo a rganos
y tejidos corporales. Tambin se ha descrito que la melatonina promovera
la actividad de enzimas antioxidantes presentes en el organismo (Poeggeler,
1994) y (Reiter, 2001)

Contrario a las premisas anteriores, un grupo de investigadores han
sealado que la combinacin in vivo de las propiedades antioxidantes muy
dbiles de la melatonina y, su relativa baja concentracin en el plasma y
tejidos corporales, hacen improbable que la hormona pueda ser considerada
como un elemento removedor de radicales libres o inhibidor de la
lipoperoxidacin celular al grado que se ha planteado (Antunes, 1999)

Por lo antes expuesto, el autor ha considerado que es de relevante
importancia contribuir a esclarecer las dudas que se han suscitado entre la
comunidad cientfica encargada del estudio de la hormona melatonina, sus
efectos y consecuencias, tomando en cuenta el inters del autor por el tema,
las investigaciones realizadas en el campo de accin de los radicales libres
sobre tejidos y rganos animales y recientemente, los efectos protectores de

la melatonina en afecciones como la diabetes mellitus y la hipertensin
arterial inducida por el embarazo (pre-eclampsia), es que se realiza este
trabajo que abarca dos aspectos fundamentales: una revisin integral y
amplia acerca de la fisiologa y bioqumica de la glndula pineal y su
principal hormona, la melatonina, as como dilucidar si sta ltima, cumple
los requisitos bioqumicos y fisiolgicos mnimos para ser considerada
como una sustancia antioxidante.


OBJETIVOS DEL TRABAJO:
En base a la exposicin realizada y los argumentos que conllevaron a
plantear el problema expuesto, se formularon los siguientes objetivos para la
realizacin de este trabajo:

1.- Evaluar con sentido crtico los ms recientes descubrimientos
relacionados con la fisiologa, la bioqumica y biologa molecular de la
glndula pineal y su hormona, lamelatonina.

2.-Caracterizar en base a los hallazgos experimentales del autor, a la
melatonina como probable agente removedor de radicales libres derivados
del oxgeno, esto es, como antioxidante celular.

Para una comprensin adecuada del tema propuesto, se ha dividido el
trabajo en tres grandes aspectos: a) los relacionados con la anatoma, la
fisiologa y la bioqumica de la glndula pineal; b) aquellos que permiten la

caracterizacin bioqumica y molecular de la hormona melatonina en base a
las investigaciones ms recientes y, c) los que permiten comprender el
mecanismo de accin de los radicales libres en clulas, tejidos y rganos del
cuerpo y como la melatonina pudiera ser considerada o no un agente
antioxidante.





















II.- GLANDULA PINEAL
ANATOMIA, FISIOLOGA Y BIOQUMICA

A.-ANATOMIA DE LA GLANDULA PINEAL
1.-Ubicacin, Peso, Dimensiones
La glndula pineal o epfisis cerebral, es un cuerpo impar, de color
grisceo-rojizo, de ubicacin central en el cerebro que se desarrolla a
expensas de una evaginacin de la bveda del tercer ventrculo. Mide por
trmino medio de 7 a 8 mm y de 4 a 6 mm de anchura en un adulto joven.
Pesa ordinariamente menos de 200 mg. Se halla recubierta por la piamadre.
Su peso especfico es de 1,047 a 1,050
2.-Situacin Anatmica-Conformacin-Relaciones
En el ser humano se sita por debajo del rodete del cuerpo calloso,
entre los dos tubrculos cuadrigminos anteriores que le forman lo que se
ha denominado el lecho de la glndula pineal. Por debajo de la glndula, se
observa el abocamiento del acueducto de Silvio en el tercer ventrculo (Ver
Fig. No. 2). La pineal se ha comparado siempre a una pia, a un cono con
la base dirigida hacia delante, de ah los diversos nombres que se le han
dado: pineal, cuerpo pineal, conarium, entre otros. Se considera en ella una
parte media o cuerpo, un extremo anterior o base y un extremo posterior o
vrtice.







Figura No. 2
Ubicacin anatmica de glndula pineal en el cerebro
Glndula Pineal

El cuerpo es ligeramente liso o granuloso; se relaciona por arriba con
las venas de Galeno y el rodete del cuerpo calloso; por abajo, con el surco
longitudinal que separa los dos tubrculos cuadrigminos anteriores; por los
lados, con los plexos coroideos del tercer ventrculo. La base dirigida hacia
delante, se desdobla en dos laminillas transversales, una superior y otra
inferior. El vrtice dirigido hacia atrs y abajo, es a veces redondeado, otras
veces puntiagudo. Dicho vrtice flota libremente por encima de los
tubrculos cuadrigminos, en los espacios subaracnoideos. La glndula est
unida al cerebro por un conjunto de fascculos nerviosos que nacen de su
base. Estos fascculos, denominados pednculos de la glndula pineal, son
en nmero de seis, ubicados tres a cada lado.

3.- Embriologa-Evolucin
Como parte integrante del epitlamo dienceflico, la pineal se
desarrolla como un divertculo de la lnea media de la parte caudal del techo
del tercer ventrculo cerebral. Comienza su desarrollo al final del segundo
mes fetal. Un hecho interesante de su desarrollo es que, la pineal pierde en
el adulto casi todas las conexiones neurales pinealofugales y en lugar de ello
resulta inervado de una forma nueva e inusual. Los pinealocitos o sea, las
clulas parenquimatosas de la glndula, reciben los impulsos nerviosos a
travs de neuronas simpticas post-ganglionares, cuyos cuerpos celulares se
hallan en el ganglio cervical superior del cuello.

Un rasgo comn de todos los rganos pineales, tanto los de funcin
fotorreceptora en vertebrados inferiores, como los de funcin glandular en
vertebrados superiores (incluyendo los mamferos), es el desarrollo de
distintos tipos de clulas a partir de la matriz ependimaria. La ulterior
diferenciacin en direccin a un rgano sensorial o a glndula endocrina, se
lleva a cabo en las distintas especies gracias a un desarrollo y proliferacin
caractersticos de los elementos celulares (Bardasano-Rubio, 1978)
En humanos, existen dos tipos de clulas diferenciadas a partir de las
clulas primordiales neuroepiteliales, de las cuales se desarrolla la pineal
embrionaria humana. Uno de los tipos celulares madura hacia las clulas
astrocticas con prolongaciones bien definidas y diferenciadas. El otro tipo
celular se convierte en los pinealocitos, formando nidos y slidos cordones
dentro de la matriz glial. Las prolongaciones de los pinealocitos rodean a los
vasos sanguneos encargados de su nutricin. Se asemejan a las neuronas,
con un pericarion y un nmero desconocido de procesos citoplasmticos; el
ncleo es grande y con un nuclolo prominente (Bardasano-Rubio, 1978)
Tambin se han encontrado restos de fibras musculares estriadas en el
rgano pineal de ciertos mamferos, lo que sugiere la existencia de un
posible ojo ancestral que tal vez tuvo movimiento voluntario (Bardasano-
Rubio, 1978). No se han encontrado en pinealocitos de mamferos
elementos fotorreceptores, a diferencia de otros vertebrados inferiores y
anfibios.
Diversos autores estn de acuerdo en sealar que, al menos 3 grandes
cambios estructurales han ocurrido en el desarrollo filogentico de la pineal

de mamferos, los cuales estn envueltos en las respuestas de la pineal a la
luz (Wurtman, 1980):
a) Un nuevo tipo celular, el pinealocito, desarrollado, careciendo de
organelas subcelulares para la fotorrecepcin, pero conteniendo otras
organelas como por ejemplo, abundante retculo endoplasmtico,
caracterstico de clulas secretorias.
b) Un nuevo patrn nico de inervacin de la glndula. La abundante
cantidad de fibras nerviosas simpticas post-ganglionares que llegan a la
pineal desde el ganglio cervical superior, y que terminan, no en los vasos
sanguneos como era de esperarse, sino sobre o cerca de los pinealocitos, las
clulas secretoras de la melatonina. Estos nervios median el control cerebral
de la pineal.
c) Una porcin del tracto ptico conteniendo fibras cuyos cuerpos celulares
descansan en la retina, divergiendo para formar una haz nervioso, el tracto
ptico accesorio inferior, los cuales transmiten la porcin del estmulo
lumnico que alcanza la pineal.
4.- Inervacin
La inervacin de la glndula pineal en mamferos ha sido claramente
definida tanto morfolgica como funcionalmente. Como ya mencionado, las
fibras nerviosas provienen del ganglio cervical superior, proporcionando la
inervacin simptica, corren por la arteria cartida interna y penetran a la
pineal como nervios conarios. En un principio se crea que la pineal no

reciba inervacin central, pero esto ha cambiado. Fibras nerviosas alcanzan
la glndula va habenular y a travs de las comisuras posteriores, y ahora,
con las modernas tcnicas neurobiolgicas disponibles, se ha aclarado que
estas fibras tienen importancia funcional. Estudios con peroxidasa de
rbano y microlesiones dirigidas, han revelado que estas fibras nerviosas
pinealopetales centrales se originan en diversas regiones del cerebro,
incluyendo la habnula, ncleos supraquiasmtico y paraventricular del
hipotlamo, amgdala, centros olfatorios, rea pre-ptica, cuerpos
geniculados laterales y ciertas zonas de la estria medular. En estas fibras se
han caracterizado entre otras, neuropptidos como oxitocina, vasopresina,
hormona liberadora de hormona luteinizante, pptido intestinal vasoactivo.
Las fibras eventualmente se distribuyen en la glndula, algunas insertndose
en la periferia y otras en el centro. Sorprendentemente, en ratas el 90% de
las fibras nerviosas que se internan en la pineal tienen una localizacin
perivascular, el resto permaneciendo entre pinealocitos. Ello es muy
curioso, ya que las fibras nerviosas simpticas predominan en los espacios
perivasculares y los nervios conarios llegan a la pineal independientemente
de los vasos sanguneos (Thipayang, 1998)





B.- FISIOLOGIA DE LA GLANDULA PINEAL
Lejos de ser el rgano rudimentario que muchos investigadores
creyeron que era, hoy da se reconoce que la glndula pineal posee una
intensa actividad bioqumica y reviste enorme importancia fisiolgica en el
control de numerosas funciones corporales en las distintas especies
animales. La pineal es de mayor tamao enel hombre que en la mujer y en
la infancia lo es ms que en la edad madura; comienza a disminuir de
tamao a partir de los 7u 8aos de edad. Esta involucin en el tamao o
atrofia de una glndula, lejos de ser negativa, parece tener implicaciones
funcionales importantes o madurativas en los seres vivos.
Entre los fisilogos existieron importantes controversias para
catalogar a la glndula pineal como un transductor neuroendocrino,
controversias afortunadamente solventadas en la propia dcada de los aos
sesenta. Esta claramente definido que, para transmitir informacin desde el
sistema nervioso a un rgano endocrino, un transductor neuroendocrino
debera presentar algunas caractersticas especiales, tanto del tejido neural
como del endocrino. Debe adems, responder a sustancias liberadas
localmente desde las terminaciones nerviosas, y debe contener la maquinaria
bioqumica necesaria para sintetizar una hormona y liberarla a la circulacin
sangunea. La pineal, cumpliendo estos requisitos ha sido catalogadacomo
un transductor neuroendocrino, capaz de convertir un impulso nervioso de
entrada (input) (proveniente del estmulo ftico, en una respuesta de salida
hormonal (output) (secrecin de melatonina) (Axelrod, 1963), (Wurtman,
1980) y (Alonso-Solis, 1992)

La pineal es el rgano del sistema visual, el cual transduce el mensaje
fotoperidico en una seal qumica la cual sirve como un mensajero para
cada rgano del cuerpo. La pineal es pues, el intermediario entre la seal
fotoperidica externa y el medio interno corporal.
Entre las numerosas funciones que se han asignado a la glndula
pineal se pueden enumerar y destacar las siguientes:
1.- Control en el inicio de la pubertad.
Desde el mismo momento del nacimiento, los testculos y los ovarios
poseen una estructura lo suficientemente adecuada como para que en
presencia de las gonadotropinas se inicie su maduracin en forma
inmediata. Sin embargo, este estmulo se halla reprimido, frenado a nivel de
la hipfisis cerebral. La hipfisis, capacitada para producir dichas
gonadotropinas en presencia del adecuado estmulo hipotlamico de
hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), no las produce por carencia
de ste. En el adulto, los esteroides sexuales se autorregulan al unirse a
receptores hipotalmicos especficos que, a partir de cierta concentracin
sangunea disparan la va opioide u opiatrgica productora de endorfinas
(opiceos fisiolgicos). Esta a su vez, distorsiona la pulsatilidad de la GnRH
que frena la produccin y liberacin de gonadotropinas, por lo que las
gnadas en ausencia de dicho estmulo, dejan de producir esteroides
sexuales, disminuyendo su concentracin en el plasma. Con ello, los
esteroides unidos a los receptores respectivos, se liberan y se vuelve a
activar la liberacin de GnRH. En el periodo pre-pber debera pasar lo

mismo, pero no es as. La hormona melatonina, esta descrito, tiene la misma
afinidad por los receptores hipotalmicos de esteroides sexuales que stos.
En la niez, se produce mayor cantidad de melatonina que en periodo post-
pberal, de forma que constantemente se halla unida a tales receptores
hipotalmicos, activando la va opiatrgica, impidiendo as la liberacin de
GnRH, y en consecuencia la maduracin de las gnadas (Alonso-Solis,
1992) y (Ganong, 2003)
A partir de los 7 aos de edad, la pineal disminuye progresivamente
de tamao, y en consecuencia, la concentracin de melatonina tambin lo
hace, hasta un punto en que ya no se une a suficiente nmero de receptores
hipotalmicos, bloquendose la va opiatrgica, producindose entonces la
sntesis y liberacin por primera vez de GnRH. Ello sucede a partir de los
11-12 aos en la mujer, y de los 13-14 aos en el hombre. Se da inicio as a
la pubertad. Descubrimientos histopatolgicos han descrito que la pineal
comienza a calcificarse al inicio de la pubertad (arenilla pineal)
De esta manera, la melatonina ha sido caracterizada como una
hormona con propiedades anti-gonadales (Wurtman, 1977). Trabajos
complementarios han demostrado que la pinealectoma en ratas machos o
hembras jvenes pre-pberes, induce a una maduracin sexual prematura.
El mismo efecto lo causa la iluminacin continua, pues como se ver ms
adelante, la pineal inhibe la produccin de melatonina bajo esta condicin.
Cuando los animales son expuestos por su parte a oscuridad continua o se
les induce ceguera, se describe retardo en el desarrollo sexual y disminucin
en el tamao de rganos reproductivos (Romijn, 1978)

2.-Regulacin de los Ritmos Biolgicos.
En la naturaleza los niveles de luz cambian con los ciclos diurnos y
anuales, aunque los humanos poco lo percibamos. De hecho, casi no
percibimos las maravillas del Universo. La relacin da/ noche (fotoperodo)
vara con un ritmo anual que alcanza su nadir en el solsticio de invierno y su
cenit el primer da de verano. Se ha demostrado sobre todo en animales
inferiores que, los ciclos de luz-oscuridad son muy importantes en la
regulacin de diversos tipos de funcin endocrina, entre ellos la
reproduccin. Tales ritmos se han denominado circadianos (del latn circiter
que se traduce por alrededor de un da, 24 horas). Los ritmos circadianos
endgenos o regulados internamente incluyen la actividad motora, ciclo
sueo-vigilia, temperatura corporal, presin arterial, patrones de secrecin
de diversas hormonas, valores basales de numerosas sustancias o sustratos
fisiolgicos, entre otros.
Una de las principales funciones de la glndula pineal es precisamente
la sincronizacin de los ritmos biolgicos del cuerpo. Este efecto es ms
prominente en aves y reptiles, donde la pineal es una parte integral del
sistema de control circadiano. Se ha descrito que en mamferos los ritmos
circadianos pueden persistir, an en animales pinealectomizados sin
interferencias obvias. Ello hace presumir la existencia de otro(s) rganos(s)
encargado(s) del control de los ritmos endgenos. Tambin en mamferos,
el ms importante de los papeles de la pineal y su hormona, la melatonina,
es mediar la regulacin de los ritmos estacionales mediante la percepcin de
fotoperodos. La adaptacin a las estaciones envuelve cambios en el status

reproductivo, pautas de alimentacin, calidad y coloracin de las pieles, y
adaptabilidad a la hibernacin. Estos cambios incrementan la viabilidad de
sobrevivencia de los organismos durante las estaciones ms desfavorables
del ao. El ritmo estacional de fertilidad en animales es regulado por
cambios en la frecuencia de pulsos de liberacin de la hormona GnRH.
(Vanecek, 1998). En lneas generales, se puede postular que la pineal acta
sin duda como un rgano sincronizador, estabilizador y modulador de los
distintos procesos fisiolgicos del organismo.
3-Regulacin de la temperatura corporal.
El papel de la pineal y de la melatonina en el control de la
temperatura corporal central ha sido conocido desde hace bastante tiempo.
Se ha visto que en humanos la melatonina tiene distintos impactos sobre la
temperatura corporal. Y esto es verdadero para situaciones naturales bajo las
cuales la sntesis de la hormona est inversamente correlacionada con los
cambios de temperatura, as como tambin cuando la melatonina es
suministrada exgenamente (Lerchi, 2002). Ensayos efectuados en gorriones
(Passer domesticus), a los cuales se les monitoreaba continuamente la
temperatura central por radio-telemetra, mostraron que el ritmo diurno
normal de temperatura corporal persista como ritmo circadiano an cuando
los animales eran colocados en oscuridad constante. La pinealectoma sin
embargo, abola este ritmo circadiano en oscuridad constante y reduca la
temperatura corporal. Se concluy as que la pineal era esencial para la
funcin normal del reloj biolgico que controla el ritmo de temperatura
corporal, ubicndose este reloj en el hipotlamo (Romijn, 1978)

As se le asignaba a la pineal otro papel, el de regulador fino del
proceso de termorregulacin.
4.-Induccin del sueo.
Hay evidencias concluyentes que sealan que la pineal y la melatonina
son inductoras potenciales del sueo. De hecho, la pineal esta involucrada
directamente en el control del ritmo sueo-vigilia, ritmo que posee
circadianidad. Lo que no esta claro an es, cmo la melatonina ejerce una
accin de tal naturaleza a nivel cerebral. Cuando se aisl por vez primera la
melatonina se descubri que tena un efecto sedante moderado en los
animales. En 1982 Wurtman y colaboradores, demostraron que la hormona
puede inducir el sueo en las personas tambin. En sus primeros ensayos, se
utilizaron dosis elevadas de melatonina (hasta 240 mg) y se describi que
tales dosis dejaban muy cansadas a las personas al da siguiente. En otra
serie de ensayos, dosis entre 0,1 y 10 mg de melatonina causaron aumento
de la somnolencia con menor cansancio post-sueo. Dosis muy pequeas
de melatonina son suficientes para subir los niveles al punto de inducir
sueo relajador, y dado que no causa efectos colaterales ni dependencia, se
ha venido usando con frecuencia e insistencia para tratar casos de insomnio,
sobre todo en ancianos (Pierpaoli, 1996)
5.-Influencia sobre el crecimiento corporal.
De acuerdo a Hester (citado en Romijn, 1978), la pineal ejerce un
efecto inhibitorio sobre el crecimiento. En sus estudios el autor utiliz ratas
machos y hembras, enucleadas unilateral y bilateralmente en combinacin o

no con pinealectoma. Las autopsias efectuadas entre los 25 y 125 das
posteriores a las maniobras, revelaron mediante pesaje de rganos que en
ratas hembras la enucleacin solamente retard el crecimiento ovrico,
uterino, adrenal y pituitario; la pinealectoma previno esta inhibicin del
crecimiento en todos los casos. En machos se detect tamao corporal
reducido, pesos disminuidos de los testculos, vesculas seminales, glndulas
adrenales y la pituitaria. Este efecto fue contrarrestado por la pinealectoma.
Estos resultados indujeron al autor postular que la melatonina inhibe o
causa una reduccin en la secrecin de somatotropina, gonadotropinas y
adrenocorticotropinas en la hipfisis. Trabajos posteriores efectuados por
diversos investigadores han indicado que, por lo menos en ratas la
melatonina actuara como un bloqueador general o inhibidor competitivo a
nivel de hipotlamo o hipfisis, bloqueando o frenando la produccin de
factores del crecimiento. Otros trabajos ms interesantes, sealan que la
pineal no slo ejerce un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de tejidos
sanos, sino tambin actuara como agente oncosttico, inhibiendo el
crecimiento tumoral (Lerchi, 2002). Estos efectos no slo se han
demostrado in vitro sino tambin in vivo; en un estudio realizado por
investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad de Texas,
descubrieron que la melatonina podra reducir en un 50% la tasa de
crecimiento de tumores de prstata en ratas. La melatonina podra impedir
el desarrollo de tumores sensibles a hormonas sexuales, normalizando la
produccin de stas ltimas. En todo caso, las ltimas investigaciones han
indicado que la hormona pudiera actuar a travs de diversas vas atacando a
las clulas neoplsicas. Una de ellas podra ser bloqueando el proceso de

divisin celular, ya que se ha visto que la melatonina impide la formacin de
husos mitticos. Otros hallazgos demuestran que la melatonina aumenta el
nmero de receptores de estrgeno en clulas cancerosas humanas; aunque
parezca paradjico, este aumento del nmero de receptores por razones an
no claras, podra desempear un papel crucial en la inhibicin de la
proliferacin celular (Pierpaoli, 1996). Los estudios ms recientes han
demostrado la accin protectora de la melatonina contra la accin de los
radicales libres, sustancias stas envueltas directamente en la aparicin y
desarrollo de neoplasias. Respecto a este punto y por su trascendental
importancia, se reserva ms adelante un aparte especial en el captulo
dedicado a la melatonina y su mecanismo de accin.
6.-Efectos sobre diversos rganos endocrinos.
a.-Corteza Adrenal: diversos estudios indican que la pineal restringe y
modula la esteroidognesis adrenal bajo condiciones normales y de estrs.
Ensayos efectuados por Kinson y su grupo (citado en Romijn, 1978) en
ratas a los cuales indujeron pinealectoma, un mes despus del mismo se
observ que la secrecin de aldosterona y corticosterona adrenal haban
aumentando, al igual que los valores de presin arterial en los animales. As
se propuso que la pineal debe normalmente ejercer un efecto inhibitorio
sobre la glndula adrenal, efecto que no slo debe estar confinado a la
aldosterona.
Investigaciones hechas por De Fronzo (citado en Romijn, 1978)
sugirieron que la pineal inhibe la funcin adrenal va la intermediacin de la

hipfisis. De esta forma, se puede proponer que la pineal tendra como otra
funcin elemental, controlar y modular las reacciones fisiolgicas de defensa
y adaptacin a cambios en el entorno y a situaciones de estrs.
b.-Glndula Tiroides: En este caso tambin se han reportado efectos
inhibitorios de la pineal sobre la funcin tiroidea. Tratamiento con
melatonina a ratas adultas causa una reduccin en el peso de la glndula y
disminucin en la captacin de yodo y secrecin de hormona tiroidea. La
pinealectoma tiene el efecto opuesto (Romijn, 1978)
c.-Otras glndulas: Dado el papel modulador de la pineal y en lo que
respecta a otras funciones endocrinas, se han descrito interacciones
recprocas entre la pineal y otras glndulas como el pncreas donde la
melatonina ejercera un efecto tnico sobre la secrecin de insulina y sobre
el timo, donde ejercera efectos estimulatorios y reguladores (Romijn, 1978)








