Etanol de 2a Geracao Por Zymomonas Mobilis

i
PRODUO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAO

POR Zymomonas mobilis NATURALMENTE
OCORRENTE E RECOMBINANTE, EMPREGANDO
BIOMASSA LIGNOCELULSICA

D DA AN NI I E EL LL LE E D DA A S SI I L LV VE EI I R RA A D DO OS S S SA AN NT TO OS S

ORIENTADOR:
Prof. Nei Pereira Jr, PhD

Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Qumica
2012
Escola de Qumica
Programa de Ps-Graduao em
Tecnologia de Processos Qumicos e
Bioqumicos

ii
PRODUO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAO POR
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E
RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA
LIGNOCELULSICA

D DA AN NI I E EL LL LE E D DA A S SI I L LV VE EI I R RA A D DO OS S S SA AN NT TO OS S

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-Graduao
em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos para a
Obteno do Grau de Doutor em Cincias (DSc)

Escola de Qumica
2012
iii
PRODUO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAO POR
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E
RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA LIGNOCELULSICA

Danielle da Silveira dos Santos

Tese submetida ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos
Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno do grau de Doutor em
Cincias, sob orientao do Prof. Nei Pereira Jr.

Banca examinadora:
Prof. Nei Pereira Junior, PhD (EQ/UFRJ)
(Orientador-Presidente)

Prof
a
. Janete Magali de Arajo, DSc (CCB/ UFPE)

Prof. Antonio Carlos Augusto da Costa, DSc (IQ/ UFRJ)

Prof
a
. Eliana Flvia Camporese Srvulo, DSc (EQ/UFRJ)

Prof. Rodrigo Pires do Nascimento, DSc (EQ/UFRJ)

Prof
a
. Ldia Maria Melo Santa Anna, DSc (PETROBRAS)

EQ/UFRJ 2012
iv

FICHA CATALOGRFICA

Santos, Danielle da Silveira dos.
Produo de etanol de segunda gerao por Zymomonas mobilis
naturalmente ocorrente e recombinante, empregando biomassa
lignocelulsica/ Danielle da Silveira dos Santos. -- Rio de Janeiro, 2012.
Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Qumicos e
Bioqumicos) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de
Qumica, Rio de Janeiro, 2012.
218 p.: il.

Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.
1. Zymomonas mobilis. 2.Fermentao. 3.Bagao de cana-de-acar.
4. Engenharia gentica. 5. Teses

I. Pereira Jr., Nei (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Escola de Qumica, Ps-Graduao em Tecnologia de Processos
Qumicos e Bioqumicos. III. Ttulo.
v

A meus pais, Maria Igns e Jos Fernando, minha irm, Vanessa, ao meu
afilhado, Joo Guilherme, aos meus avs e ao meu amor, Bruno.
Dedico esta Tese a vocs, que so tudo em minha vida.

vi

A cada dia que vivo, mais me
conveno de que o desperdcio da
vida est no amor que no
damos, nas foras que no
usamos, na prudncia egosta
que nada arrisca.

Carlos Drummond de Andrade

vii
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao querido professor Nei Pereira Jr., obrigada pela orientao exemplar,
pautada por um elevado e rigoroso nvel cientfico, contribuindo para enriquecer
todas as etapas subjacentes ao processo de investigao. Obrigada pela
confiana depositada, pela oportunidade oferecida, pela partilha do saber, por
estimular o meu interesse pelo conhecimento, pelo acompanhamento
incansvel nesta jornada, me encorajando para que eu prosseguisse e
conclusse este trabalho. Orgulho-me de ter desenvolvido este estudo sob a
sua orientao. Acima de tudo, obrigada por ter sido responsvel pelo meu
amadurecimento profissional. Jamais teria ido to longe sem o seu auxlio,
amizade e dedicao. Meu profundo respeito, admirao e gratido.

viii
AGRADECIMENTOS

Agradeo principalmente ao meu amado Deus, que com seu amor
incondicional e sua imensa graa tem me dado foras para enfrentar todos os
obstculos da vida, permitido que eu realize todos os meus sonhos.
minha famlia, da qual sempre tive apoio total e um amor incondicional:
meus pais, Jos Fernando e Maria Igns; minha irm, Vanessa; meu sobrinho,
Joo Guilherme; meu cunhado, Mario; meus avs, Geraldo, Isaura, Maria
Clara, Lus Fernando, Neide e Nyldo, que sempre estiveram presentes em
minha vida, me dando apoio e me erguendo em qualquer situao; a meus
primos e tios, em especial, Walter Silveira, pelo auxlio e carinho. Minha
felicidade no se realizaria sem a participao de vocs.
A meu futuro marido, Bruno Moreira Martins, por ser o meu porto seguro e
anjo da guarda em todos os aspectos da minha vida, por todo amor, dedicao,
carinho e conforto em todos os momentos. Com toda a certeza, se no
estivesse do seu lado no seria to feliz e completa. Agradeo tambm sua
famlia, pela convivncia agradvel e carinho.
Ao Professor Dr. Fernando Araripe Torres (IB, UnB), pela dedicao,
profissionalismo e grande colaborao depositada; assim como ao seu grupo
de pesquisa; em especial, Viviane. Meus sinceros agradecimentos.
A todos os integrantes do Laboratrio de Desenvolvimento de Bioprocessos
pelo auxlio e companheirismo, tornando o laboratrio um lugar agradvel:
Liliana, Patrycia, Sabrina Dias, Mariana Ruiz, Vanessa Rocha, Fabrcio, Lus
Andr, Paulo, Mariana Faber, Mnica, Camylle, Leonard, Beatriz, Guilherme,
Vanessa, Renata, Lys, Ludmilla, Sabrina Mesquita, Mariana Mello, Elisabete e
Eleandro, Wilma, Marcio, Carla; ao Jorge, pela colaborao e ateno em
todos os momentos.
s queridas alunas, Aghata e Jssica, pelo auxlio, amizade e carinho.
ix
Ao Lus Carlos por ter sido fundamental na elaborao da minha tese, por
todo apoio, estmulo, amizade, dedicao e confiana a mim depositadas. No
tenho palavras que descrevam tamanha gratido.
Carolina e Maeda, pela colaborao neste trabalho, auxlio, amizade e
companheirismo.
Ao meu melhor amigo, Elcio, pela presena em todos os momentos,
contribuindo efetivamente para formulao de minha tese, por todo carinho,
dedicao e amizade depositados.
Dona Edina, que j faz parte da famlia, por todo o carinho, amor e
companheirismo.
s minhas melhores amigas, Brbara, Ticiane, Regianne, Alessandra,
Daiane, Camila e nova amiga, Janana, pelo companheirismo, carinho,
momentos de descontrao, desabafo e pela amizade sincera.
Ao Professor Dr. Donato Aranda, pelo auxlio e amizade, assim como os
integrantes de seu grupo de pesquisa; em especial s queridas amigas, Ana
Paula, Andria, Mariana Barreto e Laiza; e ao amigo Dower, pelo
companheirismo e confiana depositados.
Ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e
Bioqumicos da Escola de Qumica da UFRJ; ao Departamento de Engenharia
Bioqumica, especialmente aos funcionrios da Secretaria de Ps-graduao
da Escola de Qumica, pela agradvel recepo e convivncia diria.
PETROBRAS, CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro.
Aos membros da banca, por terem aceitado a participar da avaliao deste
trabalho.
"A glria da amizade no s a mo estendida, o sorriso carinhoso
nem mesmo a companhia. a inspirao espiritual que vem quando voc
descobre que algum acredita e confia em voc.
Annimo.

E a todos que participaram direta ou indiretamente na realizao deste trabalho,

Muito Obrigada!
x
RESUMO
SANTOS, Danielle da Silveira dos. Produo de etanol de segunda gerao por
Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e recombinante empregando
biomassa lignocelulsica. Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de Qumica-
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2012.
O desenvolvimento de tecnologias para produo de bioetanol a partir de materiais
lignocelulsicos mostra-se promissor devido s vrias vantagens da utilizao de biomassa
residual para produo de etanol de segunda gerao. Dessa forma, o atual cenrio dos
biocombustveis pode ser contemplado com mais uma alternativa tecnolgica, pois o bagao
de cana-de-acar, principal material lignocelulsico em pases tropicais, possui enorme
potencial energtico. A bactria Zymomonas mobilis mostrou-se extremamente atraente
para a produo de etanol combustvel de segunda gerao a partir da glicose proveniente
da frao celulsica, em virtude de sua elevada capacidade de absoro, resultando em
altos valores de produtividade. No entanto, as linhagens nativas mostraram-se incapazes de
metabolizar outro acar importante encontrado nas biomassas de composio
lignocelulsica, a xilose oriunda da frao hemicelulsica. Visando avanar neste tema e
tornar a produo de etanol de segunda gerao mais eficiente, recomendou-se a
incorporao de tcnicas da Biologia Molecular, a fim de dotar as linhagens utilizadas no
presente estudo capazes de fermentar tambm a xilose. Com isto, motivados com a procura
de novas alternativas energticas e industriais, nas quais diferentes derivados de petrleo
sejam substitudos, avanar-se-ia para a concepo SSCF. Desta forma, o objetivo deste
trabalho consiste em avaliar a produo de etanol a partir do bagao de cana por
Zymomonas mobilis, utilizando-se a estratgia de processo SSF (hidrlise enzimtica e
fermentao simultneas) e SSCF (hidrlise enzimtica e co-fermentao simultneas) a
partir da linhagem nativa e recombinante, respectivamente. Inicialmente, para se conseguir
o fcil acesso das enzimas do complexo celulsico at a celulose, o bagao passou por um
pr-tratamento cido para extrao dos acares da frao hemicelulsica, resultando em
um resduo slido denominado celulignina. Em seguida, foi realizado um pr-tratamento
alcalino, que promove sua deslignificao parcial. Inicialmente, a celulose presente na
celulignina parcialmente deslignificada foi pr-hidrolisada com enzimas de um complexo
enzimtico comercial denominado celulases, permitindo a converso da celulose a acares
fermentveis, nas temperaturas de 50C, durante 12 horas. No que tange transformao
gentica aplicada em Z. mobilis, o plasmdio pZMO1 (1565 kb) foi sintetizado quimicamente,
contendo os genes relacionados origem de replicao de E. coli e de Z. mobilis, os genes
que codificam as enzimas XI, XK, TAL e TKL, bem como a marca de seleo tetraciclina.
Posteriormente a essa etapa, a adaptao metablica foi empregada, seguida de
planejamentos experimentais de superfcie de resposta; os quais avaliaram a adio de
glicose e xilose no meio de cultivo em diferentes concentraes, bem como de hidrolisado
hemicelulsico em diferentes propores. As condies timas para o processo SSF
utilizando-se a bactria Zymomonas mobilis nativa, empregando o bagao de cana pr-
tratado e o resduo da indstria de celulose, respectivamente, foram: teor de slido, 30% e
20%; carga enzimtica, 25 FPU/g e 17,5 FPU/g; concentrao celular, 4 g/L e 1,59% (v/v);
atingindo a concentrao final de etanol de 60 g/L e 58 g/L; avaliando a adio dos
nutrientes complementares ao processo SSF: extrato de levedura, 12,5 e 6,25 g/L; KH
2
PO
4
,
2,5 e 1,25 g/L; (NH
4
)
2
SO
4
, 1,5 e 2,25 g/L e MgSO
4
, 1,5 e 2,25 g/L. Os melhores resultados
alcanados foram de 65 g/L e 54 g/L de etanol. Foi alcanado 25 g/L de etanol, constatando-
se que cerca de 50% desta pentose foi convertida ao produto, a partir do processo SSCF
pela linhagem Zymomonas mobilis CP4 recombinante, empregando 30% de slidos, 20,5%
de hidrolisado hemicelulsico, 10 mg/L de tetraciclina, carga enzimtica de 25 FPU/g de
celulignina e 10% (v/v) de inoculo inicial. Os resultados alcanados com o presente trabalho
foram satisfatrios e apontam para o desenvolvimento de novas pesquisas.
xi
ABSTRACT

SANTOS, Danielle da Silveira dos. Second generation ethanol production by
native and recombinant strain of Zymomonas mobilis employing
lignocellulosic biomass. Supervisor: Nei Pereira Jr. School of Chemistry of
Federal University of Rio de Janeiro Brazil, 2012.
During the past decades, considerable efforts have been made to utilize agricultural and
forest residues as biomass feedstock for the production of bioethanol as an alternative fuel.
Sugarcane bagasse, composed of 38.1 w% cellulose, 28.4 w% hemicellulose and 18.4 w%
lignin, represents the main lignocellulosic material to be considered by most of tropical
countries. The bacterium Zymomonas mobilis possesses technological advantages which
make of it a potential fermentative agent for industrial ethanol production: fast glucose
uptake, high ethanol tolerance and production yields, besides the ability of fermenting in
anaerobiose. Compared with Saccharomyces cerevisiae, the ethanol yield and specific
productivity of Zymomonas mobilis are higher, because less biomass is produced and a
higher metabolic rate of glucose is maintained through its special EntnerDoudoroff
pathway. The bacterium Zymomonas mobilis was shown to be extremely attractive for the
ethanol second generation production from glucose of the cellulosic fraction, due to its high
capacity to absorb this sugar, resulting in high ethanol productivity values. However, the
wild-type strains proved to be unable to metabolize xylose arisen from the hemicellulose
fraction. In order to turn the strain used in this study also able to ferment xylose into ethanol
and make more efficient the production of second generation ethanol, the incorporation of
molecular biology techniques was planned. Thus, the aim of this study was to evaluate the
fermentation utilizing strains of Z. mobilis by simultaneous saccharification and fermentation
(SSF) and simultaneous saccharification for and co-fermentation (SSCF) processes, in
which the fermentation of both sugars occurs in one step. Initially, to make easier the
accessibility of cellulases to the cellulose microfibrils, the bagasse had to be submitted to a
pretreatment with diluted acid to fractionate it and extract the hemicellulose component
from the solid residue termed cellulignin. This solid residue was pretreated using NaOH
(4%) aiming at its partial delignification. Thereafter, the pretreated cellulignin underwent the
action of a commercial celulolytic preparation, allowing the conversion of cellulose to
glucose. This enzymatic pretreatment occurred under temperature of 50C for 12 hours,
after which the temperature was reduced to 30C and the system was inoculated with cells
of Z. mobilis. Regarding the genetic transformation, the Z. mobilis plasmid pZMO1 of 1565
kb was chemically synthesized and cloned into a synthetic vector, that contain the E. coli
and Z. mobilis replication checkmark origin; the XI, XK, TAL, TKL genes, and the
tetracycline resistance. Metabolic adaptation was performed, followed by response surface
experimental, evaluating the addition of glucose and xylose in the culture medium with
different concentrations, as well as hemicellulosic hydrolyzate in different proportions.
Employing the original strain, statistical experimental design was used to optimize the SSF
conditions, evaluating the solid content, enzymatic load and cell concentration by
submerged fermentation. Using the pretreated sugarcane bagasse and the paper industry
residue, respectively, the optimum conditions were found to be: solid content, 30% and
20%; enzyme load, 25 FPU/g and 17.5 FPU/g; cell concentration, 4 g/L and 1.59%(v/v),
resulting in a maximum ethanol concentration of 60 g/L and 58 g/L, evaluating the nutrients
addition in the SSF process: yeast extract, 12.5 and 6.25 g/L; KH
2
PO
4
, 2.5 and 1.25 g/L;
(NH
4
)
2
SO
4
, 1.5 and 2.25 g/L and MgSO
4
, 1.5 and 2.25 g/L, were achieved 65 g/L and 54
g/L of ethanol concentration. The recombinant Zymomonas mobilis CP4 strain reached 25
g/L of ethanol, confirming that about 50% of this pentose were consumed in the SSCF
process, employing 30% of solids, 20.5% of hydrolyzed hemicellulosic, 10 mg/L of
tetracycline, enzyme load of 25 FPU/g cellulignin, and 10% of the initial inoculum. The
results were very interesting and pointed out for future developments.
xii

S SU UM M R RI IO O

CAPTULO 1

1
1. APRESENTAO DO TEMA
1

CAPTULO 2

7
2. REVISO BIBLIOGRFICA
7
2.1. A ERA DOS BIOCOMBUSTVEIS 8
2.2. ETANOL: O PRINCIPAL BIOCOMBUSTVEL 9
2.2.1. PANORAMA MUNDIAL 9
2.3.2. PANORAMA NACIONAL 10
2.3. CANA-DE-ACAR: A MATRIA-PRIMA BRASILEIRA PARA
PRODUO DE ETANOL
12
2.3.1. PRODUO DE ACAR E ETANOL DO CALDO DE CANA 13
2.3.2. BAGAO DE CANA-DE-ACAR 15
2.4. MATERIAIS LIGNOCELULSICOS 16
2.4.1. MATRIA-PRIMA PARA A PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS 16
2.4.1. ESTRUTURA CELULAR 18
2.4.2. CONSTITUIO QUMICA 20
2.4.2.1. Celulose 21
2.4.2.2. Hemicelulose 23
2.4.2.3. Lignina 24
2.5. PR-TRATAMENTO DOS MATERIAIS LIGNOCELULSICOS 26
2.5.1. PRETRATAMENTO CIDO 27
2.5.2. PRETRATAMENTO ALCALINO 28
2.5.3. INIBIDORES 29
2.5.4. PR- HIDRLISE ENZIMTICA 30
2.6. A BACTRIA Zymomonas mobilis 31
2.6.1. BREVE HISTRICO 31
2.6.2. CARACTERSTICAS GERAIS 33
2.6.2.1. Biologia molecular bsica de Z. mobilis
34
2.6.3. CARACTERSTICAS CULTURAIS 35
2.6.3.1. Z. mobilis X S. cerevisiae
35
2.6.3.2. Outras Habilidades
36
2.6.4. UTILIZAO DE ACARES 37
2.6.5. ROTA METABLICA 38
2.6.6. FORMAO DE SUBPRODUTOS 39
2.6.7. MEIOS DE CULTIVO 40
2.6.7.1. Nitrognio
41
2.6.7.2. Fsforo
43
2.6.7.3. Enxofre 43
2.6.7.4. Meios de cultivo de baixo custo 43
2.6.9. PRODUO DE ETANOL CONVENCIONAL POR Z. mobilis 45
2.6.9.1. Inibio pelo produto, substrato e temperatura 47
2.7. ESTRATGIAS DE PROCESSO PARA PRODUO DE ETANOL DE
SEGUNDA GERAO
50
2.7.1. HIDRLISE ENZIMTICA SEPARADA DA FERMENTAO 50
2.7.2. HIDRLISE ENZIMTICA E FERMENTAO SIMULTNEAS 51
3.7.3. HIDRLISE ENZIMTICA E CO-FERMENTAO SIMULTNEAS 52
2.7.4. BIOPROCESSO CONSOLIDADO 53
2.7.5. PRODUO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAO POR
Z. mobilis
54
xiii
2.8. PRODUO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR
LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis
56
2.8.1. METABOLIZAO DA XILOSE 56
2.8.1.1. Breve Histrico 58
2.8.2. METABOLIZAO DA ARABINOSE 60
2.8.3. PROBLEMTICAS 64
2.8.3.1. Estabilidade 64
2.8.3.2. Protena Transportadora 65
2.8.3.3. Xilose X Glicose 66
2.8.3.4. Atividades Enzimticas 68
2.8.3.5. Produo de Xilitol 69
2.8.3.6. Inibio pelo Substrato/ Produto 70
2.8.3.7. Inibio por Compostos Txicos 70
2.8.4. ALTERNATIVAS 72
2.8.4.1. Linhagens adaptadas toxicidade 72
2.8.4.2. Reduo de cargas enzimticas no processo
SSCF
73
2.8.4.3. Modificao gentica da glf 74
2.8.4.4. Inativao da GFOR 74
2.8.4.5. Adaptao Metablica 74
2.8.4.6. Integrao Cromossomal 75
2.8.5. TRANSFORMAO GENTICA PARA DIFERENTES
FINALIDADES
75
2.9. CONSIDERAES GERAIS 77

CAPTULO 3

79
3. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
79
3.1. JUSTIFICATIVAS 79
3.2. OBJETIVO GERAL 81
3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS 81

CAPTULO 4

83
4. MATERIAIS E MTODOS
84
4.1. MATRIA-PRIMA 84
4.1.1. BAGAO DE CANA-DE-ACAR 84
4.1.2. RESDUO DA INDSTRIA DE CELULOSE 84
4.2. PR-TRATAMENTO DO BAGAO DE CANA-DE-ACAR 84
4.2.1. PR-TRATAMENTO CIDO 84
4.2.2. PR-TRATAMENTO ALCALINO 86
4.2.3. PR-HIDRLISE ENZIMTICA 87
4.3. A BACTRIA Zymomonas mobilis NATIVA 87
4.3.1. MANUTENO DAS CULTURAS DE Z.mobilis 88
4.3.2. PR- INCULO E INCULO: COMPOSIO DE MEIO E
CONDIES DE CULTIVO
89
4.3.1. ENSAIOS DE FERMENTAO 90
4.3.3.1. Desempenho das linhagens nativas frente
utilizao de glicose e xilose
91
4.3.3.2. Produo de etanol a partir do bagao de
cana e resduos da indstria de celulose por Z. mobilis
nativa atravs do processo SSF
91
I. Otimizao da produo de etanol a partir de
bagao de cana e PM2 por Z. mobilis CP4 nativa
92
II. Anlise da adio de diferentes componentes do
meio no hidrolisado celulsico do bagao de cana e
PM2 frente produo de etanol a partir por Z.
mobilis CP4 nativa
93
xiv
4.4. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis 95
4.4.1. APLICAO DA ENGENHARIA GENTICA EM Z. mobilis 95
4.4.1.1. Desenho dos genes 95
4.4.1.2. Amplificao gnica em E. coli 96
4.4.1.3. Extrao do DNA 96
4.4.1.4. Transformao em Zymomonas mobilis 97
I. Clulas competentes de Z. mobilis 97
II. Plasmdeo exgeno 98
III. Eletroporao 98
4.4.1.4. Etapa ps-transformao 98
4.4.1.5. Meio de crescimento e manuteno 99
4.4.2. ENSAIOS DE FERMENTAO 100
4.4.2.1. Ensaios preliminares para avaliar o consumo de
glicose e xilose em meio sinttico por Z. mobilis
geneticamente modificada
100
I. Seleo de clones 101
I. Adaptao metablica 101
4.4.2.2. Ensaios para produo de etanol a partir de
bagao de cana atravs do processo SSCF
102
I. Adaptao metablica 102
II. Processo de propagao mediante
diferentes estratgias de aclimatao
celular
103
III. Avaliao da produo de etanol a partir do
processo SSCF atravs de planejamentos
experimentais sequenciais
104
4.5. PRODUO DE ETANOL EM BIORREATOR INSTRUMENTADO
ATRAVS DOS PROCESSOS SSF E SSCF
105
4.6. MTODOS ANALTICOS 106
4.6.1. DETERMINAO DE ETANOL E ACARES POR CLAE 1 106
4.6.2. QUANTIFICAO DO MICRORGANISMO 1 107
4.7. ANLISE DOS RESULTADOS 1 107
4.7.1. ESTATSTICA 107
4.7.2. CLCULO DE EFICINCIA 108
4.7.3. TAXA INSTANTNEA ESPECFICA DE CRESCIMENTO 108
4.7.4. TEMPO DE DUPLICAO 109
4.7.5. VARIVEIS DE RESPOSTA 109

CAPTULO 5

110
5. RESULTADOS E DISCUSSES
110
5.1. ENSAIOS DE FERMENTAO EMPREGANDO A BACTRIA
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE
111
5.1.1. DESEMPENHO DAS LINHAGENS NATIVAS FRENTE
UTILIZAO DE GLICOSE E XILOSE
111
5.1.2. OTIMIZAO DO PROCESSO DE HIDRLISE ENZIMTICA
SIMULTNEA FERMENTAO ALCOLICA POR Zymomonas
mobilis CP4
114
I. Bagao de cana-de-acar pr-tratado 114
II. Resduos da indstria de celulose 126
5.1.3. ANLISE DA ADIO DE DIFERENTES COMPONENTES DO
MEIO NO PROCESSO FRENTE PRODUO DE ETANOL A PARTIR
POR Z. mobilis CP4 NATIVA
130
I. Bagao de cana-de-acar pr-tratado 130
Delineamento fatorial 130
Planejamento Composto Central Rotacional 134
II. Resduo da indstria de celulose 139
5.1.4. ANLISE COMPARATIVA 145
xv
5.2. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis 149
5.2.1. ETAPA PS-TRANSFORMAO 149
5.2.2. ADAPTAO METABLICA EM MEIO SINTTICO 150
5.2.3. ENSAIOS PRELIMINARES AVALIANDO O CONSUMO DE
GLICOSE E XILOSE EM MEIO SINTTICO POR Z. mobilis
GENETICAMENTE MODIFICADA
153
I. Planejamento Experimental 153
II. Comparao do desempenho de diferentes
clones
157
5.2.4. PRODUO DE ETANOL ATRAVS DO PROCESSO SSCF POR
Zymomonas mobilis RECOMBINANTE
158
I. Adaptao metablica em meio SSCF 158
II. Processo de propagao mediante
diferentes estratgias de aclimatao celular
160
III. Avaliao da produo de etanol a partir do
processo SSCF atravs de planejamentos
experimentais sequenciais
161
5.3. CONSIDERAES GERAIS 169