C.-BIOSINTESIS, SECRECION Y METABOLISMO DE LAS
HORMONAS PINEALES
La melatonina ha sido caracterizada en todos los mamferos
vertebrados, en especies invertebradas, 16 familias de plantas superiores,
eucariotas unicelulares, levaduras y procariotas.
En la glndula pineal de los vertebrados inferiores y superiores se han
caracterizado diversas sustancias de estructura qumica muy peculiar,
incluyendo no solo la melatonina como la hormona ms representativa, sino
a la arginina-vasotocina, vasopresina y oxitocina, as como las respectivas
neurofisinas, componentes de la familia de la propiomelanocortina,
componentes del sistema renina-angiotensina y distintos neuropptidos
como somatostatina, neuropptido Y, polipptido intestinal vasoactivo,
hormona liberadora de tirotropina, hormona liberadora de hormona
lutetropa. Lo que permanece en estudio es si tales sustancias tienen origen
neural o son producidas por los pinealocitos. Lo que si est bien aclarado es
que, la pineal sintetiza a travs de los pinealocitos, diversas indolaminas a
partir del triptfano circulante (Alonso-Solis, 1992) y(Ganong, 2003)
Dado que el objetivo fundamental de este trabajo es el de caracterizar
bioqumica y farmacolgicamente a la melatonina, en las pginas sucesivas
se proceder a la descripcin detallada de esta hormona as como de sus
metabolitos principales. An queda mucho camino por recorrer en la
investigacin acerca de la bioqumica de la glndula pineal, por lo que
mientras las investigaciones en el rea de estudio de las otras sustancias que

se han descrito en la pineal continan, se profundizar en el estudio de la
melatonina como principal indolamina sintetizada por ste rgano cerebral.
1.-Sitios de produccin de melatonina
Dentro del sistema neuroendocrino difuso (SNED), dos grandes
poblaciones celulares productoras de melatonina pueden ser distinguidos: el
central y el perifrico. El central incluye a los pinealocitos ubicados en la
glndula pineal, y el sistema visual que abarca la retina y la glndula
Harderiana, todos los cuales exhiben un ritmo de secrecin de melatonina
que se adapta al ciclo biolgico de luz-oscuridad. El perifrico da cuenta de
todas las clulas localizadas fuera de las reas nombradas, producen la
hormona y su funcin no depende probablemente del grado de iluminacin
ambiental; es el caso de los intestinos (Kventoy, 1999)
a.-Sntesis de melatonina en la glndula pineal
Las rutas de sntesis de la hormona melatonina en la glndula pineal
de mamferos esta bien caracterizada desde principios de los aos setenta.
Para la sntesis de melatonina se requiere que el pinealocito capte el
aminocido triptfano de la circulacin general, probablemente por un
mecanismo de transporte activo. Se ha reportado que los niveles de
triptfano son mayores al final del perodo de iluminacin ambiental con un
decaimiento progresivo a medida que avanzan las horas nocturnas. La
captacin de triptfano hacia el pinealocito est bajo control de
mecanismos simpticos noradrenrgicos (Ebels, 1986), (Kennaway, 2002) y
(Ganong, 2003). Se ha demostrado que adicin de l-noradrenalina a cultivos

de pinealocitos causan un marcado incremento en la formacin de
melatonina a partir del triptfano (Axelrod, 1974)
Luego que el aminocido es captado es inmediatamente hidroxilado a
5-hidroxitriptfano (5-HTP) por la enzima triptfano hidroxilasa, que
requiere de oxgeno molecular y tetrahidrobiopterina (una pteridina
reducida) como cofactores. Se ha detectado que la concentracin de
tetrahidrobiopterina es mayor en tejido pineal que en cualquier otra
localizacin cerebral. La actividad de esta enzima es regulada por receptores
-adrenrgicos que utiliza a su vez, AMPc como segundo mensajero. Se ha
reportado que la actividad de esta enzima en mamferos es mayor en horas
nocturnas.
Siguiendo hacia la formacin de melatonina, el (5-HTP) es
descarboxilado a serotonina (5-hidroxitriptamina) /5-HT) por la accin de
la 5-hidroxitriptfano decarboxilasa, la cual tiene una distribucin muy
abundante en la pineal y no exhibe un patrn circadiano de actividad. La
enzima requiere de 5-fosfato piridoxal como cofactor (Zinder, 1967)
Aparentemente esta enzima no responde a la estimulacin noradrenrgica.
Respecto a la serotonina, se ha descrito que el contenido de la misma en la
pineal de distintas clases de mamferos, es mayor durante el da y disminuye
en horas de la noche.
La serotonina (5-HT) tiene una variedad de rutas metablicas dentro
de la pineal. Las principales rutas incluyen la deaminacin oxidativa para
originar 5-hidroxi-indol acetaldehdo por accin de una mono-aminooxidasa

(MAO), orto-metilacin que resulta en la formacin de 5-metoxitriptamina,
y por supuesto, la de mayor inters fisiolgico, la N-acetilacin para formar
N-acetilserotonina, precursor inmediato de la melatonina (Ganong, 2003)
Para detalles de la ruta metablica referirse a laFig. No.3
La serotonina en presencia de acetil-Coa y la enzima N-acetil
transferasa (NAT) (EC 2.3.1.87), es convertida a N-acetilserotonina. La
actividad de la NAT fue de las primeras enzimas en ser demostrada que
posea un ritmo circadiano de 24 horas en la pineal. LaNAT tiene un peso
molecular de 39.000 daltons y transfiere un grupo acetilo desde la acetil-
CoA a un aceptor de amina en este caso, la serotonina. Se ha definido que la
actividad de la NAT es la limitante en la tasa de produccin de melatonina
pineal. La actividad de la NAT es iniciada en la glndula pineal en horas
nocturnas por estimulacin de la adenilato ciclasa, va de un receptor
1
-
adrenrgico. El proceso comienza con la liberacin de noradrenalina a partir
de las terminaciones nerviosas simpticas post-ganglionares que finalizan en
la pineal. Despus de su interaccin con los receptores adrenrgicos en la
membrana celular de los pinealocitos, se produce estimulacin de la
produccin de AMPc intracelular con la activacin de la cascada de
segundos mensajeros correspondientes. Se requiere de la sntesis de ARNm
para la induccin de la actividad de la NAT. Ciertas drogas como la
adrenalina, isoproterenol y L-Dopa causan un marcado incremento en la
actividad de la NAT durante el da; bloqueantes -adrenrgicos como el l-
propranolol previenen esta elevacin (Axelrod, 1974)



Figura No. 3
Ruta de biosntesisde la hormona melatonina
Triptfano 5-OH-Triptfano
Serotonina
N-acetil-serotonina
MELATONINA
5-metoxi-triptofol
5-metoxi-indol-actico
5-OH-indol-actico
5-OH-triptofol
5-OH-indol-acetaldehdo
Triptfano
Decarboxilasa
Triptfano
Hidroxilasa

En adicin a la activacin de receptores
1
-adrenrgicos, la
noradrenalina tambin se une a receptores a-adrenrgicos en la membrana
del pinealocito, incrementando el recambio de fosfatidilinositol que resulta
en la liberacin intracelular de otros segundos mensajeros, como
diacilglicerol (DAG), cido fosfatdico e inositol trifosfato (IP
3
). Esta ruta
sin duda, envuelve un efecto de potenciacin de la activacin de los
receptores beta por parte de los receptores alfa para una mayor actividad de
la enzima NAT. La N-acetil serotonina formada por N-acetilacin, es el
precursor inmediato de la melatonina. La cantidad de N-acetilserotonina
formada en la pineal semeja la actividad de la enzima NAT; as, los valores
son mayores en la noche de N-acetil serotonina cuando la actividad de N-
acetilacin de la serotonina es mayor. Ver Figura No. 4
LaO-metilacin de la N-acetilserotonina conduce a la formacin de
melatonina. Este paso requiere de la enzima hidroxi-indol-ortometil-
transferasa (HIOMT) (EC 2.1.1.4); esta enzima no slo est envuelta en la
sntesis de melatonina, sino en la produccin de otros metoxi-indoles
pineales. La HIOMT tiene dos subunidades pequeas de 39.000 daltons y
representa entre 2-5% del total de protena soluble en la pineal. La HIOMT
se encuentra altamente concentrada en la pineal de aves y mamferos;
algunas pequeas cantidades se han podido hallar en la retina de rata. La
HIOMT en anfibios, peces y rptiles se ha localizado tambin en el ojo y
cerebro, adems del cuerpo pineal (Axelrod, 1974). La sustancia que acta



Leyenda: C: adenil-ciclasa; NAT: N-acetil-transferasa; PC: protein-cinasa dependiente de AMPc; PCC:
protein-cinasa C; Gs: protena G estimulatoria; PLC: fosfolipasa C; DG: diacilglicerol; NA: noradrenalina;
IP: inositol-fosfato; VIP: pptido intestinal vasoactivo; R: receptores

Figura No. 4
Mecanismos de transduccin de seales intracelulares para la sntesis
de la melatonina



como donadora de metilos en este paso de la reaccin es la S-adenosil
metionina (SAM).
Una vez producida la melatonina en el pinealocito, rpidamente
escapa a la circulacin sangunea. No se ha descrito a la fecha ningn
mecanismo activo para explicar el eflujo de la hormona desde la glndula.
La molcula es altamente liposoluble por lo cual, el mecanismo de difusin
simple es suficiente para explicar su descarga a partir del pinealocito.
(1).- Melatonina en los fluidos corporales
Una vez liberada la melatonina al torrente sanguneo, la misma se
distribuye ampliamente por todos los tejidos corporales. Los niveles
ptimos se alcanzan desde luego en el plasma sanguneo. En el plasma los
niveles de la hormona reflejan el ritmo de produccin de la misma en la
glndula pineal., exhibiendo un tpico patrn circadiano, esto es,
incrementos nocturnos de los niveles y descenso de los mismos en horas
diurnas. En mamferos vertebrados, las concentraciones de melatonina
varan entre 0,1 nM y 1 nM. En lquidocefalorraqudeo (LCR), se ha descrito
que los niveles de melatonina exhiben de igual manera, un ritmo nada
diferente al encontrado en el plasma. Determinaciones efectuadas en
humanos, han demostrado que los niveles de melatonina son de rutina
mayores en plasma que en lquido cerebroespinal. En saliva, los niveles
diurnos de melatonina en humanos son equiparables a los del plasma; en
comparacin, los valores nocturnos fueron de casi 1/ 3 menores de aquellos
presentes en plasma. Los valores ms representativos indican

concentraciones de 0,5 a 0,9 pmol/ h en el da y de 1,0 a 2,4 pmol/ h en la
noche. Como dato interesante, en reportes efectuados por Wurtman y
colaboradores se vio que los niveles de melatonina sricos en mujeres eran
mayores, justo antes y durante el perodo menstrual (Wurtman , 1977)
En el lquido folicular ovrico, se ha descrito que el mismo concentra
cantidades importantes de la melatonina, sobre todo en los folculos pre-
ovulatorios. Las concentraciones promedio de la hormona en lquido
folicular son de 36,5 4,8 pg/ ml, valores mucho mayores que los hallados
en plasma de mujeres voluntarias, cuyas muestras se tomaron a la misma
hora (10 1,4 pg/ ml). La Tabla I presenta los valores ms representativos
de melatonina en los principales fluidos corporales.
Tabla I
Valores medios de melatonina (MLT) en fluidos corporales humanos

Lquido Valores de MLT en el da Valores de MLT en la noche
Plasma (pg/ ml) 12 135 (44) 45-200 (225)
Orina (ng/ 4h) 1-12 (6) 4-40 (25)
LCR (pg/ ml) 1-60 (39) -
Entre parentsis, valores medios. Tomado de Alonso-Solis (1992)



b.- Produccin de melatonina en otros tejidos
La sntesis de melatonina est ms ampliamente distribuida en el
organismo de los mamferos de lo que se pensaba anteriormente. La lista de
clulas productoras y almacenadoras de melatonina, indican que la hormona
tiene una posicin nica entre todas las dems hormonas del sistema
neuroendocrino, siendo hallada en prcticamente todos los sistemas
orgnicos. Tomando en cuenta la cantidad de clulas productoras de
melatonina en el cuerpo, el amplio espectro de actividades biolgicas de la
misma y especialmente, su propiedad universal de reguladora de ritmos
biolgicos, se pudiera hipotetizar que la melatonina extrapineal pudiera
jugar un papel clave como molcula mediadora de las seales paracrinas,
para la coordinacin local de relaciones intercelulares. De hecho, y como
dato adicional que apoyara tal hiptesis se tiene que en muchas de las
clulas vecinas en distintos tejidos donde la melatonina ha sido detectada, se
han caracterizado receptores de alta afinidad por la hormona. Esta
propiedad parece ser la distincin principal entre la melatonina extrapineal y
la producida en la glndula.
Uno de los principales sitios de produccin de melatonina extrapineal
lo constituye sin duda alguna el intestino delgado. Anlisis matemticos han
demostrado que el nmero total de clulas enterocromafines (EC) presentes
en el intestino, es significativamente mayor que el nmero posible de clulas
secretoras de la hormona en la pineal (Kventoy, 1999). Se ha evidenciado
que el tracto gastrointestinal de aves y mamferos contiene al menos, 400
veces ms melatonina que la misma glndula pineal. Para algunos

investigadores, estos datos y el hecho que las clulas EC dan cuenta del 95%
de toda la serotonina endgena, el precursor principal de la melatonina,
sugiere que las clulas EC son la principal fuente de melatonina en humanos
y tejidos animales (Kventoy, 1999)
Estudios posteriores han demostrado que la retina ocular y los
rganos ciliares e iris, incluyendo rganos orbitales accesorios como la
glndula Harderiana y lacrimales extraorbitales, cuentan con la maquinaria
sinttica necesaria para la sntesis de melatonina. En adicin a ello, algunas
clulas sanguneas han sido evaluadas y tienen la posibilidad de producir
melatonina (Reiter, 1991)

c.-Regulacin neurofarmacolgica de la sntesis de melatonina
El incremento nocturno en la produccin de la melatonina en la
pineal est bajo el control de la inervacin simptica de la glndula. El
ritmo de secrecin de melatonina por el pinealocito, se estima que es
iniciado por la actividad neuronal presente en el ncleo supraquiasmtico
del hipotlamo (NSQ). As, lesiones de este ncleo previenen el incremento
nocturno en la actividad de laenzima NAT pineal (Wurtmann, 1965)
Las proyecciones caudales del NSQ pudieran incluir una sinapsis en
el ncleo paraventricular, y por lo tanto, una conexin monosinptica con la
columna celular intermediolateral del cordn medular torcico superior
(Bittman, 1984). Estas neuronas simpticas preganglionares dan lugar a

fibras las cuales abandonan la mdula espinal por la raz ventral y pasan al
tronco simptico para hacer sinapsis sobre cuerpos celulares cuyos axones
terminan eventualmente en la pineal. Durante el da, la actividad neural
dentro de las fibras simpticas que inervan la pineal est deprimida por la
influencia lumnica, informacin sta que es transferida al NSQ del
hipotlamo. Para detalles de la inervacin, ver Figura No. 5
Una pregunta que ha fascinado a los investigadores de este campo
por muchos aos, es cmopuedeactuar la oscuridaden el procesodeestimulacin de
la glndula pineal para producir la melatonina yla luz tener el efectocontrario? Para la
dcada de los sesenta se plantearon 3 posibilidades, (Wurtman, 1963):
a) Que la luz penetrara directamente a travs del crneo y actuar
directamente sobre la glndula pineal. Ganong y sus colaboradores de la
Universidad de Berkeley en California, demostraron que cantidades
significativas de luz pueden penetrar el crneo de vertebrados inferiores.








Figura No. 5
Esquema de la inervacin de la glndula pineal y un ejemplo de su
accin a nivel endocrino
(tomado de Wurtman, Scient. Am., 1975)
Glndula Pineal
Mdula Espinal
Ovario
Hormona Luteinizante
Melatonina
secretada
Hipotlamo
Hipfisis
Nervio ptico
Luz
Ganglio cervical superior
Nervio simptico pre-ganglionar
Nervio simptico post-ganglionar

Esta hiptesis fue luego desechada al comprobarse que ratas ciegas
perdan por completo la capacidad de responder a la luz con cambios en la
actividad de la enzima HIOMT; as se postul que la retina deba ser la
receptora de las ondas lumnicas.
b) La segunda posibilidad que se haba planteado era que la luz alterara el
nivel de hormona circulante, afectando quizs la glndula pituitaria y que
sta hormona, secundariamente afectase la actividad enzimtica en la misma
glndula pineal. Esta hiptesis se descart tambin ya que la remocin
quirrgica de la pituitaria y los ovarios no interferan con la respuesta de la
HIOMT a la luz.
c) La tercera posibilidad y lams aceptable es que, la informacin lumnica
es transmitida a la pineal por va nerviosa. Se comprob luego que la
seccin de las terminaciones simpticas, o la extirpacin del ganglio cervical
superior, alteraban la formacin inducida por la luz de la melatonina. El
incremento en la actividad de la NAT (de casi 30 veces) en horas de la
noche, pudiera ser explicado por la liberacin reducida de noradrenalina
durante el da, causando as una supersensibilidad al neurotransmisor
descargado con mayor concentracin al inicio de la fase de oscuridad.
Otros hallazgos notables han sido que, la luz tiene la capacidad de
influenciar en la formacin de la enzima 5-hidroxi-triptfano decarboxilasa
que induce la formacin de serotonina a nivel pineal, ms no en otros
rganos. En contraste a la HIOMT, la actividad de la decarboxilasa se

incrementa cuando ratas experimentales son mantenidas bajo iluminacin
constante y decrece con la oscuridad (Axelrod, 1963)
Es en la noche, justamente cuando la actividad de la glndula pineal
es mxima, cuando el cuerpo fsico y la mente se restauran y se estabilizan
de los efectos de la actividad diaria y el estrs cotidiano. En este perodo, la
actividad nerviosa parasimptica se incrementa, la musculatura se relaja, las
frecuencias cardiaca y respiratoria se reducen, el metabolismo general se
minimiza, mientras que la hormona del crecimiento en plasma aumenta
(Romijn, 1978). La actividad endocrina de la pineal es reflejada por el nivel
de metabolitos de indolamina presentes en plasma y orina. Esta premisa es
apoyada por los siguientes hechos:
a) El neurotransmisor pinealotrpico, la noradrenalina, cuya liberacin est
aumentada en la noche, estimula simultneamente la sntesis y liberacin de
indolaminas pineales.
b) La elevada tasa de recambio del metabolismo de indolaminas pineales en
la noche, se refleja por un nivel de melatonina elevado en plasma sanguneo
y lquido cefalorraqudeo, con un pico elevado en la excrecin urinaria del
metabolito 5-hidroxi-indolactico.
c) En la noche la actividad de la pineal es mxima.
d) La concentracin de melatonina y serotonina se ha encontrado que es
mayor en la pineal que en otros tejidos cerebrales.

e) La tasa de flujo sanguneo por gramo de tejido pineal, excede aquella de
muchos otros rganos endocrinos, igualando al de la neurohipfisis y slo
sobrepasado por los riones.
Se ha considerado como muy importante el tener presente los dos
componentes del ritmo de secrecin de melatonina, es decir, la duracin del
tiempo que permanece elevada la melatonina en plasma (a) y la amplitud del
ritmo de secrecin (b), tal como se presenta a continuacin:
b

a
La duracin de la concentracin de melatonina elevada en plasma es
proporcional adems, a la duracin del perodo de oscuridad diario.
Considerando que bajo condiciones naturales la relacin luz/ oscuridad
cambia sobre la base de una relacin diaria y mensual, el mensaje que la
pineal enva al organismo debe variar diariamente y estacionalmente. En
muchas especies de animales, los altos niveles de melatonina son
mantenidos por slo un breve perodo durante la noche, mientras que en
otros, virtualmente todo el perodo de oscuridad se halla asociado con
niveles circulantes elevados de la hormona. En perodos como el invierno,
cuando las noches son ms largas, la duracin de la concentracin de
melatonina elevada est tambin prolongada (Reiter, 1991)


d.-Distribucin y metabolismo de la melatonina
Una vez que la hormona es liberada de los pinealocitos a la
circulacin sangunea mediante difusin simple gracias a su alta
liposolubilidad, difunde con rapidez y se distribuye hacia otros lquidos y
tejidos corporales. Cantidades apreciables y detectables pueden ser
cuantificadas en lquido cefalorraqudeo, lquido ocular (cmara anterior del
ojo), saliva, lquido folicular ovrico, lquido seminal, leche materna y
lquido amnitico. La melatonina tiene la capacidad de atravesar la placenta
a partir de lo cual provee informacin fotoperidica al feto (Rowe, 2002)
La melatonina circulante en plasma viaja en parte unida a la albmina
(60-70%) y el resto en forma libre. Lavidamedia de la melatonina en la
circulacin sangunea es de aproximadamente 15-20 minutos. La mayor
parte de la hormona es inactivada en el hgado mediante su conversin a 6-
hidroxi-melatonina la cual es excretada por la orina en forma de compuestos
sulfatados (75%) o glucurnidos (5%). Otra parte de la melatonina (15%) es
transformada en el tejido cerebral a compuestos derivados de la
kinurenamina, y slo apenas un 5% o menos, se excreta en forma libre por
la orina. Los metabolitos urinarios de la melatonina exhiben tambin un
ritmo circadiano que asemeja con el de la melatonina en plasma (Alonso-
Solis, 1992). El promedio de excrecin de metabolitos de la hormona por
va urinaria vara considerablemente entre los individuos, oscilando entre 0-
30 ng/ 8 h, pero es muy consistente da a da. Entre un 60 y 70% del total
excretado por da, se realiza entre las 11 pm y la 6 am. (Wurtman, 1977) y
(Fourtillan, 2001)

Entre los metabolitos derivados de la melatonina se encuentran
diversos compuestos indlicos. El grupo 5-metoxi de la molcula no es
retenido necesariamente en ellos. La melatonina incluso, puede ser
reconvertidaen su precursor, N-acetilserotonina en especies como aves y
mamferos, incluyendo al hombre. Esta ltima ruta parece predominar a
nivel de la retina que posee mayores cantidades de N-acetilserotonina que
de melatonina (Allen, 1991). Mejor documentado se encuentra el efecto de
los indoles 5-metoxilados, en particular la 5-metoxi-triptamina. Esta se
puede producir por las siguientes vas: 1) O-metilacin de la serotonina
debido a la accin de la enzima HIOMT, el cual ocurre en retina, pineal y
glndula Harderiana de roedores; 2) va de O-metil-transferasas inespecficas
localizadas en tejidos vegetales (Banerjee, 1973); 3) a partir de la melatonina
por medio de la enzima aril-acilamidasa (Beck, 1981)
La 5-metoxi-triptamina es rpidamente degradada en la glndula
pineal a 5-metoxi-triptofol mediante la accin de la Mono Amino Oxidasa
(MAO) (Galzin, 1986). En varias clases de mamferos y otras especies de
vertebrados el 5-metoxi-triptofol est presente en la pineal, retina y glndula
Harderiana. Presenta alta hidrofobicidad. Se han descrito influencias
antigonadales de este metabolito, incluyendo efectos sobre clulas de Leydig
(Hardeland, 1993). Tiene la capacidad tambin de hacer disminuir la
temperatura corporal en ratas. El metabolito es degradado rpidamente a
cido-5-metoxi-indolactico que se excreta por la orina.
Otro metabolito de inters derivado a partir de la 5-metoxi-triptamina
es el N-N-Dimetil-5-metoxi-triptamina que es formado por va de la N-

metil-transferasa; la molcula es poco hidrofbica. Es de mucho inters en
el rea psicopatolgica y est presente adems en concentraciones
importantes en numerosas plantas tropicales alucingenas (Hardeland,
1993). La ruta sinttica para formar el compuesto mencionado se cree,
comienza con la N-metilacin de la serotonina dando lugar a la bufotenina,
que luego es O-metilada por la HIOMT (Banerjee, 1973). Se ha considerado
a esta sustancia como un potente ligando serotoninrgico.
El metabolismo de las indolaminas 5-metoxiladas no est restringida
slo a modificaciones de sus residuos laterales. La cadena aliftica en
especial puede sufrir tambin ciclacin. Pueden presentarse en este caso dos
posibilidades: una, es la formacin de un segundo anillo de 5 tomos de
carbono, apareciendo simultneamente con hidroxilacin y saturacin del
doble enlace en posicin 2-3. Esto origina el ismero cclico de la 2-hidroxi-
melatonina. Esta sustancia se ha aislado en orina de ratas y humanos
(Hardeland, 1993). La segunda opcin de ciclacin es mediante la
incorporacin de un tomo de carbono adicional, formndose las -
carbolinas. Estas sustancias son halladas en todos los tejidos que producen
melatonina. Su generacin metablica bajo condiciones fisiolgicas es an
incierta. Poseen efectos psicomimticos relacionados con la interferencia de
dos importantes mecanismos neurobiolgicos: unin a receptores
benzodiazepnicos y modulacin de la afinidad del sitio de unin de la
imipramina relacionado al transportador de serotonina (Haefely, 1985). Las
-carbolinas se ha visto que influencian la secrecin de hormonas a nivel de
pituitaria, en especial, la prolactina.

Una de las principales -carbolinas metoxiladas detectadas es la
Pinolina (6-metoxi-1,2,3,4-tetrahidro- -carbolina = 5-metoxi-triptolina).
Los sitios de unin de este metabolito se han detectado densamente en la
pineal, tambin en otras regiones del cerebro y reas de corteza y mdula
adrenal (Hardeland, 1993)
Otra importante va del metabolismo de la melatonina conduce a la
formacin de kinuraminas sustituidas, formadas por clivaje del anillo
pirrlico de la melatonina. La reaccin puede ser catalizada por la
indolamina-2,3-dioxigenasa, una hemoenzima que requiere de aniones
superxido como sustrato (Vanecek, 1998). El primer metabolito que se
forma por el clivaje del anillo pirrlico es el N
1
-acetil-N
2
-formil-5-metoxi-
kinuramina (AFMK), que luego por accin de la arilamina formamidasa la
convierte en N
1
-acetil-5-metoxi-kinuramina (AMK). Ambas sustancias han
sido caracterizadas en el cerebro, en mayor proporcin en glndula pineal.
e.-Regulacin de la sntesis de melatonina
Se han descrito elementos fisiolgicos que participan bien sea, en la
estimulacin o en la inhibicin de la sntesis de la hormona. Se describirn a
continuacin algunos de los principales elementos investigados a la fecha y
su influencia en la sntesis de melatonina.
.-Noradrenalina: como ya ha sido sealado anteriormente, el efecto del
inicio de la oscuridad en mamferos conduce ala liberacin de noradrenalina
a partir de las terminaciones nerviosas simpticas provenientes del ganglio
cervical superior. La noradrenalina activa receptores
1
y estimula la

actividad adenilato-ciclasa con la consecuente produccin de AMPc. Este
proceso estimula la sntesis de melatonina.
.-GABA: lo que se ha podido describir acerca del efecto del cido
gamma amino-butrico sobre el metabolismo de las indolaminas pineales es
variada entre las distintas especies de mamferos. Estimulacin o carencia de
este efecto puede observarse en ratas, mientras que en pineal de bovinos, el
GABA inhibe la estimulacin de la enzimaNAT inducida por norepinefrina
(Ebels, 1986)
-Taurina: este aminocido sulfurado presente tambin en la pineal
estimulala actividad de la enzima NAT (Wheler, 1979). Sin embargo, en
combinacin con la noradrenalina, su efecto es menor. Se ha evidenciado
que los niveles de taurina alcanzan un mximo en las primeras horas luego
del amanecer, y que la misma compite con la noradrenalina, hacindola un
candidato interesante para la regulacin de la biosntesis de melatonina; no
est claro el mecanismo de accin del aminocido.
.-S-adenosil-L-metionina: esta sustancia es una donadora natural de
grupos metilo y es efectiva slo si el grupo amino est libre. Este grupo
amino puede reaccionar sin embargo, con el fosfato de piridoxal y perder
as, su capacidad donadora de metilos, la cual es indispensable para la
sntesis de melatonina. Del otro lado, el fosfato de piridoxal es necesario
para los procesos de descarboxilacin (Ebels, 1986)
.-S-adenosil-homocistena: este compuesto es formado cuando la S-
adenosil-L-metionina ha servido de donador de grupos metilo, y puede

unirse a la enzima HIOMT inactivndola. Recurdese que esta enzima es
clave para la biosntesis de la melatonina.
.-Pteridinas: estas sustancias son muy sensibles a la luz y juegan un rol
muy importante en los procesos metablicos en mamferos. En estas
especies, tres mono-oxigenasas de aminocidos aromticos como lo son la
fenilalanina hidroxilasa, la tirosina hidroxilasa y la triptfano hidroxilasa,
requieren de pteridina reducida como cofactor para su funcionamiento. La
6-L-Eritrotetrahidro-Biopterina (BH
4
) es el cofactor natural para las tres
enzimas citadas arriba. Las tres hidroxilasas juegan un papel crucial en la
biosntesis de las aminas bigenas tales como, catecolaminas y dopamina, y
la serotonina-hidroxi-indolamina a partir de aminocidos aromticos. As, el
BH
4
es esencial para la sntesis de melatonina y otros metoxi-indoles en la
pineal (Ebels, 1986)







D.-ESTRUCTURA Y PROPIEDADES FISICOQUIMICAS
DE LA MELATONINA
La hormona melatonina, 5-metoxi-N-acetil-triptamina es una
sustancia perteneciente al grupo de las indolaminas de coloracin amarillo
plida, muy sensible a la luz, cuya estructura bsica est conformada por un
anillo pirrlico con un grupo metilo en la posicin 5 del grupo indol y un
grupo acetilo presente en la molcula. El grupo N-acetilo representa la
porcin de la molcula que previene la unin o binding sustancial de la
misma a receptores de serotonina. Tambin protege este grupo de la
degradacin de la hormona por la enzima Monoamino-Oxidasa (MAO), una
caracterstica que la distingue de su anlogo, 5-metoxi-triptamina.
Adicionalmente, el grupo acetilo participa en la ciclacin de los residuos
alifticos (Hardeland, 1993) Ver detalles en la Figura No. 6
En la Tabla II se resumen las principales propiedades fisicoqumicas
de la melatonina.







Estructura tridimensional

Estructura planar
Figura No. 6
Estructura qumica de la melatonina


TABLA II
PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LA MELATONINA
___________________________________________________________
Frmula Qumica: -N-[2-(5-metoxi-1H-indol-3-yl) etil] Acetamida
Frmula Estructural: C
13
H
16
N
2
O
2
Peso Molecular: 232,27 g/ mol
Composicin: Carbono: 67,22%; Oxgeno: 13,78%; Nitrgeno: 12,06%;
Hidrgeno: 6,94%
Espectro de Absorcin y Emisin: la melatonina absorbe luz solamente en
la regin UV del espectro con una mxima absorcin a ~278 nm. El
espectro de fluorescencia es muy fuerte en la regin cercana a la UV con un
mximo de emisin a ~340 nm
Punto de fusin: 116-118C
Solubilidad: en agua: 0,1 mg/ ml; en etanol: 8 mg/ ml
Almacenamiento: = 0C o menor
Se cristaliza a partir de solucin de benceno: mp: 116 a119C
Densidad: 1,269 g/ cc medido por mtodo de flotacin en solucin acuosa
de cloruro de calcio.
Estructura Molecular: La distancia C-C en el anillo bencnico es de 1,402
A, mientras la distancia C-C y C-N en el anillo pirrlico es de 1,405 A y
1,394 A respectivamente. La parte indlica de la melatonina es planar,
siendo el promedio de desviacin de los tomos a partir del plano 0,011 A




E.-RECEPTORES CELULARES DE MELATONINA
La respuesta celular a la accin de la melatonina requiere que el
mensaje sea decodificado. Para ello, las clulas cuentan con los receptores
especficos para esta hormona. Gracias al desarrollo de modernas tcnicas
para la caracterizacin cuantitativa de receptores, agentes farmacolgicos
selectivos y ligandos como la 2-(
125
I) Iodomelatonina, se ha logrado avanzar
significativamente en el estudio de los receptores celulares de la melatonina.
Se ha evidenciado que los efectos de la melatonina son mediados a
travs de receptores especficos de alta afinidad. El patrn de distribucin
de estos receptores vara de especie a especie. En los vertebrados no
mamferos por ejemplo, la distribucin de los mismos es muy abundante, a
diferencia de los mamferos la cual es discreta o baja (Vanecek, 1998) y
(Laitinen, 1990). El grupo 5-metoxi y la cadena N-acetilo lateral son
fundamentales para el binding de alta afinidad al receptor, ya que derivados
de la melatonina que carecen de estos grupos son menos afines al receptor.
La densidad de receptores no slo vara con las especies y su localizacin,
sino en diversos tejidos est influenciado tambin por el fotoperodo,
rgimen de iluminacin y status endocrino del individuo (etapa de
desarrollo) (Vanecek, 1998). Ver Figura No. 7
En los mamferos, los receptores de alta afinidad por melatonina
estn presentes en la pars tuberalis de la pituitaria y en ncleo
supraquiasmtico del hipotlamo. Este patrn de distribucin puede ser


TM: Dominios trans-membrana En verde: molcula de melatonina
Figura No. 7
Representacin tridimensional de la unin de la melatonina
a su receptor
(Tomado de Balk, Physiol. Rev., 2004)


Melatonina

hallado tambin, pero en menor grado en rea pre-ptica medial,
hipotlamo anterior, ncleos dorsomedial y ventromedial hipotalmicos,
ncleos talmico anteroventral y paraventricular, hipocampo, rea postrema,
cortezas cerebral y cerebelar y retina. En retina el binding de Iodo-
melatonina se evidencia mayormente en la capa plexiforme interna, cuyas
clulas contienen importantes conexiones simpticas. Tambin ha sido
descrita su existencia en las arterias del crculo de Willis y arteria caudal de
distintos mamferos (Vanecek, 1998)
Hasta el presente y gracias al desarrollo de estudios de
autorradiografa y biologa molecular (clonamiento), se han caracterizado 3
subtipos de receptores de melatonina, perteneciendo a una subfamilia de
receptores con 7 dominios trans-membrana, conectados por 3 asas
extracelulares y 3 intracelulares, acoplados a protena G inhibitoria sensible
a toxina pertussispresentes en la membrana plasmtica celular. Los dominios
transmembrana V, VI y VII se ha sugerido estn envueltos en interacciones
especficas entre el receptor y el ligando. Los subtipos de receptores de
melatonina humanos muestran una homologa del 60% a nivel de
aminocidos y distintos perfiles farmacolgicos de unin de agonistas y
antagonistas (Dubocovich, 2000) y (Balk, 2004)
La nomenclatura y clasificacin para los receptores de melatonina
utilizados en este trabajo son las adoptadas por la Unin Internacional de
Farmacologa (IUP) en 1998 (Dubocovich, 1998). De acuerdo al mismo, los
receptores de melatonina se denominan con la letra MT, utilizando la
denominacin en minscula, (mt), para aquellos receptores de los cuales

slo la estructura molecular se conoce.; la denominacin en mayscula se
reserva para aquellos receptores con una caracterizacin farmacolgica y
funcional bien definidas en un tejido en particular, as como su estructura
molecular. La denominacin en maysculas e itlicas (MT) se utiliza para
receptores caracterizados farmacolgicamente a nivel tisular, pero a los
cuales no se les conoce la estructura molecular.
En la Tabla III se presenta la ms reciente nomenclatura y la
caracterizacin de los receptores de melatonina descritos a la actualidad.
Los subtipos mt
1
y mt
2
parecen estar ampliamente expresados en los
tejidos antes nombrados y ser los ms importantes desde el punto de vista
funcional. Hay variaciones circadianas en la densidad de receptores de
melatonina por ejemplo, en la pars tuberalis lo cual est directamente
regulado por las variaciones diarias de la propia hormona. En retina se ha
encontrado que el receptor mt
2
est envuelto en la inhibicin de la
liberacin de dopamina. En la glndula pituitaria anterior, la melatonina a
travs de sus receptores, transduce el efecto del fotoperodo actuando a
nivel de dos tipos de clulas secretorias: lactotrofas que secretan prolactina y
gonadotrofas que producen la hormona luteinizante (LH) y la hormona
estimulante del folculo (FSH). La activacin de receptores en la pars
distalis, conduce a la inhibicin de la liberacin de gonadotropinas
controlado por GnRH. Este efecto se ha observado notoriamente en clulas
gonadotropas neonatales; ello coincide con la expresin temprana de
receptores de melatonina de alta densidad y su gradual declinacin en la
pituitaria durante el desarrollo (Balk, 2004)

TABLA III
CLASIFICACION DE RECEPTORES DE MELATONINA
Nomenclatura mt
1
mt
2
MT
3

Otros nombres Mel
1a
, ML
1A
Mel
1b
, ML
1B
ML
2

Afinidad (K
D
) 45 pM 140 pM 0.3-2 nM
Acoplamiento G i/ o G i/ o -
Radioligandos
3
H-MLT
3
H-MLT 2-iodo-(
125
I) MLT
2-iodo-(
125
I) MLT 2-iodo-(
125
I) MLT
Agonistas selectivos - IIK7 N-acetilserotonina
5MCA-NAT
Antagonistas selectivos - 4P-PDOT Prazosin
DH97, K185
Gene/ cromosoma MTNR1A/ 4q35.1 MTNR1B/ 11q21-22 -
Estructura-7TM h350 P48039, h362 P49286, m121 U57554 -
M353 Q61184, r156 P49218 r120 P49287 -
Localizaciones Retina, NSQ hipotlamo Retina, cerebro Melanforos
Cerebelo hipocampo cerebro, retina
Especies Mamferos, Aves Mamferos Peces, aves,
anfibios
Nomenclatura: * IIK/ 7: N-butanoil-2(2-metoxi-6H-isoindol [2,1-a]indol-11-il)etamina; * 5MCA-NAT: 5-
metoxi-carbonilamino-N-acetil-triptamina; * 4P-PDOT: 4-fenil-2-propioamido tetralina; * DH97:2-bencil-
N-pentanoil-triptamina; * K185:N-butanoil-2-(5,6,7-trihidro-11-metoxibenxo[3,4]cicloheptano[2,1-a]indol-
13-il)etamina.

Est bien documentado que los principales efectos de los receptores
de melatonina a nivel celular son mediados por la inhibicin de la actividad
de la adenilato ciclasa, conduciendo a una disminucin de los niveles de
AMPc e inhibicin de los procesos celulares regulados por este mensajero
intracelular. En las clulas que expresan por ejemplo, receptores de mt
1
la
inhibicin de la adenilciclasa, est ocasionalmente acompaada de una
facilitacin simultnea de la actividad de la fosfolipasa C, que origina a su
vez, diacilglicerol e inositol-trifosfato. La activacin de receptores tipo mt
2

tambin da lugar a inhibicin de la actividad guanilato ciclasa, pero el grado
al cual se produce esta inhibicin an se desconoce (Balk, 2004) Ver la
Figura No. 8 que ilustra el efecto de la activacin de receptores de
melatonina en clulas gonadtrofas neonatales, y su accin inhibitoria sobre
la liberacin de LH y FSH.