CAPTULO 6

171
6. CONCLUSES 171
6.1. CONCLUSES 171
6.2. SUGESTES 174

CAPTULO 7

175
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 175

xvi
SUMRIO DE FIGURAS

Figura 2.1. Participao, de pases selecionados, no consumo mundial de
petrleo no ano de 2011.
8
Figura 2.2. Evoluo do consumo de etanol no Brasil e EUA. 10
Figura 2.3. Cana-de-acar. 12
Figura 2.4. Excedente de Palha de cana-de-acar. 14
Figura 2.5. Excedente de Bagao de cana-de-acar. 15
Figura 2.6. Diagrama da estrutura das camadas da parede de uma fibra. 18
Figura 2.7. Principais componentes de materiais lignocelulsicos. 20
Figura 2.8. Estrutura simplificada da cadeia linear da celulose, formada por
vrias unidades consecutivas de celobiose.
22
Figura 2.9. Representao das ligaes de Hidrognio na estrutura da
celulose
23
Figura 2.10. Monossacardeos constituintes das hemiceluloses. 24
Figura 2.11. Estrutura simplificada da lignina. 25
Figura 2.12. Efeito do pr-tratamento qumico em materiais lignocelulsico. 26
Figura 2.13. Atuao sinrgica das celulases. 30
Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4. 33
Figura 2.15. Via metablica de formao de produtos da fermentao de
carboidratos por Zymomonas mobilis.
38
Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrlise enzimtica
separada da fermentao (SHF).
51
Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrlise enzimtica e
fementao simultneas (SSF).
51
Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificao e co-
fermentao simultneas (SSCF).
53
Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produo
de etanol de segunda gerao (BPC).
53
Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff de Z.
mobilis.
57
Figura 2.21. Mapa do plasmdeo pZMETX. 60
Figura 4.1. Etapas do pr-tratamento cido. 85
Figura 4.2. Bagao de cana-de-acar in natura (A); Bagao de cana-de-
acar aps pr- tratamento cido (Celulignina) (B).
85
Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino. 86
Figura 4.4. (A) Frao lquida aps pr-tratamento alcalino, (B- E) Sequncia
de lavagens com gua destilada para a remoo da lignina residual.
86
Figura 4.5. Perfil cromatogrfico tpico do hidrolisado celulsico pr-tratado
enzimaticamente.
87
Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis. 88
Figura 4.7. Linhagem floculante de Z. mobilis CP4, em meio de cultura. 88
Figura 4.8. Sistema de operon duplo para os genes do metabolismo de
xilose.
96
Figura 4.9. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis CP4. 99
xvii
recombinante (aumento de 1000 X).
Figura 4.10. Diagrama de blocos indicando a estratgia empregada para
aclimatao celular.
104
Figura 4.11. Experimento em Biorreator BIOFLO III (New Brunswick). 106
Figura 4.12. Sistema cromatrogrfico CLAE com deteco por ndice
refrao.
106
Figura 5.1. Cintica de acompanhamento de consumo de glicose, produo
de etanol e crescimento celular de Z. mobilis linhagem AG11.
111
Figura 5.2. Cintica de acompanhamento de consumo de glicose, produo
de etanol e crescimento celular de Z. mobilis linhagem CP4
112
Figura 5.3. Perfil cromatogrfico tpico de fermentao de Z.mobilis 113
Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose. 113
Figura 5.5. Material celulsico deslignificado (A), logo aps a adio de
enzimas e meio (B) e aps a pr-hidrlise enzimtica (C)
115
Figura 5.6. Superfcie de resposta mostrando os efeitos combinados da
relao slido:lquido (parmetro A) e carga enzimtica (parmetro B) sobre
a concentrao inicial de glicose do processo SSF a partir do bagao de
cana pr-tratado.
117
relao slido:lquido (parmetro A) e carga enzimtica (parmetro B) sobre
a concentrao de etanol atravs do processo SSF a partir do bagao de
cana pr-tratado por Z. mobilis CP4.
119
Figuras 5.8. Superfcies de resposta mostrando os efeitos combinados da
entre (A) relao slido: lquido (parmetro A) e carga enzimtica (parmetro
B), (B) relao slido: lquido (parmetro A) e concentrao celular
(parmetro C), (C) carga enzimtica (parmetro B) e concentrao celular
(parmetro C) sobre a produtividade volumtrica de etanol atravs do
processo SSF a partir do bagao de cana pr-tratado por Z. mobilis CP4.
122
Figura 5.9. Cintica do processo de hidrlise enzimtica de celulose e
fermentao simultneas a partir de bagao de cana pr-tratado atravs do
processo SSF por Z. mobilis CP4, em frascos agitados. Condies
operacionais: relao slido lquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de clulas.
124
processo SSF por Z. mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condies
125
Figura 5.11. Superfcie de resposta mostrando os efeitos da relao
slido:lquido, carga enzimtica e suas interaes na produo de etanol
atravs do processo SSF a partir de resduos da indstria de celulose por Z.
mobilis CP4.
129
Figura 5.12. Perfil cintico do processo de hidrlise enzimtica de celulose e
fermentao simultneas a partir de resduos da indstria de celulose por Z.
mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condies operacionais: relao
slido:lquido (2:10 g/mL), carga enzimtica (17,5 FPU/g) e concentrao
celular (1,59 %).
129
Figura 5.13. Validao experimental da condio tima obtida no 133
xviii
Planejamento fatorial 2
4
, a partir de bagao de cana pr-tratado: 2,5 g/L de
extrato de levedura, 1 g/L de KH
2
PO
4
, 0,5 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
e 0,5 g/L de
MgSO
4
.7H
2
O, atingindo 53 g/L de etanol em biorreator instrumentado.
Condies: relao slido lquido de 3:10 (g:mL), carga enzimtica de 25
FPU/g e concentrao inicial de clulas de 4 g/L.
Figura 5.14. Superfcie de resposta mostrando efeitos de MgSO
4
.7H
2
O (g/L)
e (NH
4
)
2
SO
4
(A);

KH
2
PO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L) (B); KH
2
PO
4
(g/L) e
(NH
4
)
2
SO
4
e suas interaes para a produo de etanol (C).
137
Figura 5.15. Cintica da produo de etanol a partir de bagao de cana pr-
tratado, na relao slido:lquido 3:10 (g:mL) e carga enzimtica de 25 FPU/
g, atravs do processo SSF por Z. mobilis CP4, utilizando 12,5 g/L de extrato
de levedura, 2,5 g/L de KH
2
PO
4
, 1,25 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
e 0,5 g/L
MgSO
4
.7H
2
O no meio fermentativo.
139
Figura 5.16. Superfcies de resposta mostrando efeitos de extrato de
levedura e MgSO
4
.7H
2
O

(A);

KH
2
PO
4
e (NH4)
2
SO
4
(B); (NH
4
)
2
SO
4
e

MgSO
4
.7H
2
O

(C) e suas interaes para a produo de etanol a partir de
resduo da indstria de celulose.
143
Figura 5.17. Cintica da melhor condio obtida (extrato de levedura, 5 g/L;
KH
2
PO
4
, 1 g/L; (NH4)
2
SO
4
, 2 g/L e MgSO
4
.7H
2
O, 2 g/L) para a produo de
etanol atravs do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de resduo da
indstria de celulose, em biorreator instrumentado.
144
Figura 5.18. Crescimento de diferentes linhagens aps 168 h de crescimento
a 30
C frente utilizao de meio RMG, contendo glicose (20 g/L), KH

2
PO
4

(2 g/L), extrato de levedura (10 g/L), gar (20 g/L) e tetraciclina (10 mg/L).
149
Figura 5.19. Histograma representando os 50 ciclos de adaptao metablica,
empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis em meio sinttico.
Figura 5.20. Superfcie de contorno avaliando efeitos combinados entre a
glicose (Parmetro A) e a xilose (Parmetro B) sobre a produo de etanol
por Zymomonas mobilis recombinante.
152

156

Figura 5.21. Cintica comparativa de diferentes clones selecionados aps
crescimento em meio RMGX durante 72 horas, em 30
C de temperatura e
agitao de 150 rpm
158
Figura 5.22. Superfcie de contorno avaliando efeitos combinados entre os
parmetros sobre a produo de etanol a partir do primeiro Planejamento
referente ao processo SSCF pela linhagem recombinante de Z. mobilis.
164
parmetros sobre a produo de etanol a partir do segundo Planejamento
referente ao processo SSCF pela linhagem recombinante de Z. mobilis.
165
Figura 5.24. Processo SSCF2 em biorreator instrumento por Z. mobilis
modificada, empregando 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulsico e 2,99:10
(g:mL) de relao slido:lquido de bagao de cana pr-tratado.

166
xix
SUMRIO DE TABELAS

Tabela 2.1. Perspectivas da produo de etanol. 11
Tabela 2.2. Composio qumica mdia do bagao de cana. 16
Tabela 2.3. Composio qumica dos resduos agrcolas (%). 21
Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produo de
etanol convencional por Zymomonas mobilis.
46
Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produo de etanol de
segunda gerao por Zymomonas mobilis.
55
Tabela 2.6. Comparao do desempenho de diferentes linhagens
recombinantes de Z. mobilis para a produo de etanol.
61
Tabela 4.1. Meio de manuteno de Z. mobilis. 89
Tabela 4.2. Meio de crescimento de Z. mobilis. 89
Tabela 4.3. Experimentos sequenciais avaliando a bactria Zymomonas
mobilis naturalmente ocorrente frente produo de etanol.
90
Tabela 4.4. Variveis independentes do planejamento experimental central
composto: relao slido:lquido (g:mL), carga enzimtica (FPU/g) e
concentrao celular (g/L), avaliando a produo de etanol, produtividade
volumtrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando o bagao
de cana-de-acar.
93
concentrao celular (%), avaliando a produo de etanol, produtividade
volumtrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando PM2.
94
Tabela 4.6. Parmetros e nveis usados no Planejamento Experimental
Fatorial 2
4
: extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH4)
2
SO
4
(g/L) e
MgSO
4
.7H
2
O (g/L), adicionados no hidrolisado celulsico do bagao de cana.
94
Tabela 4.7. Variveis independentes do planejamento central composto
avaliando a adio de extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH4)
2
SO
4

(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L) no hidrolisado celulsico do bagao e de PM2
frente produo de etanol atravs do processo SSF por Z. mobilis CP4
nativa.
99
Tabela 4.8. Composio do meio RM, empregado na linhagem recombinante
de Z. mobilis.
100
Tabela 4.9. Experimentos sequenciais avaliando a bactria Zymomonas
mobilis frente produo de etanol.
101
Tabela 4.10. Variveis independentes do planejamento experimental,
avaliando diferentes concentraes de glicose e xilose, em g/L, quanto
produo de etanol por Z. mobilis recombinante.
102
Tabela 4.11. Processo de adaptao metablica mediante 50 ciclos, variando
as concentraes de glicose e xilose em meio sinttico.
102
Tabela 4.12. Processo de adaptao metablica mediante 25 ciclos
fermentativos, variando as concentraes de hidrolisado cido proveniente
do bagao de cana, mantendo-se a glicose em 20 g/L.
105
Tabela 4.13. Variveis independentes do primeiro planejamento 105
xx
experimental avaliando o percentual de hidolisado cido, bem como a
relao slido:lquido (g:mL) do mesmo do bagao de cana no que tange
produo de etanol. atravs do processo SSCF.
Tabela 4.14. Variveis independentes do segundo planejamento
experimental avaliando o percentual de hidolisado cido, bem como a
relao slido:lquido (g:mL) do mesmo do bagao de cana no que tange
produo de etanol atravs do processo SSCF.
105
Tabela 4.15. Curvas padro de absorvncia versus concentrao da massa
celular para as linhagens de Z. mobilis.
107
Tabela 5.1. Desempenho das linhagens AG11 e CP4 de Z. mobilis na
fermentao de glicose (concentrao inicial de 20 g/L).
112
Tabela 5.2. Planejamento Experimental de Superfcie de Resposta 2
3
,
avaliando a relao slido:lquido, carga enzimtica e concentrao celular
frente produo de etanol a partir do bagao de cana pr-tratado atravs
do processo SSF por Z. mobilis CP4.
115
Tabela 5.3. Anlise de varincia da concentrao de glicose inicial do
processo SSF a partir do bagao de cana pr-tratado por Z. mobilis CP4,
atravs do Planejamento Experimental de Superfcie de Resposta 2
3
,
avaliando a relao slido:lquido, carga enzimtica e concentrao celular.
116
Tabela 5.4. Anlise de varincia da concentrao de etanol atravs do
utilizando o Planejamento Experimental de Superfcie de Resposta 2
3
,

118
Tabela 5.5. Anlise de varincia da produtividade volumtrica de etanol
atravs do processo SSF a partir do bagao de cana pr-tratado por Z.
mobilis CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfcie de
Resposta 2
3
, avaliando a relao slido:lquido, carga enzimtica e
concentrao celular.
121
Tabela 5.6. Planejamento Superfcie de Resposta 2
4
investigando efeitos da
Relao slido:lquido (g:mL), Carga enzimtica (FPU/g) e Concentrao
celular (%) na produo de etanol a partir de resduos da indstria de
celulose por Z. mobilis CP4.
126
Tabela 5.7. Anlise de Varincia da concentrao de etanol atravs do
processo SSF a partir de resduos da indstria de celulose por Z. mobilis
CP4, utilizando o Planejamento Superfcie de Resposta 2
4
, o qual avaliou os
efeitos da Relao slido:lquido (g:mL), Carga enzimtica (FPU/g) e
Concentrao celular (%).
128
Tabela 5.8. Planejamento fatorial 2
4
, avaliando efeitos da concentrao de
extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L)
na produo de etanol atravs do processo SSF a partir de bagao de cana
pr-tratado, na relao slido:lquido 3:10 (g:mL) e carga enzimtica de 25
FPU/g, por Z. mobilis CP4.
131
Tabela 5.9. Anlise da varincia da produo de etanol, empregando
diferentes concentraes de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O, atravs do processo SSF a partir de bagao de cana pr-
132
xxi
tratado por Zymomonas mobilis CP4.
Tabela 5.10. Planejamento Composto Central 2
4
, avaliando efeitos da adio
de extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O
(g/L) na produo de etanol atravs do processo SSF a partir de bagao de
cana pr-tratado, na relao slido:lquido 3:10 (g:mL) e carga enzimtica de
25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
134
Tabela 5.11. Anlise de varincia da produo de etanol, empregando
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O, atravs do processo SSF por Z. mobilis a partir do bagao de
cana.
136
4
investigando efeitos
da adio de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH4)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O na
produo de etanol a partir de resduos de celulose.
140
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O, atravs do processo SSF por Zymomonas mobilis a partir de
resduo da indstria de celulose.
142
Tabela 5.14. Principais resultados relatados na literatura para o processo
SSF com linhagens de Zymomonas mobilis.
145
Tabela 5.15. Resultados obtidos pela linhagem nativa de Zymomonas
mobilis CP4 a partir do processo SSF e a partir da fermentao em meio
sinttico.
147
Tabela 5.16. Processo de adaptao metablica mediante 50 ciclos,
variando as concentraes de glicose e xilose em meio sinttico.
151
Tabela 5.17. Comparao das variveis de resposta entre diferentes etapas
de adaptao metablica.
152
Tabela 5.18. Planejamento experimental preliminar avaliando diferentes
concentraes de glicose e xilose no meio RM frente produo de etanol e
crescimento de biomassa a partir de meio sinttico pela linhagem
recombinante de Zymomonas mobilis CP4.
154
Tabela 5.19. Avaliao de diferentes concentraes de glicose e xilose na
produo de etanol a partir de meio sinttico pela linhagem recombinante de
Zymomonas mobilis CP4.
155
Tabela 5.20. Anlise de Varincia da concentrao de etanol a partir de
diferentes concentraes de glicose e xilose pela linhagem recombinante de
Z. mobilis CP4, aps a execuo de 10 ciclos de adaptao metablica.
156
Tabela 5.21. Avaliaes de diferentes clones frente ao consumo de glicose e
xilose provenientes no meio RMGX, assim como produo de etanol por
Zymomonas mobilis recombinante.
157
fermentativos, variando as concentraes de hidrolisado cido proveniente
do bagao de cana e mantendo a concentrao de glicose em 20 g/L.
159
Tabela 5.23. Comparao das variveis medidas e calculadas entre
diferentes etapas de adaptao metablica.
160
Tabela 5.24. Crescimento celular em diferentes estratgias de aclimatao. 160
xxii
Tabela 5.25. Primeiro Planejamento 2
2
avaliando o percentual de hidrolisado
hemicelulsico (%), bem como a relao slido:lquido (g:mL) do bagao de
cana-de-acar pr-tratado atravs do processo SSCF1 no que tange
produo de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis
CP4.
161
Tabela 5.26. Segundo Planejamento 2
2
hemicelulsico (%), bem como a relao slido:lquido (g:mL) do bagao de
cana-de-acar pr-tratado atravs do processo SSCF2 no que tange
produo de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis
CP4.
162
Tabela 5.27. Anlise de Varincia da concentrao de etanol alcanada no
primeiro Planejamento Experimental do processo SSCF1.
163
segundo Planejamento Experimental do processo SSCF2.
163
Tabela 5.29. Evoluo dos resultados obtidos pela linhagem recombinante
de Z.mobilis CP4 a partir do processo SSCF e da fermentao em meio
sinttico.
167

xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Abs
600
600 nanmetros de absorbncia
Acr: Mutante tolerante ao acetato
ADP Adenosina difosfato
Aj.

Ajustado
ANOVA Anlise de varincia
araA L-arabionose isomerase
araB L-ribuloquinase
ara D L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase
ATP Adenosina trifosfato
ART Acares redutores totais
BNDES Banco Nacional de Desenvolvimento Econmico e Social
BPC Bioprocesso consolidado
BR Biorreator
CBH Celobiohidrolases
CE Carga enzimtica
[cell] Concentrao celular
CFU Colony-forming unit
COGEN Associao da Indstria de Cogerao de Energia
CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
CMC carboximetilcelulose
CmR gene de resistncia ao clorofenicol
CNI Confederao Nacional da Indstria
CONAB Companhia Nacional de Abastecimento
EISA Energy Independece and Security Act
EL Extrato de levedura
EMP Embder-Meierhopf-Parnas
EPE Empresa de Pesquisa Energtica
Etanol 2G Etanol de segunda gerao
EUA Estados Unidos da Amrica
Ex. Experimentos
F Fisher Calculado
FA Frascos agitados
FPU Filter Paper Units
fru Frutose
GFOR Glicose-frutose oxidorredutase
glf Protena facilitadora do transporte de glicose
gli Glicose
gaL Galactose
GL Grau de Liberdade
gl Gluconolactona
h Hora
HMF hidroximetilfurfural
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica
LB Meio Luria-Bertani, contendo 10 g/L de triptona, 0,5 g/L de extrato de
levedura, 1 g/L de NaCl (pH7)
LADEBIO Laboratrio de Desenvolvimento de Bioprocessos
LM Lamela Mdia
MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
min. Minuto(s)
MJ Megajoule
MME Ministrio de Minas e Energia
MP Matria-prima
MQ Mdia Quadrtica
mV Milivolts
xxiv
NAD Nicotinamida adenina dinucletido
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotdio fosfato-oxidase
OCDE Organizao de Cooperao e de Desenvolvimento Econmicos
OD600 Densidade tica em 600 nanmetros de absorbncia
ODM Organic dry matter
ORI Plasmdeo contendo a origem de replicao para Z. mobilis
ORI ZYMO Plasmdeo contendo a origem de replicao para Z. mobilis, alm dos
genes que metabolizam a xilose: xilose isomerase, xululoquinase,
transaldolase e transquetolase.
P Produto
PC Pontos centrais
Peno Promotor enolase
PEA Policy Energy Act
Pgap Promotor glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
P.H. Pr-hidrlise enzimtica
Pi Radical fosfato inorgnico
PP Parede Primria
Ppdc Promotor piruvato decarboxilase
PROALCOOL Programa Nacional do lcool
PS Parede Secundria
pZMO1 Plasmdio de Z. mobilis utilizado neste trabalho (1565 kb)
p15a Origem de replicao de E. coli
Q
P
Produtividade volumtrica em etanol
Ref. Referncias Bibliogrficas
PM2 Resduo da indstria de celulose
rpm Rotaes por minuto
S Substrato
S:L Relao slido:lquido
sac Sacarose
RM Meio de cultura contendo fosfato de potssio, 2 g/L; extrato de
levedura, 10 g/L; tetraciclina, 10 mg/L
RMG Meio de cultura contendo fosfato de potssio, 2 g/L; extrato de
levedura, 10 g/L; glicose, 20 g/L; xilose, 20 g/L; tetraciclina, 10 mg/L
RMGX Meio de cultura contendo fosfato de potssio, 2 g/L; extrato de
levedura, 10 g/L; glicose, 20 g/L; tetraciclina, 10 mg/L
SQ Soma Quadrtica
SHF Hidrlise enzimtica separada da fermentao
SSCF Hidrlise enzimtica e co-fermentao simultneas
SSF Hidrlise enzimtica e fermentao simultneas
TAL Transaldolase
Tc Tetraciclina
TKT Transquetolase
UNICA Unio de Agroindstria Canavieira de So Paulo
v/v Relao volume/volume
XI, xylA Xilose isomerase
XK, xylB Xululoquinase
xil Xilose
ZM22; ZM27 Origem de replicao de Z. mobilis

xxv
NOMENCLATURA MATEMTICA
E
f
Eficincia, expressa em porcentagem
g gravidade
g Grama
g/mL Microgramas por mililitro
g/L Gramas por litro
h Hora
max

Taxa especfica mxima de crescimento (h
-1
)
Taxa de crescimento especfico (h
-1
)
L Litro
mg Miligrama
mL Mililitros
P Concentrao de produto (g/L)
p>F Probabilidade de Fisher
m Micrmetro
pH Potencial hidrogeninico
p/v Relao peso/volume
Q
P
Produtividade volumtrica em etanol, g/L.h
S
o
Concentrao inicial de substrato, g/L
T Temperatura,
o
C
v/v Relao volume/volume
X
o
Concentrao inicial de clulas, g/L
w/v Massa por volume
Y
P/S

Fator de converso em produto, em g.g
-1

CAPTULO 1: Apresentao do tema de tese


1

_____________________CAPTULO 1

APRESENTAO DO TEMA DE TESE

1.1. INTRODUO
As matrias-primas de origem lignocelulsica contm de 20% a 60% de
celulose, que pode ser totalmente convertida glicose por ao enzimtica,
aps etapa de pr-tratamento para desorganizao do complexo
lignocelulsico. Por sua vez, a glicose caracteriza-se por ser um
monossacardeo utilizado pela maioria dos microrganismos, fazendo desta
molcula um importante bloco de construo para a obteno de uma imensa
gama de substncias de interesse comercial, abrangendo desde combustveis
at polmeros (KNAUF & MONIRUZZAMAN, 2004). O bagao de cana-de-
acar, resduo gerado pelos processos de produo de etanol, considerado
uma matria-prima lignocelulsica por excelncia, apesar de ser utilizado para
a gerao de energia em unidades de produo, ainda assim existem enormes
excedentes. Neste contexto, a Companhia Nacional de Abastecimento estima
que a produo de cana-de-acar deva crescer 6,5% na safra de 2012/2013 e
atingir 596,63 milhes de toneladas, resultando em cerca de 180 milhes de
toneladas de bagao gerado (CONAB, 2012).


2
A hidrlise completa das fraes polissacardicas dos materiais de
composio lignocelulsica busca o aproveitamento integral dos resduos
agroindustriais, potencializando o rendimento de produto em relao matria-
prima. Como exemplo, pode-se citar que no contexto brasileiro, onde o etanol
produzido utilizando-se apenas uma frao da matria-prima (caldo de cana-
de-acar), tem-se os resduos (bagao excedente e palha) de composio
lignocelulsica, que so passveis de processos hidrolticos, disponibilizando
acares que podem ser fermentados a etanol. Adicionalmente, este tema vem
hoje acompanhado do conceito de Biorrefinaria, que so semelhantes a
refinarias de petrleo, em concepo, entretanto utilizam material biolgico em
oposio s fontes fsseis, para a produo de combustveis para transporte,
substncias qumicas e energia. As Biorrefinarias industriais tm sido
identificadas como as rotas mais promissoras para a criao de um novo
segmento industrial com base nas matrias-primas renovveis. A realidade
nacional se encaixa perfeitamente neste conceito, graas diversidade de
recursos naturais aqui existentes e a vocao do pas para estes
desenvolvimentos.
A produo de etanol a partir de biomassa lignocelulsica lana mo de
pr-tratamentos qumicos/enzimticos para a hidrlise da celulose e da
hemicelulose, fornecendo carboidratos (hexoses e pentoses), que
posteriormente podem ser convertidos a etanol por microrganismos
fermentadores. Dentre os pr-tratamentos, que visam desorganizar o complexo
lignocelulsico, o pr-tratamento cido tem se mostrado uma alternativa
interessante, pois alm de desestruturar o complexo, provoca a hidrlise da
hemicelulose, o que resulta em uma frao lquida contendo, no caso do
bagao de cana, majoritariamente a xilose. Aps o pr-tratamento, o lquido
contendo o hidrolisado hemicelulsico separado de um resduo slido,
composto fundamentalmente de celulose e lignina, denominado de celulignina.
A neutralizao do pH, seguida de uma etapa de deslignificao do resduo
slido gerado necessria quando se vislumbra a hidrlise enzimti ca, a fim
de se aumentar a acessibilidade da celulose ao ataque cataltico.