Leyenda: AC, adenil-ciclasa; CNGC, canal activado por nucletidos cclicos; GnRH REC: receptor de
GnRH; SERCA, ATPasa de Calcio de Retculo Endoplasmtico Liso; VSSC, canal de sodio sensible a
voltaje; VSCC, canal de calcio sensible a voltaje; InsP3: inositol-tri-fosfato; PLC: fosfolipasa C; Kca: canal
de potasio sensible a calcio
Efecto inhibitorio
Efecto Estimulatorio

Figura No. 8
Modelo propuesto de accin inhibitoria de la melatonina sobre
clulas gonadtrofas neonatales de ratas

Receptor de Melatonina
Despolarizacin

F.- ACCIONES DE LA MELATONINA EN CELULAS Y
TEJIDOS CORPORALES
.1.- A nivel cerebral. A causa de su alta solubilidad en lpidos y agua,
la melatonina es capaz de atravesar la barrera hematoenceflica, penetrar a
las neuronas y clulas gliales y distribuirse con facilidad entre los
componentes subcelulares. En cerebro el efecto de la hormona pudiera ser
mediado por distintos mecanismos, bien sea a travs del control de la
homeostasis del calcio y sus mecanismos de sealizacin intracelular, a
travs de sus efectos sobre el estado se alerta y sueo, o a travs de su
influencia sobre la actividad de aminocidos excitatorios o inhibitorios.
Algunos efectos centrales pudieran ser mediados por su interaccin con
receptores especficos o sitios de unin expresados en ciertas regiones
cerebrales, y otros pudieran resultar de interacciones, no mediadas por
receptores, con cierta clase de neuronas o clulas gliales (Huethe, 1996). En
lo que respecta a este ltimo efecto, es decir, no mediados por receptores
existe una tendencia significativa de considerar a la melatonina como
potente agente antioxidante celular, accin sta que protegera al tejido
cerebral de la accin de los radicales libres generados en diversos procesos
patolgicos (Iacovitti, 1997). Ya que ste es uno de los objetivos
fundamentales de este trabajo de investigacin, ms adelante se har
referencia y en detalle, acerca del papel de la melatonina como antioxidante
celular.
.-Efectos Metablicos: luego de la administracin de la melatonina se
pueden evidenciar diversos cambios en la actividad metablica cerebral. Se

ha detectado un incremento de casi dos veces en los niveles de GABA en el
hipotlamo y corteza cerebral (luego de inyectar a conejos adultos va
intraperitoneal, 50 g/ kg. peso); hecho curioso es que, a dosis de 250
g/ kg. peso la concentracin de GABA decae (Antn-Tay, 1974)
Los niveles de serotonina tambin son modificados por la accin de
la hormona; la serotonina tiende a aumentar en cerebro de ratas adultas una
hora despus de la administracin de 500 g/ kg. peso de melatonina. Luego
de 30 minutos de la inyeccin, los niveles de serotonina decayeron en un
14% en corteza cerebral, pero con importantes incrementos en el
hipotlamo. Los niveles permanecieron elevados luego de 180 minutos en
cerebro medial, disminuyendo los valores en hipotlamo y corteza hasta
estabilizarse (Antn-Tay , 1974)
Melatonina a dosis de 200 g/ kg. peso suministrados a ratas caus
un incremento notable, de casi seis veces sus valores normales, en la
actividad de la enzima piridoxal-fosfokinasa que cataliza la formacin de
fosfato de piridoxal, grupo prosttico muy importante de la enzima L-
aminocido decarboxilasa, que a su vez, sintetiza la formacin de serotonina
cerebral. Lo mismo se describe para la enzima cido glutmico
decarboxilasa que cataliza la sntesis de GABA.
.- Efectos Electrofisiolgicos: estudios electroencefalogrficos y de
comportamiento de individuos, han indicado que la administracin de
melatonina, en este caso, a gatos y pollos resulta en una desincronizacin
electroencefalogrfica y del sueo. En sujetos voluntarios humanos,

suministrndoles melatonina a dosis de 1,25 g/ kg. peso, se observaron
cambios tales como, ligera desincronizacin y desactivacin
electroencefalogrfica y del sueo en los siguientes 30 minutos. Monitoreo
electroencefalogrfico en las siguientes dos horas, mostr un incremento en
la aparicin de ondas alfa de gran amplitud. Muchos sujetos luego del
ensayo, manifestaron sensacin de quietud, paz y tranquilidad (Antn-Tay,
1974)
2.- A nivel del Sistema Inmunolgico. Hay evidencias que refieren
que la melatonina posee efectos estimulantes sobre este sistema, aunque hay
carencia de informacin en cuanto a los mecanismos de accin a este nivel.
En ratones inyectados con melatonina por seis das va intraperitoneal, se
encontr que hay estimulacin en la produccin de anticuerpos, incremento
en el nmero de clulas formadoras de placas en el bazo y antagonismo de
la inmunosupresin inducida por corticoesteroides (Pierpaoli-Regelson,
1996). Asimismo, a ratas pinealectomizadas y a las cuales se les suministr
melatonina exgena, se evidenci un incremento en la unidad formadora de
colonias de macrfagos en mdula dea (Huethe, 1996). Otro efecto muy
interesante y conocido desde hace cuatro dcadas, es la habilidad de la
melatonina para suprimir el crecimiento de tumores y la reproduccin de
clulas neoplsicas, inclusive en humanos (Ebels, 1986), (Maestroni, 1999) y
(Bindoni y Raffaele, 1968) observaron una elevada actividad mittica en
adenohipfisis de ratas luego de pinealectoma. Tres aos despus, estos
mismos autores describieron una relacin importante entre pineal y la
actividad mittica en otros tejidos corporales. Otras evidencias

experimentales indican que, la adicin de melatonina a medios de cultivo
inhibe el crecimiento de clulas cancerosas mamarias de humanos MCF-7;
tambin se ha descrito que la hormona retrasa el ciclo celular, regulando
adems, la accin de factores de crecimiento sobre stas clulas (Garca,
1998). La melatonina tambin tiene accin regulatoria sobre la enzima 5-
lipo-oxigenasa, en el sentido de su inhibicin. Esta enzima est restringida
su presencia a granulocitos, monocitos/ macrfagos, mastocitos y linfocitos
B. Esta accin envuelve la presencia de un receptor nuclear de la hormona
(Reiter, 1997) y (Xian-Tan, 1999)
3.- A nivel endocrino y sistemas de control y retroalimentacin.
.- Melanforos de la piel: la melatonina tiene la propiedad nica de
concentrar los melanforos dermales de anfibios, rptiles y peces, como un
mecanismo de adaptacin a distintas intensidades de luz o iluminacin
ambiental. Esta accin la realiza gracias a su propiedad de agregar
rpidamente los grnulos pigmentarios que contienen a la melanina, en
zonas perinucleares celulares, lo cual se traduce en un emblanquecimiento
de la piel del animal. Este movimiento del melanosoma es causa de los
cambios en la arquitectura del citoesqueleto del melanforo, envolviendo la
fosforilacin/ desfosforilacin de protenas especficas. La dispersin de los
grnulos de melanina parece ser mediada por cinesinas, ATPasa
dependiente de microtbulos y dineina la cual es la responsable de la
agregacin. El efecto lo ejerce la melatonina, actuando va de receptores de
alta afinidad, lo cual se traduce luego en una inhibicin del contenido de
AMPc inducido por la hormona estimulante del melanocito (MSH).

Despus de la exposicin a la luz, la concentracin de melatonina
decae, resultando en la dispersin de los grnulos pigmentarios y
oscurecimiento de la piel. El significado fisiolgico de los cambios
pigmentarios parece envolver la proteccin de los tejidos profundos de la
peligrosa radiacin solar. Este efecto no se ha reportado en mamferos
(Vanecek, 1998)
.- Retina: la regulacin de la sensibilidad visual ocurre a diferentes
niveles dependiendo de la intensidad de la iluminacin ambiental. Uno de
los efectos ms prominentes de la melatonina es sobre el movimiento
fotomecnico, esto es, la elongacin de conos y contraccin de bastones,
que ocurre en retinas de vertebrados no mamferos como una adaptacin a
una disminucin en la intensidad de la iluminacin. El efecto opuesto en
respuesta a una intensa iluminacin, ocurre y es mediada por la dopamina.
La liberacin de la dopamina en la retina es mayor en horas del da y
disminuye en horas nocturnas. La melatonina suprime la liberacin de
dopamina en retina provocada por la luz. Un hecho bien interesante es que,
la melatonina se produce dentro de la misma retina. Los receptores de la
melatonina a nivel de retina se localizan a nivel de la capa plexiforme
interna, justo donde se encuentran las conexiones entre las clulas amacrinas
productoras de dopamina y las clulas ganglionares. As, la hormona regula
la cantidad de luz que llega al fotorreceptor, controlando el movimiento de
grnulos de melanosomas dentro del epitelio pigmentario retinal. La
melatonina se ha demostrado tambin que altera la actividad elctrica de

este epitelio retiniano en mamferos, y en el control de la sensibilidad de las
clulas horizontales a la luz (Vanecek, 1998)
.- AjusteySincronizacin deRitmos Biolgicos: como ya fue mencionado,
la melatonina est involucrada en la sincronizacin de los ritmos
circadianos. Este efecto es ms notable en aves, peces y reptiles, donde la
glndula pineal es parte integrante del sistema circadiano. De esta manera,
en estos animales el ritmo de sntesis de melatonina es controlado por un
marcapasos interno (pacemaker) y continua an despus de aislamiento
completo de la pineal in vitro. An ms, en estas especies sus pinealocitos
son sensibles a la luz y es el ciclo luz-oscuridad la que ajusta o sincroniza
directamente el ritmo de sntesis de la hormona (Bardasano-Rubio, 1978)
En los mamferos, los ritmos persisten en animales sujetos a
pinealectoma sin ninguna interferencia importante. En humanos, el retraso
o adelanto en la fase del ritmo de 24 horas ha sido descrito despus de la
administracin matinal o nocturna de melatonina. As, la melatonina puede
causar un desajuste o desvo en la fase de los ritmos de sueo/ vigilia,
temperatura corporal y aparicin de la melatonina pineal en plasma
(Vanecek, 1998)
.- Vasos Sanguneos: el primer reporte que se tiene sobre la accin de la
melatonina sobre un vaso sanguneo, proviene de la potenciacin de la
accin constrictora mediada por noradrenalina en la arteria caudal en
cerebro de rata (Viswanathan, 1990). Ahora se comprobado el efecto sobre
la contraccin de la arteria caudal, sobre la base del descubrimiento de

receptores mt
1
de alta afinidad en la capa de msculo liso de las arterias
cerebrales anterior y caudal. Este efecto de la hormona es dependiente de la
edad del sujeto. En vasos sanguneos asilados de ratas muy jvenes (5
semanas de edad), la melatonina por s misma causa una fuerte
vasoconstriccin. En ratas adultas, la melatonina no mostr efectos de
vasoconstriccin directa, pero en presencia de noradrenalina la melatonina
produjo un efecto constrictor pequeo y variable, adicional al de la
catecolamina (Stokkan, 2004)
Otro efecto interesante de la melatonina a nivel de vasos sanguneos,
es su accin inhibidora de la enzima xido ntrico sintetasa (NOS),
productora de xido ntrico, por va de un mecanismo que envuelve su
unin a la calmodulina (Pozo, 1994)
4.- Otras acciones.
A causa de su gran liposolubilidad, la melatonina no tiene problemas
en atravesar las membranas celulares de todas las clulas del organismo para
as ejercer su accin, incluso en compartimientos subcelulares incluyendo al
ncleo. La melatonina tiene tambin la propiedad de ligarse a la
calmodulina, protena que liga fuertemente al ion calcio y que est envuelta
en la regulacin de los niveles de calcio libre intracelular. La melatonina
pudiera de esta manera estimular la sntesis de novo de calmodulina,
incrementando la captacin de calcio e inhibir la fosfodiesterasa
dependiente de calcio. Estas acciones sobre el calcio y su homeostasis,
pudieran tener consecuencias directas sobre la actividad y respuestas de

otros segundos mensajeros (AMPc, GMPc), sobre la fosforilacin proteica y
la expresin gnica (Huether, 1996) De esta forma, la melatonina se ha
propuesto como un interesante modulador de la sealizacin mediada por
segundos mensajeros intracelulares.
Conociendo ahora la estructura, las propiedades fisicoqumicas, los
sitios de produccin y accin de la melatonina, as como sus sitios de unin,
se proceder a partir de las siguientes pginas, a describir en detalle el
objetivo fundamental de este trabajo, el cual es la caracterizacin de las
propiedades bioqumicas de la melatonina, que la han llevado a proponer
como molcula antioxidante celular.











III.- MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE CELULAR

Aunque bien conocida por sus efectos hormonales, sincronizadora
de ritmos biolgicos, inductora del sueo, estimuladora del sistema
inmunolgico, entre otras funciones, la melatonina ha sido propuesta como
una molcula que puede funcionar como antioxidante celular. A este
respecto las controversias han surgido y las mismas continan.
En 1991, tres investigadores rumanos (Ianas, Olnescu y Badescu)
publicaron sus manuscritos en donde sealaban que la hormona melatonina
tena acciones antioxidantes. Ellos generaban radicales libres usando una
combinacin de luminol y H
2
O
2
y usaron quimioluminiscencia como un
ndice de la produccin de radicales libres derivados del oxgeno. Mediante
este sistema, la melatonina fue reportada que ejerca su efecto removedor de
radicales libres cuando la concentracin de melatonina excedaa 0,25 mM.
(Reiter, 1997)
Posteriormente en 1993, (Tan y colaboradores, 1993) aportaron
nuevos datos experimentales acerca del papel de la melatonina como
antioxidante, esta vez usando otro sistema de ensayo. Aqu, radicales
hidroxilo (
?
OH) fueron generados durante la exposicin de H
2
O
2
a luz
ultravioleta a 254 nm, utilizando como asociador de radicales libres el
DMPO (5,5-dimetil-pirrolina-N-xido); la molcula resultante,
?
OH-
DMPO fue identificada mediante HPLC usando deteccin electroqumica y

espectroscopia de resonancia de spin electrnica. Con este sistema, la
melatonina fue comparada con otros removedores (scavengers) de radicales
libres, tales como glutation (GSH) y manitol. Curvas dosis respuesta
revelaron que la concentracin requerida para neutralizar 50% (IC
50
) de los
radicales libres generados fue de 21 M para la melatonina, 123 M para el
GSH y de 283 M para el manitol. Esto sin duda indicaba que la melatonina
era un removedor de radicales libres, ms efectivo que los dos anteriores.
Estudios posteriores de radilisis por pulsos y mtodos qumicos
adicionales, demostraron que la melatonina neutralizaba radicales
?
OH con
un alto grado de eficiencia. La tasa constante para la remocin de radicales
?
OH por melatonina se ha calculado en 2,7 x 10
10
M
-1
. S
1

Poeggeler y colaboradores en 1994, demostraron tambin que la
melatonina, basado en su prdida de fluorescencia, es rpidamente oxidada
en presencia de
?
OH. Los autores utilizaron una solucin de H
2
O
2
y FeSO
4

para generar
?
OH; el hierro en su estado ferroso (Fe
++
) por su parte, no fue
capaz de oxidar en forma eficiente a la melatonina; tampoco lo fue por el
H
2
O
2
. Cuando la riboflavina fue adicionada a la solucin de H
2
O
2
, el
agregado de melatonina condujo a una rpida oxidacin de la misma. Todos
estos resultados tomados en conjunto, permitieron a los investigadores
sealar que, por lo menos in vitro, la melatonina tiene la capacidad de
neutralizar en forma eficiente a oxidantes altamente reactivos mediante la
donacin de electrones (Poeggeler, 1994)

Pieri y su equipo de trabajo en el mismo ao 94, compararon la
actividad removedora de la melatonina de radicales perxido (ROO
?
) con la
del trolox (una forma hidrosoluble de vitamina E), vitamina C y GSH
(glutatin reducido). Utilizaron -ficoeritrina como indicador fluorescente y
el 2-2-azo-bis-dihidrocloruro - (2 amidopropano) como iniciador de
radicales ROO
?
. Encontraron que la melatonina fue ms eficiente como
removedor de radicales libres que el trolox, la vitamina C y el GSH
(melatonina>trolox>vitamina C>GSH). En base a tales resultados,
plantearon que la melatonina, dado que era dos veces mejor removedor de
radicales libres que el trolox, poda neutralizar cuatro ROO
?
por molcula
de melatonina (Pieri, 1994)
En 1995 Scaiano, us la excitacin mediante lser para iniciar el
clivaje de la molcula perxido de di-ter-butilo en dos radicales ter-butxilo
(Bu
t
O
?
); la melatonina una vez ms, fue capaz de neutralizar a estos
radicales generando radicales indolil a partir de la hormona. La tasa
constante para la interaccin de la melatonina con el radical ter-butxilo fue
calculado en 3,4 x 10
7
M
-1
S
-1
(Scaiano, 1995). En ese momento, dada la alta
reactividad de la melatonina con los radicales libres se apoy la idea que la
hormona era un excelente antioxidante in vivo.
An ms, en ese mismo ao el equipo de Poeggeler investig las
propiedades antioxidantes de la melatonina comparada de nuevo con el
trolox, la vitamina C y GSH utilizando el agente capturador de radicales
libres 2,2

-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-cido sulfrico (ABTS). Se


evidenci que la melatonina actuaba sinrgisticamente con los antioxidantes

tilicos y fenlicos en neutralizar el ABTS cuando ste era incubado con
H
2
O
2
y FeSO
4
. Se comprob adems que, la melatonina actuaba mediante la
donacin de electrones y en conjunto con los antioxidantes bloqueantes de
la cadena de accin de los radicales libres, para neutralizar el ABTS. Se
infiri de una vez que in vivo, donde la melatonina coexiste con tales tipos de
antioxidantes naturales, la misma pudiera interactuar cooperativamente en
los mecanismos de defensa antioxidantes celulares (Poeggeler, 1995) y
(Reiter, 1997)
En 1996 Marshall y colaboradores, utilizando ensayos in vitro,
establecieron que la melatonina era una excelente removedora de radicales
triclorometilperxilo (CCl
3
O
2
?
); encontraron tambin que aunque la
hormona reaccionaba con el cido hipocloroso HOCl), lo haca en forma
lenta. Sealaron adems que, la melatonina no remova radicales anin
superxido (O
2
?
) en forma directa (Marshall, 1996)
Posterior aestos trabajos, se realizaron muchos otros que postulaban
a la melatonina como poderoso agente antioxidante celular directo e
indirecto, que tena la propiedad removedora de radicales libres tanto in vitro
como in vivo. A la luz de tales hallazgos, surgieron numerosas crticas (y con
evidencias experimentales) de que, la melatonina no poda ser considerada
como un agente antioxidante celular. Estos investigadores que han refutado
las afirmaciones primeras, han mencionado que casi todas las molculas
orgnicas, en especial las aromticas (y la melatonina lo es), reaccionan con
los radicales
?
OH, as que est propiedad de la melatonina no la haca algo
especial. Era la naturaleza misma de la hormona.

Respecto a si es ms eficiente que las vitaminas E o C como
antioxidante, otro grupo de investigadores re-examinaron las evidencias y
concluyeron con variados grados de aseveracin que, la melatonina no
atrapaba directamente radicales perxilo o alcxilo y por ende, no es un
antioxidante de la misma clase que la vitamina E. Esta conclusin la
apoyaron en que, su estructura carece de un enlace dbil O-H o N-H capaz
de donar tomos de hidrgeno a un radical libre. Otros autores con postura
ms radical, han afirmado que la melatonina no es un removedor de
radicales libres, menos pudiera ser considerado un antioxidante celular.
Dadas estas circunstancias controversiales, a la importancia que cobra
cada da la hormona melatonina en sus diversos aspectos funcionales y a
que el autor del presente trabajo ha llevado por varios aos, lneas de
investigacin en el estudio del campo de los radicales libres y en el papel
funcional de la melatonina como hormona, es que se realiz la presente
investigacin, haciendo una exhaustiva revisin de la literatura acerca de los
mecanismos de accin bioqumicos de la melatonina, y con los trabajos
experimentales realizados contribuir con un poco de luz a la solucin de la
controversia planteada.





A.-Papel de los radicales libres en el proceso de salud y
enfermedad
Los radicales libres, molculas altamente reactivas con los diversos
componentes y sustratos celulares, han sido involucrados en un importante
nmero de patologas que afectan a los seres humanos, entre ellas
afecciones del sistema nervioso (enfermedades de parkinson y de
Alzheimer), trastornos cardiovasculares (cardiopatas isqumicas), aparicin
de neoplasias, diabetes mellitus, lesiones dermatolgicas, dao a la
estructura del ADN, procesos de isquemia-reperfusin tisular, enfisema
pulmonar y otras afecciones respiratorias, intoxicacin por distintas drogas y
txicos, lesiones oculares (catarata), en el mismo proceso de envejecimiento
celular, entre tantas afecciones que hoy da aquejan no slo al hombre, sino
a numerosos animales de la escala evolutiva (Tiskow, 1996) y (de Zwart,
1999)
El organismo cuenta con un importante grupo de sustancias que se
han denominado antioxidantes celulares, que nos protegen de la accin
nociva de los radicales libres. Estos antioxidantes pueden ser clasificados en
enzimticos (caso de la superxido dismutasa, la catalasa o la glutation
peroxidasa) o no enzimticos (como las vitaminas C y E, el glutatin
reducido, entre otros) y los mismos ejercen su accin neutralizando o
removiendo estos radicales generados a partir de molculas de oxgeno, la
mismade la cual depende toda la vida aerobia en el planeta.