3
A hidrlise enzimtica da celulose ocorre em condies brandas de
presso, temperatura e pH. Sua alta especificidade elimina a ocorrncia de
furfurais e derivados da lignina, que seriam seguramente produzidos caso a
opo fosse a hidrlise cida da celulose, obstaculizando o processo
fermentativo subsequente. O consrcio enzimtico utilizado na hidrlise da
celulose denominado de celulases, composto por diferentes atividades em
funo da especificidade pelo substrato. Assim, as celulases so divididas em
trs grupos: endoglucanases, que clivam ligaes internas em regies
amorfas da fibra celulsica; exoglucanases, que atuam na regio externa da
celulose cristalina; e -glucosidases, que hidrolisam oligossacardeos solveis
a glicose (LYND et al., 2002; HENRISSAT, 1991). Ressalta-se que estas
enzimas so conhecidas por serem fortemente inibidas pelos seus produtos de
hidrlise (glicose e celobiose). Desta forma, as pesquisas em etanol de
segunda gerao tm sido orientadas para o processo SSF, que combina em
uma s etapa a hidrlise enzimtica e a fermentao alcolica da glicose,
oriunda da hidrlise da celulose (PEREIRA JR., 2008).
Os processos de sacarificao e fermentao alcolica simultneas de
resduos agrcolas so reconhecidos por propiciarem o aproveitamento de
substratos disponveis e de baixo custo, motivo pelo qual vm sendo
empregados na obteno de etanol de segunda gerao e produtos de maior
valor agregado. Esforos tm sido envidados no sentido de se aumentar os
rendimentos e produtividades desses processos (McMILLAN et al., 1999).
A espcie bacteriana Zymomonas mobilis, existente em fontes naturais
como frutas, ou contaminantes benficos de fermentao alcolica industrial ,
capaz de produzir etanol com muita eficincia, fermentando acares pela via
de Entner-Doudoroff. Nesta via, a glicose convertida duas molculas de
etanol e uma de ATP, ao contrrio da via glicoltica clssica, que gera duas
molculas de ATP para cada mol de glicose, produzindo duas molculas de
etanol. Esta espcie classificada como gram-negativa, utiliza sacarose,
glicose e frutose como fonte de carbono e energia, produzindo quantidades
equimolares de etanol e CO
2
(SWINGS & DE LEY, 1977). Pode fermentar 1
mol de glicose em cerca de 1,9 moles de etanol; 1,8 moles de CO
2
e pequenas


4
quantidades de outros subprodutos como lactato, acetaldedo, cido actico e
outros. Este microrganismo utiliza mnima frao de acar como fonte de
carbono, sendo aproximadamente 98% destinados para a fermentao e
apenas 2% para o crescimento. Por isso muito utilizado na fabricao de
bebidas, leite enriquecido com acares fermentveis e em processos de
industrializao de bebidas tradicionais como Pulque (LIEGH, 1985). Devido ao
seu alto potencial fermentativo, Zymomonas mobilis tem sido objeto de
inmeras pesquisas, as quais resultam em uma produo de etanol
comparvel ou at mesmo superior a obtida por leveduras (KANNAN;
SANGILIYANDI; GUNASEKARAN, 1998; DOELLE et al., 1993; YANASE et al.,
1992).
A busca de microrganismos fermentadores de xilose, acar mais
abundante proveniente da frao hemicelulsica, um dos maiores desafios da
Biotecnologia moderna; uma vez que se faz necessria a eficiente e integral
converso dos carboidratos potenciais oriundos de materiais lignocelulsicos.
No entanto, uma limitao ao potencial de Z. mobilis para a produo industrial
de etanol a sua capacidade de utilizar apenas a glicose, frutose ou sacarose
como fonte de energia (YANASE et al., 2005). Desta forma, a engenharia
gentica e metablica aplicada em Z. mobilis apresenta-se como a melhor e
possivelmente a nica alternativa para tornar esta bactria capaz de fermentar
esta pentose, oferecendo uma excelente oportunidade para o processo de
melhoria deste microrganismo.
Com o objetivo de se avanar neste tema e tornar a produo de etanol
de segunda gerao mais eficiente recomenda-se o desenvolvimento de
pesquisa e desenvolvimento, particularmente com a incorporao de tcnicas
da Biologia Molecular, a fim de dotar as linhagens utilizadas no presente estudo
capazes de fermentar tambm a xilose em etanol. Com isto, avanar-se-ia para
a concepo SSCF (Simultaneous Saccharification and Cofermentation), na
qual a fermentao de ambos os acares ocorreriam em uma mesma etapa.
Este trabalho faz parte de uma das linhas de pesquisas desenvolvidas
nos Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos Escola de Qumica/


5
UFRJ, sob a coordenao do Prof. Dr. Nei Pereira Jr., intitulada Produo de
etanol de segunda gerao por Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e
recombinante, empregando biomassa lignocelulsica.
Neste contexto, a presente tese de doutorado est estruturada da
seguinte maneira: aps este captulo introdutrio, realizou-se uma reviso
bibliogrfica sobre o tema, discorrendo sobre a composio de resduos
agrcolas e agro-industriais, seus pr-tratamentos, novas concepes
tecnolgicas para a produo de etanol de segunda gerao, caractersticas da
bactria agente do processo em tela, ressaltando os principais resultados
reportados na literatura (captulo 2). Na sequncia, so apresentados os
objetivos e as justificativas do trabalho (captulo 3), seguidos das metodologias
experimentais e analticas esto descritas no captulo 4. Os resultados esto
apresentados no captulo 5, onde foram discutidos e comparados com base
nas informaes disponibilizadas na literatura especializada. Finalmente, no
captulo 6 registraram-se as principais concluses, bem como as
recomendaes para trabalhos futuros. Por fim, as referncias bibliogrficas
so apresentadas no stimo captulo, atravs das quais todas as informaes
contidas nesse texto podero ser localizadas e, obtidos mais detalhes sobre
seus registros.
Com o desenvolvimento da presente pesquisa, foram publicados
(ANEXO) os seguintes trabalhos:
Artigo publicado em peridico indexado:
Santos, D. S.; Camelo, A. C.; Rodrigues, K. C. P.; Carlos, L. C. & Pereira Jr.,
N. Ethanol production from sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using
Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) Process, Applied
Biochemistry and Biotechnology. v. 161, n. 1-8, p. 93-105, 2010.
Artigos em preparao:
Santos, D. S.; Pea, J. D Santa Anna, L. M. M. & Pereira Jr., N. Optimization of
fermentation conditions for the ethanol production from sugarcane bagasse by
Zymomonas mobilis using Response Surface Methodology.
Santos, D. S.; Reis, V. C. B.; Borges, E. R.; E. R.; Santa Anna, L. M. M; Torres,
F. A. G. & Pereira Jr., N. Preliminary analysis of ethanol production using the
simultaneous saccharification for and co-fermentation process by recombinant
Zymomonas mobilis CP4.



6
Trabalhos em congressos nacionais:
Santos, D. S.; Souza, A. R.; Reis, V. C. B.; Borges, E. R.; Torres, F. A. G. &
Pereira Jr, N. (2012) Produo de etanol a partir de bagao de cana-de-acar
pelo processo de hidrlise enzimtica e co-fermentao simultneas (SSCF) por
Zymomonas mobilis. XIX COBEQ- Congresso Brasileiro de Engenharia Qumica,
Bzios, RJ.
Santos, D. S.; Souza, A. R.; Reis, V. C. B.; Torres, F. A. G. & Pereira Jr, N.
(2012) Ethanol production from glucose and xylose using the recombinat
Zymomonas mobilis CP4. 4 Congresso Brasileiro de Biotecnologia, Guaruj- SP.
Santos, D.S.; Borges, E. R.; Pea, J. D. & Pereira Jr., N. (2011) Produo de
etanol a partir de resduos da indstria de papel atravs do processo SSF por
Zymomonas mobilis XVIII SINAFERM Simpsio Nacional de Bioprocessos,
Caxias do Sul RS.
Santos, D.S.; Pea, J. D. & Pereira Jr., N. (2010) Otimizao da concentrao
de nutrientes complementares ao hidrolisado celulsico do bagao de cana-de-
acar. XVIII COBEQ- Congresso Brasileiro de Engenharia Qumica, Foz do
Iguau, PR
Santos, D.S.; Camelo, A.C.; Schirmer, L.; Santos, D. & Pereira Jr., N. (2009).
Anlise preliminar da produo de etanol do bagao de cana-de-acar pela
bactria Zymomonas mobilis CP4, empregando o processo SSF (Simultaneous
Saccharification and Fermentation). XVII Simpsio Nacional de Bioprocessos
SINAFERM. Natal- RN.
Trabalhos em congressos internacionais:
Santos, D. S.; Borges, E. R.; Souza, A. R.; Carlos, L. C.; Santa Anna, L. M. M.
& Pereira Jr, N. (2012). Preliminary analysis of ethanol production using the
simultaneous saccharification for and co-fermentation process by recombinant
Zymomonas mobilis CP4. 34nd Symposium on Biotechnology for Fuels and
Chemicals.
Santos, D. S.; Borges, E. R.; Souza, A. R.; Carlos, L. C. & Pereira Jr, N. (2011)
Control strategy for the ethanol production from sugar cane bagasse by
Zymomonas mobilis in a fed-batch Bioreactor. International symposium of alcohol
fuels (ISAF).
Santos, D.S.; Pea, J. D.; Carlos, L. C.; Borges, E. R. & Pereira Jr., N. (2011)
Ethanol production from waste paper industry using the Simultaneous
Saccharification and Fermentation process by Zymomonas mobilis. 33nd
Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.
Santos, D.S.; Pea, J. D.; Carlos, L. C.; Gomes, E. B. & Pereira Jr., N. (2010)
Optimization of fermentation conditions for the ethanol production from sugarcane
bagasse by Zymomonas mobilis using Response Surface Methodology. 32nd
Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.
Santos, D.S.; Camelo, A.C.; Carlos, L.C. & Pereira Jr., N. (2009). Ethanol
production from Sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Simultaneous
Saccharification and Fermentation (SSF) Process. 31st Symposium on
Biotechnology for Fuels and Chemicals.
CAPTULO 2: Reviso Bibliogrfica


7

_____________________CAPTULO 2

REVISO BIBLIOGRFICA

Neste captulo so apresentados os diferentes aspectos tericos
referentes temtica abordada: aspectos gerais da produo de
bicombustveis; o bagao de cana como matria-prima para a produo de
etanol; algumas caractersticas relevantes ao processo de aproveitamento do
material lignocelulsico; o microrganismo Zymomonas mobilis sendo
empregado na produo de etanol a partir da glicose e xilose, atravs de
processos de primeira e de segunda gerao; bem como a transformao
gentica no que tange insero de genes que codificam enzimas
responsveis pela metabolizao da xilose: histrico, atualidades,
problemticas e perspectivas.


8
2.1. A ERA DOS BIOCOMBUSTVEIS
A matriz energtica mundial tem participao total de 80% de fontes de
carbono fssil, sendo 38,4% de petrleo, 26% de carvo mineral e 20,5% de
gs natural. A biomassa corresponde apenas a 10,1% da matriz energtica
mundial (IEA, 2008).
Material oleoso e inflamvel, o petrleo atualmente, a principal fonte de
energia. Estimativas apontam que o consumo de petrleo deve passar dos
atuais 88 milhes de barris para 103 milhes de barris em 2015. Os Estados
Unidos e a China esto entre os principais responsveis por este aumento,
conforme observado na figura 2.1 (ANP, 2012).

Figura 2.1. Participao dos pases no consumo mundial de petrleo no ano de
2011. Fonte: ANP (2012).

Todavia, devido ao esgotamento progressivo do petrleo e s ameaas
ambientais que a explorao de fontes no renovveis ocasiona,
particularmente em termos de emisses de CO
2
, a busca por outras fontes de
energia torna-se cada vez mais imperiosa. Desta forma, a indstria qumica do
sculo XXI ser obrigada a passar por uma completa reestruturao,
recorrendo ao uso de recursos renovveis como matria-prima bsica e
36,6%
2,1%
2,6%
2,6%
2,7%
2,7%
3%
3,3%
3,9%
4%
5%
11,1%
21,4%
0% 10% 20% 30% 40%
Outros
Ir
Mxico
Canad
Alemanha
Coreia do
Brasil
Arbia
Rssia
ndia
Japo
China
Estados


9
Biotecnologia para realizao de transformaes qumicas (BRDTAC, 2002;
NRC, 2000; WILKE, 2000).
2.2. ETANOL: O PRINCIPAL BIOCOMBUSTVEL
2.2.1. PANORAMA MUNDIAL
O etanol, tambm denominado lcool etlico (C
2
H
5
OH) produzido desde os
tempos antigos pela fermentao dos acares encontrados em produtos vegetais.
Ainda hoje, grande parte do etanol industrial obtido pelo mesmo processo, embora
tambm possa ser produzido a partir de eteno, derivado do petrleo (BASTOS, 2007).
O uso do bioetanol tem suscitado grande interesse devido alta dos
preos e aos problemas ambientais causados pelos combustveis fsseis.
Trata-se de um produto renovvel com caractersticas combustveis, que
contribui para a reduo do efeito estufa e diminui substancialmente a poluio
do ar, minimizando os seus impactos na sade pblica. Atualmente, este o
principal biocombustvel empregado mundialmente, correspondendo por 10%
da energia mundial. No entanto, estimativas indicam que a utilizao mundial
do mesmo ser de 27% em 2050 (IEA, 2010).
Diversos so os pases com interesse em iniciativas que envolvam o uso
do lcool combustvel, entre os quais se destacam: Austrlia, Guatemala,
Unio Europia, ndia, Japo, Nova Zelndia, Nicargua e Tailndia. Os
importadores tradicionais so os EUA, a Unio Europia, Japo e Coria
(CASTRO, 2005).
O acordo implementado pela PEA, Policy Energy Act, seguida pela
EISA, Energy Independece and Security Act, almejam que em 2022 obtenha-se
cerca de 36 bilhes de gales de bioetanol por ano (LIMAYEM & RICKE,
2012), bem como a Unio Europia almeja o uso de 10% de biocombustveis
de segunda gerao no setor de transporte em 2020 (PORZIO et al. 2012).
Neste contexto, estudos de modelagem realizados por Giacomo et al. (2012)
indicaram que uma planta piloto produziria 40.000 t etanol/ ano a partir de
240.000 t biomassa/ ano.


10
O Brasil e os Estados Unidos produzem o etanol a partir de cana-de-
acar e milho, respectivamente, sendo os maiores produtores mundiais e
juntos respondem por 89% da produo global. De acordo com a Associao
de Combustveis Renovveis, a produo de etanol foi de 10,9 e 12,82 bilhes
de gales nos anos de 2009 e 2010, respectivamente (LIMAYEM & RICKE,
2012), representando 55% da produo mundial. Adicionalmente, a figura 2.2
compara a demanda de etanol nos EUA e no Brasil, indicando que em
dezembro de 2011, os pases consumiram cerca de 44,5 e 19,1 milhes de m
3

deste lcool, respectivamente.

Figura 2.2. Evoluo do consumo de etanol no Brasil e EUA.
Fonte: MME (2012).
2.2.2. PANORAMA NACIONAL
A substituio da gasolina pelo etanol no Brasil comeou em 1975,
quando o governo lanou o Programa do lcool, denominado de PROALCOOL.
Atualmente, o Brasil tem sido lder no uso de combustveis renovveis,
possuindo 851 milhes de hectares de rea total, dos quais cerca de 8 milhes
so utilizadas para plantaes de cana-de-acar (CONAB, 2011; CARVALHO,
2006).
No Brasil, 44,1% da energia fornecida so de origem renovvel, uma das
maiores propores mundiais, contrastando significativamente com a mdia
mundial, de 13,3%, e mais ainda com a mdia dos pases que compem a
Organizao de Cooperao e de Desenvolvimento Econmicos (OCDE), em
sua grande maioria pases desenvolvidos - de apenas 8% (EPE, 2012).


11
A produo nacional em 2010 foi de 27,9 bilhes de litros de etanol, um
grande aumento em relao ao volume de 2002/2003 (12,5 bilhes de litros),
antes da introduo dos veculos flex-fuel. O nmero de licenciamento de
veculos leves em janeiro de 2012 foi de 252,6 mil, apresentando um
crescimento de 9,89% em relao a janeiro de 2011. Desse total, os carros
flex-fuel representaram 83,7%. Em janeiro de 2012, o setor automotivo
alcanou a marca de 15,60 milhes de veculos bicombustveis licenciados
desde 2003 e a sua participao estimada na frota total de veculos leves foi de
48% (CENBIO, 2011; MMA, 2012).
A tabela 2.1 aponta os avanos na produo de etanol para os prximos
anos, indicando que no perodo de 2020/2021 sero produzidos 65,3 milhes
de toneladas de etanol, sendo 49,6 milhes de toneladas voltados para o
consumo interno e 15,7 milhes de toneladas exportao (NICA, COGEN,
2009)
Tabela 2.1. Perspectivas da produo de etanol
2008/2009 2015/2016 2020/2021
Produo de cana de acar
(milhes de toneladas)
562 829 1.038
Etanol
(bilhes de litros)
27,0 46,9 65,3
Consumo interno 22,0 34,6 49,6
Excedente para exportao 4,8 12,3 15,7
Fonte: UNICA, COGEN (2009).
O fato de o Brasil ser o maior pas tropical do mundo um diferencial
positivo para a produo de energia de biomassa. Portanto, considera-se que a
grande quantidade de bagao de cana-de-acar gerado pelos processos de
produo de etanol venha a se tornar matria-prima para outros processos
produtivos, incluindo a produo de mais etanol atravs de tecnologias
portadoras de futuro, gerando emprego e desenvolvimento. Este um cenrio
to promissor que para cada 10 milhes de toneladas de biomassa seca
possvel produzir 600 milhes de gales de etanol, considerando apenas o seu
componente celulsico (PEREIRA, 2008).


12
2.3. CANA-DE-ACAR: A MATRIA-PRIMA BRASILEIRA
PARA PRODUO DE ETANOL
A cana-de-acar (Figura 2.3) uma gramnea, cujo potencial, variado e
complexo, ainda pode ser muito explorado. Tem origem asitica e pertence a
uma das mais importantes e maiores famlias de angiospermas, a Poaceae.
Das seis espcies mais conhecidas, duas so consideradas silvestres
(Saccharum robustum Brandes & Jewiest e Saccharum spontaneum L.) e
quatro cultivadas (Saccharum officinarum L., Saccharum sinense Roxb.,
Saccharum edule Hassk e Saccharum barberi Jewiest.) (DANIELS & ROACH,
1987).

Figura 2.3. Cana-de-acar.
Fonte: NUNES (2008).
So herbceas, perenes, caule do tipo colmo cheio, com ns (de onde
saem gemas) e entrens, epiderme caracterstica, raiz fasciculada e flores
monclinas (JOLY, 2002). As folhas da cana-de-acar so alternas ou
opostas, possuem nervuras paralelinrvias e bainhas largas, so lineares e
podem chegar a 140 centmetros de comprimento. J o fruto bem pequeno,
do tipo cariopse. Dentre seus constituintes qumicos esto o cido hidrocinico,
o cido ascrbico, sais minerais (sobretudo de clcio e de ferro), fibras e
sacarose.
O Brasil o maior produtor mundial de cana-de-acar, seguido da
ndia, China, Tailndia e Paquisto. No Brasil, a cana-de-acar utilizada,
principalmente na produo de lcool (anidro e hidratado) e acar, uma das


13
culturas agrcolas mais importantes em pases tropicais, gerando diversos
recursos e empregos diretos, e contribuindo, dessa forma, para o
desenvolvimento com melhores fontes de renda. O interior paulista, principal
produtor mundial de cana-de-acar, uma das regies mais desenvolvidas do
Brasil, possuindo elevados ndices de desenvolvimento urbano e renda per
capita muito acima da mdia nacional (BNDES, 2006).
2.3.1. PRODUO DE ACAR E ETANOL DO CALDO DE CANA
Para a produo de acar, a cana prensada, submetida a uma etapa
de sulfitao, seguida de clarificao e, por fim, cristalizao, onde obtido o
produto para ser comercializado (NANDY et al., 2002). Diversos tipos de
acares podem ser fabricados, e posteriormente, gerado o melao, um
xarope altamente viscoso que contm cerca de 35% (p/p) de sacarose e 15%
(p/p) de acares invertidos (glicose e frutose).
Para a produo de etanol, o caldo da cana ou o melao diludo so
utilizados como meio de fermentao, resultando em uma soluo com um teor
alcolico de 6-8% (v/v) (COSTA et al., 2001; ROGERS, 2005). Aps a
separao das clulas, da destilao do meio fermentado e da retificao do
destilado, obtm-se o produto com 94-95% (v/v) de etanol (RYAN &
JOHNSON, 2001).
Como exemplo de uma usina que produz tanto acar como lcool
(usina de acar com destilaria anexa), para cada tonelada de cana
processada podem ser produzidos 100 a 150 kg de acar e 70 a 90 L de
etanol, gerando 300 kg de bagao, 980 L de vinhoto, dentre outros resduos
(NANDY et al., 2002).
O vinhoto, resduo da destilao fracionada do caldo de cana-de-acar
fermentado para a obteno do etanol, tem sido aproveitado como fertilizante
ou na produo de biogs. A torta de filtro, resduo composto da mistura de
bagao modo e lodo da decantao, proveniente do processo de clarificao
do acar, um composto orgnico (85% da sua composio) rico em clcio,


14
nitrognio e potssio, com composies variveis dependendo da variedade da
cana e da sua maturao, podendo ser utilizado como fertilizante ou na
composio de ceras.
A biomassa microbiana, gerada com o esgotamento do reciclo celular,
vem sendo utilizada na indstria alimentcia. possvel utilizar a levedura seca
para a produo de rao, uma vez que esse produto possui 40% de protena.
H estudos para a utilizao da levedura seca tambm na alimentao
humana. H oportunidades para a comercializao de gs carbnico (CO
2
),
principalmente para as fbricas de refrigerantes e indstria qumica (ROGERS,
2005).
O potencial energtico da cana-de-acar desmembrado em seus trs
principais contribuintes: para cada tonelada de cana, 1.700 MJ vm do etanol
produzido, enquanto que 2.100 e 2.150 MJ so referentes ao bagao e palha,
respectivamente (MOREIRA, 2000).
A palha (Figura 2.4) no considerada um resduo do processamento
industrial. Este resduo agrcola ainda queimado no campo de colheita.
(BNDES, 2006), embora esta prtica, por fora da lei n 11.241, venha sendo
proibida no estado de So Paulo. O bagao, obtido aps a prensagem dos
colmos de cana, destaca-se por ser gerado em grandes quantidades e possuir
enormes potenciais energticos e biotecnolgicos.

Figura 2.4. Excedente de Palha de cana-de-acar.
Fonte: PEREIRA (2006).


15
2.3.2. BAGAO DE CANA-DE-ACAR
O bagao da cana de acar (Figura 2.5) um resduo lignocelulsico e
um dos subprodutos da indstria da cana.

Figura 2.5. Excedente de Bagao de cana-de-acar.
Fonte: PEREIRA (2006).
A Companhia Nacional de Abastecimento estima que a produo de
cana-de-acar deva crescer 6,5% na safra 2012/13 e atingir 596,63 milhes
de toneladas, gerando cerca de 180 milhes de toneladas de bagao de cana
(CONAB, 2012). Atualmente, 90% do bagao gerado na usina consumido
para produo de energia por meio da co-gerao, tornando a usina auto-
sustentvel energeticamente.
Este material, constitudo por celulose, hemicelulose e lignina, compe
em mdia, 28% do peso da cana de acar. Sua composio elementar de
44,6% de carbono, 5,8% de hidrognio, 44,5% de oxignio, 0,6% de nitrognio,
0,1% de enxofre e 4,4% de outros elementos (SIMES, 2005). Neste contexto,
a tabela 2.2 apresenta a composio qumica do bagao de cana em base
mida, indicando que h mais de 20% de hexoses e 10% de pentoses.
A hemicelulose e a celulose apresentam-se como uma das principais
fraes estruturais do bagao de cana, representando uma fonte potencial de
xilose e glicose, respectivamente; porm, a obteno desses acares requer a
aplicao de tcnicas que permitam a sua extrao seletiva. No caso da


16
extrao de xilose, so utilizadas diferentes metodologias de solubilizao e
hidrlise, dentre as quais o pr-tratamento cido normalmente empregado
(BETANCUR & PEREIRA JR, 2010; FUJITA et al., 2004).
Tabela 2.2. Composio qumica mdia do bagao de cana
Composio qumica (%)
Glicose 19,50
Xilose 10,50
Arabinose 1,50
Galactose 0,55
Lignina 9,91
Organosolveis 2,70
Outros AR 1,85
Cinzas 1,6
Umidade 50,00
Hexoses Totais 20,04
Pentoses Totais 12,00
Fonte: SOARES (2011). Onde: AR: acares redutores.
Neste contexto, o bagao de cana-de-acar apresenta-se como um dos
materiais lignocelulsicos com maior potencial para a obteno de diversos
produtos de interesse comercial. No que tange produo de etanol, so
realizadas reaes qumicas e/ou biolgicas, aumentando-se a produtividade
das indstrias. Estimativas estabelecem que a produo de etanol no Brasil
possa ser duplicada, sem a necessidade de aumentar reas de cultivo de cana-
de-acar (PEREIRA, 2008).
2.4. MATERIAIS LIGNOCELULSICOS
2.4.1. MATRIA-PRIMA PARA A PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Os materiais lignocelulsicos constituem-se em matria-prima para a
produo de etanol, bem como de outros produtos utilizados em diversos
segmentos industriais, devido ao seu carter renovvel, abundante e de seu
baixo custo (BINOD et al., 2010; YAMASHITA et al., 2008; DEMIRBAS, 2003).
Devido grande disponibilidade de resduos agrcolas foi estimado que
491 bilhes de litros deste biocombustvel possam ser gerados a partir de


17
biomassa lignocelulsica residual, ampliando em at 16 vezes a sua produo
anual (BINOD et al., 2010; SARKAR et al., 2012). S nos Estados Unidos, a
biomassa residual gerada estimada em torno de 1,4 bilhes de toneladas de
matria seca por ano, 30% originadas de florestas. Neste contexto, tais
biomassas podem suprir em grande escala a produo deste combustvel,
utilizando diferentes resduos agro-industriais (CARDONA & SANCHEZ, 2007;
HU et al., 2008; CARDONA et al., 2009).
Atualmente, os resduos derivados de materiais lignocelulsicos mais
promissores para serem empregados em bioprocessos so o bagao de cana,
palha de arroz, de milho e de trigo, provenientes da Amrica do Sul, sia,
Estados Unidos e Europa, respectivamente (KADAM & MCMILLAN, 2003;
CHENG et al., 2008). Segundo Sarkar et al. (2012), a sia gera cerca de 667,6
milhes de toneladas de palha de arroz e 145,2 milhes de toneladas de palha
de trigo, enquanto que a Amrica produz 140,86 milhes de toneladas de palha
de milho.
Embora alguns destes resduos sejam utilizados como rao animal,
combustveis domsticos ou mesmo para co-gerao de energia, grande parte
ainda inutilizada, constituindo-se em excedentes. Adicionalmente, muitos
pases da Europa Ocidental probem a queima no campo, menos de 1% de
palha de milho recolhida para o processamento industrial, bem como cerca
de 5% utilizado como alimento e forragem para animais. No entanto, nos
Estados Unidos, mais de 90% de palha de milho deixada nos campos
(BANERJEE, 2010).
Adicionalmente, a indstria de celulose tambm gera resduos
industriais, contendo alto teor de fibras de celulose (cerca de 80%) com
potencial suficiente para se tornar tambm matria-prima. Isto se deve,
principalmente, presena destes materiais em abundncia e a no
necessidade das etapas de pr-tratamento para muitos deles, uma vez que no
processo realizada a deslignificao das polpas, que permite a remoo de
grande parte da lignina para obteno da celulose (SILVA, et al., 2009).
Neste contexto, segundo a associao brasileira de celulose e papel, nos


18
ltimos 10 anos, a produo mundial de papel cresceu 35%; sendo que o Brasil
somou 8,2 milhes de toneladas de papel em 2004 e ocupou a posio de
stimo maior fabricante mundial de celulose, com cerca de 9,4 milhes de
toneladas (BRACELPA, 2006).
2.4.2. ESTRUTURA CELULAR
A estrutura microscpica da maioria das clulas vegetais formada por
uma parede celular rgida composta basicamente de polissacardeos (cerca de
70% da massa) com propriedades fsico-qumicas tais como plasticidade,
elasticidade, resistncia tenso e decomposio por microrganismos.
Conforme ilustrado na figura 2.6, a parede celular dos materiais
lignocelulsicos formada por arranjos/concntricos divididos em camadas
com diferente composio qumica e orientao dos elementos estruturais
(FENGEL & WEGENER, 1991).

Figura 2.6. Diagrama da estrutura das camadas da parede de uma fibra.
Onde: PP: Parede Primria; Subdividida em 3 camadas: S1, S2, S3; PS:Parede
Secundria, LM: Lamela Mdia. Fonte: BRUM (2007).
A parede primria a camada depositada durante o aparecimento da
clula, onde as fibrilas de celuloses formam arranjos com aspectos de redes.
Alm da celulose, polioses (hemiceluloses), pectinas e protenas tambm esto
presentes na parede primria, envolvidas pela lignina. A parede primria fina
e elstica nas clulas vegetais mais jovens. J nas clulas adultas, esta parede


19
sofre um espessamento, que pode formar internamente parede primria, uma
parede secundria, composta de lignina, hemicelulose e suberina. A formao
da parede secundria no uniforme, o que pode ser constatado por locais
onde ocorre interrupo da sua formao, as chamadas pontuaes
(SJSTRM, 1981; FENGEL & WEGENER, 1991).
A celulose, a pectina e as glicoprotenas, formam a parede celular das
clulas vegetais e contribuem em sua textura rgida. Quando analisada mais
detalhadamente nota-se que a parede celular formada por uma trama de
fibrilas de celulose. Existem algumas camadas distintas que formam a parede
celular: a camada mais interna que delimita o lmem celular, denominada de
lamela terciria; a camada intermediria formada pela parede secundria, que
pode ser formada por quatro lamelas, lamela transicional, parede primria,
lamela mdia, camada externa, em contato com a parede primria. A lamela
mdia uma camada fina (0,2 a 1 m) que une as clulas entre si para formar
o tecido e possui grandes quantidades de lignina (SJSTRM, 1981; FENGEL
& WEGENER, 1991).
Cada uma das fibrilas que compem a trama de celulose formada pela
agregao de mais ou menos 250 microfibrilas, as quais so constitudas por
pequenos nmeros de feixes de molcula de celulose (fibrilas elementares),
sendo que cada molcula de celulose formada por mais de mil resduos de
glicose, os quais se interligam por pontes de oxignio (FENGEL & WEGENER,
1991).
Em alguns pontos das fibrilas elementares as molculas de celulose
esto dispostas de maneira desordenada e em outros pontos, este
polissacardeo se dispe ordenadamente, formando as micelas de estrutura
cristalina. Entre as fibrilas, microfibrilas e fibrilas elementares ocorrem outros
componentes da parede celular como a hemicelulose, lignina, etc. Quando no
h a presena destas outras substncias, ocorrem microcapilares que
transportam gua e outros solutos, o que confere parede celular uma grande
permeabilidade gua (SJSTRM, 1981).


20
2.4.3. CONSTITUIO QUMICA
Como se pode observar na figura 2.7, os materiais lignocelulsicos so
constitudos basicamente pelos compostos estruturais ou celulares. Alm da
celulose, lignina e hemicelulose, outros constituintes menores tambm se
mostram presentes. Estes incluem compostos orgnicos tambm chamados de
extrativos (steres, lcoois, esterides e outros) e inorgnicos (sulfatos,
oxalatos, carbonatos e silicatos de clcio, potssio e magnsio,
principalmente). As propores entre os constituintes dependem do tipo de
material (LEWIN & GOLDSTEIN, 1991).

Figura 2.7. Principais componentes de materiais lignocelulsicos.
Fonte: RITTER (2008).
A tabela 2.3 indica a composio qumica bsica de alguns dos
principais resduos lignocelulsicos. Conforme observado, a massa seca
vegetal composta por cerca de 70% de polissacardeos, sendo que 40-60%
de celulose, 20-40% de hemicelulose e 15-25% de lignina (BALAT et al., 2008).


21
Tabela 2.3. Composio qumica dos resduos agrcolas (%)
Resduos Celulose Hemicelulose Lignina Protena Cinzas
Palha de arroz 32-47 19-27 5-24 - 12,4
Palha de trigo 35-47 20-30 8-15 3,1 10,1
Palha de milho 42,6 21,6 8,2 5,1 4,3
Bagao de
cana-de-acar
33-36 28-30 18,4 3 2,4
Fonte: SARKAR et al. (2012)
A hemicelulose e celulose so estruturas duras e fibrosas, entremeadas
por uma macromolcula composta por lcoois aromticos, a lignina, que se
encontra unida por ligaes covalentes e de hidrognio (LEE, 1997).
2.4.2.1. Celulose
A celulose (C
6
H
10
0
5
)n, principal componente da parede celular da fibra
vegetal, um polmero de cadeia longa composto de um s monmero
(glicose) e por isso classificado como homopolissacardeo. a matria
orgnica mais abundante sobre a Terra, consistindo aproximadamente em 50%
de toda a biomassa e uma produo anual de cerca de 100 bilhes de
toneladas (YANG et al., 2007).
Estudos obtidos na rea de espectroscopia no infravermelho,
ressonncia magntica nuclear e difratometria de raios-X permitiram constatar
que a molcula de celulose tem uma forte tendncia a formar ligaes de
hidrognio (LAKABI, 1990). Sua estrutura forma-se pela unio de molculas de
-D-glicose atravs de ligaes -1,4-glicosdicas carbono-carbono, nas quais
se estabelecem inmeras ligaes de hidrognio entre os grupos hidroxilas das
distintas cadeias juntapostas de glicose, fazendo-as impenetrveis a gua e,
portanto, insolveis, originando fibras compactas que constituem a parede
celular dos vegetais, dando origem a um polmero linear (LEMOS, 2001).
O comprimento das cadeias de celulose pode variar de 1.000 a 15.000
unidades de glicose, dependendo da origem e do possvel grau de degradao
durante o processo de isolamento (FENGEL & WEGENER, 1991). Seu
tamanho normalmente expresso em termos do grau de polimerizao, ou


22
seja, o nmero de unidades de glicose anidra presente em cada fibra. No
entanto, a anlise estrutural da cadeia polimrica informa que sua unidade de
repetio a celobiose, conforme mostrado na figura 2.8 (RAMOS, 2003). Isto
se deve s ligaes do tipo , pelas quais os monmeros de glicose so
unidos, fazendo com que molculas adjacentes encontrem-se arranjadas com
uma rotao de 180 entre si (STRYER, 1996).
Este tipo de ligao permite que haja ligaes no s intramoleculares,
mas tambm intermoleculares, do tipo ligaes de hidrognio e foras de van
der Waals, decorrendo na formao de fitas planas de anis de glicopiranose
simetricamente dispostas que compem uma estrutura altamente cristalina,
estvel e com uma alta fora de tenso (ZHANG & LYND, 2004).

Figura 2.8. Estrutura simplificada da cadeia linear da celulose, formada por
vrias unidades consecutivas de celobiose.
Fonte: TMR-BALZSY & EASTOP (1998).
Conforme observado na figura 2.9, o principal tipo de ligaes de
hidrognio intermoleculares (entre molculas de glicoses adjacentes) ocorre
entre o C6-OH e o oxignio do C3, ao longo da cadeia de celulose (LAI, 1996),
fazendo com que as molculas se alinhem, formando as rnicrofibrilas, as quais
se ordenam para formar as paredes celulares (FENGEL & WEGENER, 1991).
Como resultado das ligaes de hidrognio, as molculas de celulose
podem formar regies cristalinas e amorfas (BRISTOW & KOLSETH, 1986;
MITRA & MUKHELJEE, 1980). As regies cristalinas apresentam um arranjo
ordenado das cadeias moleculares, que resulta de espaamentos
interatmicos, os quais se repetem tridimensionalmente e difratam raios-X
(SJSTRM, 1981; LAKABI, 1990). Entre essas regies se encontram as
regies amorfas ou desordenadas, em que as cadeias podem ser deformadas
e assumir formas encurvadas. No entanto, supe-se que no existam limites


23
bem definidos entre essas regies e, sim, transies contnuas entre elas,
podendo existir nas regies desordenadas cadeias mais ou menos paralelas
at completamente aleatrias (KOGA, 1988).

Figura 2.9. Representao das ligaes de hidrognio na estrutura da
celulose. Fonte: GARRET & GRISHAM (1999).
2.4.2.2. Hemicelulose
Outro componente essencial na parede celular das plantas so as
hemiiceluloses. Estas macromolculas esto intimamente ligadas celulose,
definindo propriedades parede celular e desempenhando funes de
regulao do crescimento e desenvolvimento das plantas (FENGEL &
WEGENER, 1991; LIMA & RODRIGUES, 2007). As hemiceluloses so
polissacardeos formados por diferentes unidades de acares pertencentes
aos grupos das pentoses, hexoses, cidos hexournicos e desoxiexoses.
Estes polissacardeos consistem, principalmente, de cadeias polimricas
ramificadas com grau de polimerizao de 100 a 200 unidades de acares,
entre os quais incluem, como principais componentes: glicose, galactose,
manose, xilose, arabinose e cido glucurnico (Figura 2.10), que podem ser
lineares ou ramificados, alm de serem amorfos e possurem massa molecular
relativamente baixa (LIMA & RODRIGUES, 2007).


24
As hemiceluloses encontram-se intercaladas s microfibrilas de celulose,
promovendo a elasticidade e impedindo que elas se toquem (RAMOS, 2003).
Estas macromolculas so solveis em gua e facilmente solubilizados em
soluo alcalinas. Apresentam-se divididas em xilanas, mananas, galactanas e
galacturonanas e suas unidades monomricas so unidas por ligaes do tipo
1,3; 1,4 e 1,6 (SZENGYEL, 2000). Destas molculas, as presentes em maiores
propores so as xilanas (BISSOON et al., 2002), que consistem em
molculas de xilose unidas por ligao -1,4 (DAMASO et al., 2004).
Diferentemente da celulose, as hemiceluloses so constitudas por
vrios tipos de unidades de acares. Estas macromolculas so ramificadas e
apresentam cadeias curtas, alm de serem solveis em lcalis fortes e so
fundamentalmente amorfas, sendo mais suscetveis a pr-tratamentos
qumicos (SHLESER, 1994).

Figura 2.10. Monossacardeos constituintes das hemiceluloses. Onde: (1) D-
Glucose; (2) D-Galactose; (3) L-Arabinose; (4) D-Xilose; (5) D-Manose; (6) 4-O-
Metil-D-Glucurnico; (7); L-Ramnose. Fonte: SJSTRM (1999).
2.4.2.3. Lignina
Uma das substncias orgnicas macromoleculares naturais mais
abundantes da Terra a lignina, que ocupa cerca de 30% dos carbonos da
biosfera (FENGEL & WEGENER, 1991). Sua estrutura bastante heterognea
e consiste em uma rede de anis aromticos unidos, principalmente por
ligaes alquil-aril-ter, formando um arranjo amorfo com grandes quantidades
de ligaes cruzadas entre os anis aromticos (ARGYROPOULOS &


25
MENACHEM, 1997) (Figura 2.11).
As ligninas so substncias de estruturas complexas, macromolculas
tridimensionais fenilpropanidicas formadas pela polimerizao dos lcoois p-
cumarlico, coniferlico e sinaplico (BRISTOW & KOLSEI, 1986; FENGEL &
WEGENER, 1991). A proporo destes trs compostos resulta em diferentes
tipos de ligninas: as formadas pela combinao dos lcoois coniferlico e p-
cumarlico apresentam estruturas mais complexas do que as formadas pelos
lcoois coniferlico e sinaplico (FENGEL & WEGENER, 1991; ABREU &
OERTEL, 1999). Sabe-se que os polmeros derivados do lcool sinaplico so
os principais responsveis pela ligao com a frao hemicelulsica contida
nessa biomassa (SUN et al., 2004).

Figura 2.11. Estrutura simplificada da lignina.
Fonte: FENGEL & WEGNER (1991).
Durante o desenvolvimento das clulas, a lignina incorporada como o
ltimo componente na parede, interpenetrando as fibrilas e, assim, conferindo
rigidez, impermeabilidade e resistncia a ataques microbiolgicos. Estas
ligaes so, em parte, responsveis pela forte e rgida natureza da molcula


26
da celulose na estrutura da fibra vegetal (FENGEL & WEGENER, 1991;
MESHITSUKA & LSOGAI, 1996). Nas partes da madeira, age como agente
permanente de ligao entre as clulas, gerando uma estrutura resistente ao
impacto, compresso e dobra.
A lignina, por ser altamente energtica, pode ser utilizada para produzir calor e
eletricidade necessrios ao processo de produo de etanol. Alm disso, pode ser
utilizada para formao de diversos produtos, incluindo compostos fenlicos,
aromticos, cidos dibsicos e metil, formado pela reao da frao fenlica com
lcoois (WYMAN, 1994).
2.5. PR-TRATAMENTO DOS MATERIAIS LIGNOCELULSICOS
O pr-tratamento tem por objetivo aumentar a rea de superfcie da
biomassa, aumentar a porosidade dos materiais e reduzir a cristalinidade da
celulose (Figura 2.12).

Figura 2.12. Efeito do pr-tratamento qumico em materiais lignocelulsicos.
Fonte: HECTOR (2009).

O pr-tratamento de biomassa Iignocelulsica uma etapa que aumenta
significativamente a eficincia da hidrlise enzimtica da celulose para
posterior fermentao, realizada por leveduras ou bactrias produtoras de
etanol (McMILLAN, 1994). Enquanto o pr-tratamento cido promove a
hidrlise da frao hemicelulsica, o alcalino resulta na remoo de parte da


27
frao de lignina, expondo as fibras de celulose e tomando a celulose mais
acessvel ao ataque enzimtico (HAHN-HAGERDAL et aI., 2006).
2.5.1. PR-TRATAMENTO CIDO
Esta tcnica efetiva na solubilizao do componente hemicelulsico da
biomassa, provocando desacetilao e despolimerizao da frao
hemicelulsica. Combinaes entre concentrao de cido, temperatura e
tempo de reao podem gerar grandes quantidades de acares provenientes
da frao hemicelulsica (BAUDEL, 2006).
Durante o pr-tratamento cido, os catalisadores liberam prtons que
clivam as ligaes heterocclicas de ter entre os monmeros das cadeias
macromoleculares da hemicelulose e, no caso de cidos concentrados, da
celulose (BORGES, 2011). Aps clivagem da hemicelulose so liberadas
diversas substncias, sendo majoritria a presena de xilose, glicose e
arabinose na maioria dos materiais lignocelulsicos. Entre os cidos utilizados
para este tipo de pr-tratamento, encontram-se: H
2
SO
4
, HCl, HF, CH
3
COOH e
HNO
3
(AGUILAR et al., 2002; SUN & CHENG, 2002; CUZENS & MILLER,
1997; RODRGUEZ-CHONG et al., 2004).
Alm do pr-tratamento da biomassa lignocelulsica empregando cidos
utiliza-se tambm exploso a vapor, a qual consiste no aquecimento do
material com vapor saturado em temperaturas elevadas. Posteriormente, tal
processo seguido de uma sbita descompresso do equipamento,
produzindo assim, o "slurry", resultante da fragmentao da biomassa
(BAUDEL, 2006).
A utilizao de H
2
SO
4
permite uma elevada reatividade da fibra
celulsica, apresentando cerca de 90% de digestibilidade da mesma ao ataque
enzimtico; porm, ao empregar elevadas concentraes deste composto, o
processo demanda complexas configuraes de equipamentos, necessitando
de elevado consumo de gua e energia (BAUDEL, 2006). Aps esta etapa
necessria a neutralizao do pH (MARTN et al., 2007).


28
2.5.2. PR-TRATAMENTO ALCALINO
O tratamento alcalino, empregado aps execuo do pr-tratamento
cido, o qual visa remoo de hemicelulose, consiste na remoo de Iignina
da biomassa, causando o desnovelamento da estrutura lignocelulsica,
separando as ligaes entre lignina e carboidratos, reduzindo o grau de
polimerizao, bem como de cristalinidade e aumentando a porosidade das
matrias-primas lignocelulsicas (SUN & CHENG, 2002).
O efeito deste pr-tratamento varia de acordo com as concentraes de
lcalis, tempo reacional, assim como combinaes de pH e temperatura em
condies moderadas. Estudos recentes de Stenseng (2001) investigaram o
uso do ultra-som no auxlio da hidrlise, onde o pequeno aumento da eficincia
explicado pela ao mecnica deste na parede celular, resultando em maior
acessibilidade e consequente extrao dos componentes da hemicelulose e
lignina. Visando contornar a formao de compostos inibitrios, Karagos et al.
(2012) e Karimi et al. (2008) empregaram o perxido alcalino na biomassa
lignocelulsica. Os autores no detectaram concentraes de furfural e HMF,
favorecendo as etapas fermentativas do processo para a obteno de etanol.
2.5.3. INIBIDORES
Todavia, em consequncia das altas temperaturas empregadas nos pr-
tratamentos qumicos, os acares originados se degradam, provocando a
formao de compostos que podem interferir, posteriormente, no processo de
fermentao e hidrlise do material lignocelulsico. Martin et aI. (2007)
relataram a produo dos seguintes inibidores: cido actico (formado pela
hidrlise do grupo acetil presente na frao hemicelulsica), aldedos, lcoois
aromticos, bem como compostos fenlicos (formados principalmente pela
degradao parcial da Iignina) e furaldedos, como o furfural e o 5-
hidroximetilfurfural (HMF) (formados pela degradao de pentoses e hexoses);
estes que por sua vez podem dar origem a outros produtos, como os cidos
frmico e levulnico, respectivamente (RANATUNGA et al., 1997, JARDINI et
al., 2009).


29
O cido actico o composto presente nos hidrolisados que apresentou
maior inibio sobre Z. mobilis, seguido do furfural, o qual apresentou efeito
moderado. Adicionalmente, os cidos orgnicos e os aldedos resultaram em
maiores toxicidades ao microrganismo do que a presena de derivados da
lignina e alcalides (RANATUNGA et al., 1997). Desta forma, Baudel et al.
(2006) enfatiza que o pr-tratamento deve ser eficiente em termos de
rendimento e funcionalidade, com reduo de insumos qumicos e de energia,
visando uma menor gerao desses compostos inibitrios.
2.5.4. HIDRLISE ENZIMTICA
A converso da celulose glicose enzimaticamente catalisada por um
grupo de enzimas denominadas celulases, as quais rompem as ligaes
glicosdicas das microfibrilas de celulose, resultando na liberao de
oligossacardeos, celobiose e glicose. Este processo de crucial importncia
na ciclagem de nutrientes, uma vez que tal polmero representa cerca de 40%
do material de origem vegetal (DILLON, 2004).
Embora existam muitas bactrias celulolticas, especialmente os
anaerbios Clostridium thermocellum e Bacteroides cellulosolvens, que
produzem celulases com altas atividades especficas (UI/mg protena), estes
microrgansimos no produzem altas concentraes de enzima, pois possuem
baixa taxa de crescimento em celulose. Dessa forma, a maioria dos estudos
sobre produo de celulase comercial est centralizada em fungos
filamentosos (DUFF & MURRAY, 1996).
Dentre os fungos que produzem celulases esto as espcies Sclerotium
rolfsii, Phanerochaete chrysosporium e principalmente os pertencentes aos
gneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum. De todos estes
gneros, Trichoderma reesei o mais reportado na literatura, possuindo pelo
menos cinco tipos de endoglucanases (MARTINS, 2005).
A ao sinrgica dos componentes individuais do sistema de celulases
(Figura 2.13), composto por endoglucanases, exoglucanases e -glucosidase


30
(CHAHAL, 1991) tem sido relatada por diversos trabalhos (BGUIN &
AUBERT, 1994; BHAT & BHAT, 1997; MANSFIELD & MEDER, 2003; MAEDA
et al., 2011). Basicamente, as endoglucanases atacam as regies de baixa
cristalinidade da fibra celulsica, criando extremidades livres na cadeia; as
exoglucanases degradam ainda mais a molcula atravs da liberao de
unidades de celobiose das extremidades livres da cadeia e as glucosidases
hidrolisam as molculas de celobiose, produzindo glicoses (COUGHLAN &
LJUNGDAHL, 1988). Cabe ressaltar que existem outras enzimas auxiliares que
atacam a hemicelulose, como as glucuronidases, acetilesterases, xilanases, -
xilosidases, galactomannanases e glucomannanases (DUFF & MURRAY,
1996).