Dado que no es el objetivo principal de este trabajo entrar en la
descripcin detallada del mecanismo de accin de los radicales libres, se
refiere al distinguido lector al Anexo No. 1 donde encontrar en detalle la
bioqumica de estos compuestos y la accin de las sustancias antioxidantes,
as como la descripcin del proceso de peroxidacin lipdica, uno de los
principales mecanismos de dao que sufre la clula al ser atacada por las
especies radicales derivadas del oxgeno molecular.
B.- Por qu la melatonina como antioxidante celular?
Segn la deduccin de varios investigadores y con las evidencias
experimentales correspondientes, la melatonina ya exista en los antiguos
organismos dinoflagelados (Gonyaulax polyedra) y en al menos dos especies
de bacterias. G. polyedra evolucion hace unos 2,5 millones de aos atrs,
cuando existan elevadas concentraciones de oxgeno en la atmsfera
terrestre. Es posible que la melatonina en estos organismos inferiores, haya
aparecido y evolucionado como un agente protector contra el dao causado
por el oxgeno y los radicales libres derivados, y que las funciones
adicionales como hormona hayan surgido a lo largo de la evolucin de las
especies. En bacterias y dinoflagelados, los niveles de melatonina son
elevados en la noche y bajos en el da; ahora, si la melatonina evolucion
como un agente antioxidante el hecho de por qu la produccin de esta
indolamina es mayor en la noche, requiere de profundas investigaciones.
Hay que recordar que los niveles de produccin de radicales libres son
mayores en el da, debido a la presencia de la luz solar y los rayos
ultravioleta, el estrs, la actividad en general y el mismo metabolismo

bioqumico. Esta regla tampoco se aplica aanimales de actividad nocturna
como las ratas (Poeggeler, 1991), (Manchester, 1995), (Tilden, 1997) y
(Reiter, 1997)
Un hecho importante de la accin de la melatonina como agente
neutralizador o removedor de radicales libres es que, no requiere de la
presencia de un receptor. Esta accin implica una funcin muy especial de
la hormona en cada clula y tejido del organismo, puesto que este indol
tiene una gran permeabilidad a travs de las membranas celulares debido a
su alta liposolubilidad.
Se pueden derivar de los estudios analizados que las propiedades
antioxidantes de la melatonina tiene 2 implicaciones:
a) La melatonina es capaz de proteger a las clulas del estrs oxidativo
causado por los radicales libres. Hay suficientes evidencias para confirmarlo.
Es cinco veces ms potente que el mismo glutatin, pero in vivo, la
melatonina es mucho menos abundante en las clulas y tejidos que los otros
antioxidantes naturales conocidos (vitamina E o C).
b) Si la melatonina acta como removedor de radicales libres in vivo, en cada
clula del cuerpo, debera esperarse que la hormona al mismo tiempo
interfiera con todos los mecanismos o procesos que conducen a la
generacin de los radicales libres, esto es, sntesis de prostaglandinas,
formacin de radicales a partir del xido ntrico, en la cadena respiratoria
mitocondrial, entre otros.

Y he aqu, la primera gran controversia surgida. Puede la
melatonina a las concentraciones fisiolgicas existentes en el
organismo, ser relevante en trminos de su capacidad antioxidante, o
slo los niveles farmacolgicos empleados hasta ahora en los ensayos
experimentales, ofrecer un grado de proteccin eficiente contra la
accin de los radicales libres?
Algunos autores que apoyan la hiptesis que la melatonina si se
comporta como un antioxidante celular, postulan que la misma pudiera
actuar mediante un sistema o mecanismo de amplificacin, tales como la
estimulacin por la melatonina de la expresin aumentada de otros sistemas
antioxidantes, o que la melatonina acte como una especie de gatillo para
la induccin de un amplio complejo de sistemas de defensa celulares contra
la accin de los radicales libres (Huether, 1996) y (Reiter, 2001)
Un grupo de investigadores se apoyan en el hecho que la melatonina
est presente en concentraciones muy importantes a nivel intestinal; en
estos rganos se produce en las clulas enterocromafines y luego liberada al
lumen intestinal, y en forma especial cuando su sntesis est aumentada (por
un aumento de su precursor el triptfano) tambin es liberada a la
circulacin portal y luego penetra la circulacin general. No est muy clara
an la presencia de estas grandes cantidades de melatonina en el intestino,
pero se ha propuesto que debe jugar un rol crucial como antioxidante
endgeno, protegiendo a los intestinos contra la accin de los radicales
libres, caso de intoxicaciones, procesos inflamatorios locales o irritaciones
locales (Huether, 1992) y (Huether, 1993)

Otros hallazgos experimentales han apoyado la hiptesis propuesta
de la accin de la melatonina como antioxidante celular, justamente por su
accin en patologas donde est bien definida la accin de los radicales
libres. En ratas, el dao heptico inducido por el carcingeno safrol, se
reduce con la administracin de melatonina (Tan, 1993). Un efecto similar
ha sido observado en linfocitos humanos sometidos a la accin de radiacin
ionizante in vitro(Vijayalaxmi, 1995). La melatonina se ha descrito, reduce la
incidencia de cataratas formadas en ratas recin nacidas despus de la
administracin de drogas que agotan el glutatin celular, y atena el nivel de
peroxidacin lipdica en ratas tratadas con el herbicida paraquat (Huether,
1996). Asimismo, el grado de estrs oxidativo despus de la administracin
de lipopolisacrido bacterial, una potente endotoxina que causa extenso
dao tisular, se ve atenuado por el suministro exgeno de melatonina
(Sewerynek, 1996)
Sin dudas, la propuesta accin antioxidativa de la melatonina merece
una discusin a fondo, con un basamento cientfico contundente que
permita esclarecer la controversial situacin. Para comprender mejor el
razonamiento que apoyan las evidencias a favor y en contra de que la
melatonina es un antioxidante celular, hay que abrir un espacio para
presentar una explicacin acerca de las caractersticas y acciones de un
antioxidante celular.
La oxidacin de cualquier compuesto orgnico por el oxgeno
molecular (peroxidacin lipdica si es un lpido la molcula atacada)
comienza por una reaccin de iniciacin donde se forma un compuesto

radical libre, altamente reactivo, con un electrn desapareado en su orbital
ms externo, luego de lo cual esta reaccin puede propagarse formando
otras especies radicales o finalizar gracias a la accin o la presencia de un
antioxidante (Halliwell Gutteridge, 1990) y (Antunes, 1999). Para detalles
referirse al Anexo 1, donde encontrar una descripcin detallada del
mecanismo de la peroxidacin lipdica.
Los antioxidantes retardan o neutralizan la accin de los radicales
libres. Se han dividido a los antioxidantes, en base a su mecanismo
bioqumico de accin, en dos grandes grupos segn (Ingold, 1968):
a) Antioxidantes Preventivos, que reducen la tasa de iniciacin de las
reacciones por radicales libres. De este tipo hay varias subclases de
antioxidantes, segn su mecanismo de accin.
a.1) Descomponedores de perxidos, que estequiomtrica o
catalticamente descomponen molculas de hidroperxidos a productos no
radicales, previniendo as la formacin de nuevas fuentes de generacin de
radicales libres que inicien nuevas reacciones

a.2) Desactivadores de iones metlicos, los cuales actan quelando un
electrn de metales redox-reactivos (caso del hierro y el cobre), retardando
la capacidad del metal de catalizar la formacin de molculas de
hidroperxidos.

b) Antioxidantes interruptores de la cadena de reaccin, que pueden
capturar una de las molculas de la cadena portadora de los radicales para
producir productos que no propagarn la reaccin o si la continan lo
hagan con baja eficiencia. Estos deben su actividad generalmente a su
capacidad de reducir radicales perxilo a compuestos ms estables. Los ms
efectivos de este grupo son los compuestos fenlicos y las diarilaminas, en
particular aquellos con enlaces O-H y N-H relativamente dbiles:

ROO
?
+ ArOH ROOH + ArO
?

ROO
?
+ Ar
2
NH ROOH + Ar
2
N
?


Antunes en su trabajo de investigacin enfatiza que, muchos
antioxidantes interruptores de la cadena de reaccin deben esta propiedad a
su capacidad de atrapar los radicales alquil-perxilos, que son muy poco
reactivos. El hecho que algn compuesto en particular reaccione con
radicales libres muy reactivos como el ?OH (hidrxilo), RO? (alcxilo) o
Cl
3
COO
?
(triclorometilperxilo), no significa que la molcula sea un
antioxidante del tipo que interrumpa la cadena de reaccin (Antunes, 1999).
La mayora de molculas orgnicas reaccionan muy rpidamente con el
radical
?
OH y casi tambin de forma rpida con los radicales RO
?
y
Cl
3
COO
?
. La caracterstica esencial de un antioxidante que interrumpe la
cadena de reaccin es que, debe donar su tomo lbil de hidrgeno a los

radicales alcoxi-perxilos, mucho ms rpido (= 100) de lo que el ROO
?
puede reaccionar con sus sustratos orgnicos, y que el radical formado no
sea capaz de continuar la reaccin de auto-oxidacin.
Quotrascaractersticassepueden agregar a lasya descritaspara postular que
una molcula sea un antioxidanterelevantein vivo?
Las pruebas que se han efectuado para examinar la posibilidad de que
un compuesto dado acte como antioxidante in vivo en forma directa,
pueden claramente demostrar que una accin de este tipo sea improbable.
En forma alternativa, pudiera demostrar que una accin antioxidante sea
factible en base a que el compuesto muestre una accin protectora a
concentraciones fisiolgicas, es decir, en el rango presente in vivo.
Cmo se puede probar entonces que un compuesto en
particular acta como un antioxidante in vivo?
Las evidencias que se tienen hasta el presente apoyan el papel
antioxidante de un compuesto in vivo, siempre que satisfaga estos 2
planteamientos:
a) Es el compuesto depletado o agotado bajo condiciones de estrs
oxidativo? Esto pudiera no suceder. La vitamina E y ciertos flavonoides
pueden ser reciclados por la presencia de cido ascrbico.
b) Si un antioxidante remueve radicales libres, es el antioxidante degradado
a productos cuya concentracin puede ser medida y demuestra as, un
aumento bajo condiciones de estrs oxidativo?

Otros dos puntos, con frecuencia olvidados, deben ser tomados
siempre en cuenta a la hora de valorar o catalogar la actividad antioxidante
de una molcula dada:
.-Una sustancia debera ser verificada experimentalmentesiempreen lasconcentracionesa
la quesehaya disponiblein vivo.
.-Al ensayar molculas antioxidantes en particular, sedeberan utilizar radicales libres
biolgicamenterelevantes.
Como corolario a los planteamientos efectuados, 4 preguntas son
fundamentales de responder cuando se evala una sustancia como
antioxidante celular:
1.- Sobre qu sustancia acta para ejercer su papel protector antioxidante?
El antioxidante alcanza ese blanco in vivo?
2.- Cmo protege? Acaso, remueve radicales libres, previene su formacin
o acta reparando el dao causado.
3.- Si el antioxidante propuesto acta en la remocin de radicales libres,
pueden los productos derivados del antioxidante por s mismo, causar dao
celular?
4.- Puede el antioxidante causar dao en otros sistemas biolgicos? Se
deben plantear siempre estudios toxicolgicos.


C.- Qu caractersticas bioqumicas de la melatonina han
permitido postular a esta molcula como antioxidante celular?
Los hallazgos hasta ahora presentados sugieren que la hormona
remueve y detoxifica selectivamente oxidantes altamente reactivos por lo
menos in vitro, donando un electrn a estos compuestos electroflicos. El
radical catin indolil formado a partir de la reaccin de transferencia de un
electrn y oxidacin parcial de la indolamina, es entonces rpidamente
convertida a kinuramina en presencia del radical anin superxido.
Como se aprecia, los estudios han sido efectuados la gran mayora de
ellos in vitro, lo que a juicio de muchos autores no hace de la melatonina una
candidata ideal para ser postulada como antioxidante celular.
Una ventaja de la melatonina sobre otros compuestos antioxidantes
como la vitamina C, es que la misma tiene la capacidad de atravesar las
membranas celulares con mucha facilidad (liposuble) y muestra adems,
cierta solubilidad acuosa, propiedad que no posee la vitamina E. Siendo una
molcula anfiflica, la melatonina puede proteger contra el dao inducido
por radicales libres, limitando los mismos a nivel de membrana celular,
protenas citoslicas y el propio ADN nuclear. Otro punto de inters que se
ha descrito con la melatonina, es que ella puede ser reciclada tanto por el
cido ascrbico como por el cido rico. Esto refuerza una de las
interrogantes arriba planteadas: su eficiencia (Reiter, 2000) y (Reiter, 2001)

Ya se ha mencionado en varias oportunidades que, la melatonina tiene
la capacidad de remover radicales libres del tipo
?
OH con un alto grado de
eficiencia. Tambin se ha evidenciado que es capaz de neutralizar una
variedad de compuestos intermediarios derivados de los radicales,
reduciendo as la destruccin macromolecular. La melatonina puede
neutralizar molculas de H
2
O
2
, de oxgeno singlete (
1
O
2
), de xido ntrico
(NO
?
), aniones peroxinitritos (ONOO?) y sus metabolitos.
Adicionalmente, se ha identificado que la melatonina acta en forma
sinrgica con otros antioxidantes en la destoxificacin de radicales libres.
Esto apoya la idea que la hormona pudiera actuar como un removedor
directo e indirecto de radicales libres (Yi-Zang, 1998) y (Reiter, 2000)
En 1998 se identific un producto intermediario de la interaccin de
la melatonina con dos radicales hidrfilos: la 3-OH-melatonina cclica. La
misma puede ser detectada en orina y su concentracin vara
circadianamente y con el status oxidativo del organismo. Se ha considerado
as que, la 3-OH-melatonina (3-OHM) en orina puede ser considerado
como un biomarcador de la generacin de radicales
.
OH in vivo, y pudiera
ser un indicador clnico til del status oxidante de un individuo en
presencia de enfermedades relacionadas con la produccin de radicales
libres (Tan, 1998)
Otra evidencia general a favor de la melatonina es que, por lo menos a
dosis farmacolgicas empleadas en los ensayos, la hormona tiene la
capacidad de incrementar los niveles de ARNm o las actividades de las

principales enzimas antioxidantes (superxido dismutasa, catalasa, glutatin
peroxidasa). Otros datos apoyan el hecho que, el incremento nocturno de la
hormona est correlacionado con un aumento en los niveles de enzimas
antioxidativas. La importancia relativa de estas acciones indirectas de la
melatonina estn sujetas hoy da a intensa investigacin (Reiter, 2000)
D.- Acciones protectoras de la melatonina en su papel de
antioxidante a nivel de rganos y tejidos corporales.
1.- Sistema nervioso central. Este sistema en particular es muy
susceptible a dao tisular por una variedad amplia de agentes biolgicos.
Este hecho se complica an ms debido a que las neuronas no regeneran o
tienen poca capacidad de hacerlo in vivo, conduciendo a lo largo de la vida a
una significativa prdida en el nmero de las mismas. Esta reduccin en el
nmero neuronal y en las interconexiones sinpticas, eventualmente
compromete el funcionamiento integral del sistema nervioso.
De todos los rganos y sistemas, ste es uno de los ms susceptibles
al ataque causado por los radicales libres; las razones para ello son diversas.
El cerebro, aunque constituye slo un 2% del peso corporal total en el
humano, consume una gran cantidad de oxgeno inhalado (un 20%). Dado
que los subproductos derivados del oxgeno son txicos, no es
sorprendente que el tejido neural pueda ser daado a una relativa mayor tasa
que otros rganos. El cerebro tambin posee regiones con altas
concentraciones de hierro y vitamina C, adems de importantes cantidades
de cidos grasos poli-insaturados que son proclives a la peroxidacin.

(Halliwell Guterridge, 1990) Considerando lo anterior, se debera esperar
que el cerebro contase con un complemento adicional de antioxidantes;
pero este no parece ser el caso, y ms bien tiene una baja capacidad para
resistir agresiones oxidativas.
Un hecho interesante es que se ha descrito poca o ninguna
reactividad directa de la melatonina con el H
2
O
2
. Las dos enzimas
implicadas en la remocin de H
2
O
2
son la catalasa y la glutatin peroxidasa.
La actividad catalasa dentro del cerebro se considera tiene mnima influencia
como mecanismo antioxidante a causa de su baja actividad tisular. La
glutatin peroxidasa, la cual requiere de selenio como cofactor, juega un rol
antioxidante muy importante a causa de que remueve molculas de H
2
O
2

cuando oxida glutatin reducido (GSH) a su forma GSSG (Reiter, 1998).
Las pruebas son claras en el sentido que la actividad de la glutatin
peroxidasa es estimulada por la melatonina administrada exgenamente, no
slo en cerebro sino en otros rganos. La actividad glutatin reductasa
tambin es estimulada por melatonina, lo que permite regenerar GSH. De
igual forma, la enzima glucosa 6-fosfato dehidrogenasa se ve estimulada por
la accin de la melatonina. De esta forma, la hormona estimula la actividad
de tres enzimas que intervienen en la remocin de H
2
O
2
de las clulas
convirtiendo la molcula en productos menos txicos, protegiendo las
clulas neuronales del dao oxidativo (Reiter, 1998) y (Reiter, 2001)
La melatonina tambin es efectiva en reducir los niveles de
peroxidacin lipdica cerebral. Un agente que con frecuencia se ha utilizado
para inducir la peroxidacin de cidos grasos poli-insaturados en cerebro, es

el kainato (cido kainico). Esta sustancia es un anlogo no degradable del
aminocido excitatorio glutamato, muy txico a ciertas estructuras neurales,
tales como hipocampo y corteza frontal. Estudios recientes han
puntualizado que la melatonina reduce el dao inducido por el kainato en el
ADN de clulas piramidales del hipocampo. Igual efecto se observa cuando
homogenizados de rebanadas de corteza cerebral son incubadas con
kainato; en este caso, los niveles de malondialdehdo y 4-hidroxialquenales
(4-HDA), productos de la lipo-peroxidacin, se incrementaron
drsticamente, pero en presencia de melatonina (0,1 a 4 mM), y de manera
dosis-dependiente, se redujeron los niveles de estos subproductos en
regiones como corteza cerebral, hipocampo, cuerpo estriado (Reiter, 1997)
El estudio ms complejo realizado acerca del uso potencial de la
melatonina como antioxidante en la Enfermedad de Parkinson, proviene de
Miller y colaboradores. La prdida de neuronas dopaminrgicas
nigroestriadas que ocurre en esta patologa, envuelve la accin de los
radicales libres citotxicos, derivados de la auto-oxidacin de la dopamina,
como la dopamina-3,4-dihidro-fenetilamina. Utilizando la capacidad de
absorbancia de radicales libres derivados del oxgeno, Miller hall que la
melatonina contrarresta el incremento en la oxidacin de la protena
fluorescente -ficoeritrina, inducida por la accin de la dopamina o su
precursor L-Dopa (3,4-hidroxifenilalanina). La disminucin de la oxidacin
de la -ficoeritrina fue tomada como evidencia clara que la melatonina es
capaz de remover radicales libres generados durante la auto-oxidacin de la

dopamina, y que la hormona puede ser un agente protector contra la
degeneracin celular dopaminrgica (Miller, 1996)
La retina ocular de vertebrados posee una alta tasa de consumo de
oxgeno, unas 7 veces ms que cualquier otro tejido. Este elevado consumo
y el alto nmero de mitocondrias presentes en las clulas retinianas, pueden
conducir en un momento dado a la produccin de cantidades importantes
de radicales libres; adems, las membranas celulares de fotorreceptores,
clulas fundamentales de la retina, son ricas en cidos grasos poli-
insaturados y la exposicin de este tejido a la luz comnmente conduce a su
foto-oxidacin. Estas caractersticas de la retina la hacen muy vulnerable al
dao por auto-oxidacin. Aunque la retina posee mecanismos de defensa
antioxidantes en cantidades importantes, en relacin a otros tejidos,
cualquier desbalance de stos puede, y de hecho ocurre con el
envejecimiento, afectar severamente al tejido y causar lesiones a veces
irreversibles. Hay que recordar tambin que la retina es otro de los tejidos
que produce cantidades importantes de melatonina. Cuando se utilizaron
homogenizados de retina de ratas albinas, las cuales se incubaron a 37C, un
aumento progresivo en las concentraciones de MDA y 4-HDA fue
observado. Al adicionar melatonina a la mezcla de reaccin (0,1 a 2 mM), el
aumento en los niveles de perxidos lipdicos fue significativamente
disminuido en una forma dependiente de la concentracin de la hormona.
Los autores propusieron que la melatonina actuaba removiendo radicales
libres o regenerando biomolculas deficientes en electrones, donndoles un
electrn a los mismos (Dun-Chen, 1995)