Figura 2.13. Atuao sinrgica das celulases. BG: -Glicosidases, CBH:
Celobiohidrolases, EG: Endoglucanases, R: Terminal redutor, NR: Terminal
no redutor. Fonte: USDOE (2003).
O acmulo gradativo dos produtos finais da hidrlise enzimtica, como a
celobiose e a glicose, resulta na inibio da atividade das prprias enzimas do
complexo celulsico. Vrios mtodos tm sido desenvolvidos com o intuito de
contornar essa problemtica, incluindo a utilizao de elevadas concentraes
enzimticas, a suplementao de -glucosidases durante a hidrlise, bem
como a adoo da estratgia de sacarificao e fermentao simultneas (SUN
& CHENG, 2002).
Dentre os diversos fatores que podem afetar a hidrlise enzimtica esto
includos: tamanho de partcula, porosidade do material, presena de fibras


31
cristalinas na celulose, assim como presena de Iignina e de hemicelulose, as
quais dificultam o acesso da enzima celulose, resultando na reduo da
eficincia do processo de hidrlise. Neste contexto, a relao slido:lquido, a
atividade das celulases, as condies de reao (tempo, temperatura e pH), as
quais normalmente so amenas, bem como a composio do meio especfico e
o tempo de fermentao tambm apresentam grande importncia no processo
enzimtico (SUN & CHENG, 2002; OLIVEIRA & VASCONCELOS, 2006).
De acordo com Baudel (2006), a disponibilidade da glicose oriunda da
celulose, em termos de custo global, rendimento glicosdico e fermentabilidade
do hidrolisado apresenta-se como um obstculo no que tange viabilizao
econmica da produo do bioetanol proveniente de resduos lignocelulsicos.
Desta forma, a tcnica de reciclo enzimtico aumentaria o rendimento de
hidrlise, reduzindo consideravelmente o custo do processo, porm, cabe
ressaltar que a eficincia de hidrlise diminui gradativamente a cada reciclo
(XIN, 1993).
2.6. A BACTRIA Zymomonas mobilis
Cosmopolita, a bactria Z. mobilis encontra-se em reas tropicais da
Amrica, sia e frica. Esta bactria foi originalmente descoberta em
fermentaes com seivas de plantas ricas em acar, como a seiva do agave
no Mxico e em vinho de palmceas. Foi identificada como contaminante em
melao, em cidras e em cervejas produzidas em pases da Europa. Hoje em
dia, produzem-se bebidas alcolicas de sucos de frutas por fermentao mista
com Zymomonas sp. associada a leveduras (VIIKARI & LINKO, 1986; LIEGH et
al., 1985; OMULLEN et al., 1991).
2.6.1. BREVE HISTRICO
Os primeiros estudos sobre Zymomonas mobilis datam do incio do
sculo XX. Em 1911, esta bactria foi isolada por Baker e Hillier a partir da
cidra, uma bebida produzida pela fermentao do suco de ma, que
freqentemente se deteriorava e apresentava sinais caractersticos como


32
formao de espuma, liberao de gases e aumento da acidez, gerando um
lquido turvo, com depsito no fundo da garrafa (SWINGS & DE LEY, 1977).
Contudo, a descoberta da bactria comumente atribuda a Lindner, que
a isolou no Mxico, em 1924, a partir da seiva fermentada do Agave atrovirens,
conhecida como pulque, uma bebida alcolica de 4 a 6% em etanol, dando
bactria o nome de Thermobacterium mobile (CHANG et al., 1981;
MONTENECOURT, 1985; PARKER et al.,1995). Em 1931, Kluyver e
Hoppenbrouwers modificaram o nome da bactria para Pseudomonas lindneri,
devido a sua semelhana bioqumica com a famlia Pseudomonadaceae.
Somente em 1936, Kluyver e van Nielr criaram o gnero Zymomonas e
deram o nome de Zymomonas mobilis bactria, por existirem maiores
diferenas do que similaridades com essa famlia (PARKER et al.,1995). Em
1937, Shimwell isolou Zymomonas sp. durante a primeira etapa de
fermentao da cevada, na elaborao da cerveja e lhe deu o nome provisrio
de Achromobacter anaerobium.
Na dcada de 50, esta bactria chamou a ateno dos bioqumicos por
utilizar uma via metablica semelhante utilizada por microrganismos
estritamente aerbios, como os do gnero Pseudomonas. Em 1950, lhe deram
o nome de Saccharomonas sp. e em seguida, foi denominada como
Zymomonas anaerobia (VIIKARI & KORHOLA, 1986). Em 1956, j havia sido
reportada como: A. anaerobium e T. mobile. Neste perodo, j era conhecida a
sua capacidade de produzir levana, um polmero de frutose, que possui
diversas utilidades na indstria alimentcia. Nos anos 70, esta bactria foi
apontada como a mais rpida e eficiente produtora de etanol, empregando
sacarose, glicose ou frutose como nicas fontes de carbono e energia (DOELE
et al., 1993).
No Brasil, a pesquisa com Z. mobilis foi iniciada pelo pesquisador
Gonalves de Lima em 1952, quando trouxe do Mxico a cepa AG11. Em
1970, este pesquisador isolou as linhagens CP1, CP2, CP3 e CP4 de amostras
de caldo de cana-de-acar ligeiramente degradadas. A linhagem conhecida


33
como CP4 foi mundialmente distribuda e tem sido detectada como
contaminante nas indstrias de fermentao alcolica (ABUD, 2005).
2.6.2. CARACTERSTICAS GERAIS
Zymomonas mobilis uma bactria Gram-negativa, no patognica que
engloba apenas uma espcie, dividida em duas subespcies: Zymomonas
mobilis subespcie mobilis e Zymomonas mobilis subespcie pomaceae
(SWINGS & DE LEY, 1977).
Estas bactrias podem ocorrer isoladamente, embora seja mais comum
sua ocorrncia aos pares (Figura 2.14). No possuem cpsulas e no formam
esporos e, em sua grande maioria, no possuem mobilidade (algumas
linhagens perderam a mobilidade, embora cerca de 30% so mveis). Suas
clulas possuem a forma de bastonetes com 2 a 6 m de comprimento e de 1 a
1,5 m de largura, com extremidades arredondadas, possuindo de 1 a 4
flagelos polares. As colnias apresentam colorao branca ou creme,
crescentes em temperaturas em torno de 30C (FALCO DE MORAIS, 1983).

Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4. Fonte: PALHA (2002).

O crescimento celular ocorre na faixa de pH variando de 3,5 a 7,5,
embora a faixa tima seja entre 5 a 7. Muitas linhagens crescem a pH 3,5 e 4,
igualmente como ocorre com as bactrias acticas, que apresentam habilidade
de crescimento em valores de pH entre 4 e 4,5 (SWINGS & DE LEY, 1977;
SCHMIDT et al., 1986; ERZINGER & VITOLO, 2006).


34
Desta forma, as bactrias do gnero Zymomonas se assemelham
maioria das bactrias acticas, por apresentarem rpido consumo de glicose,
ciclo de Krebs incompleto, ocorrncia do mecanismo de Entner Doudoroff e, no
caso das linhagens que possuem mobilidade, por apresentarem flagelos
polares. Alm disso, estes microrganismos ocorrem em plantas e preferem
crescer em nichos ricos em sucos de plantas, tolerando um pH baixo. Apesar
de sua alta capacidade fermentativa, Zymomonas mobilis apresenta funes de
cadeia de transporte de eltrons e bom crescimento em ambientes
microaerbicos, ocupando uma posio taxonmica claramente prxima dos
organismos aerbios Glucanobacter e Acetobacter (SPRENGER, 1996).
Algumas linhagens de Zymomonas, assim como a maioria das bactrias
acticas so hbeis em crescer em meio contendo 20% de glicose.
Adicionalmente, grande parte destas linhagens hbil em crescer em meio
contendo 40% de glicose, de forma semelhante a muitas bactrias acticas,
que so capazes de crescer rapidamente em um meio contendo 50% de
glicose. No vinho da palma, a principal bactria tolerante ao alto contedo de
glicose, frutose, sacarose e, em consequncia, ao contedo alcolico, assim
como tambm ocorre no caldo de cana-de-acar e no mel de abelhas
(VIIKARI & LINKO, 1986).
As bactrias do gnero Zymomonas possuem mecanismos de
adaptao para crescer em presena de etanol. Esses mecanismos incluem a
alterao da composio da sua membrana lipdica, evitando assim a
penetrao de etanol no interior da clula, aumentando-se as propriedades da
barreira hidrofbica e diminuindo a perda de material intracelular. Em nveis
acima do mximo tolervel, o lcool atua na dissoluo da membrana
citoplasmtica, de composio fosfolipdica, afetando a sua fluidez e
aumentando a sua permeabilidade, resultando no fluxo de ons, cofatores e
coenzimas para o meio exterior (SCHMIDT et al., 1986).
2.6.2.1. Biologia molecular bsica de Zymomonas mobilis
O genoma da bactria Zymomonas mobilis apresenta cerca de 1,53
0,19.10
9
Da, 56% do tamanho do genoma de Escherichia coli podendo


35
acomodar cerca de 1500 cstrons, bem como 48,5 1,0% de composio das
bases nitrogenadas G e C. Alguns genes presentes no microrganismo em
estudo apresentam destaque em relao possvel origem gentica. Neste
contexto, o gene adh (40 kDa), o Gap (36,1 kDa) e o phoC (29 kDa)
apresentam homologias com o Adh IV de S. cereviseae (SWINGS & DE LEY,
1977), com microrganismos termoflicos, e com isoenzimas de cloroplasto
(POND et al., 1989); assim como semelhana com genes de E. coli, e com
sequncias reguladoras de S. cerevisae. A organizao dos genes trp
semelhante encontrada em espcies de Rhizobium, calcoaceticus
Acinetobacter, Pseudomonas e acidoovorans (CONWAY et al., 1987). Cabe
ressaltar que 50% das protenas celulares existentes nesta bactria
correspondem s enzimas responsveis pelo processo fermentativo.
2.6.3. CARACTERSTICAS CULTURAIS
2.6.3.1. Zymomonas mobilis X Saccharomyces cerevisiae
O interesse em Zymomonas mobilis tem sido reavivado nos ltimos
anos, devido s vantagens de sua utilizao sobre a tradicional levedura
Saccharomyces cerevisiae, como o seu alto rendimento de converso de
acar a etanol e sua elevada produtividade. Esse microrganismo possui um
enorme potencial para utilizao na produo de etanol combustvel,
apresentando valores de produtividade especfica (g etanol/g clulas. h) 3 a 5
vezes maior quando comparados aos obtidos com a tradicional levedura, bem
como um rendimento em etanol a partir de glicose prximo ao mximo
obtenvel pela estequiometria (97%) (SPRENGER, 1996; BAI et al., 2007).
Contudo, cabe ressaltar que a bactria possui baixa tolerncia a inibidores,
bem como pequeno espectro de utilizao de acares fermentveis.
Na frica e na sia, a bactria Z. mobilis ocupa uma posio similar
que a tradicional levedura ocupa na Europa e na Amrica. Z. mobilis consegue
catabolizar o substrato com altas taxas especficas, pois o seu balano de
energia resulta na formao de uma molcula de ATP por glicose metabolizada
durante a fermentao alcolica (que equivale metade da quantidade
produzida pela levedura). Desta forma, h produo de baixos rendimentos de


36
biomassa durante a fermentao, pois apenas cerca de 2% da glicose
utilizada como fonte de carbono. O tempo de gerao relativamente rpido,
variando de 90 a 120 minutos (OSMAN et al., 1985; CONWAY et al., 1987;
SWINGS & DE LEY, 1977). Outra diferena entre os dois microrganismos
ocorre em suas rotas metablicas. A bactria executa uma simples rota
catablica, sem alternativas metablicas encontradas em outros
microrganismos.
O microrganismo Z. mobilis tambm se diferencia da levedura pelo maior
crescimento em anaerobiose e, portanto, no necessita de controle de oxignio
para manter sua viabilidade em cultivo contnuo. Alm disso, a bactria tolera
elevadas concentraes de glicose, fermenta etanol em nveis maiores
(especialmente em cultivo continuo), produzindo elevadas concentraes deste
produto (GUNASEKARAN & RAJ,1999).
Portanto, as simples condies para seu crescimento, o baixo
rendimento celular, a formao de poucos produtos secundrios, facilidade de
manipulao gentica, a alta tolerncia a acares, resistncia a temperaturas
prximas de 40
o
C, resistncia a altas concentraes de etanol, em at 120 g/L
(ARISTIDOU & PENTTIL, 2000; LEE & ROGERS, 1983) e 140 g/L (DIEN et
al., 2003), assim como a possvel utilizao na alimentao animal tornam
Zymomonas mobilis um potencial concorrente s tradicionais leveduras (DIEN
et al., 2003; LIMAYEM & RICKE, 2012), em particular para a produo de
etanol 2G .
2.6.3.2. Outras habilidades
Esta bactria j demonstrou diversas outras habilidades: produo de
levana, produo de substncias antimicrobianas (CALAZANS, 1997) e
desenvolvimento de probiticos (culturas de microrganismos vivos
administrados a humanos e/ou animais para fins teraputicos). Alm da
produo de substncias de maior valor agregado, como sais de gliconato,
sorbitol e levana, concomitantemente produo de etanol (ALVES, 1993;
FONSECA, 2003).


37
Clavijero (1968), em seu livro intitulado A Histria do Mxico, relata o
uso pelos astecas do aguamiel (seiva aucarada do agave), considerada o
habitat natural da Zymomonas mobilis, como agentes teraputicos no
tratamento de diversas doenas, tais como distrbios intestinais (ABUD, 2005).
Adicionalmente, a utilizao do caldo fermentado por este microrganismo vem
sendo muito estudada para o tratamento de diversas outras doenas: Lindner
(1928) menciona a utilizao de solues contendo clulas de Zymomonas
mobilis no tratamento de doenas contra a febre aftosa, brucelose e doenas
renais em bovinos, assim como no tratamento de furnculos e feridas
purulentas, distrbios ginecolgicos e intestinais (como colites crnicas
resistentes a medicamentos quimioterpicos e antibiticos) em seres humanos
(GONALVES DE LIMA, 1958; FALCO DE MORAIS, 1993; ABUD, 2005).
2.6.4. UTILIZAO DE ACARES
As bactrias da espcie Zymomonas mobilis so quimioorganotrficas,
ou seja, utilizam fontes de carbono orgnicas, como glicose, frutose ou
sacarose, para seu crescimento, gerando quantidades praticamente
equimolares de etanol e CO
2.
Estes carboidratos so indispensveis na
composio do meio de cultura de Zymomonas mobilis. Porm, com a
utilizao da glicose que se tem melhores resultados em relao produo de
etanol (CAMLO, 2009).
As caractersticas nicas do metabolismo de Z. mobilis tm atrado
considervel interesse de pesquisadores, servindo como modelo para as
investigaes sobre o fluxo glicoltico e sua regulao. A glicose
metabolizada em uma taxa extraordinariamente alta, onde, a cada minuto, tal
bactria consome concentraes deste acar equivalentes a um tero de sua
biomassa; uma vez que, somente cerca de 2% so utilizados para a
plasticidade celular, compensando o seu baixo rendimento energtico. Desta
forma, a hexose transportada por um sistema de difuso facilitada de alta
velocidade, baixa afinidade e sem dependncia energtica (DOELLE & KIRK,
1993; PARKER et al., 1997).


38
Seo et al. (2005) atribuem a sua rpida e elevada produo de etanol
presena de duas enzimas, lcool desidrogenase, juntamente com piruvato
descarboxilase. Teoricamente, estas bactrias podem fermentar 1 mol de
glicose a quase 1,8 a 1,9 moles de etanol, 1,8 moles de CO
2
, 0,15 moles de
cido actico e pequena quantidade de outros subprodutos, como lactato,
acetaldedo, glicerol, acetona, dihidroxicetona, sorbitol, manitol e cido
glicnico, seguindo um balano metablico simples (BERTASSO, 1996).
2.6.5. ROTA METABLICA
O metabolismo de acares em clulas de Zymomonas mobilis (Figura
2.15), assim como em algumas bactrias Gram-negativas, incluindo
Rhizobium, Pseudomonas e Agrobacterium, ocorre atravs da via de
EntnerDoudoroff (SPRENGER, 1996).

Figura 2.15. Via metablica de formao de produtos da fermentao de carboidratos
por Zymomonas mobilis. 1. glucoquinase; 2. glicose 6-P-desidrogenase; 3. 6-P-
gluconolactonase; 4. 6-P-gluconato desidratase; 5. aldolase; 6. gliceraldedo P-
desidrogenase; 7. fosfoglicerato quinase; 8. fosfoglicerato mutase; 9. enolase; 10.
piruvato quinase; 11. frutoquinase; 12. glicose 6-P isomerase; 13. glicose-frutose
oxidoredutase (GFOR); 14. gluconolactonase (GL); 15. gluconato quinase; 16. piruvato
descarboxilase; 17. lcool desidrogenase. Fonte: SPRENGER (1996).


39
Nesta via, a partir de cada molcula de glicose h a produo de duas
molculas de NADPH e uma molcula de ATP, que sero utilizadas nas
reaes biossintticas celulares (SPRENGER, 1996). Dessa forma, a glicose
transportada do meio para o interior da clula, sendo fosforilada a glicose-6-
fosfato atravs da enzima glucoquinase. Em seguida, formada a molcula de
glucono-6-fosfato o lactona, atravs da desidrogenao pela enzima glicose-6-
fosfato desidrogenase (que age na presena da coenzima NADP).
A molcula de glucono-6-fosfato o lactona sofre reao de hidratao,
atravs da enzima 6-fosfato gluconolactonase, e, com isso, ocorre a formao
da molcula 6-fosfogluconato, que desidratada pela enzima 6-fosfogluconato
desidratase e forma a molcula 2-ceto-3-desoxi-fosfogluconato. Esta
hidrolisada, atravs da enzima aldolase, ocorrendo formao de outras duas
molculas: gliceraldedo-3-fosfato ou piruvato.
A molcula de gliceraldedo-3-fosfato pode ser utilizada na sntese de
componentes celulares ou sofrer as mesmas transformaes da rota de
Embder-Meierhopf-Parnas (EMP), na sua converso para piruvato. Este
importante intermedirio sofre descarboxilao, reao catalisada pela enzima
piruvato descarboxilase (requer Mg
++
e tiamina pirofosfato como co-fatores),
gerando acetaldedo e dixido de carbono atravs de reao irreversvel.
Finalmente o acetaldedo reduzido a etanol. A enzima lcool desidrogenase
comum a muitos microorganismos; porm, a enzima piruvato descarboxilase
a enzima-chave desta via, pois direciona o fluxo de piruvato para etanol, alm
de ser pouco encontrada em bactrias (CAMLO, 2009).
Adicionalmente, a GFOR foi identificada como sendo uma enzima
periplasmtica relativamente abundante na bactria em estudo. A mesma
pertence categoria enzimtica em que a oxidorreduo realizada com
NADP no dissocivel (ZHANG & CHEN, 2009).
2.6.6. FORMAO DE SUBPRODUTOS
A converso de sacarose ou de misturas de glicose e frutose a etanol
pela bactria Z. mobilis significantemente inferior obtida pela glicose ou
frutose separadamente, atingindo apenas cerca de 70% do valor terico. Este


40
fato ocorre, pois a frutose formada da hidrlise da sacarose no
primariamente transportada para o interior das clulas via difuso facilitada,
mas sim utilizada na formao de levana, sorbitol e fruto-oligmeros,
subprodutos de alto valor agregado (DWIDAR et al., 2012).
A sntese da levana dependente dos monossacardeos livres,
especialmente a frutose formada aps a hidrlise da sacarose. Neste contexto,
a concentrao de sacarose decresce no meio de cultura, enquanto que a
glicose e a frutose geradas se acumulam no mostro, sendo posteriormente
absorvidas pela bactria (DOELLE & KIRK, 1993).
Uma vez que a taxa de consumo da glicose mais rpida que a da
frutose, geralmente a mesma se acumula em maiores quantidades, sendo
posteriormente reduzida a sorbitol, enquanto a glicose oxidada (KANNAN et
al., 1997). Desta forma, tal composto, assim como o cido glucnico, formado
por monmeros de frutose, sendo obtido equimolarmente em reao catalisada
por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono--lactonase (GL),
enzimas periplasmticas de Zymomonas mobilis.
Adicionalmente, Loss et al. (1994) reportaram que a formao do sorbitol
conseqncia de um mecanismo de proteo osmtica, quando as clulas se
encontram sob o estresse de altas concentraes de acares. Desta forma,
este soluto compatvel funciona como um osmoprotetor para o microrganismo,
que o acumula intracelularmente at concentraes de 1M, visando compensar
os efeitos exercidos pela alta presso osmtica externa.
2.6.7. MEIOS DE CULTIVO
Assim como grande parte dos organismos quimiorganotrficos, a
bactria Z. mobilis necessita de fontes de nitrognio, fsforo, enxofre e
micronutrientes para o funcionamento do metabolismo e para a sntese das
clulas em uma forma assimilvel pelo microrganismo. Alm disso, necessitam
de gua, carbono, fator de crescimento e oxignio. A glicose e o extrato de
levedura so fundamentais para a fermentao pelo microrganismo em estudo
(OTHUMOANGAT et al. 1999).


41
Nas fermentaes com Zymomonas mobilis em meio de cultivo contendo
glicose, extrato de levedura, sulfato de amnio, fosfato de potssio e sulfato de
magnsio, quando a hexose exaurida, cessa-se a utilizao da fonte
inorgnica de nitrognio NH
4
+
e a bactria comea a metabolizar os
aminocidos da meio como fonte de carbono, com liberao do nitrognio na
forma de amnia, resultando em um aumento do pH do meio (ERNANDEZ et
al., 2009).
Alimentando-se novamente o meio com glicose aps a sua exausto, o
mecanismo gera um potencial eletroqumico e direciona o processo de
transporte de entrada deste carboidrato opera via excreo de prtons com os
produtos metablicos por ao de uma protena de membrana, a prton-
translocante ATPase, fazendo com que o pH do meio de cultivo decresa
gradualmente (ISHIZAKI et al., 1994).
Belaich et al. (1972) estudaram o efeito da limitao de pantotenato no
crescimento de Zymomonas mobilis, observando a reduo da taxa especfica
de crescimento. Sreekumar et al. (1999), citam que o mesmo uma vitamina
essencial para a produo de etanol porque a bactria no a sintetiza, embora
necessite desta substncia para a produo de compostos orgnicos
essenciais ao crescimento celular, produzindo, consequentemente, o etanol.
Recentemente, Soleimani et al. (2012) tambm constataram que a
produo de etanol foi significativamente reduzida aps remoo de nutrientes
do meio de cultura, tais como o extrato de levedura e peptona. No entanto,
alguns estudos demonstram que a utilizao de alguns resduos agro-
industriais pode substituir fontes de carbono ou nitrognio, conforme observado
por Patle & Lal (2008).
2.6.7.1. Nitrognio
A bactria capaz de utilizar diversas fontes de nitrognio para o seu
crescimento, variando de simples componentes inorgnicos, como nitratos, a
componentes complexos, como os aminocidos, mas nem todas as fontes de
nitrognio suportam bem o crescimento bacteriano.


42
As rotas metablicas para o metabolismo do nitrognio podem ser
divididas em duas classes: a rota necessria para a assimilao do nitrognio
proveniente do meio extracelular e a rota biossinttica para a produo
intracelular de compostos que contm nitrognio. Os aminocidos aps a
metabolizao so incorporados diretamente s protenas ou catabolizados de
acordo com as necessidades da clula em termos de carbono, nitrognio e
energia (ABUD, 2005).
A fonte de nitrognio pode ser adicionada na forma de aminocidos,
peptona, sais de amnia e peptdeos. Segundo Frana & Rodrigues (1985), os
sais de amnio e os aminocidos conduzem para um melhor crescimento, uma
vez que no causam acmulo de nitritos e nitratos. Sanchez & Demain (2002)
citam que, em geral, amnia, glutamina e asparagina so boas fontes de
nitrognio, enquanto prolina, leucina e uria so qualificadas como ms fontes
de nitrognio. Galani et al. (1985) constataram que sais como NH
4
Cl e
(NH
4
)
2
SO
4
so as melhores fontes de nitrognio. Pinheiro (2001) ressaltou uma
relao mssica entre glicose e asparagina (entre 75:1 e 100:1), para a qual a
bactria apresenta a maior taxa de crescimento.
Neto et al. (2005) notaram que grandes concentraes de extrato de
levedura podem provocar diminuio da produo de etanol, devido a um
excesso de fonte de nitrognio. Desta forma, ocorre um aumento na
concentrao de biomassa, uma vez que Zymomonas utiliza esse composto
no apenas como fonte de nitrognio, mas tambm como blocos para
biossntese, implicando em uma menor necessidade de energia. Tal fato
justificaria a diminuio na produo de etanol e, consequentemente, a menor
formao de ATP. A regulao do nitrognio de fundamental importncia na
microbiologia industrial, uma vez que afeta a sntese de enzimas envolvidas
tanto no metabolismo primrio quanto no secundrio. Desta forma, muitas rotas
metablicas secundrias so negativamente afetadas por fontes de nitrognio
favorveis ao crescimento, como os sais de amnio, assim como elevadas
concentraes de nitrognio podem afetar a sntese dessas enzimas (BELACH
& SENEZ, 1965; Neto et al., 2005).


43
2.6.7.2. Fsforo
O fsforo tem papel importante nas vias metablicas que so iniciadas
com uma fosforilao do substrato. Esse elemento, constituinte das molculas
de ATP, absorvido pelas clulas sob a forma de sais, como KH
2
PO
4
ou
K
2
HPO
4
(RANZAN, 2010).
2.6.7.3. Enxofre
O enxofre, constituinte estrutural da clula de grande importncia para
a formao de protenas, pode ser suprido por metionina, cistena e sulfatos
(FRANA & RODRIGUES, 1985). No entanto, MgSO
4
a melhor fonte deste
elemento, por servir tambm como de fonte de magnsio; que por sua vez
responsvel pela estabilidade estrutural de diversas enzimas, como tambm
por prevenir a formao de vesculas na membrana externa da clula (GALANI
et al., 1985).
2.6.8. Meios de cultivo de baixo custo
A elaborao de meios de cultivo de baixo custo um importante fator
em processos fermentativos industriais. Desta forma, Neto et al. (2005)
reportaram a utilizao de melao de cana, subproduto da indstria do acar,
que apresenta alta concentrao de sacarose. Atravs de um planejamento
experimental, onde as variveis estudadas foram: a concentrao de sacarose,
a concentrao de extrato de levedura e o tempo, as condies timas para a
produo de etanol do melao foram, respectivamente, 100 g/L, 2,0 g/L e 24
horas. Recentemente, Thanonkeo et al. (2011) tambm obtiveram sucesso ao
avaliar a produo de etanol a partir de alcachofra de Jerusalm pela linhagem
de Z. mobilis isolada na Tailndia, TISTR548, alcanando 95,9 g/L de etanol a
partir de 250 g/L de acares redutores totais.
Ruanglek et al. (2006) utilizaram meio sinttico contendo glicose como
substrato (100 g/L), alm de fontes de nitrognio provenientes de resduos
agro-industriais de Ajinomoto Co. Ltd. atingindo cerca de 43 g/L de etanol. O
mesmo resultado foi alcanado quando adicionou-se 10 g/L de extrato de
levedura.