Por otro lado, en ratas recin nacidas tratadas con 1-Butionina-S-R-
Sulfoximina (BSO), un inhibidor de la produccin de glutatin, el
suministro de melatonina previno la formacin de cataratas oculares,
demostrndose que la melatonina tiene la capacidad de reducir el dao por
estrs oxidativo protegiendo no slo a los lpidos, sino tambin a las
protenas (Dun-Chen, 1995)
2.-Sistema gastrointestinal. En vescula biliar, la melatonina
funciona como inhibidor en la produccin de clculos biliares, proceso que
inclusive se piensa es mediado por radicales libres (Shiesh, 2000). Otros
interesantes estudios han demostrado los efectos protectores de la
melatonina sobre la toxicidad oxidativa sobre el hgado. Hay experimentos
muy claros que involucran a los radicales libres en el dao que se produce al
tejido heptico en situaciones de isquemia-reperfusin. Este tipo de lesin
se ve disminuido cuando el tejido es previamente perfundido con
melatonina (Sewrynek, 1996). En un modelo experimental utilizando ratas, a
las cuales se les indujo isquemia por 40 minutos, seguido de 60 minutos de
reperfusin, marcados cambios oxidativos fueron observados en el tejido,
incluyendo niveles elevados de malondialdehdo (MDA) y 4-HDA,
incrementada infiltracin de leucocitos, disminucin de los niveles de
glutatin reducido y aumentados de glutatin oxidado, con disminucin de
la actividad de la enzima glutatin reductasa. Para cada uno de los
parmetros sealados, los cambios fueron contrarrestados
significativamente por la inyeccin de melatonina (10 mg/ kg. peso), unos 15

minutos previos a la isquemia, y otra dosis al momento de reperfundir el
tejido (Sewrynek, 1996)
A nivel de intestino grueso, al inducir colitis en ratones por el
suministro de sulfato de sodio-dextrano (SSD) disuelta en el agua de beber,
la inyeccin diaria de melatonina redujo la severidad de las lesiones
inflamatorias del colon, evaluada por la presencia de diarrea, sangre oculta
en heces y lesiones de la mucosa intestinal. El SSD induce el sobre-
crecimiento de Escherichia coli en intestino, lo cual produce el
lipopolisacrido bacteriano, la endotoxina causante de las lesiones (Pentney,
1995). Otros ensayos han demostrado que la melatonina estimula la
actividad de la enzima glucosa 6-fosfato-dehidrogenasa heptica en ratones,
incrementando la biodisponibilidad de NADPH y la conversin de GSSG a
GSH mediante la glutatin reductasa (Pierrefiche, 1995)
En el aparte anterior, ya se describi que el intestino delgado
produce concentraciones importantes de melatonina, lo cual ha sido
indicativo de la probable accin antioxidante de esta hormona a ese nivel.
Otros estudios han demostrado que la melatonina minimiza los
efectos diabticos causados por aloxano a nivel de pncreas endocrino. Al
compararla con el conocido antioxidante hidroxitolueno butilado (BHT), se
evidenci que ste tena mayor propiedad antioxidante que la melatonina.
Es posible en este caso, que la hormona combine una actividad antioxidante
intrnseca in vivocon aquella de su metabolito heptico, la 6-OH-melatonina.
Esto ltimo basado en la hiptesis de que la vida media corta de la

melatonina en el organismo, despus de su administracin intraperitoneal
(20 a 30 minutos), se corresponde al perodo de latencia observado entre la
inyeccin de la hormona y la de aloxano (Pierrefiche, 1993)
3.-Piel. En trabajos recientes utilizando un test para verificar la
capacidad de la melatonina para modificar la respuesta eritematosa de la piel
humana expuesta a exposicin a luz ultravioleta (UV), Bangha y su equipo
reportaron una reduccin en el grado de enrojecimiento (estimado por
cromometra e inspeccin visual) en aquellos sujetos quienes utilizaron
melatonina aplicada tpicamente en un gel no coloidal. Las concentraciones
utilizadas de melatonina fueron de 0.05, 0.1 y 0.5 %. Los autores proponen
una accin removedora de radicales libres generados por accin de la luz
UV a nivel de piel (Bangha, 1996)
4.- Otras acciones antioxidantes a nivel celular.
Relativamente se tienen pocos datos acerca de la accin protectora de
la melatonina a protenas celulares, las cuales son susceptibles de dao
oxidativo. Experimentos efectuados tanto in vivo como in vitro, han
demostrado que las protenas son protegidas de la accin de los radicales
libres cuando en el ensayo se encuentra presente la melatonina. Esto es
compatible con la nocin que la hormona tambin previene la disminucin
en las actividades de enzimas antioxidativas en los casos de estrs oxidativo
(Reiter, 2000)
Autores como (Tan, 1993) reportan proteccin al ADN nuclear por
parte de la melatonina, cuando se administra a los animales experimentales

carcingenos tipo safrol. La fragmentacin del ADN inducida con lipo-
polisacrido bacterial (LPS), se reduce al ser suministrada la melatonina en
dosis farmacolgicas, indicado por el recuento de clulas sanguneas
perifricas y mdula sea.
Se ha descrito que el dao oxidativo a alguna base en el ADN nuclear
es usualmente transferido a la guanina, puesto que su potencial de oxidacin
es relativamente bajo en relacin a las otras bases del ADN. La melatonina
es capaz de reparar el radical guanosina formado (G
?
), presumiblemente va
de la transferencia de un electrn y con un alto grado de eficiencia. Se ha
propuesto que la melatonina actuara como molcula reparadora del ADN
en horas nocturnas, cuando sus niveles son ms altos, y cuando las
concentraciones nucleares de la hormona son mayores referentes a los
niveles hallados en sangre u otros compartimientos subcelulares (Prior,
1995) y (Reiter, 2000)
Otros estudios muy interesantes, han mostrado que la adicin de
FeCl
3
, ADP y NaDPH decrecen la fluidez de la membrana microsomal en
hgado de ratas, cuantificado por el ndice de polarizacin y de anisotropa, e
incremento en los niveles de MDA y 4-HDA. Existe una relacin inversa
entre fluidez de membrana y los parmetros de polarizacin y anisotropa.
La pre-incubacin de microsomas hepticos con melatonina a la
concentracin de 300 M o superior, increment significativamente la
fluidez de esta membrana subcelular y redujo los niveles de MDA y 4-HDA
en comparacin a las muestras que no contenan la hormona pineal. A
concentraciones de 3 mM de melatonina se previno por completo la rigidez

de la membrana. De esta manera, la melatonina se ha postulado ejerce un
efecto estabilizante sobre la membrana celular (Poeggeler, 1994)
Otras investigaciones utilizando tamoxifeno, una droga
antiestrognica utilizada en el tratamiento del cncer de mama, en
combinacin con la melatonina (150-200 M), fueron capaces de reducir los
niveles de peroxidacin lipdica y la rigidez de la membrana celular inducida
por especies radicales libres, en microsomas hepticos de ratas Sprague-
Dawley. El modo se accin que se propuso para la melatonina es que,
aumentara la actividad o respuesta del tamoxifeno, previniendo la rigidez de
la membrana. Hecho importante que se comprob tambin es que, cuando
microsomas hepticos fueron pre-incubados con la melatonina en ausencia
de agentes inductores de estrs oxidativo, an a elevadas concentraciones de
la hormona, no alter la fluidez de la membrana en forma significativa. El
tamoxifeno se ha reportado, causa disminucin en la fluidez en liposomas,
presumiblemente duplicando el efecto rigidificante del colesterol. Esto
tambin apoya la idea que, la adicin de la hormona a la solucin con
tamoxifeno retorn la fluidez de la membrana a los niveles basales, quizs
los ptimos para este tipo de membrana (Garca, 1997) y (Garca, 1998)





Con las evidencias presentadas, los investigadores que han
propuesto que la melatonina puede actuar como un agente
antioxidante celular, y los que critican tal punto de vista, se apoyan
sobre la base que:
.-La melatonina es ms un antioxidante de tipo preventivo, de la subclase
desactivadora demetales inicos. Por lo menos, los datos experimentales in vitro
apuntan a que es cierto lo anterior para sistemas homogneos y dispersiones
lipdicas-acuosas heterogneas. Es probable que la melatonina forme un
enlace coordinado simple con el ion metlico; este enlace lo hara con el
tomo de hidrgeno del anillo nitrogenado de la melatonina. Por ello,
algunos autores la han considerado un antioxidante de menor potencia que
del tipo preventivo, queladores de metales inicos (Antunes, 1999)
.-Seha reportadotambin quela melatonina pudiera actuar en forma sinergstica
con otros compuestos atrapadores de radicales libres, tales como la vitamina C,
vitamina E y glutatin en un sistema que tenga un alto contenido de H
2
O
2
y
Fe
+2
. Los antioxidantes que funcionan por el mismo mecanismo de
remocin de radicales libres, tienen un efecto aditivo simple cuando son
usados en conjunto en un sistema determinado. Una verdadera accin
sinrgica entre dos antioxidantes requerira que ellos funcionen por distintos
mecanismos, lo cual explicara que la melatonina no clasifique como
atrapador de radicales libres en este sistema. Se propone ms bien que se
comporte como un retardador de los sistemas de auto-oxidacin en
presencia de iones metlicos.

.-Otros autores han propuesto que es improbable que esta supuesta
accin retardadora de los sistemas de auto-oxidacin, envuelva la
transferencia de electrones desde la melatonina a los radicales perxilo a
causa de que el proceso de retardacin fue observado, no slo en
dispersiones acuosas de lpidos (donde es favorecido el proceso), sino
tambin en soluciones homogneas (donde es ms bien desfavorecido)
(Antunes, 1999)
.-Es la opinin de la mayora de investigadores que propugnan que la
melatonina no puede ser considerada un antioxidante celular que, las
concentraciones de melatonina utilizadas en todos los estudios sobre
propiedades antioxidantes son farmacolgicas, mucho ms elevadas que las
halladas en el plasma sanguneo y cualquier otro tejido (Maestroni, 1996) y
(Antunes, 1999)
.-Estudios bioqumicos realizados con los precursores de la
melatonina, esto es, triptfano y serotonina, as como un nmero
importante de sus derivados oxidativos, han establecido que poseen una
importante actividad antioxidativa, algunos ms que la propia melatonina.
Esta actividad esta basada en la estructura indlica de las molculas, las
cuales tambin atrapan radicales libres, dando lugar a estructuras con
resonancia estabilizada sobre el anillo pirrlico y no ocasionando stos,
efectos dainos a nivel celular. Concluyen los autores que la melatonina no
pareciera ser un antioxidante de relevancia en comparacin con la actividad
mayor que presenta su precursor indlico la serotonina, o el principal
metabolito heptico la 6-OH-melatonina, cuyas estructuras difieren de la

hormona por slo un grupo hidrxilo en la posicin seis. La 6-OH-
melatonina puede transferir con mayor facilidad el hidrgeno fenxilo de su
estructura. Otros autores exponen el hecho que el grupo hidrxilo fenlico
estara intra-molecularmente ligado al grupo 5-metoxi, y los fenoles con
tales enlaces de hidrgeno tienen aumentadas las entalpas de disociacin del
enlace O-H y as, reducidas las reactividades hacia los compuestos radicales
libres. Es de inters sealar que, aquellas estructuras que poseen grupos
hidrxilos en su conformacin qumica, incrementan su propiedad
antioxidante en forma significativa, mientras la deshidrogenacin produce el
efecto opuesto (Pierrefiche, 1993) y (Fowler, 2003)
.-Se ha mencionado que la melatonina no posee dentro de su
estructura, un enlace dbil O-H o N-H capaz de donar un tomo de
hidrgeno a un radical lipdico tipo perxilo.
.-Muchos autores objetan que la melatonina pueda ser una molcula
removedora o atrapadora de radicales libres, pero la qumica brinda
sorpresas todos los das y la melatonina pudiera ser considerada
prximamente como un nuevo tipo de antioxidante, no clasificado dentro
de los esquemas bioqumicos actuales.




Con la intencin de contribuir al esclarecimiento de las controversias
surgidas respecto al papel antioxidante de la melatonina, el autor del
presente trabajo ha querido exponer en el mismo, resultados experimentales
que ha obtenido a lo largo de varios meses de estudio acerca del papel de la
melatonina como posible agente protector contra la accin de los radicales
libres generados en condiciones patolgicas o experimentales.
En primer lugar, se presentarn los resultados obtenidos en una serie
de ensayos realizados en el Decanato de Medicina de la Universidad
Centroccidental Lisandro Alvarado de Barquisimeto a principios del ao
2004, estudiando el posible papel protector de la melatonina contra la
accin de radicales libres generados en la diabetes mellitus. Posteriormente,
se expondrn los resultados obtenidos en una serie de experimentos
realizados en el Laboratorio de Bioenergtica Celular del Instituto
Venezolano de Investigaciones Cientficas en Altos de Pipe, a finales del
ao 2004 utilizando como modelo biolgico glbulos rojos irradiados con
luz ultravioleta, en los cuales se valor el efecto protector de la melatonina.






E.- Evaluacin del estrs oxidativo en ratas con diabetes
mellitus tipo I inducida por estreptozotocina: posible papel protector
de la melatonina


Reportes efectuados por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
en 1999, han establecido que la diabetes mellitus es una de las enfermedades
metablicas crnicas de mayor tendencia de aparicin de nuevos casos
clnicos en los seres humanos, con una prevalencia actual de 5 a 10% entre
la poblacin mundial, y a juicio de un grupo notable de investigadores
proponen que en la misma, los radicales libres derivados del oxgeno juegan
un papel crucial como subproductos nocivos a los tejidos afectados. Dada la
importancia de lo sealado anteriormente, se propuso como objetivo central
el analizar el papel que juegan estas molculas como agentes inductores del
estrs oxidativo evaluando adems, el posible papel protector que pudiera
jugar la hormona melatonina como agente antioxidante. Los objetivos
especficos planteados fueron los siguientes:
.-Evaluacin de algunos parmetros fisiolgicos como peso corporal y
volumen excretado de orina en 24 horas en ratas con diabetes mellitus tipo I
.-Evaluacin de los niveles de glicemia en ratas con diabetes mellitus tipo I.
.-Determinacin de niveles de peroxidacin lipdica en rebanadas de corteza
de riones de rata con diabetes mellitus tipo I.

Trabajo experimental desarrollado por el autor en la Unidad de Investigacin en Fisiologa. Decanato


de Medicina de la UCLA. Barquisimeto. 2004

.-Identificacin del posible efecto protector de la melatonina como agente
antioxidante en este tipo de afeccin.
En la diabetes mellitus, la hiperglicemia constituye la principal
manifestacin de enfermedad y est implicada en la aparicin de las diversas
complicaciones que se presentan asociadas con la misma, entre ellas, un
grupo heterogneo de disfunciones clnicas que afectan el sistema nervioso,
el sistema cardiovascular, el rin, la retina, el cristalino del ojo y la propia
piel. Los seres humanos diabticos tienen 25 veces mayor probabilidad de
contraer ceguera, 20 veces ms riesgo de amputaciones y de 6 a 10 veces
ms riesgo de padecer enfermedades de las arterias coronarias que los
sujetos sanos. Esta situacin de desequilibrio comienza en una etapa
temprana de la enfermedad, tal como se ha demostrado en varios estudios.
Estos desequilibrios por lo general comienzan con trastornos bioqumicos a
nivel celular.

En los recientes estudios de las causas implicadas en la aparicin de la
diabetes mellitus y la aparicin de sus complicaciones, se ha demostrado que
altos valores de glucosa en sangre conducen a la aparicin del estrs
oxidativo. Las teoras que vinculan el estrs oxidativo con la diabetes
mellitus plantean que la hiperglicemia per sees esencial en el desarrollo de
las complicaciones derivadas de esta enfermedad. Una de tales teoras se
fundamenta en el hecho de que la glucosa en solucin acuosa es capaz de
autooxidarse a ciertos compuestos llamados enedioles, en presencia de
metales de transicin como el hierro (Fe
+3
) reducindolo a (Fe
+2
), a travs

de la denominada Reaccin de Fenton, y descompone el perxido de
hidrgeno (H
2
O
2
) generando el radical libre inestable hidrxilo (OH
?
), que
posee alto poder oxidante (Clapes, 2001), (Nuez, 2001) y (Kiersztan, 2004)
Por otro lado, los productos finales de la glicosilacin de protenas
(PFG) tambin generan radicales libres de oxgeno y stos, con su elevado
poder oxidante afectan las membranas celulares y lipoprotenas circulantes,
las cuales contienen productos de peroxidacin altamente dainos a las
clulas. Estos productos de la glicosilacin de protenas aumentan el estrs
oxidativo, afectando funciones biolgicas de suma importancia, necesarias
para mantener la integridad de los tejidos vascular, nervioso, renal, entre
otros (Nue, 2001). El estrs oxidativo pudiera ser una va comn que
relacione los mecanismos fisiopatolgicos en apariencia diversos, pero que
convergen en la explicacin del papel que desempea el incremento en los
radicales libres y los productos de la peroxidacin lipdica en la explicacin
de la fisiopatologa de la diabetes mellitus y sus complicaciones.
Para el desarrollo de la investigacin se seleccionaron por azar simple,
un total de 24 ratas adultas blancas, hembras, de la cepa Sprague-Dawley,
suministradas por el Bioterio Central de la Universidad Centroccidental
Lisandro Alvarado, las cuales fueron divididas en dos grandes grupos
(cada sub-grupo conformado por 6 animales) (n=6):

GrupoControl:
.-Animales Control (C) (n=6)
.-Animales Control inyectados con melatonina (C+M) (n=6)

GrupoExperimental:
.-Animales Experimentales con diabetes mellitus tipo I sin suministro
de melatonina (D-M) (n=6)
.-Animales Experimentales con diabetes mellitus tipo I con
suministro de melatonina (D+M) (n=6)

Los animales una vez recibidos del Bioterio Central, fueron
colocados en forma individual en jaulas metablicas (los cuatro subgrupos),
en el Bioterio que funciona en las instalaciones del Decanato de Medicina, y
dejados los mismos por una semana para su adaptacin a las condiciones
ambientales de este lugar; recibieron alimentacin y agua ad libitum.

A la semana, todos los animales fueron pesados para obtener los
pesos corporales iniciales de referencia y medidos los volmenes de orina
excretados en 24 horas. De igual manera, se les tom una muestra de sangre
(obtenida de la punta de la cola de cada rata) para medirles los niveles de
glucosa basal, como ndice de referencia. Al dcimo da, a los animales de
los grupos Control (C+M) y Experimentales (diabetes mellitus con
suministro de melatonina) (D+M), se les comenz a suministrar va intra-
peritoneal (cavidad abdominal), una dosis de 4 mg/ animal de la hormona
melatonina (suministrada por la empresa Sigma Chemical) diluida en
solucin fisiolgica, hasta el final de los ensayos experimentales. A partir del
da once, a los doce animales que se les inducira diabetes mellitus tipo I
(grupos D-M y D+M), se les inyect va intra-peritoneal, una dosis de 40
mg/ Kg peso corporal de la droga Streptozotocina (proporcionada por

Sigma Chemical) por 5 das consecutivos para inducir la diabetes mellitus
tipo I. Cumplido el tratamiento con Streptozotocina, se tom una nueva
muestra de sangre de las colas de las ratas para verificar los niveles de
glicemia y de esta manera, comprobar que la droga indujo la diabetes en los
animales experimentales.

Cumplidos los protocolos anteriores, a todos los animales (grupos
controles y experimentales) desde el da 15 se les comenz a medir cada tres
das y hasta el final de los ensayos:
.-Peso corporal
.-Volumen de orina excretado en 24 horas
.-Niveles de glucosa en sangre
.-Niveles de peroxidacin lipdica renal al final de los experimentos.

De acuerdo a los resultados obtenidos y la aplicacin de los anlisis
estadsticos (clculo de la media aritmtica y la desviacin estndar, y para la
determinacin de la significancia estadstica el test de Anlisis de Varianza
de una va ANOVA-) se disearon cuadros y grficos, los cuales muestran
los resultados para cada una de las dimensiones analizadas en el laboratorio,
esto es, peso corporal, volumen de orina excretado en 24 horas y niveles de
glicemia y de peroxidacin lipdica en rebanadas de corteza renal, tanto en
las ratas controles como experimentales. A continuacin se presentan los
resultados obtenidos:


? Peso de los Animales: para la determinacin de los pesos de los
animales controles y experimentales, se utiliz una balanza especial para
pesaje de animales de experimentacin (Ohaus Instrument)

Como se puede observar en el Grfico y Cuadro nmero 1 que, mientras
los animales de los grupos control (C) y los inyectados con melatonina
(C+M) experimentaron ligeras variaciones de peso pero, con tendencia al
incremento del mismo, los animales experimentales inyectados con
Estreptozotocina y convertidos en diabticos tipo I, tratados o no con la
hormona melatonina, experimentaron una tendencia significativa a
disminuir su peso hasta en un 20% respecto a los animales controles. El
hecho que los animales controles que solo recibieron melatonina
incremntaran su peso, pudiera explicarse debido a que esta hormona es
inductora del sueo, lo que se evidenciaba cuando los animales permanecan
en su mayor parte en reposo, con poco ejercicio dentro de la jaula,
alimentndose ad libitumcon la respectiva ganancia de peso.