44
A formulao de meios com diferentes composies foi reportada por
Tanaka et al. (1999), que utilizaram suco de abacaxi sem diluio, contendo
125 g/L de sacarose, e traos de glicose e frutose, alm de outros
componentes em menores propores, como Mg, Ca, P, Fe, Na e K. Foi
alcanada a concentrao de 59 g/L de etanol, sem nenhum controle de pH e
agitao. Em seguida, os autores fizeram a comparao com a fermentao
em meio sinttico nas mesmas concentraes de sacarose, alm da adio de
extrato de levedura e de outros nutrientes, reduzindo-se a concentrao de
etanol para 42,5 g/L, sob as mesmas condies de pH e agitao.
Silva et al. (2007) utilizaram a farinha de algaroba na formulao do
meio para a fermentao pela bactria Z. mobilis, atingindo 77 g/L de etanol.
Atravs de um planejamento experimental, foi constatado que a condio tima
da farinha era de 30% (m/v), a qual apresentou elevados nveis de nutrientes,
principalmente acares, e minerais, como o fsforo e o clcio.
Patle & Lal (2008) investigaram a fermentao por Z. mobilis e C.
tropicalis em resduos agro-industriais de amido, o thippi -subproduto do
processo do processamento de amido, contm alm deste carboidrato, pectina,
fibras e protenas- atingindo 72,8 g/L de etanol quando as duas culturas
microbianas ocorriam simultaneamente e 65,3 g/L apenas com a bactria Z.
mobilis.
Soleiman et al. (2012) reportaram a otimizao das melhores condies
fermentativas pela linhagem de Z. mobilis PTCC 1718 (DSMZ 424), utilizando
resduos de baixo custo, tais como soro de leite e farelo de trigo, associados
nutrientes sintticos, onde as melhores condies foram de 25 g/L de sacarose,
15 g/L de soro de leite, 2,5 g/L de farelo de trigo, 5 g/L de extrato de levedura,
2,5 g/L de peptona, 7 g/L KH
2
PO
4
, 1 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
, e 0,5 g/L MgSO
4
; sob
50
o
C de temperatura, pH 5,5 e inculo de 12% (v/v); alcanando at 91,22 g/L
em biorreator instrumentado, durante 48 horas.
Dwidar et al. (2012) obtiveram 25 g/L de etanol por Z. mobilis ZM4 a partir
de 55-60 g/L de bebidas carbonatadas, em 10 horas de fermentao. Os
autores ressaltam a importncia de tal pesquisa, indicando que estudos


45
posteriores apontam para a produo de etanol em maior escala a partir destes
resduos industriais.
2.6.9. PRODUO DE ETANOL CONVENCIONAL POR Z. mobilis
A bactria Z.mobilis possui um grande potencial para a produo
industrial de etanol a partir de acar, xarope e caldo de cana, dentre outros
substratos (LEE & HUANG, 2000). Comparaes de resultados recentes
reportados na literatura utilizando a bactria Zymomonas mobilis na
fermentao de etanol convencional esto apresentadas na tabela 2.4.
A produtividade e produo de etanol variam, dentre diversos fatores, de
acordo com o substrato empregado, nutrientes adicionais, bem como o
microrganismo a ser utilizado. Pinilla et al. (2011) obtiveram elevadas
concentraes de etanol (83,81 g/L), a partir de glicose adicionada de extrato
de levedura, peptona e sais, aps isolamento de colnias crescidas no melao
de cana. J Wiikins (2009) empregaram misturas de acares, frutose, glicose,
sacarose e galactose, atingindo 43,5 g/L de etanol ao final do processo
fermentativo, ao passo que Maiti et al. (2011) alcanaram 58,4 g/L a partir de
melao de cana-de acar.
Sabe-se que bactria Z. mobilis possui baixa tolerncia a sais quando
est na sua forma livre, entretanto, a imobilizao proporciona maior aceitao
desses compostos, assim como reduz a produo de sorbitol pelo
microrganismo (IIDA et al., 1993). Tais autores estudaram a imobilizao em
diversas linhagens de Z. mobilis (B-69 147, MX 3303, HSZA 1006, HSZI 4160,
e NRRL B-14023) utilizando gel de resina (photo-crosslinkable) atravs de um
processo contnuo, atingindo 80 g/L de etanol e 60 g/L.h de produtividade
volumtrica pela linhagem B-69 147, durante 14 dias. O desempenho da
linhagem utilizada foi superior ao do microrganismo Saccharomyces uvarum,
que a partir de 200 g/L de glicose inicial, produziu 60 g/L de etanol, bem como
cerca de 44 g/L.h de produtividade volumtrica.


46

Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produo de etanol convencional por Zymomonas mobilis.

Onde: MP: matria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal: galactose; ART: acares redutores totais; FA:
frascos agitados; BR: biorreator; Q
P
: produtividade volumtrica em etanol.
Referncias Bibliogrficas: 1. SILVA (2007); 2. ZHANG (2003); 3.CAZETTA et al. (2007); 4. TANAKA et. al. (1999); 5. WIIKINS
(2009); 6. ZHANG et al. (2008); 7. NETO et al. (2005); 8. COSTA et al. (2001); 9. MAITI et al. (2012); 10. RUANGLEK et al. (2006); 11.
DAVIS et al. (2006); 12. BANDARU et al. (2006); 13. PATLE & LAL (2008).
MP/Meio
Substrato

X
o

Sistema
reacional
Etanol
(g/L)
Q
P
(g/L.h)
Ref.
Farinha de algaroba 30% (m/v) 5% (v/v) FA 77 4,3 1
Meio sinttico 35 g/L de xil + 35 g/L de gli 2,5 g/L BR 38 1,59 2
Meio sinttico 200 g/L de sac 0,2 g/L FA 55,8 1,16 3
Suco de abacaxi 125 g/L de sac 10 % (v/v) BR 59 2,81 4
Meio sinttico
29.9 g/L de fru; 7.7 g/L de gal;
51,7 g/L de gli; 1,3 g/L de sac
0,3 g/L FA 43,5 0,60 5
Meio sinttico 200 g/L de gli 1,8 g/ L FA 72,5 1,2 6
Melao de cana 100 g/L de ART 2 g/L FA 30 1,25 7
Meio sinttico 20% (v/v) 10% (v/v) BR 67,7 2,25 8
Melao de cana 216 g/L de ART No consta BR 58,4 1,33 9
Meio sinttico 100 g/L de gli 2,3 g/L FA 43 2,38 10
Amido Hidrolisado 110 g/L de gli 10% (v/v) BR 54 4,90 11
Sagu 150 g/L de amido
93,2 g /L de
esferas
FA 55,3 3,20 12
Resduos alimentares 254.45 g. kg
-1

2.8x10
8

CFUmL
-1

FA/ BR 72,8 1,51 13


47
Amutha & Gunasekaran (2001) tambm empregaram a tecnologia de
imobilizao associada fermentao, atingindo 46,7 g/L de etanol a partir de
hidrolisado de mandioca por clulas co-imobilizadas de Z. mobilis e S.
diastaticus, contrastando com 37,5 g/L por S. diastaticus. J Bandaru et al.
(2006) avaliaram a co-imobilizao de clulas de Z. mobilis MTCC 92, assim
como da enzima amiloglicosidase, onde a produo de etanol ocorreu em
55,3 g/L, na temperatura de 32,4
o
C, pH 4,93, durante 17,24 horas, a partir de
150 g/L de amido.
Behera et al. (2010) compararam a performance de Z. mobilis
(MTCC92) e S. cerevisiae (CTCRI) frente produo de bioetanol a partir das
flores de Madhuca latiflia L. Aps 96 h de fermentao, a produo e
produtividade de etanol foi de 20,47 e 24,83 g/L; 0,213 e 0,258 g/L.h,
respectivamente. Bansal & Singh (2003) tambm reportaram que a levedura
produziu maiores concentraes de etanol do que a bactria em meio de
fermentao contendo 15% (m/v) de acares; assim como os estudos
realizados por McGheeet al. (1981), apontando para o maior desempenho da
levedura imobilizada em processo contnuo, a partir de concentraes de 1%
a 5% de glicose. No entanto, Raman & Pothiraj (2008) afirmaram que a
bactria apresenta melhor desempenho em relao levedura, atingindo 9,25
g/L e 8,73 g/L de etanol, respectivamente, a partir de resduos da mandioca,
em pH 6, durante 36 h.
2.6.9.1. Inibio pelo produto, substrato e temperatura
Karsch et al. (1983) propuseram que o microrganismo Z. mobilis
apresenta maior produo de etanol e menor crescimento de biomassa em
relao levedura S. cerevisiae, tendo como uma de suas peculiares
caractersticas, a variao do pH de 5,5 a 3,8. No entanto, a levedura
apresenta maior aplicabilidade na produo industrial, por ser menos sensvel
a alguns fatores, tais como temperatura elevada e toxicidade ao etanol,
podendo desencadear um estresse fisiolgico na bactria, o que pode alterar
a fluidez da membrana plasmtica, provocando reduo do crescimento
especfico, prejudicando a viabilidade celular, bem como a habilidade


48
fermentativa (OSMAN et al., 1985; BARBOSA et al., 1994; MOREAU et al.,
1997; THANONKEO et al., 2007).
importante ressaltar que h controvrsias em relao faixa de
inibio pelo etanol e temperatura do processo, variando de acordo com a
linhagem e o substrato empregado, conforme experimentos realizados por
Ernandez et al. (2009) e Gunassekaran & Raj (1999). Utilizando 20% de
sacarose, Jobses et al. (1985) relataram que a concentrao limitante deste
lcool foi de 57,5 g/L, provocando reduo do crescimento celular, bem como
um aumento do substrato residual. J a partir da glicose, a bactria
apresentou tolerncia nas concentraes de 70 a 80 g/L (GALLEGOS et al.
2006).
Panesar et al. (2007) constataram que a linhagem Zymomonas mobilis
MTCC2428 tolera at 8% (v/v) de etanol em meio contendo glicose, em
temperatura de 30C. No entanto, quando a temperatura se elevou para 35 e
40C, o microrganismo tolerou apenas 6 % (v/v) e 2 % (v/v) deste produto,
respectivamente.
Adicionalmente, Lee, Wroble e Ross (1989) notificaram que em
temperaturas prximas de 40C, os rendimentos de formao de biomassa e
produo do lcool por tal microrganismo decresciam. Porm, as taxas
especficas de consumo de substrato, crescimento e formao de produtos
no foram afetadas.
Ranzan (2010), e Bekers et al.(1990) estudaram as oscilaes que
ocorrem no processo fermentativo pela bactria em questo, indicando que
estas so decorrente da inibio pelo produto ou pelo substrato, ambos em
elevadas concentraes. Consequentemente, as oscilaes podem afetar a
produo de etanol e de biomassa, aumentando as concentraes de
acares residuais.
Estudos iniciais desenvolvidos por Rogers et al. (1979) aplicaram
elevadas concentraes de substrato, onde houve a converso de 250 g/L de
glicose a 100 g/L de etanol no perodo de 40 horas, empregando Zymomonas
mobilis ATCC10988 e Saccharomyces carlsbergensis (uvarum). O


49
crescimento de biomassa bacteriana foi consideravelmente menor do que o
obtido pela levedura, indicando maior taxa especfica de consumo deste
acar, assim como maior produo de etanol pelo microrganismo. Segundo
Torres (1987), concentraes superiores a 156,0 g/L de glicose provocam
inibio no crescimento da linhagem Z. mobilis (ZAP) na temperatura de
35C. Na medida em que a temperatura se eleva, a mesma torna-se inibitria
para o crescimento.
Segundo Zhang et al. (2008), a presena de solutos compatveis na
produo de etanol por Z. mobilis diminui relativamente a inibio pelo
substrato em altas concentraes. Os autores avaliaram a fermentao a
partir de 200 g/L de glicose, atingindo concentraes de etanol acima de 70
g/L; no entanto, a partir de 250 g/L deste acar, a produo decai para 66
g/L, devido hiper osmolaridade causada pelas altas concentraes de
substrato no meio, associadas presena de um soluto compatvel, a ectoina,
composto natural que serve como uma substncia protetora em algumas
clulas bacterianas.
Hermans (1992) avaliaram a fermentao contnua por Zymomonas
mobilis ATCC 29191 atravs da adio de diferentes concentraes de
glicose, 150,0; 170,0; 200,0 g/L, obtendo 4 g/L.h de produtividade volumtrica,
com rendimentos em etanol de 98% e taxa especfica de 1,1 h
-1
. Costa et al.
(2001) tambm avaliaram a fermentao contnua de sacarose, 20% (m/v),
atingindo cerca de 65 g/L de etanol atravs da fermentao por Z. mobilis,
que apresentou oscilao em seu crescimento, devido s elevadas
concentraes desse acar.
Estudos pioneiros de Rogers et al. (1979) tambm constataram que
10% (v/v) de inoculo, crescido por at 25 horas, na temperatura de 30
o
C, era
o mais apropriado para a fermentao por Zymomonas mobilis, pois apesar
da produo de etanol ter aumentado juntamente com a adio de inculo
acima desta proporo estabelecida, o tempo de processo no sofreu
alterao.


50
Adicionalmente, a produtividade volumtrica e a produo de etanol
podem ser afetadas pela presena de altos nveis de oxignio, principalmente
em elevadas concentraes de substrato, assim como o dixido de carbono
pode promover reduo ou inibio do crescimento de biomassa, aumentando
a concentrao de glicose residual do processo (BARATTI & BULOCK,
1986).
2.7. ESTRATGIAS DE PROCESSO PARA PRODUO DE
ETANOL DE SEGUNDA GERAO
Aps os pr-tratamentos (cido e alcalino) dos materiais
lignocelulsicos, que visam o fracionamento da hemicelulose e a
deslignificao do resduo slido (celulignina), possvel hidrolisar a celulose
atravs de concepes modernas, que incluem processos enzimticos para a
obteno de glicose, que, por sua vez, poder ser fermentada a etanol (LYND
et al., 2002). Diferentes configuraes de processos podem ser definidas com
base nesses eventos e de acordo com a integrao dos mesmos, que se
seguem detalhadas.
2.7.1. HIDRLISE ENZIMTICA SEPARADA DA FERMENTAO (SHF)
Nesta concepo, como o prprio nome indica os materiais pr-
tratados so hidrolisados enzimaticamente para obteno da glicose, a qual
subsequentemente fermentada a etanol. Os eventos acontecem em unidades
separadas fisicamente (Figura 2.16).
A grande vantagem desse mtodo que o mesmo permite que tanto a
hidrlise quanto a fermentao sejam conduzidas em condies timas para
cada etapa. A temperatura tima para as celulases est entre 45 e 50
o
C e a
temperatura ideal para a fermentao est entre 30 e 37
o
C (OLSSON et al.,
2006).
No entanto, cabe ressaltar que a maior desvantagem deste processo
est relacionada inibio das enzimas do complexo celulsico pelos seus
produtos finais de hidrlise (glicose e celobiose); assim como a possibilidade
de contaminao, pois o tempo envolvido na etapa de hidrlise longo, e a


51
soluo de acares formada torna-se uma fonte disponvel ao ataque de
microrganismos indesejados. Alm disso, as prprias enzimas podem ser
uma fonte potencial de contaminao (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).

Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrlise enzimtica separada
da fermentao (SHF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).
2.7.2. HIDRLISE ENZIMTICA E FERMENTAO SIMULTNEAS (SSF)
Esta concepo combina a hidrlise enzimtica dos materiais pr-
tratados e a fermentao em um nico evento (Figura 2.17).

Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrlise enzimtica e
fermentao simultneas (SSF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN
(2008).


52
Sua maior vantagem que a glicose produzida atravs da atividade
das celulases imediatamente consumida pelo microrganismo fermentador,
minimizando os efeitos inibitrios causados pela glicose, que se apresenta em
baixas concentraes. Alm disso, h um aumento de produtividade em
etanol, pois menores cargas enzimticas so utilizadas no processo; assim
como h reduo do risco de contaminao, pois a presena de etanol reduz
essa possibilidade (McMILLAN et al., 1999).
Entretanto, estes processos so conduzidos fora das condies timas
de operao das enzimas, de modo que um ganho de rendimento devido
menor inibio enzimtica pode ser contrabalanado por uma menor atividade
das enzimas em razo das condies operacionais menos apropriadas
atividade cataltica. Microrganismos termotolerantes tm sido propostos para
serem usados neste processo, dessa forma, seria possvel aproximar a
temperatura do processo temperatura tima de atividade das celulases
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
Embora exera um menor efeito inibitrio que a glicose ou a celobiose
sobre a taxa de hidrlise, a presena de etanol na celulignina pr-tratada
provoca um acentuado decrscimo da atividade enzimtica durante o
processo hidroltico. H registros de que concentraes de etanol de 30 g/L
reduziriam a atividade enzimtica em 25% (WU & LEE, 1997).
Apesar de algumas desvantagens, este tem sido o mtodo preferido
tanto em estudos de laboratrio quanto em escala piloto. Da mesma forma
que na concepo anterior, os acares provenientes da hemicelulose aps o
pr-tratamento podem ser convertidos a etanol em um fermentador separado
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
2.7.3. HIDRLISE ENZIMTICA E CO-FERMENTAO SIMULTNEAS
(SSCF)
Esta concepo refere-se co-fermentao de ambos os acares,
pentoses e hexoses, em uma mesma etapa (Figura 2.18). Neste sentido, o
hidrolisado hemicelulsico e a celulose no so separados aps a etapa de
pr-tratamento, permitindo que os acares da hemicelulose sejam


53
convertidos a etanol juntamente com a sacarificao e fermentao da
celulose (TEIXEIRA et al., 2000).
necessria a interveno da Biologia Molecular, visando conferir a
um nico microrganismo as caractersticas necessrias para fermentar ambos
os acares. Existem vrios exemplos na literatura de microrganismos
engenheirados com essa finalidade, dentre os quais se encontra Zymomonas
mobilis (LAWFORD & ROUSSEAU, 1998; McMILLAN et al., 1999; TEIXEIRA
et al., 2000; AGRAWAL et al., 2011; ZHOU, et al., 2011).

Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificao e co-fermentao
simultneas (SSCF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).
2.7.4. BIOPROCESSO CONSOLIDADO (BPC)
Esta concepo de processo une em uma mesma etapa a produo de
celulases, a hidrlise enzimtica de celulose e a fermentao de pentoses e
hexoses por um mesmo microrganismo (Figura 2.19).

Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produo
de etanol de segunda gerao (BPC). Fonte: PEREIRA JR et al. apud
WINGREEN (2008).
A adoo desta estratgia tecnolgica permitiria uma significativa
reduo nos custos de produo, alm de representar uma alternativa


54
estratgia convencional de produo de celulases em uma etapa, com o uso
das enzimas resultantes para a hidrlise da celulose em uma segunda etapa.
Em termos de custos e de desenvolvimento tecnolgico, a estratgia
do Bioprocesso Consolidado (BPC) apresenta-se como a ideal a ser atingida.
Contudo, esse tipo de processo ainda no pode ser desenvolvido nvel
industrial com os microrganismos disponveis atualmente, tais como
Clostridium thermocellum e Clostridium cellulolyticum, necessitando-se do
desenvolvimento de contnuas tcnicas de engenharia gentica para a
construo de linhagens que possuam maiores nveis de expresso tanto de
atividade enzimtica quanto de fermentao (OLSON et al., 2012).
2.7.5. PRODUO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAO POR Z. mobilis
Nas ltimas dcadas, diversos estudos tm sido realizados visando
utilizao de biomassa residual como matria-prima para produo de
bioetanol. A bactria Z. mobilis vem sendo empregada em alguns trabalhos,
devido sua alta capacidade de produzir etanol em condies anaerbicas.
A tabela 2.5 sumariza os resultados mais proeminentes reportados na
literatura utilizando linhagens de Zymomonas mobilis nativa ou engenheirada
geneticamente, visando produo de etanol de segunda gerao.
Yamashita et al. (2008) avaliaram a utilizao de altas concentraes
de lodo de papel na produo de etanol atravs do processo SSF, por
clulas de Z. mobilis inicialmente livres, no havendo nenhuma produo de
etanol atravs desta estratgia de operao do processo. O resultado foi
atribudo grande quantidade de ons metlicos presentes no hidrolisado de
papel. Sendo assim, as bactrias foram imobilizadas em alginato de clcio,
resultando na produo de etanol de 18 g/L em 4 corridas.
Recentemente, alguns autores avaliam a fermentao a partir do
bagao de cana. Velmurugan et al. (2012) estudaram o processo SSF a partir
deste resduo por Z. mobilis MTCC89, alcanando 91,2% de eficincia de
produo de etanol em 36 horas. Kuo & Lee (2008) avaliaram o pr-
tratamento desta matria-prima atravs de xido de n-metilmorfolina e, em
seguida, tambm empregaram o processo SSF, atingindo a concentrao


55
14,5 g/L de etanol por tal bactria. Fu et al. (2009) analisaram a fermentao
do hidrolisado cido do bagao por clulas de Z. mobilis imobilizadas em
alginato de clcio, associadas a clulas de Pichia stipitis, atingindo cerca de
28 g/L de etanol.
Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produo de etanol de
segunda gerao por Zymomonas mobilis.
Onde: MP: matria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal:
galactose; cel: celobiose; ART: acares redutores totais; SR: sistema reacional; FA:
frascos agitados; BR: biorreator; Q
P
: produtividade volumtrica em etanol; X
0
:
concentrao inicial de clulas, P: etanol (g/L). Referncias Bibliogrficas: 1. FU et al.
(2009); 2. DAVIS et al. (2005); 3. YAMASHITA et al. (2008); 4. KUO & LEE (2008);
5.YANASE et al. (2005); 6. MOHAGHEGHI et al. (2004); 7. VELMURUGAN et al. (2012).

Wirawan et al. (2012) compararam a imobilizao de Z. mobilis em
alginato de clcio e em lcool polivinlico, onde os melhores resultados
obtidos foram de 6,24 g/L e 5,52 g/L de etanol, eficincia de fermentao de
79,09% e 69,96%, produtividade volumtrica de 3,04 g.L/h e 2,37 g.L/h,
utilizando o processo SHF e de 5,53 g/L e 5,44 g/L de etanol, eficincia de
fermentao de 70,09% e 68,95%, produtividade volumtrica de 1,31 g.L/h e
1,27 g.L/h, utilizando o processo SSF para a produo de etanol,
respectivamente. Os estudos mostraram boa estabilidade e possibilidade de
MP/Meio Substrato X
o
SR P (g/L) Q
P
(g/L.h) Ref.
Hidrolisado de
bagao de cana
32 g/L de gli;
21 g/L de xil
1x10
8
CFU/mL
BR 28 0,7 1
Vinhoto de trigo
Hidrolisado cido,
suplementado com
40 g/L de gli
0,2 g/L FA 28 g/L 1,55 2
Lodo de Papel
200 g/L de resduo
de papel
0,01 g BR 18 0,372 3
Bagao de cana 15 g/L de gli 1,5 g/L BR 14,5 0,29 4
Materiais
lignocelulsicos
10% de gli e 20 g/L
de cel
10
7
/ml
-1
FA 10,7 0,22 5
Hidrolisado cido
do milho
75 g/L de gli;
52 g/L de xil
0,06 g/L BR 53 0,073 6
Bagao de cana 38,4 g/L de gli 0,1 g - 17,9 0,497 7


56
reutilizao das clulas nas fermentaes em batelada simples e alimentada,
tanto para a imobilizao em alginato de clcio quanto em lcool polivinlico.
Estudos prvios sobre a co-imobilizao de diferentes microrganismos
foram desenvolvidos recentemente por Liu et al. (2012). Os autores
empregaram fungos da espcie Trichoderma reesei e Aspergillus niger,
produtores de celulases, juntamente com a bactria Zymomonas mobilis,
produtora de etanol. Desta forma, o material celulsico foi convertido a
acares atravs das enzimas do complexo celulsico e, posteriormente,
fermentado pela bactria. Aps 96 horas de co-cultivo das duas espcies dos
fungos filamentosos na proporo 1/1, inculo de 18% (m/v), os mesmos
obtiveram uma taxa de produo de acar redutor e de eficincia de hidrlise
de 2,57 g/L e 46,27%, respectivamente. A concentrao de etanol alcanada
foi de 0,56 g/L a partir de carboximetilcelulose (CMC), promovendo uma
eficincia de fermentao de 11,2% aps o perodo de 24 horas.
2.8. PRODUO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR
LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis
Para viabilizar a produo comercial do etanol lignocelulsico faz-se
necessria a eficiente e integral converso dos carboidratos potenciais em
bioetanol. Embora a fermentao da glicose seja realizada com eficincia pela
bactria Zymomonas mobilis, bem como por Saccharomyces cerevisiae, o
mesmo no ocorre com as pentoses, principais componentes da frao
hemicelulsica. Segundo Zhang & Lynd (2010), o emprego de
microrganismos fermentadores de glicose e xilose aumentou em 19% a
produo de etanol atravs do processo SSCF de resduos de papel, quando
comparada produo apenas da glicose oriunda da frao celulsica.
2.8.1. METABOLIZAO DA XILOSE
A busca de microrganismos fermentadores de xilose , pois, um dos
maiores desafios da Biotecnologia moderna. Conforme citado nos itens 2.6 e
2.7, a bactria gram-negativa Zymomonas mobilis apresenta diversas
caractersticas interessantes para este propsito, contudo, a mesma s
capaz de fermentar um pequeno espectro de acares, glicose, sacarose e


57
frutose. Alm disso, tal microrganismo no possui algumas enzimas-chave da
via das pentoses, que permitem o metabolismo da xilose. Desta forma, a
engenharia metablica em Z. mobilis apresenta-se como alternativa para
tornar esta bactria capaz de fermentar pentoses, alm de hexoses.
A figura 2.20 ilustra a insero da via das pentoses na via de Entner-
Doudoroff, aps a adio de genes que codificam para as enzimas xilose
isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase na bactria Z.
mobilis (ZHANG et al., 1995).

Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff do
microrganismo Z. mobilis. Fonte: AGRAWAL et al. (2011).