Grfico No. 1
Parmetro Fisiolgico Analizado: Peso (g)
C C+M D-M D+M
0
50
100
150
200
250
300
350
Control (C)
Control + Melatonina(C+M)
Diabticas - Melatonina(D-M)
Diabticas + Melatonina (D+M)
Grupo
P
e
s
o

(
g
)
Cuadro No. 1. Pesos de los animales controles y experimentales
(en gramos)
Grupo Peso de los animales (g)
C 276 8
C + M 308 8*
D M 264 12
D+ M 258 25
Los valores representan el promedio D.E de 6 determinaciones
(* P < 0.0001 respecto a C)


Los animales experimentales diabticos tipo I, tratados o no con
melatonina, disminuyeron sus pesos progresiva y significativamente en
referencia a los controles (P < 0.0001) desde el primer da de la inyeccin de
la droga estreptozotocina hasta el final de la fase experimental, indicando
esto que la melatonina no influy sobre la conservacin del peso de los
animales diabticos. Se debe recordar que en la diabetes mellitus el
metabolismo proteico, lipdico y glucido se halla muy alterado lo que explica
la prdida significativa de peso en estos animales.

? Volumen de Orina Excretado: la disminucin de los volmenes de
orina excretado en los animales controles y experimentales se realiz
basndose en la medicin del volumen de orina producido por cada animal
en 24 horas.

Ntese en el Grfico y Cuadro nmero 2, que los volmenes de orina
excretados en 24 horas por los animales diabticos, tratados o no con
melatonina, fueron significativamente superiores al de los animales
controles (P< 0.002). Esto se explica por el hecho que los sujetos diabticos
presentan lo que se denomina poliuria, es decir excesiva produccin y
eliminacin de orina, motivado a que los niveles de glucosa circulantes en
sangre son muy elevados, y cuando esta glucosa pasa por los riones para
ser filtrada y reabsorbida, el exceso de glucosa es excretado por orina y
debido a que por razones osmticas la excrecin excesiva de glucosa
arrastra agua consigo, se produce la eliminacin abundante de orina. Este
aumento en la excrecin de lquido coincidi con incrementos importantes

en la ingesta de lquidos por estos animales experimentales (datos no
cuantificados)

? Niveles de Glicemia: como se desprende del anlisis del Grfico y
Cuadro nmero 3, los animales diabticos que no recibieron la hormona
melatonina presentaron cifras elevadas de glucosa circulante en sangre, pero
si se comparan con los animales que si recibieron la hormona, se puede
apreciar que este ultimo grupo, aunque present cifras elevadas de glicemia,
las mismas fueron significativamente menores respecto a los no tratados
con melatonina (P< 0.003), lo que indica claramente que la melatonina
ejerce algn efecto protector disminuyendo los niveles de glucosa en sangre
en animales diabticos.

? Niveles de Peroxidacin Lipdica en rebanadas de corteza de
riones de rata controles y experimentales: Como se puede observar en
la Tabla No. IV, los niveles de peroxidacin lipdica, cuantificados como
Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbitrico (SRAT) (ver Anexo 2 para
detalles del procedimiento experimental), se incrementaron en forma
significativa en aproximadamente un 25% en homogenizados totales de
rebanadas de corteza riones de ratas diabticas no tratadas con melatonina
(D-M), respecto a los riones control (C) o los tratados con la hormona
(C+M). Es de destacar que, en los homogenizados de corteza renal de ratas
diabticas y tratadas con melatonina (D+M), los niveles de peroxidacin
lipdica, aunque fueron un poco ms elevados respecto a los controles,


Grfico No. 2
Parmetro Fisiolgico Analizado: Volumen de orina (ml)
C C+M D-M D+M
0
15
30
45
60
75
90
105
120
Control
Control + Melatonina
Diabticas sin Melatonina
Diabticas con Melatonina
Grupo
V
o
l
u
m
e
n

d
e

O
r
i
n
a

(
m
l
)

Cuadro No. 2. Volmenes de orina excretados en 24 horas de los
animales controles y experimentales (en mililitros)
Grupo Volmen de Orina (ml)
C 2.02 0.71
C + M 2.70 0.73
D M 83 62*
D+ M 79 60*
Los valores representan el promedio D.E de 6 determinaciones
(* P < 0.002 respecto a C y C+M)



Grfico No. 3
Parmetro Bioqumico Analizado: Nivel de Glicemia (mg/dl)
C C+M D-M D+M
0
100
200
300
400
500
Control
Control + Melatonina
Diabticas sin Melatonina
Diabticas con Melatonina
Grupo
N
i
v
e
l
e
s

d
e

G
l
i
c
e
m
i
a

(
m
g
/
d
l
)


Cuadro No. 3. Niveles de Glicemia de animales controles y
experimentales (mg/ dl)
Grupo Nivel de Glicemia (mg/ dl)
C 80 6.5
C + M 76 6.8
D M 393 49*
D+ M 276 86*
Los valores representan el promedio D.E de 6 determinaciones
(* P < 0.003 respecto a C y C+M)


TABLA IV
Niveles de peroxidacin lipdica en rebanadas de corteza de
riones de animales controles y experimentales
(nmoles MDA/ mg prot.)

Grupo Nivel de Peroxidacin Lipdica
(nmol MDA/ mg prot)
C 5.59 0,60
C + M 4,90 0.45 *
D M 12,45 2.40
D+ M 7,75 0.36

Los valores representan el promedio D.E de 3 determinaciones

P < 0.02 respecto a (C)
P < 0.01 respecto a (C)
* P < n.s. respecto a (C)










fueron significativamente menores que los de riones de ratas diabticas no
tratadas con la melatonina.

En base a los resultados obtenidos en este trabajo, se pudo evidenciar
que la hormona melatonina suministrada a los animales diabticos aunque
no logr prevenir la disminucin de peso y el incremento de los volmenes
urinarios en los mismos, si se apreci que la melatonina logr evitar la
elevacin drstica en los niveles de glucosa en sangre en animales que
recibieron la hormona en referencia a aquellos que no fueron tratados con la
misma (comparar resultados en el grfico y cuadro nmero 3). De igual
manera, la melatonina fue capaz de prevenir el incremento sustancial en los
niveles de peroxidacin lipdica en riones de rata diabticas (homogenizado
de corteza renal) respecto a las no tratadas con esta hormona producida por
la glndula pineal. En los animales control inclusive, la melatonina no tuvo
efectos secundarios reflejados, bien sea en la elevacin o en la disminucin
de los niveles de perxidos lipdicos, por lo menos a estas dosis
farmacolgicas utilizadas en el presente trabajo.

De esta manera, se evidencia que la melatonina pudiera estar
ejerciendo un efecto protector o antioxidante en los animales que recibieron
la estreptozotocina y se convirtieron en diabticos, previniendo la elevacin
sustancial en los niveles de glucosa en sangre y aminorando el dao causado
por la oxidacin de esta sustancia cuando circula en elevados niveles en el
organismo. Hay evidencias suficientes en cuanto a que la melatonina
estabiliza las membranas celulares, protege a lpidos y al ADN nuclear, de

forma tal que puede ser considerada una molcula que tiene efectos
protectores contra el dao oxidativo causado por los radicales libres. Se
plantea as una nueva perspectiva que deber ser considerada en el futuro
inmediato por los investigadores biomdicos, tanto para conformar estudios
ms controlados y rigurosos como para valorar una medida teraputica
adicional en la clnica mdica.

F.- Niveles de peroxidacin lipdica en fantasmas de glbulos
rojos sometidos a radiacin ultravioleta, tratados o no con
melatonina


Este otro estudio fue realizado en la fecha comprendida entre los
meses de Octubre y Noviembre del ao 2004, en las instalaciones del
Laboratorio de Bioenergtica Celular del Centro de Biofsica y Bioqumica
del IVIC, Altos de Pipe, mediante un trabajo conjunto entre ese laboratorio
y la Unidad de Investigacin en Fisiologa del Decanato de Medicina de la
UCLA de Barquisimeto.
Al igual que otros tipos de antioxidantes, caso de la vitamina E, se ha
descrito que la melatonina es capaz de proteger a la clula contra posibles
reducciones en la fluidez de la membrana plasmtica celular y procesos
asociados a la peroxidacin lipdica. En otras palabras, sera capaz de ejercer
efectos estabilizantes sobre la membrana celular. Trabajos muy interesantes

Trabajo experimental realizado en el Laboratorio de Bioenergtica Celular. Centro de Biofsica y


Bioqumica. IVIC. Altos de Pipe. Ao 2004

han demostrado que, la melatonina debido a su propiedad de liposolubilidad
e hidrosolubilidad, puede difundir a travs de la membrana plasmtica
ejerciendo sus efectos antioxidantes a ese nivel. Se han efectuado ensayos
donde se evidencia que la hormona tiene diferentes valores de movilidad y
accesibilidad a liposomas de fosfatidilcolina (PC) (el fosfolpido ms
predominante en las membranas celulares de mamferos) inmersos en
soluciones conteniendo generadores de radicales libres, lo cual pudiera
involucrar un consumo diferencial de la melatonina por los radicales libres y
productos de la peroxidacin lipdica. Resultados presentados por los
investigadores muestran que, un 35% de la melatonina (concentracin de 30
M) incorporada hacia liposomas unilamelares difunde hacia la fase acuosa.
La actividad antioxidante tambin fue evaluada cuando los radicales libres se
generaron en la fase lipdica; para ello, concentraciones variables de
melatonina (10 a 250 M), fueron incorporadas en 10 mM de liposomas de
PC de soya multilamelares. A concentraciones de 10 M, la melatonina fue
poco efectiva, mientras que a concentraciones de 50 a 250 M caus efectos
antioxidantes variables (Livrea, 1997)
Estos interesantes experimentos reflejan la idea que la melatonina
puede actuar como antioxidante a nivel intramembranoso, reduciendo los
niveles de peroxidacin de los fosfolpidos de la membrana, sobre todo
aquellos ricos en cidos grasos insaturados. Es conocido tambin el efecto
de la radiacin ultravioleta sobre diversos componentes celulares, entre ellos
la propia membrana plasmtica (Halliwell-Guterridge, 1989). En este ensayo
se utilizaron glbulos rojos humanos, para valorar el posible efecto

protector de la melatonina contra de la peroxidacin de los lpidos de
membrana de este tipo de clulas.
? Obtencin de muestras de sangre:
Para la realizacin de estos experimentos in vitro, se obtuvieron
glbulos rojos de adultos masculinos sanos, mediante la extraccin de 10 ml
de sangre venosa, que fueron colocados de inmediato en un tubo de ensayo
con heparina. Para la preparacin de los fantasmas de glbulos rojos se
sigui el siguiente procedimiento.
? Preparacin de fantasmas de glbulos rojos:
Se lav la sangre heparinizada por 3 veces con una solucin de NaCl
al 0,9% (140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 0C) hasta quedar el
sobrenadante transparente. Luego se centrifug a 10.000 rpm en
ultracentrifuga refrigerada por una sola vez. El plasma y la capa de glbulos
blancos eran removidos por aspiracin. Los glbulos rojos empaquetados
fueron resuspendidos en una solucin salina como la descrita. Se procedi a
hemolizar con 9 volmenes de una solucin hipo-osmtica 17 mM Tris-
HCl pH: 7,5 y 0,1 mM EDTA por 10 minutos (solucin de hemlisis).
Posteriormente, se centrifug y lav a 20.000 rpm por espacio de: 20, 15, 10
y 5 minutos respectivamente hasta obtener los fantasmas de glbulos rojos,
es decir, clulas sin ningn contenido de hemoglobinaen su interior. Esto
es, un precipitado de color crema, constituido por membranas de
eritrocitos. Obtenidas estas preparaciones, eran de inmediato congeladas a
una temperatura de -70C hasta su utilizacin.

? Procedimientos experimentales:
Las preparaciones obtenidas de fantasmas de glbulos rojos fueron
utilizadas para ensayar la capacidad antioxidante de la melatonina, y para ello
las membranas de glbulos rojos eran sometidas a irradiacin ultravioleta,
con o sin la adicin de la melatonina en el medio de incubacin.
Se emple el mtodo de (Kako et al., 1988), para lo cual una alcuota
de 250 l de la suspensin de fantasmas (con una concentracin de protena
entre 0,6 y 0,8 mg/ ml) fue colocada en un vial de vidrio (40 mm x 25 mm),
el cual se encontraba dentro de un vaso de precipitado con hielo. A este vial
se le agregaba segn corresponda, 1 mM de melatonina, 30 minutos antes
de la irradiacin con luz ultravioleta. Las membranas eran entonces
iluminadas por espacio de 30 minutos con una lmpara UV Mineralight
(USA), situada a una distancia de 4 cm de la preparacin, a una longitud de
onda de 254 nm. El espesor de la suspensin no era mayor de 1 mm.
Una vez cumplido el anterior procedimiento, se proceda a
determinar de inmediato los niveles de Sustancias Reactivas al Acido
Tiobarbitrico (SRAT) de acuerdo al mtodo de (Feix et al., 1991). A tubos
de centrfuga se les agregaba 50 l de hidroxitolueno butilado (BHT) (50
mM); 750 l de cido tricloroactico al 10% y, 250 l de la suspensin de
membranas (tratadas o no con melatonina), las cuales haban sido lavadas
previamente en 10 ml de buffer fosfato 10 mM, centrifugadas a 48.000 x g y
resuspendidas en 1 ml del mismo buffer. Los tubos as preparados se
mantenan sobre hielo a una temperatura de 4C, por aproximadamente 10

min. Luego se proceda a centrifugar a 1500 rpm en centrifuga clnica por 10
min. Y se tomaban despus, 500 l del sobrenadante y se colocaban en
tubos de vidrio, en donde se les aadan 250 l del reactivo de cido
tiobarbitrico al 0,5%. De inmediato, los tubos eran colocados en un bao
de agua hirviente por 15 min. Transcurrido ese tiempo, se dejaban enfriar a
temperatura ambiente. Se determinaba su absorbancia a una longitud de
onda de 532 nm, contra un blanco tratado de igual forma, pero que no
contena la suspensin de membranas. En cada caso, se preparaba al
instante, una curva de calibracin usando como estndar el 1,1-3,3-
tetrametoxipropano (TMP). Los resultados son expresados como
nanomoles de malondialdehdo por miligramo de protena (nM MDA/ mg.
prot). En todos los casos, la determinacin de protenas se realiz mediante
el mtodo de (Bradford, 1976). Los anlisis estadsticos se realizaron
mediante el empleo del Student t test.
? Resultados obtenidos:
Como se desprende del anlisis de la Tabla No. V, la melatonina por
s sola, no tiene algn efecto sobre los niveles de peroxidacin lipdica en
membranas de glbulos rojos cuando se comparan con los valores controles
comparar [(C+MLT) con (C)]. Cuando los fantasmas de glbulos rojos
fueron irradiados con luz UV por 30 minutos, sin la adicin previa de
melatonina, los valores de SRAT se incrementaron en casi 5 veces respecto
a los controles [comprese (C + UV) con (C)]

Al tratar previamente las membranas con la hormona melatonina y
luego ser sometidas a irradiacin con luz UV, puede notarse que los valores
disminuyeron significativamente respecto a aquellas membranas que no
recibieron el pre-tratamiento con melatonina, compare [(MLT +UV) con el
grupo (C + UV)]
Dado que, el hidroxi-tolueno-butilado (BHT) es un excelente
antioxidante utilizado comnmente in vitro, y el mismo est incluido en la
solucin de determinacin de niveles de SRAT en este procedimiento
experimental, se procedi a realizar un ensayo usando el BHT como
probable antioxidante, pre-incubndolo 30 minutos antes con las
membranas de glbulos rojos, previo a la irradiacin con luz UV,
comparando as la efectividad de esta sustancia antioxidante con la
melatonina. La concentracin de BHT empleada fue 50 mM. Los resultados
presentados en la TablaV muestran que el BHT efectivamente previene el
incremento en los niveles de SRAT, pero hay que tener en cuenta que las
dosis utilizadas fueron 50 veces superiores a las empleadas para la
melatonina.






TABLA V
Niveles de peroxidacin lipdica en membranas de glbulos rojos
sometidas o no a radiacin ultravioleta (UV), tratadas o no con
melatonina (MLT) o hidroxi-tolueno-butilado (BHT)
Condicin Niveles de Malondialdehdo (nM MDA/ mg prot.)


(C) 0,39 0,02
(C + UV) 1,84 0,27
(C + MLT) 0,42 0,06
(MLT + UV) 0,94 0,14 &
(C + BHT) 1,10 0,17
(BHT + UV) 0,92 0,01 *
Datos procesados con paquete estadstico GraphPad Prism 3.02 for windows
Los datos son expresados como la media E.S. obtenida de una serie de 3 ensayos
p < 0.005 respecto a(C)
& p < 0.020 respecto a (C)
p < 0.03 respecto a (C+ UV)
* p < n.s. respecto a (C + BHT)


Es conocido que alteraciones en la estructura qumica de las
membranas celulares, debido a la formacin de enlaces covalentes cruzados
entre lpidos y protenas, o entre lpidos adyacentes, causado por el proceso
de peroxidacin lipdica, y la reduccin en la relacin de cidos grasos
insaturados/ saturados, son causas de la disminucin de la fluidez de las
membranas. La irradiacin con luz UV es causa directa del incremento en
los niveles de peroxidacin lipdica detectados en los fantasmas de glbulos
rojos, con las alteraciones descritas anteriormente. La melatonina como
molcula que neutraliza el proceso de peroxidacin lipdica, tambin debe
prevenir la rigidez de la membrana inducida por el estrs oxidativo. Estos
resultados obtenidos con fantasmas de glbulos rojos apoyaran la nocin
que, la melatonina hace ms resistente la membrana al dao peroxidativo.
En este caso, trabajando con un sistema biolgico in vitro, esto es,
fantasmas de glbulos rojos que no poseen los mecanismos enzimticos
antioxidantes en su interior, se pudo comprobar que la melatonina, aparte
que pudiera ejercer un efecto indirecto, estimulando los mecanismos de
defensa antioxidantes propios de la clula, tambin acta directamente
estabilizando la membrana celular al nivel ptimo.





G.- Otras acciones de la melatonina en el organismo
Desde hace varios aos se conoce que durante el proceso de
envejecimiento celular, existe un incremento en la produccin de radicales
libres derivados del oxgeno, concomitante con una reduccin en la
actividad de las enzimas antioxidantes. Sucede tambin que durante el
envejecimiento existe una declinacin progresiva en los niveles de
melatonina circulantes y alteraciones en el propio ritmo circadiano
(Huether, 1996). Numerosos son los ensayos que han descrito que la
melatonina suministrada exgenamente, tiene efectos inmuno-
estimulatorios, oncostticos y rejuvenecedores en roedores seniles,
previniendo la degeneracin celular, la desdiferenciacin y carcinognesis.
Asimismo, hay evidencias que postulan que la melatonina retrasa el inicio de
enfermedades relacionadas con el envejecimiento (Pierpaoli-Regelson, 1996)
Autores como (Sainz, 1995) han demostrado que, la apoptosis
inducida y la que ocurre en forma espontnea, es retardada por el
tratamiento previo con melatonina. Este grupo de trabajo encontr que la
apoptosis normal en el timo de rata, estuvo reducida cuando los animales
eran tratados con dosis diarias de hasta 500 g/ kg peso en edades
comprendidas entre 25 y 65 das. La adicin de melatonina al medio de
cultivo con timocitos (10
-9
M o 10
-7
M) redujo la muerte celular programada
en un 20% y 35% respectivamente. Concluyeron los autores que,
probablemente la melatonina en estos estudios no protegi directamente al
ADN nuclear removiendo radicales libres prximos a esta estructura, sino
que la hormona actu de manera indirecta envolviendo la remocin de

radicales libres, alterando los mecanismos de sealizacin, los cuales inician
los eventos apoptticos (Sainz, 1995)
Papolla y col. en 1997, estudiando clulas apoptticas de
neuroblastoma murino tipo N2a y utilizando protena -amiloide
(constituyente de las placas seniles en pacientes con Alzheimer) para su
induccin, concluyeron que en este modelo experimental in vitro, la
melatonina fue muy efectiva en reducir apoptosis en esta lnea celular.
Estudios muy recientes efectuados por un equipo de investigadores
venezolanos de la Universidad del Zulia, han demostrado que la melatonina
reduce los eventos apoptticos y post-necrticos en riones con falla renal
aguda, de ratas tratadas con cloruro de mercurio y en los cuales el estrs
oxidativo es evidente (Nava, 2000)










IV.- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

En los estudios realizados in vivo en el presente trabajo, se encontr
que la melatonina a las dosis farmacolgicas empleadas, efectivamente reduce
los niveles de peroxidacin lipdica que se presentan a consecuencia de la
generacin de radicales libres derivados del oxgeno en el desarrollo de la
diabetes mellitus. En los ensayos realizados in vitro, utilizando como modelo
biolgico membranas de glbulos rojos, la melatonina tambin fue efectiva
para prevenir o reducir el dao peroxidativo inducido por la radiacin
ultravioleta.

En los reportes publicados por diversos investigadores y que fueron
expuestos en el presente trabajo, ms los resultados obtenidos por este autor,
no deja lugar a dudas que la hormona melatonina ejerce un efecto protector
contra la peroxidacin de los lpidos de la membrana celular. Recurdese que
la destruccin de los cidos grasos poli-insaturados de los fosfolpidos
integrantes de las membranas, compromete el funcionamiento celular y por
ende, el normal funcionamiento de los tejidos corporales. Puesto que la
melatonina es altamente liposoluble, cabe esperar que la misma difunda sin
problemas a travs de la membrana e inhiba el proceso peroxidativo a ese
nivel.