58
Neste contexto, o rendimento terico ocorre em 0,51 g de etanol/ g de
xilose (1,67 mol/mol), havendo formao de 1 mol ATP/mol de pentose.
Aristidou & Penttil (2000) indicaram que a nova via metablica promove a
converso de 5 moles de etanol a partir de 3 moles de xilose, conforme a
seguinte equao estequiomtrica:
3 xilose + 3ADP + 3 Pi 5 etanol + 5CO
2
+ 3ATP + 3H
2
O.
2.8.1.1. Breve Histrico
Os trabalhos pioneiros de Liu et al. (1988) e Feldman et al. (1992), que
introduziram os genes da xilose isomerase (XI) e xiluloquinase (XK),
provenientes de Xanthomonas capestris e Klebsiella pneumoniae em Z.
mobilis tiveram pouco sucesso. Tais enzimas so responsveis pela
assimilao da xilose, no entanto, as enzimas transaldolase (TAL) e
transquetolase (TKT) promovem a metabolizao da mesma, sendo
essenciais para a produo de etanol (MATSUSHIKA et al., 2012).
Os mesmos genes codificadores destas enzimas, provenientes de E.
coli, tambm foram introduzidos na bactria Zymobacter palmae. Aps
adaptao metablica em meio contendo xilose, o microrganismo atingiu 95%
de eficincia de fermentao a partir de glicose e xilose (YANASE et al.,
2007), resultado superior ao reportado por Mohagheghi et al. (2006), que
alcanaram 76% de eficincia, com o consumo de 75% (m/v) da pentose
proveniente de hidrolisado hemicelulsico por Z. mobilis. Desta forma, Zhang
et al. (1995) demonstraram que a co-expresso de XI, XK, TAL e TKT,
oriundas de Escherichia coli, permitiram que Z. mobilis co-fermentasse xilose
e glicose, atingindo 11 g/L de etanol e converso em produto de 0,44 g/g
xilose, correspondendo uma eficincia de fermentao de 86%. J a partir
de glicose, e de hexose/ pentose, a linhagem recombinante CP4 (pZB5)
atingiu 94% e 95% de eficincia, durante 16 e 30 horas, respectivamente.
Posteriormente, estudos avaliaram o emprego de diferentes linhagens
de Zymomonas mobilis quanto produo de etanol e ao crescimento celular.
O grupo de pesquisa do NREL empregou a linhagem ATCC31821 (pZB5), no
intuito de alcanar maiores rendimentos, comparativamente a estudos


59
utilizando a linhagem CP4 (pZB5). Os resultados indicaram que a linhagem
ATCC31821 fermentou 1,5% (m/v) de glicose e 3,5% (m/v) de xilose, sem
controle de pH, nas temperaturas de 30 e 37
o
C, respectivamente, alcanando
99 e 96% (m/v) de consumo dos acares (12 e 18% a mais do que a
linhagem CP4); 20 e 18% de aumento nos valores de produtividade
volumtrica, assim como 49 e 40% de aumento na taxa de converso destes
carboidratos frente linhagem CP4, durante 69 horas (ZHANG et al., 1995;
ZHANG et al., 2003).
Recentemente, estudos de Zhang & Lynd (2010) indicaram que o
microrganismo Z. mobilis 8b (derivada da 31821-pZB5) apresentou melhor
desempenho frente levedura S. cerevisiae RWB222, quanto hidrlise e co-
fermentao simultneas de resduos do papel, onde ambas as espcies
atingiram 40 g/L de etanol na temperatura de 37
o
C. Contudo, a bactria e a
levedura reduziram a viabilidade celular aps 44 e 25 horas de processo, em
concentraes de 29 e 23 g/L de etanol, atingindo 0,47 e 0,40 g/ produto/g
acares consumido, respectivamente.
Diversos artigos reportam sobre a fermentao da xilose presente na
frao hemicelulsica de resduos agro-industriais. Mohagheghi et al. (2004)
utilizaram o hidrolisado cido de resduos do processamento do milho, cuja
fermentao resultou na concentrao de etanol de 53 g/L. Davis et al. (2006)
compararam o desempenho de Z. mobilis e de S. cerevisiae em hidrolisado
de amido, apresentando produtividades de 4,90 e 3,25 g/L.h,
respectivamente, mostrando que tal bactria recombinante apresentou-se
mais promissora do que a levedura quanto produtividade em etanol. Davi s
et al. (2005) tambm fizeram uso do hidrolisado hemicelulsico proveniente
de gros de trigo, composto por 6 g/L de glicose e 16 g/L de xilose, sendo
adicionado de 10 g/L desta hexose, alcanando 11 g/L de etanol e 12 g/L de
xilose residual pela linhagem ZM4 (pZB5). Em estudos posteriores, os autores
suplementaram o meio com 5 g/L de extrato de levedura e 40 g/L de glicose,
obtendo 28 g/L de etanol e 2,6 g/L de xilose residual aps o perodo de 18
horas. Adicionalmente, Joachimshtal & Rogers (1999) tambm ressaltaram a


60
importncia da adio desta fonte de nitrognio, assim como da glicose na
fermentao por Z. mobilis recombinante.
A figura 2.21 mostra o mapa do plasmdeo pZMETX, desenvolvido pelo
grupo de pesquisa de Agrawal et al. (2011), os quais empregaram dois
operons para a assimilao da xilose, sob o controle do promotor de Z.
mobilis piruvato decarboxilase (Ppdc), e, para a metabolizao desta pentose,
o promotor enolase (Peno).

Figura 2.21 Mapa do plasmdeo pZMETX. Onde: Ppdc, promotor piruvato
decarboxilase; Peno, promotor enolase; xylA, xilose isomerase; xylB,
xilulokinase; talB, transaldolase; tklB/tktA, transquetolase; CmR, gene de
resistncia ao clorofenicol; ZM27, origem de replicao de Z. mobilis; p15a,
origem de replicao de E. coli. Fonte: AGRAWAL et al. (2011).

2.8.2. METABOLIZAO DA ARABINOSE
Conforme observado no item 2.4.3, a hemicelulose principalmente
composta por pentoses, em maior proporo a xilose, na maioria dos
materiais lignocelulsicos, no entanto, a arabinose tambm se apresenta em
nveis significativos. Parker et al. (1995) transformaram a linhagem
ATCC39676 (pZB206), inserindo genes de metabolizao desta pentose,
alcanando 25 g/L de etanol; contudo relataram dificuldades na
metabolizao deste carboidrato, relacionando-as baixa afinidade da
protena transportadora com os mesmos. Na tabela 2.6 observa-se a
comparao do desempenho de diferentes linhagens recombinantes de Z.
mobilis para a produo de etanol a partir da xilose e arabinose.


61
Tabela 2.6. Comparao do desempenho de diferentes linhagens recombinantes de Z. mobilis para a produo de etanol.

Linhagem Objetivo da T.G. Genes inseridos Fonte de Carbono Condies Etanol Referncia
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Metabolizao
da xilose
XI, XK, TAL, TKT
Hidrolisado de trigo
(6 g/L de glicose,
16 g/L de xilose)
+ 10 g/L de glicose
Temperatura: 30
o
C
pH: 5
Tempo: 11 h
11 g/L
DAVIS
et al. (2005)
Z. mobilis
CP4 (pZB5)
Metabolizao
da xilose
XI, XK, TAL, TKT
15 g/L de glicose
35 g/L de xilose
Temperatura: 30
o
C
pH: sem ajuste
Tempo: 69 h
24 g/L
ZHANG
et al. (2003)
Z. mobilis
ZW801-4
Metabolizao
da xilose
XI, XK, TAL, TKT
100 g/L de glicose
80 g/L de xilose
Temperatura: 33
o
C
pH: 5,8
Tempo: 67 h
7 g/L de acetato
70 g/L
CAIMI
et al. (2011)
Z. mobilis
ZM4
Metabolizao
da xilose
XI, XK, TAL, TKT

45 g/L de xilose

Temperatura: 30
o
C
pH: 5
Tempo: 40 h
1,2% cido actico
24 g/L
CHEN
et al. (2009)
Z. mobilis
8 b
Metabolizao
da xilose
XI, XK, TAL, TKT

170 g/L de resduo de
papel + 1% (v/v) de
hidrolisado de milho
Temperatura: 37
o
C
pH: 4,8
Tempo: 5 dias
C. E.: 10 FPU/g
40 g/L
ZHANG
et al. (2010)
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Metabolizao
da xilose
XI, XK, TAL, TKT
65 g/L de glicose
65 g/L de xilose
Temperatura: 30
o
C
pH: 5
Tempo: 48 h
60 g/L
JOACHIMSTHAL
et al. (1999)


62
Linhagem Objetivo da T.G. Genes inseridos Fonte de Carbono Condies Etanol Referncia
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Metabolizao
da xilose
XI, XK, TAL, TKT
100 g/L de glicose
100 g/L de xilose
Temperatura: 30
o
C
pH: 5,75
Tempo: 48 h
90 g/L
AGRAWALL
et al. (2011)
Z. mobilis
ATCC 39676
Metabolizao de
xilose/
arabinose
XI, XK, TAL e TKT
+
araA, araB, araD
25 g/L de arabinose
25 g/L de glicose
Temperatura: 37
o
C
pH: -
Tempo: 48 h

20 g/L
DEANDA
et al. (1996)
Z. mobilis
206 C (pZB301)
Metabolizao de
xilose/
Arabinose
XI, XK, TAL, TKT +
araA, araB, araD
20 g/L de xilose
20 g/L de arabinose
20 g/L glicose
Temperatura: 30
o
C
pH: -
Tempo: 48 h
19,8 g/L
ZHANG
et al. (1998)
Z. mobilis
ZM4/Acr(pZB5)

Metabolizao
de xilose/
Resistncia ao
acetato
XI, XK, TAL, TKT +
Acr
40 g/L de glicose
40 g/L de xilose
Temperatura: 30
o
C
pH: 5
Tempo: 53 h
12g/L de acetato
38,6 g/L
JEON
et al. (2002)
Z. mobilis
206C (pZB301)
Metabolizao de
xilose/
arabinose
XI, XK, TAL e TKT
+
araA, araB, araD
40 g/L de xilose
20 g/L de arabinose
40 g/L de glicose
Temperatura: 37
o
C
pH: -
Tempo: 48 h
42 g/L
MOHAGHEGHI
et al. (2002)
Z. mobilis
ZW705-ara354A7
Metabolizao de
xilose/
Arabinose
XI, XK, TAL e TKT
+
araA, araB, araD
50 g/L de glicose
30 g/L de xilose
30 g/L de arabinose
Temperatura: 30-35
o
C
pH: -
Tempo: 96 h
45 g/L
YANG
(2011)
Z. mobilis
MTCC 92
Produo de
endoglucanases
pET 20b
4% de bagao de cana
pr-tratado
Temperatura: 30
o
C
pH: 7
Tempo: 3 dias
40 g/L
VASAN
et al. (2011)
Onde: T.G: Transformao gentica; XI: xilose isomerase; XK: xiluloquinase; TAL: transaldolase; TKT: transquetolase; araA: L-
arabionose isomerase; araB: L-ribuloquinase; ara D: L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase; Acr: Mutante tolerante ao acetato.


63
Posteriormente, Zhang et al. (1998) desenvolveram uma linhagem
recombinante atravs da adio de genes responsveis pelo metabolismo de
xilose e de arabinose, tais como: xilose isomerase, xiluloquinase, L-arabionose
isomerase (araA), L-ribuloquinase (araB), L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase (ara
D), transaldolase (talB) e transquetolase (tktA). A produo de etanol ocorreu
em 96 horas (exceto em 47 horas para a xilose), atingindo 91, 55 e 79% de
eficincia de fermentao a partir de 2% (m/v) das seguintes combinaes de
acares: xilose, arabinose, e xilose/arabinose, respectivamente. Na presena
de xilose, arabinose e glicose, a bactria recombinante atingiu 79% de
eficincia de fermentao em etanol, durante 48 horas.
Estudos sobre o desenvolvimento da linhagem Z. mobilis ATCC39767,
fermentadora de arabinose e glicose foram realizados por Deanda et al. (1996),
atravs da insero dos seguintes genes: L-arabionose isomerase (araA), L-
ribuloquinase (araB), L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase (ara D), transaldolase
(talB) e transquetolase (tktA). Foi alcanado cerca de 20 g/L de etanol, a partir
de 2,5% (m/v) de L-arabinose e 2,5 % (m/v) de glicose. Todavia, 40% das
clulas perderam sua habilidade aps crescimento em meio complexo (KUHAD
et al., 2011). Empregando a mesma linhagem, ATCC39767, Chou et al. (1997)
obtiveram etanol em uma concentrao de 33,5 g/L, em meio contendo 30, 30
e 20 g/L de glicose, xilose e arabinose, respectivamente.
Mohagheghi et al. (2002) empregaram a linhagem AX101, que resultou
em uma eficincia de fermentao de 84%, atingindo 42 g/L de etanol a partir
de 100 g/L em meio contendo glicose, xilose e arabinose, durante 48 horas. A
presena de at 4,5 g/L de cido actico no afetou a fermentao, no entanto,
acima destas concentraes houve acmulo de xilose, aumento de xilitol,
subproduto na fermentao de xilose, bem como reduo da produo de
etanol pela bactria Zymomonas mobilis.
Cabe ressaltar que, segundo Mohagheghi et al. (2002), o maior
crescimento bacteriano ocorre na presena de glicose, no havendo aumento
significativo na presena de xilose e arabinose, devido inibio pelo etanol
produzido anteriormente ao consumo dos mesmos. Deanda et al. (1996) j


64
haviam reportado sobre tal comportamento, relatando ainda que linhagens
fermentadoras de arabinose e xilose apresentam lentido em seu crescimento,
assim como utilizao incompleta destes carboidratos; todavia, a produo de
biomassa obtida a partir de arabinose apresentou-se semelhante obtida pela
hexose. Neste contexto, na nova via metablica h a converso de 5 moles de
etanol, a partir de 3 moles de L-arabinose, conforme a seguinte equao
estequiomtrica:
3 L-arabinose + 3 ADP + 3 Pi 5 etanol + 5 CO
2
+ 3 ATP + 3 H
2
O.
2.8.3. PROBLEMTICAS
Alguns problemas esto relacionados transformao gentica do
microrganismo Z. mobilis, tais como a resistncia a alguns antibiticos (como
estreptomicina e gentamicina), o que pode influenciar quanto insero de
marcas de seleo que promovem resistncia a tais composto (YANG et al.,
2010), a presena de plasmdeos nativos no citoplasma celular, dificultando a
estabilidade de plasmdeos recombinantes, a no ocorrncia de bacterifagos,
dificultando a transformao atravs dessa tcnica, e, principalmente, o
eficiente mecanismo de reparo deste microrganismo (ZOU et al., 2012).
Adicionalmente, aps o desenvolvimento da transformao gentica, tal
bactria tambm possui algumas dificuldades de metabolizao das pentoses,
assim como inibio por algumas substncias presentes nos meios
hidrolisados, conforme descrito nos itens a seguir.
2.8.3.1. Estabilidade
A estabilidade dos plasmdeos recombinantes um fator preocupante,
uma vez que estes podem ser perdidos ao longo das inmeras divises
celulares, o que proporciona baixa expresso dos genes transformantes
(NORDSTROM, 1985).
Desta forma, Song et al. (2005) avaliaram a estabilidade do
microrganismo Z. mobilis 31821 (pZB5) recombinante, o qual fermenta xilose e
glicose, relatando que aps 12 horas de fermentao, os acares foram
consumidos em cerca de 90% (m/v), sendo que o consumo exclusivamente da
pentose ocorreu na proporo de 81,9% (m/v). Atravs da ferramenta de


65
simulao, a frao de plasmdeo recombinante (calculada de acordo com
razo entre a taxa de crescimento mximo do plasmdeo original e do
recombinante) foi de 81,0%, aps 23 geraes em meio sinttico, bem como de
90,3% em meio contendo 20% de hidrolisado hemicelulsico, apresentando
taxa de crescimento mximo de 0,185 h
-1
. J aps a 26
o
gerao, a taxa de
utilizao da xilose, a taxa de consumo dos acares totais, o rendimento de
etanol, bem como o consumo de xilose foram reduzidos em 30, 40, 6 e 44%,
respectivamente.
2.8.3.2. Protena Transportadora
A protena facilitadora (glf) responsvel pelo transporte de acares no
interior das clulas atravs de um sistema de difuso facilitada, baixa afinidade
e alta velocidade (WEISSER et al., 1995). Neste contexto, Kim et al. (2010) e
Agrawal et al. (2011), dentre outros pesquisadores reportaram sobre a
problemtica da insero da xilose em clulas Z. mobilis, afirmando que uma
das solues para avanos no seu metabolismo seria o desenvolvimento de
genes que codificam para o transporte desta pentose. Cabe ressaltar que
estudos sobre a incorporao dos genes de metabolizao deste acar na
levedura S. cerevisiae, a qual tambm no possui transportador especfico para
a xilose, demonstraram que tal microrganismo apresenta as mesmas
dificuldades de fermentao que a bactria em estudo (SEDLAK & HO, 2004).
Provavelmente, aps a transformao gentica em Z. mobilis, a xilose
dentre outros compostos so transportados pelo fato de serem relativamente
semelhantes estrutura da glicose e frutose (WEISSER et al., 1996). Tal
fenmeno ainda no foi profundamente estudado, no entanto, pesquisas
apontam por uma competio pela nica via de transporte, comum para os dois
carboidratos. Porm, Weisser et al. (1996) inseriram o gene que codifica para a
enzima responsvel pelo transporte de glicose e xilose (glf) de Z. mobilis, em
uma colnia mutante de E. coli, a qual possua deficincia no transporte de
acares e diferentemente do reportado com a bactria em estudo, E. coli
apresentou o transporte eficiente para tal pentose. Chen et al. (2009) tambm


66
reproduziram este experimento, promovendo um aumento de 28 e 42 % no
consumo de glicose e de pentose, respectivamente.
Adicionalmente, estudos de modelagem indicam que uma das causas
relacionadas dificuldade de metabolizao desta pentose est relacionada
constante de saturao pelo substrato para o crescimento de biomassa, a qual
apresenta-se cerca de 3 vezes maior para o consumo de xilose do que para a
glicose, similar ao comportamento de outros microrganismos recombinantes,
como Saccharomyces cerevisiae (KRISHNAN et al., 1999) e Klebsiella oxytoca
(TURNER et al., 1988), de 3 a 6 vezes maior.
2.8.3.3. Xilose X Glicose
Conforme sinalizado na literatura por Zhang et al. (1995), Krishnan et al.
(2000) e Lawford & Rousseau (2000), a maior produo de etanol ocorre
durante o consumo de glicose e, posteriormente, o consumo de xilose ocorre
mais lentamente. Embora Zhang et al. (1995) tenham engenheirado a linhagem
CP4 de Z. mobilis (pZB5), tornando-a capaz de co-fermentar a xilose e a
glicose, a hexose ainda permanece como acar prioritrio, promovendo uma
possvel represso catablica sobre a pentose, diferentemente do metabolismo
de E. coli (LAWFORD et al., 2000).
Este fato ocorre, pois medida em que os dois carboidratos so
consumidos sequencialmente, a xilose ou fontes no preferenciais de carbono
permanecem inalterados no meio de cultura at a metabolizao completa da
glicose, gerando elevadas concentraes de inibidores, como o etanol e cido
ltico, reduzindo a taxa de utilizao da xilose. Dessa forma, segundo relatos
de Supple et al. (2000), Joachimshtal & Rogers (1999), Lawford & Rousseau
(1999) e Lawford et al. (1996), no que tange melhorias na metabolizao da
xilose, visando um processo de co-fermentao em escala industrial, tal
pentose deveria ser metabolizada anteriormente glicose; uma vez que o
etanol promove maior inibio na metabolizao da pentose do que quando
comparado metabolizao desta hexose pela bactria Zymomonas mobilis
recombinante.


67
Neste contexto, Supple et al. (2000) buscaram pelo isolamento de um
mutante que demonstrasse alterao na fonte de carbono preferencial pela
bactria Z. mobilis, sendo capaz de metabolizar a xilose anteriormente
glicose. O mutante CP4 (pZB5) M1-2 apresentou alterao gentica nos genes
da glucoquinase (glK) e da protena facilitadora do transporte de glicose (glf),
atingindo 90% de eficincia de produo de etanol.
A proporo ideal de glicose e xilose utilizadas em um processo
fermentativo por Z. mobilis recombinante varia de acordo com as linhagens
empregadas, uma vez que alguns autores, como Kim et al. (2010) afirmaram
que quando h concentraes semelhantes desses acares na fermentao
por tal microrganismo h baixo consumo da pentose (apenas 10%), enquanto a
hexose completamente consumida. Lau & Dale (2009) tambm notaram que,
na fermentao empregando estas duas fontes de carbono, apenas de 10 a
20% (m/v) da pentose foi metabolizada por Saccharomyces cerevisiae 424A
(LNH-ST). Os pesquisadores ainda relataram que o transporte de xilose
aumentou em at 85% quando a concentrao de glicose era baixa, contudo,
enfatizaram que sem a presena de hexose no meio de cultura no houve
consumo da pentose.
Entretanto, contraditoriamente, Joachimsthal et al. (1999), Rogers et al.
(1997) e Zhang et al. (1995) reportaram que a adio de concentraes
equimolares de glicose e xilose, empregando linhagens de Z. mobilis CP4
(pZB5) e ZM4 (pZB5), CP4(pZB5) e CP4(pZB5), respectivamente, so
favorveis ao crescimento celular e produo de etanol por tais linhagens.
Estes acontecimentos podem ser decorrentes de diferenas adaptativas nas
linhagens, pois Lau & Dale (2009) empregaram Saccharomyces cerevisiae
424A (LNH-ST), ao passo que Joachimsthal et al. (1999), Rogers et al. (1997) e
Zhang et al. (1995) utilizaram as linhagens CP4 e ZM4, conforme descrito
anteriormente.
Cabe ressaltar que as clulas se tornam mais sensveis com a presena
de etanol quando os dois carboidratos esto presentes no meio do que quando
h apenas a hexose (LEKSAWASDI et al., 2001), o que pode ser causado pela


68
formao de subprodutos, ou mesmo pela dificuldade no transporte de xilose.
Outra hiptese para essa problemtica seria a possvel represso catablica da
glicose sobre a pentose, o que torna a rota metablica mais lenta, afetando
tambm a produtividade do processo (DiMARCO& ROMANO, 1985; PARKER
et al. 1995; ROGERS & LAWFORD, 1999; LAWFORD et al., 2000;
LEKSAWASDI et al., 2001; MOHAGHEGHI et al. 2002; KIM et al., 2010).
2.8.3.4. Atividades enzimticas
Estudos recentes de Caimi et al. (2012) reportaram o acmulo de
ribulose em colnias de Z. mobilis crescidas em xilose. Desta forma, os autores
modificaram geneticamente tal microrganismo, visando aumentar a atividade
de ribose-5-fosfato isomerase, reduzindo o acmulo deste composto. A
produo de biomassa e de etanol aumentou em 15 e 5% (m/v),
respectivamente, durante 60 horas, empregando 100 g/L de xilose.
De Graaf et al. (1999) alegaram que a baixa expresso de xiluloquinase
poderia justificar a dificuldade de fermentao de xilose pelo microrganismo em
tese, uma vez que a taxa de captao da pentose de 2 a 3 vezes menor do
que a da glicose. Visando aumentar a converso deste monossacardeo em
etanol, Jeon et al. (2005) buscaram por melhorias genticas atravs da super-
expresso desta enzima na linhagem ZM4/Acr (pZB5), porm, tal
transformao no promoveu maior converso em produto. Jim et al. (2003)
citaram que a super-expresso de xiluloquinase em Saccharomyces cerevisiae
promoveu reduo do crescimento celular, assim como da produo de etanol.
J Gao et al.(2002) e Chou et al. (2002) reportaram que as baixas
concentraes de xilose isomerase detectadas na linhagens ATCC 39676
(pZB4L) so os fatores responsveis pelo lento consumo de xilose. De Graaf et
al. (1999) tambm sugeriram que XI e XK, provenientes de Klebsiella
pneumoniae, possuem pouca afinidade pela pentose no microrganismo Z.
mobilis. Foi constatado, ainda, que as mesmas enzimas mantinham-se em
baixas concentraes, ao contrrio da TKL e TAL, exgenas de E.coli. Neste
contexto, Kahsay et al. (2011) expressaram a xilose isomerase a partir de A.