Cul sera el mecanismo bioqumico de accin de la melatonina?
Podran postularse tres considerandos:
La melatonina podraactuar:
a) Directamente, removiendo los radicales libres generados.
b) Indirectamente, estimulando la produccin de enzimas antioxidativas.
c) Ejerciendo efectos inmunomodulatorios
Con respecto a la primera opcin, se ha comprobado su efecto
removedor o neutralizador de radicales libres; inclusive, se han efectuado
estudios comparativos entre diversas sustancias y la melatonina,
evidencindose que la hormona realmente es ms eficaz que otros
componentes o sustratos antioxidativos para ejercer un efecto antioxidante.
Una caracterstica fundamental de la melatonina es su gran liposolubilidad e
hidrosolubilidad. Un punto de debate que contina y deber esclarecerse
prontamente, es el de las dosis empleadas de melatonina para los diversos
ensayos que se han realizado a lo largo de los aos incluyendo el presente
trabajo. Las cantidades de melatonina que se suministran causan que los
niveles sanguneos excedan en varias veces, los niveles fisiolgicos.
Recurdese que los niveles de la hormona en horas nocturnas, alcanza
valores en el rango de 100-150 pg/ ml en plasma; con los niveles dados en
los experimentos, es probable que estos niveles plasmticos se eleven en
varias veces los fisiolgicos; una gran ventaja de la melatonina, es que no

posee efectos colaterales txicos, por lo menos a corto plazo. Esta primera
opcin explicara, las acciones como antioxidante de la melatonina en
glbulos rojos sometidos a radiacin UV, neutralizando los radicales libres
generados durante tal proceso. Tambin en los estudios efectuados en ratas
con diabetes mellitus inducida por la Estreptozotocina, la accin
removedora de radicales libres fue evidente, aunque los experimentos deben
ser ampliados y un mayor nmero de rganos debe ser examinado.
Respecto a la segunda opcin, se ha demostrado que la melatonina
tambin tiene la capacidad de estimular las defensas antioxidantes propias
de la clula. Hay dos enzimas relacionadas al sistema defensivo antioxidante
del organismo, que al parecer son reguladas por el ritmo circadiano
endgeno impuesto por la melatonina. Estas enzimas son estimuladas por la
hormona en horas nocturnas, incrementando los niveles de ARNm de
superxido dismutasa y glutatin peroxidasa (Reiter, 1997). Esta opcin se
descarta para los ensayos efectuados in vitrocon los glbulos rojos, ya que al
ser hemolizados y naturalmente carecer de ncleo, no cabe la posibilidad de
estimulacin de este tipo de sistema antioxidativo.
En lo referente al efecto inmuno-estimulatorio, hay resultados que
dan prueba de ello; para lograr este efecto se requieren que los tratamientos
sean efectuados a largo plazo. Se necesitarn mayor cantidad de ensayos
para corroborar la inmuno-estimulacin por la melatonina y su relacin con
la capacidad antioxidante del organismo (Huether, 1996)

En opinin de muchos investigadores, la melatonina debido a sus
propiedades y estructura bioqumica, puede ser catalogada como un dbil
antioxidante in vivo, ms an con las concentraciones a las que se le
encuentra en los fluidos corporales. Muchos autores la han catalogado
como una molcula que puede retardar la auto-oxidacin en sistemas libres
de metales inicos (Fe
++
, Cu
++
), o ser un antioxidante preventivo de la
subclase desactivador de metales inicos. Tambin tiene la capacidad de
actuar en forma sinrgica con otros antioxidantes celulares (Antunes, 1999),
(Reiter, 2000) y (Hayter, 2004)
El que la melatonina pueda ser clasificada como una molcula
antioxidante, requerir de muchas ms investigaciones en el campo; debe
quedar claro que la melatonina es una hormona producida por la glndula
pineal y otros tejidos del cuerpo, diseada para cumplir una funcin crucial,
cual es el control y sincronizacin de los ritmos biolgicos. El autor del
presente trabajo concluye que, an es muy temeroso proponer que la
melatonina deba ser incluida como una sustancia antioxidante celular
dentro de los esquemas actuales. Se necesitan ms ensayos experimentales
tanto in vivocomo in vitropara poder obtener conclusiones ms slidas. No
hay duda de la capacidad neutralizadora o removedora de radicales libres
que posee la hormona; las evidencias lo demuestran, pero para que una
sustancia sea catalogada como antioxidante debe cumplir y satisfacer una
serie de requisitos que ya fueron presentados en detalle y con anterioridad
en este mismo trabajo. Ello debe ser demostrado fehacientemente.

La melatonina tiene sus ventajas farmacolgicas; posee una muy baja
toxicidad aguda, es de fcil administracin, es muy econmica, no induce
efectos colaterales indeseables, es bien tolerada en todas las edades, no se
han evidenciado interacciones con otros medicamentos y no produce
dependencia, lo que resulta til y todo ello sugiere que posee un enorme
potencial para ser incluida dentro de la terapia contra los radicales libres
producidos en diversas patologas.

Hay ms interrogantes que respuestas. La atencin pblicase sigue
centrando en los efectos benficos reportados de la melatonina, sobre todo
como retardador del envejecimiento, como sustancia anti-tumoral, para
combatir el insomnio y contra muchas otras patologas, incluyendo la
remocin de radicales libres. Mientras tanto, la melatonina se sigue vendiendo
sin prescripcin mdica y est al alcance de las personas en los estantes de los
establecimientos expendedores de medicina de todo el mundo ?











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ANEXO 1
Bioqumica y Mecanismos de Accin de los Radicales Libres
Un radical libre (R?) constituye una molcula o fragmento molecular
que contiene uno o ms electrones no apareados en su orbital ms externo.
Una molcula puede convertirse en radical libre tanto por ganancia como por
prdida de electrones, y tambin por fisin de enlaces homolticos. Cuando un
enlace covalente se rompe simtricamente, ambos fragmentos retienen un
electrn, y por tanto, se convierten en radicales libres. El estudio de los
radicales libres se ha enfocado desde el punto de vista mdico y biolgico, ya
que las interacciones de los radicales libres con molculas orgnicas han sido
implicadas en un gran nmero de estados patolgicos, los cuales pueden jugar
un papel significante en el dao tisular (de Zwart, 1999) y (Tiskow, 1996). Los
radicales libres han sido detectados por mtodos como la resonancia de spin
del electrn o mtodos ms sofisticados como el atrapamiento del spin del
electrn (Spin Trapping) (Southorn, 1988)

Muchos organismos requieren del oxgeno para su sobrevivencia, en
donde el oxgeno es utilizado por las clulas para oxidar compuestos
orgnicos. El oxgeno molecular (O
2
) acta como elemento oxidante al
aceptar hasta cuatro electrones en su orbital ms externo (reduccin
tetravalente) para dar lugar a dos molculas de agua:
O
2
+ 4H
+
+ 4e
-
2 H
2
O [1]

El oxgeno tambin puede sufrir reduccin univalente, divalente o
trivalente (al aceptar uno, dos o tres electrones) dando lugar a la formacin de

especies activadas de oxgeno. Los productos respectivos son: radical anin
superxido (O
2
?
), el intermediario perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) y el radical
hidrxilo (OH
?
):

e
-
e
-
e
-
e
-

O
2
O
2
?
H
2
O
2
2OH
?
2H
2
O [2]

Estas especies activadas tienen la particularidad de que pueden
reaccionar con relativa facilidad con sustratos endgenos de las clulas.

La reduccin univalente del oxgeno fue descrita en el ao de 1931 por
(Haber y Willstatter, 1934). En otro orden de ideas, (Haber y Weiss, 1935)
describieron que la reduccin secuencial trivalente del oxgeno molecular, en
combinacin con un catalizador en presencia de hierro, daba lugar a la
produccin de intermediarios oxigenados muy reactivos que eran especies
fuertemente oxidantes. La importancia biolgica de este descubrimiento tuvo
que esperar hasta 1969 cuando (McCord y Fridovich, 1959) identificaron una
enzima, la superxido dismutasa, que cataliza la produccin de perxido de
hidrgeno (H
2
O
2
) a partir del anin superxido (O
2
?
)

A lo largo de la evolucin, mientras las clulas desarrollaban los
mecanismos de utilizacin de oxgeno, desarrollaban simultneamente
mecanismos de defensa contra la toxicidad del mismo. Un incremento o una
disminucin significativa del oxgeno disponible para las clulas, resulta en

alteraciones bioqumicas profundas, las cuales pueden culminar en dao
estructural e inclusive hasta la muerte celular (Halliwell, 1987)

Se han descrito numerosos mecanismos bioqumicos celulares
responsables de la generacin de radicales libres:

1. Las mitocondrias, peroxisomas y microsomas celulares, producen estos
compuestos aunque en cantidades muy pequeas (1 a 2 % de los radicales
libres generados por las clulas). Las mitocondrias y sus sistemas de transporte
de electrones son el sitio de mayor oxidacin celular, donde se promueve la
reduccin tetravalente del oxgeno hasta agua (ver ecuacin 1). La reduccin
del oxgeno hasta agua por la enzima Citocromo C Oxidasa mitocondrial
envuelve una transferencia de cuatro electrones con ningn radical libre
intermediario. Menos del 1 % del flujo de electrones resulta en produccin de
radical superxido (Cadet, 1988)

2. La autooxidacin de catecolaminas. En ciertos procesos, como la
isquemia cerebral, hay liberacin regional de noradrenalina y dopamina -
hidroxilasa de las terminaciones nerviosas en la zona de isquemia. Las
catecolaminas son degradadas por la enzima monoamino-oxidasa (MAO), y
ello envuelve un paso oxidativo con produccin de un exceso de electrones.
El oxgeno, sobre todo al darse el proceso de reperfusin, puede actuar como
agente aceptor de electrones y producir algunos radicales hidrxilo y perxido
de hidrgeno (Ikeda, 1990)

3. Los neutrfilos activados poseen una enzima, la nicotinamida adenina
dinucletido fosfato oxidasa (NADPH oxidasa), responsable de la produccin
del radical anin superxido (Weiss, 1982):

NADPH
oxidasa
2O
2
+ NADPH ---------- 2O
2
?
+ NADP
+
+ H
+
[3]

Tambin, los neutrfilos, poseen una mieloperoxidasa, la cual genera el
radical ClO
?
Al reaccionar con perxido de hidrgeno:

Cl
?
+ H
2
O
2
ClO
?
+ H
2
O [4]

4. El cido araquidnico puede ser metabolizado por ciclooxigenasas o
por lipooxigenasas, produciendo diversas sustancias con propiedades
vasoactivas, entre ellas: prostaglandinas, trombxano, prostaciclina,
leucotrienos (Samuelson, 1983)

5. La oxidacin de hipoxantina y xantina a cido rico catalizada por la
xantina oxidasa, est acoplada a la reduccin del oxgeno molecular a anin
superxido (McCord, 1985):

xantina + H
2
O
2
+ 2O
2
cido rico + 2O
2
?
+ 2H
+
[5]


6. Otras probables fuentes de radicales libres son la radiacin ionizante,
como la radiacin ultravioleta, productos de la reaccin de drogas y toxinas
con sustratos celulares, contaminantes atmosfricos, fotosensibilizadores, y
productos de la combustin de materia orgnica (Bulkley, 1983)

En condiciones normales, las clulas cuentan con mecanismos de
proteccin, enzimticos y no enzimticos, contra los radicales libres. Entre los
mecanismos celulares de proteccin enzimticos se cuentan:

a) La enzima superxido dismutasa (SOD). La misma se encarga de la
reaccin de dismutacin del radical anin superxido intracelular. La enzima,
perteneciente a la familia de metaloenzimas, cataliza la conversin del anin
superxido a perxido de hidrgeno ms oxgeno a travs de la siguiente
reaccin:

SOD
O
2
?
+ O
2
?
+ 2e
-
+ 2H
+
------- H
2
O
2
+ O
2
[6]

La superxido dismutasa se ha encontrado en varias formas activas;
una conteniendo manganeso, la cual se encuentra en la matriz mitocondrial y
otra conteniendo cobre y zinc, la cual se localiza en el citoplasma (McCord
1981)

b) La catalasa y la glutatin peroxidasa (GP), conforman el principal
sistema intracelular de catlisis del perxido de hidrgeno. El mayor peligro de

la presencia de H
2
O
2
es la produccin del radical OH
.
, que es una especie
oxidante muy reactiva e inestable. La produccin de radicales OH
?
se realiza a
travs de la reaccin de Haber-Weiss en presencia de un agente quelante
metlico, o por intermedio de la reaccin de Fenton:

Fe
3+
+ quelante
H
2
O
2
+ O
2
?
--------------------- O
2
+ OH
?
+ OH

(Haber-Weiss)
H
2
O
2
+ Fe
2+
complejo intermedio Fe
3+
+ OH
?
+ OH
-
(Fenton)

El radical OH
?
Es muy inestable y reacciona con una variedad de
compuestos orgnicos y con componentes diversos de las membranas
biolgicas. En condiciones normales, no se producen o no existen
concentraciones importantes de radicales hidrxilo y no existe sistema
enzimtico capaz de remover cantidades excesivas de este tipo de compuesto,
de all la importancia de la catalasa y la glutatin peroxidasa en la remocin del
H
2
O
2
intracelular. A bajas concentraciones de H
2
O
2
, ste es removido por la
glutatin peroxidasa, en presencia de glutatin reducido (GSH) el cual es
oxidado hasta glutatin oxidado (GSSG):


2 GSH + H
2
O
2
GSSG + 2H
2
O [9]




A altas concentraciones de H
2
O
2
, la catalasa se vuelve primordial en su
remocin:


2 H
2
O
2
O
2
+ 2H
2
O [10]

Entrelos mecanismos celulares no enzimticos de proteccin contra
los radicales libres, se cuentan:

a) El a-tocoferol o vitamina E, que se le ha descrito como antioxidante de
la fase lipdica, ya que por ser liposoluble, se particiona con mucha facilidad
hacia las membranas y transforma especies reactivas como los radicales
hidrxilo o perxilo en componentes menos reactivos. Acta donando H
+
al
radical y por tanto, confinando el efecto del radical; en adicin se produce una
forma de radical estable de vitamina E (Halliwell-Gutteridge, 1989).

b) El cido ascrbico o vitamina C, antioxidante de fase acuosa, lacual se
localiza en altas concentraciones en ciertos rganos, especialmente en el ojo
(Halliwell, 1986). A este compuesto se le ha reconocido por mucho tiempo,
que posee propiedades antioxidantes y protege contra daos oxidativos a
aceites de origen vegetal, grasas animales, alimentos conteniendo grasas, tales
como leche, pescados, margarinas, entre otros. Estas funciones de la vitamina
C son mayormente derivadas de sus propiedades Redox. El compuesto acta
donando hidrogeniones al radical libre, transformandose el cido ascrbico
(AH
2
) en cido dehidroascrbico (A), con la concomitante formacin del

radical ascrbilo (A
?
) como intermediario, molcula que acta como un
radical libre, pero que es normalmente mantenido a una baja concentracin en
el plasma. Se ha demostrado que la vitamina C suprime la oxidacin de
liposomas de fosfatidilcolina de soya y membranas de fantasmas de eritrocitos
en dispersiones acuosas, oxidacin inducida por radicales libres. Por el
contrario, se ha notado que la vitamina C no suprime en forma eficaz, como
lo hace la vitamina E, radicales dentro de las regiones lipdicas de las
membranas (Halliwell-Gutteridge, 1989)

c) Ceruloplasmina, protena circulante portadora de cobre, puede actuar
como antioxidante extracelular (Halliwell, 1986)

d) Otros: Cistena, Manitol, Alopurinol, Tiourea, Hidroxitolueno-butilado,
Desferroxamina, Dimetilsulfxido, Dimetiltiourea, Fosfatidilcolina de soya,
entre otros (Tiskow, 1996)

? El Proceso de Peroxidacin Lipdica:

El ataque a los fosfolpidos de membrana por los radicales libres se
centra fundamentalmente en el proceso de peroxidacin lipdica de los
residuos de cidos grasos de los fosfolpidos.

Se considera que el proceso de peroxidacin lipdica ocasiona cambios
en la composicin qumica y deterioros en la organizacin ultraestructural de
las membranas celulares, disminuyendo la fluidez de las mismas, alterando su

permeabilidad e inactivando receptores y enzimas unidas a la membrana.
(Halliwell-Guteridge, 1989), (Tiskow, 1996)

El proceso de peroxidacin lipdica como tal es complejo y puede
entenderse como un mecanismo por el cual los lpidos insaturados reaccionan
con el oxgeno para producir hidroperxidos lipdicos:

LH + O
2
LOOH [11]
donde LH es un lpido y LOOH es el hidroperxido resultante.

El mecanismo intrnseco de peroxidacin lipdica puede describirse
como sigue: la reaccin es iniciada por el ataque de radicales libres, los cuales
sustraen un tomo de hidrgeno de un carbono metileno en la cadena lateral
de un cido graso de un fosfolpido (ver Fig. No. 9). El tomo de hidrgeno
es un radical libre de por s (puesto que tiene un electrn singlete desapareado)
y su remocin deja un electrn desapareado en el tomo de carbono
atacado. A este proceso descrito se le ha denominado iniciacin de la
peroxidacin lipdica.

El radical carbonilo (L?) resultante sufre rearreglos moleculares
originando un dieno conjugado, y en presencia de oxgeno molecular da lugar
al radical perxilo.





R? + LH RH + L
?
(Fase de Iniciacin)
El radical carbonilo resultante (L) sufre rearreglos moleculares originando un dieno conjugado, y en
presencia de oxgeno molecular da lugar al radical perxilo (LOO):

L
?
+ O
2
LOO
?
El radical perxilo puede sustraer un tomo de hidrgeno de otra molcula vecina (LH), la cual puede ser
otro cido graso insaturado, formndose as un hidroperxido (LOOH) y un nuevo radical lipdico (L),
entrando la peroxidacin en una Fase de Propagacin:

LOO
?
+ LH L
?
+ LOOH (Fase de Propagacin)

LOOH LO
?
+ OH
?
(Fase de Ramificacin)


Reacciones de Terminacin:
L
?
+ L
?
P* P + h?
LOO
?
+ L
?
P* P + h?
LOO
?
+ LO
?
P* P + h?


Figura No. 9
Representacin esquemtica del proceso de peroxidacin lipdica.

Los radicales perxilo pueden sustraer un tomo de hidrgeno de otra
molcula vecina (LH), la cual puede ser otro cido graso poliinsaturado,
formndose as un hidroperxido (LOOH) y un nuevo radical lipdico (L
?
),
entrando la peroxidacin lipdica en un proceso de propagacin. El grado de
propagacin de la reaccin depende de muchos factores, entre ellos, la
relacin lpido/ protena en la membrana (la oportunidad de reaccionar un
radical con una protena se incrementa cuando el contenido de protena
aumenta), de la composicin de cidos grasos, concentracin de oxgeno y de
la presencia dentro de la membrana de antioxidantes que inhiban la
propagacin de la reaccin. El hidroperxido lipdico puede en adelante
degradarse a una variedad de productos. Adems, en presencia de metales de
transicin, como Fe
++
, Cu
+
, el hidroperxido produce un radical alcxilo
(LO
?
) y un radical hidrxilo (OH
?
), los cuales causan la ramificacin de la
reaccin, involucrando un mayor nmero de molculas del sustrato en el
proceso de peroxidacin. Cuando la concentracin de molculas de sustrato
se hace pequea, los radicales libres comienzan a reaccionar entre s, en
distintas combinaciones provocando la formacin de productos excitados
(P
*
). El paso de estos productos excitados a su estado estable (P) ocurre con la
emisin de cuantos de luz visible. Estas reacciones reciben el nombre de
reacciones de terminacin y con ellas concluye la reaccin en cadena mediada
por radicales libres (Halliwell-Gutterige, 1989), (de Zwart, 1999)



ANEXO 2
Determinacin de Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbitrico
mediante la cuantificacin de malondialdehdo producido
Mtodo de Ohkawa et.al

Para determinar los niveles de peroxidacin lipdica, se cuantificaron los
niveles de Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbiturico (SRAT), por el
mtodo de (Ohkawa, 1979). A los tubos experimentales se les agreg 700 l
de agua destilada, 200 l de SDS al 8,1%, 1500 l de cido actico (pH 3.5)
al 20%, 1500 l de cido tiobarbitrico al 0,8 % y 100 l del homogenizado.
Los tubos se colocaron en un bao de agua hirviendo por 45 minutos.
Luego los tubos fueron enfriados en bao de agua a temperatura ambiente
por unos 5 minutos, y se les aadi luego 1 ml de agua destilada y 5 ml de
butanol. La suspensin fue agitada vigorosamente y sometida a
centrifugacin a 4000 rpm por 10 minutos en centrfuga clnica. El
sobrenadante se removi con sumo cuidado y se determin su absorbancia
a 532 nm en contra de un blanco tratado de igual manera, pero que no
contena la suspensin de membranas. Se prepar una curva de calibracin
usando como estndar 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP). Los resultados
fueron expresados como nanomoles de malondialdehdo (MDA) por mg de
protena.

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