69
missouriensis, relatando que a bactria em estudo apresentou melhores
resultados do que utilizando genes de E. coli, atingindo 26,3 g/L de etanol.
2.8.3.5. Produo de Xilitol
Recentemente, diversos autores relatam a produo de xilitol por Z.
mobilis recombinante, a qual contm genes de metabolizao e assimilao da
xilose (KIM et al., 2000; MOHAGHEGHI et al., 2002; JEON et al., 2005;
ZHANG & CHEN, 2009). Viitanem et al. (2008) e Smith et al. (1999) tambm
afirmaram que a xilose isomerase inibida pela presena de xilitol em
linhagens de Arthrobacter e de E. coli.
Feldmann et al. (1992) foram os primeiros autores a identificar que a
formao de xilitol durante o metabolismo da xilose por Z. mobilis um fator
limitante para a produo de etanol. Os estudos detectaram a atividade de
NADPH dependente aldose redutase, capaz de reduzir xilose a xilitol no
presente microrganismo. Segundo Zhang & Chen (2009), a enzima
periplasmtica glicose-frutose oxirredutase (GFOR), responsvel pela produo
de sorbitol, catalisa tambm tal reao juntamente com o cofator NADPH,
todavia, pouco se sabe sobre as causas do desvio da rota metablica.
A enzima GFOR catalisa a reduo de xilose atravs do mecanismo
ping-pong, o qual inibido na presena de elevadas concentraes de glicose.
Comparativamente, a produo de sorbitol inicia-se em cerca de 2 horas a
partir de frutose/glicose, enquanto que a de xilitol ocorre em 30 horas de
processo a partir da pentose. Devido a menor atividade especfica e afinidade
desta enzima no que tange sntese de xilitol, os nveis alcanados do mesmo
so inferiores aos de sorbitol, porm, o cofator no desassocia-se do produto,
mantendo-se fortemente ligado (Zhang & Chen, 2009).
Adicionalmente, pesquisas recentes de Agrawal & Chen (2011) indicam
a existncia da enzima xilose redutase na bacteria Z. mobilis, exibindo 150
vezes mais afinidade com o benzaldedo do que com a xilose. Neste contexto,
o xilitol d origem ao xilitol-fosfato, dificultando a fermentao mesmo quando
apresenta-se em baixas concentraes (JEON et al., 2005). A produo e o
acmulo deste resulta na inibio do crescimento microbiano, bem como do


70
rendimento em etanol pelas linhagens consumidoras desta pentose (ZHANG &
CHEN, 2009).
2.8.3.6. Inibio pelo Substrato/ Produto
Leksawasdi et al. (2001) desenvolveram um modelo matemtico
baseado na cintica de Monod, o qual avalia a produo de etanol a partir de
xilose e glicose em meio sinttico, indicando as concentraes limitantes e
inibitrias de substrato e produto. Os autores utilizaram concentraes de 25
g/L, 50 g/L e 65 g/L de glicose e xilose, a partir de resultados reportados por
Lee & Rogers (1983), constatando que o etanol se torna inibitrio para o
crescimento celular de Z. mobilis recombinante (linhagem ZM4, pZB5) em
concentraes de glicose e xilose de 57,2 g/L e 56,3 g/L, e para a sntese de tal
produto em concentraes de 75,4 g/L e 81,2 g/L, respectivamente. Segundo
estes estudos tericos, os substratos promovem interrupo da produo de
biomassa e de etanol nas concentraes de 200 g/L e 186 g/L de glicose,
assim como nas concentraes de 600 g/L e 600 g/L de xilose,
respectivamente. Adicionalmente, Jeon et al. (2002) relataram que 160 g/L a
tolerncia mxima ao etanol por tal linhagem, produzindo 2 moles de
produto/mol substrato.
2.8.3.7. Inibio por Compostos Txicos
A eficincia da produo de etanol pelos microrganismos pode ser
afetada devido presena de substncias txicas presentes na frao
hemicelulsica pr-tratada, assim como em substratos slidos, conforme
descrito no item 2.7.
Atravs de anlise microscpica foi constatado que concentraes
inibitrias de aldedos provocam modificaes morfolgicas na fase de
crescimento exponencial de Z. mobilis. Diferentemente das clulas normais, as
mesmas apresentaram-se alongadas ou formaram cadeias curtas aps o
perodo de 6 horas. Em 24 horas, as clulas expostas a concentraes
inibitrias de aldedo se tornam arredondadas (ZALDIVAR et al., 1999). SONG
et al. (2005) tambm notaram modificaes morfolgicas na linhagem de Z.
mobilis 31821 aps um longo perodo de adaptao em at 50% (v/v) de


71
hidrolisado cido de madeira. Empregando 20% (v/v) deste material, as
colnias do incio do processo adaptativo apresentam-se translcidas,
mucides, planas e cilndricas, ao passo que as aclimatadas possuem
colorao leitosa e superfcie curvilnea.
Shahab & Hadi (1995) j haviam demonstrado que o furfural reage com
os pares de base (A-T) nas seqncias de DNA de cadeia dupla, promovendo
ruptura dos filamentos. A reduo da taxa de crescimento, da produtividade em
etanol, assim como da sntese de biomassa esto entre os efeitos negativos
produzidos pelo furfural e pelo HMF sobre os microrganismos (TAHEZRADEH,
1999). Conforme observado por diversos autores, a bactria em estudo possui
baixa tolerncia a esses compostos, os quais dificultam a fermentao da
xilose presente no hidrolisado hemicelulsico.
Padilla et al. (2005) investigaram a toxicidade do furfural frente
produo de etanol e ao crescimento da linhagem CP4 (pZB5) de Z. mobilis
modificada, atravs da adio de 0,475 g/L e 1,9 g/L deste aldedo no meio de
fermentao. Na primeira condio, os acares foram consumidos
integralmente, entretanto, a metabolizao dos mesmos foi prejudicada com a
presena de altas concentraes de furfural no meio. Os autores observaram
que os efeitos inibitrios reduziram a produo de biomassa em 30 e 60% e a
produo de etanol em 19 a 76%, respectivamente. Ranatunga et al. (1997)
fizeram avaliao semelhante atravs da fermentao do hidrolisado ci do de
carvalho, indicando que 0,9 g/L de hidroximetil furfural provoca inibio de 40%
na produo de etanol.
Adicionalmente, estudos realizados por Yang et al. (2010) indicaram que
dentre as diferentes formas de acetato, o acetato de sdio o mais prejudicial
bactria em questo, seguido do acetato de potssio, do acetato de amnio e
do cloreto de sdio. Segundo Kim et al. (2000) e Jeon et al. (2002), elevadas
concentraes destes sais alteram o pH intracelular, modificando o
metabolismo devido reduo dos nveis de nucleosdeos trifosfatos presentes
nas clulas. Desta forma, apesar de alguns autores, como Lawford et al.
(2001), terem atingido elevada converso em etanol por linhagens


72
recombinantes de Z. mobilis a partir de pentoses, as mesmas ainda
apresentam pouca tolerncia frente ao cido actico e ao etanol (DION et al.,
2003).
2.8.4. ALTERNATIVAS
Visando minimizar o efeito da toxicidade destes compostos inibitrios
nas clulas, muitos estudos utilizam diferentes linhagens para se obterem
maiores rendimentos em etanol e produtividade volumtrica. Alm disso, no
que tange melhoria do processo metablico da xilose, existem algumas linhas
de pesquisa que almejam contornar problemtica de converso deste acar
a etanol, conforme detalhado nos itens a seguir.
2.8.4.1. Linhagens adaptadas toxicidade
Tcnicas de engenharia gentica tambm vm sendo utilizadas para a
obteno de microrganismos tolerantes a compostos inibitrios presentes no
hidrolisado cido, como furfural, acetato e lactato. A linhagem Z. mobilis ZM4,
originada da ATCC31821 (JOACHIMSTHAL et al., 1998; YANG et al., 2009),
assim como a CP4, foram isoladas do caldo de cana-de-acar; no entanto,
comparativamente, a linhagem ZM4 apresenta melhor performance em etanol
(ZOU et al., 2011). Joachimshtal & Rogers (2000) j haviam comparado a
performance da linhagem ZM4 (pZB5) com a CP4 (pZB5), a partir de 65 g/L de
xilose e 65 g/L de glicose, produzindo 62 g/L e 52 g/L de etanol, em 48 h e 60
h, respectivamente. Contudo, quando as concentraes de carboidratos se
elevam para 75 g/L, a produo mantm-se em 67 g/L pela linhagem ZM4.
A espcie Z. mobilis ZM4 possui genes com importantes funes
fisiolgicas e metablicas, dentre elas, a tolerncia ao acetato de sdio na
concentrao de 12 g/L, em temperatura de 30
o
C e pH (YANG et al., 2010), ao
passo que a linhagem CP4 (pZB5) de Z. mobilis tolera at 9,3 g/L deste sal
(RANATUNGA et al., 1997). J Kim et al. (2000) reportaram que concentraes
de 10,9 g/L de acetato de sdio afetaram significativamente a fermentao por
tal espcie. Dentre outros compostos inibitrios, o crescimento de Z. mobilis
ZM4 foi mais influenciado negativamente pela presena de vanilina, seguida de
furfural e do HMF, atingindo completo crescimento (at a fase estacionria) em


73
21, 19 e 16 horas, respectivamente, ao passo que na ausncia destes, a
linhagem cresce em 11 h de fermentao (YANG et al., 2010).
Lawford et al. (2000) avaliaram a co-fermentao atravs de processo
contnuo por uma linhagem recombinante de Z. mobilis (39676/ pZB4L), que
apresenta boa performance no hidrolisado cido de madeira. Os pesquisadores
mostraram que 4 g/L de cido actico no afetou o crescimento celular, que
ocorreu com um fator de rendimento em biomassa de 0,030 g clulas/g dos
acares, promovendo tambm um aumento do coeficiente de manuteno
energtica variando de 0,46-1,0 g carboidratos/g clulas.h. Por tolerar maiores
concentraes deste composto, a converso em produto por substrato
consumido foi de 0,47 g/g, a partir de alteraes na alimentao do processo
de 4 a 3% (m/v) de xilose e de 0,8 a 1,8% (m/v) de glicose, assim como
reportado por Lawford et al. (1999). Entretanto, quando houve variao do pH 6
para 5, a concentrao de biomassa e a produtividade volumtrica reduziram
em 12 e 32%, respectivamente, contudo, a converso em etanol e a produo
final foram inalteradas, atingindo a concentrao de 24 g/L de etanol e 5 g/L de
xilose residual, aps 24 horas de fermentao.
Estudos empregando a linhagem ZM4 transformada geneticamente
atravs da insero do gene AcR, que a atribui maior resistncia ao acetato,
apontam para a tolerncia a este inibidor em concentraes de 20 g/L
(JOACHIMSTHAL et al., 1998). Posteriormente, Jeon et al. (2002) empregaram
esta linhagem recombinante (ZM4/Acr), inserindo, tambm, os genes de
metabolizao da xilose (pZB5). A nova bactria recombinante passou a tolerar
a presena de 12 g/L de acetato, a partir de 40 g/L de glicose e 40 g/L de
xilose, atingindo 38,6 g/L de etanol e 7 g/L de xilose residual aps 53 horas de
processo. Recentemente, Zhang & Lynd (2011) reportam que a linhagem 8b
tolera maiores concentraes deste inibidor, em at 16 g/L de cido actico,
atingindo 87 e 85% de eficincia de fermentao em etanol, em pH 6, nas
temperaturas de 30
o
C e 37
o
C, respectivamente, a partir de meio contendo
glicose, xilose e hidrolisado cido do milho.



74
2.8.4.2. Reduo de cargas enzimticas no processo SSCF
Visando contornar as questes inibitrias do transporte de pentoses
atravs do processo de hidrlise enzimtica e co-fermentao simultneas
frente ao microrganismo Zymomonas mobilis recombinante, Olofsson et al.
(2010) desenvolveram uma estratgia simplificada, que se baseava na adio
de baixos nveis de celulases. Dessa forma, ocorria a liberao de baixas
concentraes de glicose ao longo da fermentao, reduzindo a represso
catablica por tal acar e possibilitando, assim, que o consumo de xilose
aumentasse de 40 a 80%.
2.8.4.3. Modificao gentica da glf
Conforme relatado no item 2.8.3, Weisser et al. (1995), Kim et al. (2010),
Agrawal et al. (2011), dentre outros autores, indicaram que clulas de Z.
mobilis geneticamente transformadas possuem dificuldades metablicas de
consumir a xilose, sendo uma das hipteses relacionada possvel competio
entre esta pentose e a glicose frente uma nica protena transportadora
desses carboidratos. Neste contexto, algumas pesquisas investigam a
transformao gentica dos genes que codificam para as protenas
transportadoras, visando otimizar o desempenho de tal bactria frente
insero e fermentao da xilose. Recentemente, Ren et al. (2009)
modificaram geneticamente o microrganismo E. coli, inserindo o gene
codificador da protena facilitadora do transporte dos carboidratos (glf) em Z.
mobilis. Os autores inativaram genes responsveis pela represso catablica
em E. coli, promovendo o consumo de 42% de xilose.
2.8.4.4. Inativao da GFOR
Viitanem et al. (2008) desenvolveram a linhagem ZW800, a qual possui
reduzida produo de xilitol, atravs da inativao do gene que codifica para a
GFOR, um dos mecanismos responsveis pela sntese deste composto. Os
autores obtiveram a produo de 73,3 g/L de etanol, a partir de 92 g/L de
glicose e 97 g/L de xilose, na presena de 7,2 g/L de acetato, bem como 10
mM de sorbitol. No entanto, apenas 30 g/L de xilose foram consumidas durante
o perodo de 50 horas.


75
2.8.4.5. Adaptao Metablica
Diversos autores reportaram a tcnica de adaptao metablica, Fong et
al. (2003), Kuyper et al. (2005), Rosemberg, (2001), Meijnem et al. (2008),
dente outros. Segundo Portnoy et al. (2011), o processo de adaptao
metablica promove aclimatao a diferentes condies ambientais, ativao
das vias metablicas, melhorias na utilizao de substratos, eleva as
concentraes de produto, proporciona maiores valores de produtividade e
rendimento em produto, dentre outros benefcios.
Nghuyem et al. (1996) realizaram esta tcnica adaptativa atravs de um
longo perodo de cultivo contnuo da bactria Z. mobilis no hidrolisado cido de
madeira, o que proporcionou reduo da sensibilidade celular a componentes
inibitrios presentes no meio hidrolisado. Recentemente, Yanase et al. (2007)
tambm reportaram melhorias na espcie Zymobacter palmae aps
aclimataes sucessivas, reduzindo o tempo de processo de 5 dias a 8 horas,
a partir de 40 g/L de glicose e 40 g/L de xilose.
Kim et al. (2010) e Agrawal et al. (2011) tambm sugeriram a utilizao
da adaptao metablica sequencial, na qual houve adio de xilose e glicose
em diferentes concentraes. Atravs desta tcnica, Agrawal et al. (2011)
contornaram o desvio da via das pentoses para xilitol, elevando a produo de
etanol pela linhagem ZM4 (ATCC 31821) em at 90 g/L, a partir de 100 g/L da
pentose e 100 g/L da hexose, no perodo de 48 horas.
2.8.4.6. Integrao Cromossomal
A integrao cromossomal de genes responsveis pela metabolizao
de xilose outra questo a ser avaliada, a qual promove maior estabilidade s
clulas (MATSUSHIKA et al., 2009). Desta forma, a construo do transposon
pXt contendo os genes XI, XK, TAL, TKL, bem como a integrao destes no
genoma da bactria Zymomonas mobilis ZM-mtc9xt foi investigada por Zhou et
al. (2011). Os pesquisadores relatam a produo de etanol em 98, 3 g/L e 24,1
g/L a partir de 23% (m/v) de glicose e 6% (m/v) de xilose, respectivamente;
misturas de pentose e hexose nas concentraes de 6% (m/v) 17% (m/v),
respectivamente, reduziram a produo para 88,9 g/L de etanol.


76
2.8.5. TRANSFORMAO GENTICA PARA DIFERENTES FINALIDADES
Alm da incorporao de genes que codificam para a atividade de XI,
XK, TAL e TKL em Z. mobilis, pesquisas reportam a modificao gentica para
outras finalidades.
So vrios os relatos de melhoria da bioconverso da celulose atravs
de microrganismos procariotos geneticamente modificados. Yanase et al.
(2005) estudaram a insero de genes que codificam a enzima -glucosidase
de Ruminococcus albus em Z. mobilis, transferindo-lhe a habilidade de
fermentar a celobiose proveniente de materiais lignocelulsicos, atingindo
cerca de 10 g/L de etanol.
Linger et al. (2010) avaliaram a insero de genes responsveis pela
sntese de celulases heterlogas, e sugeriram que a bactria Z. mobilis seria
capaz de expressar e excretar altos nveis dessas enzimas, podendo
futuramente ser empregada na concepo tecnolgica do Bioprocesso
Consolidado. Vasan et al. (2011) tambm realizaram tais estudos, alcanando
0,134 FPU/mL de celulases e 5,79 IU/mL de endoglucanases, no entanto, as
mesmas armazenaram-se, em sua maior proporo, no espao periplasmtico
das clulas. Os autores realizaram experimentos utilizando a linhagem
recombinante MTCC92, produzindo 12% (m/v), 5,5% (m/v) e 4% (m/v) de
etanol, a partir de glicose, CMC e 4% de bagao de cana pr-tratado,
respectivamente.
Kaczowka et al. (2005) estudaram sobre a incorporao do gene que
codifica para a enzima piruvato descarboxilase proveniente de Z. mobilis, no
microrganismo Haloferaz volcanii, pertencente ao grupo Archaea. Tal grupo
possui caractersticas e propriedades fisiolgicas que permitem o crescimento
em altas concentraes de sal, temperatura e pH, tornando-o hbil para a
produo de etanol sob condies extremas.
Kazuyoshi et al. (1991) transformaram o microrganismo Klebsiella
oxytoca, inserindo-lhes genes responsveis pela codificao da enzima
piruvato descarboxilase e lcool desidrogenase da bactria Zymomonas
mobilis, alcanando 40 g/L de etanol e rendimento de 0,48 g produto/ g de


77
xilose, assim como de 0,50 g produto/ g glicose. Wood & Ingram (1992)
tambm empregaram a bactria Klebsiella oxytoca, previamente engenheirada
com os genes de Zymomonas mobilis, bem como genes de C. thermocellumm,
responsveis pela sntese de etanol e codificao de endoglucanases
(permitindo a degradao de celulose), respectivamente, atingindo 45,2 g/L de
etanol e produtividade volumtrica de 1,5 g/L.h a partir de 1% (m/v) de
celobiose.
2.9. CONSIDERAES GERAIS
A bactria Zymomonas mobilis possui caractersticas nicas dentre os
microrganismos fermentativos, apresentando crescimento, produo de energia
e resposta s condies de cultura extremamente peculiares, causando um
grande interesse no mundo cientfico, biotecnolgico e industrial. O excntrico
comportamento desta bactria, que possui habilidade em acoplar e desacoplar
a produo de energia a favor da formao do produto, alm de possuir
comportamentos oscilatrios, permitindo a interao entre a taxa de
crescimento celular e a produo de etanol; capacidade de responder a
alteraes fsicas e qumicas do meio ambiente, bem como sua diversidade na
formao de produtos, torna-a um microrganismo ideal para o estudo e
desenvolvimento de processos levados a cabo por agentes microbianos
(ELNASHAINE et al., 2006).
No entanto, o potencial de utilizao industrial de Z. mobilis declinou
aps a constatao de que o rendimento desta bactria era inferior ao
apresentado pela levedura Saccharomyces cerevisiae quando a fermentao
ocorria em melao e caldo de cana. Na presena de sacarose, a bactria
sintetiza dois subprodutos, a levana e o sorbitol, diminuindo significativamente
a produo de etanol. Concluiu-se que a utilizao da bactria Z.mobilis no
era vantajosa quando o substrato era a sacarose, embora, visando melhorias
na produo de etanol, o uso de invertase para a hidrlise deste substrato vem
sendo estudado (LEE & HUANG, 2000). Atualmente, a levedura S. cerevisiae
o microrganismo mais utilizado industrialmente para a produo de etanol,
contudo, a questo da escolha de tecnologias mais apropriadas necessite de


78
maiores anlises, uma vez que h muitas divergncias em relao ao
microrganismo adequado para a produo de etanol.
Quando o substrato a glicose, Zymomonas mobilis apresenta
vantagens competitivas em relao levedura, pois a bactria possui elevadas
taxas de produo, facilidade de manipulao gentica, dentre outras
vantagens, tornando relevante o estudo deste microrganismo como uma
alternativa promissora na cadeia produtiva do bioetanol. Visando promover
tambm a converso da xilose proveniente da frao hemicelulsica a etanol,
Zhang et al. (1995) iniciaram importantes avanos na engenharia gentica de
Z. mobilis, uma vez que tal bactria, naturalmente ocorrente, no possui a
habilidade de fermentar esta pentose. Todavia, conforme relatado por diversos
autores, o mecanismo gnico desta bactria no regula corretamente a
expresso dos genes inseridos, XI, XK, TAL e TKT. Desta forma, a
fermentao deste carboidrato ainda o foco de diversas pesquisas, pois a
habilidade de metabolizao da xilose considerada baixa quando comparada
com a da glicose (GAO et al., 2002; JEON et al., 2005).
Sumariamente, a estratgia concebida para a elaborao do presente
trabalho foi realizar o pr-tratamento qumico no bagao de cana-de-acar,
sob condies moderadas, seguido do desenvolvimento de diferentes
processos de bioconverso, denominados de processo SSF (Simultaneous
Saccharification and Fermentation) e SSCF (Simultaneous Saccharification and
Co-Fermentation). A bactria Z. mobilis apresenta resultados promissores no
que tange converso de glicose oriunda da frao celulsica, atravs do
processo SSF, no entanto, poucos estudos reportaram sobre o emprego do
bagao de cana como matria-prima para a produo de etanol por tal bactria
atravs dessa tecnologia. O processo de SSCF, considerado um
aperfeioamento do processo anterior, necessita de um microrganismo capaz
de consumir ambos os acares presentes neste material lignocelulsico.
Neste contexto, com o intuito de conferir ao microrganismo Z. mobilis as
caractersticas necessrias para fermentar ambos acares, a xilose oriunda
da frao hemicelulsica e a glicose oriunda da frao celulsica, necessria
a interveno da engenharia gentica e metablica.
CAPTULO 3: Justificativas e Objetivos

79
_____________________CAPTULO 3
JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS

3.1. JUSTIFICATIVAS
A cana-de-acar largamente produzida no Brasil e fornece a principal
fonte de carboidratos fermentveis para produo de etanol, embora apenas
um tero da biomassa contida no vegetal , atualmente, empregado para a
produo deste biocombustvel. A utilizao de materiais lignocelulsicos como
a palha da cana e o bagao, um dos principais resduos agroindustriais
gerados em nosso pas, desponta como soluo para se aumentar o
rendimento da produo de lcool em relao matria-prima, sem que haja a
necessidade de se expandir a rea de plantio, favorecendo toda a cadeia
produtiva e preservando o meio ambiente.
O novo conceito de produo de etanol est associado a sua obteno a
partir da biomassa lignocelulsica, aps hidrlise completa das fraes
polissacardicas. Neste panorama, faz-se evidente a importncia de
desenvolvimentos de estratgias para a produo de etanol do bagao de
cana, visto que este resduo possui alto contedo de celulose, que pode ser

80
hidrolisada para a produo de glicose e, posteriormente, possa ser
fermentada, atravs do processo de hidrlise enzimtica simultnea
fermentao.
O gnero bacteriano Zymomonas possui uma especial habilidade para a
produo de etanol, apresentando-se como uma alternativa atraente atual
demanda mundial por petrleo. Quando este microrganismo comparado com
a tradicional levedura, Saccharomyces cerevisiae, verifica-se uma maior taxa
especifica de produo de etanol, facilidade de manipulao gentica, e menor
produo de biomassa. Conforme observado em trabalhos anteriores, a
bactria Zymomonas mobilis mostra-se extremamente atraente para a
produo de etanol combustvel de segunda gerao a partir de glicose
proveniente da frao celulsica, em virtude de sua elevada capacidade de
absoro de glicose, altas taxas especficas de produo de etanol, resultando
em elevados valores de produtividade. No entanto, as linhagens naturalmente
ocorrentes mostraram-se incapazes de metabolizar um outro acar importante
encontrado nas biomassas de composio lignocelulsica, a xilose oriunda da
frao hemicelulsica.
A experincia aliada grande competncia instalada na produo de
bioetanol de segunda e terceira geraes pelos Laboratrios de
Desenvolvimento de Bioprocessos da Escola de Qumica da UFRJ, com
colaborao do Laboratrio de Biologia Molecular da UnB, especializado em
estudos de engenharia gentica, criam o ambiente favorvel para a realizao
de experimentos, empregando o microrganismo Z. mobilis, naturalmente
ocorrente e recombinante, como agente de processo. Consequentemente,
ampliam-se as possibilidades para que, no futuro, o pas fabrique em larga
escala produtos biotecnolgicos de grande interesse industrial.
Neste contexto, buscando pelo aproveitamento integral bagao de cana-
de-acar, o presente trabalho visa investigar a construo de uma linhagem
recombinante de Z. mobilis, atravs da incorporao de genes responsveis
pela metabolizao desta pentose; assim como avaliar o desempenho da
linhagem nativa quanto converso da glicose oriunda da frao celulsica.

81
Portanto, faz-se evidente a importncia do desenvolvimento de um
projeto sobre esta temtica, envolvendo baixos custos e altas produtividades. A
seguir, o objetivo geral e objetivos especficos foram traados:
3.1. OBJETIVO GERAL
Dentro do contexto apresentado acima, o objetivo geral do presente
trabalho consiste em investigar a produo de etanol de segunda gerao por
Zymomonas mobilis CP4 naturalmente ocorrente e recombinante, a partir da
fermentao do bagao de cana-de-acar, atravs da converso de xilose
(hemicelulose) e glicose (celulose), respectivamente.

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
Avaliar o desempenho de duas linhagens naturalmente ocorrentes de
Zymomonas mobilis, AG11 e CP4, face utilizao de dois acares
abundantes (glicose e xilose) no bagao de cana;
Otimizar o processo de hidrlise enzimtica com preparados comerciais,
simultnea fermentao com a linhagem selecionada a partir de bagao de
cana-de-acar (SSF), atravs de anlise de superfcie de resposta mediante
experimentos multivariados;
Avaliar a adio de nutrientes complementares ao hidrolisado celulsico
do bagao de cana para a produo de etanol por Z. mobilis atravs de
planejamento experimental;
Reproduzir os resultados obtidos no planejamento experimental em
biorreator instrumentado, com as variveis significativamente mais favorveis
produo de etanol a partir de bagao de cana-de-acar (SSF) segundo os
experimentos conduzidos em frascos agitados;
Otimizar o processo de hidrlise enzimtica com preparados comerciais
simultnea fermentao com a linhagem selecionada a partir de resduos da
indstria de celulose atravs de anlise de superfcie de resposta mediante
experimentos multivariados;
Avaliar a adio de nutrientes complementares ao hidrolisado celulsico

82
de resduos da indstria de celulose para a produo de etanol por Z. mobilis
atravs de planejamento experimental;
produo de etanol a partir de resduos da indstria de celulose, segundo os
experimentos conduzidos em frascos agitados;
Construir uma linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4 com
habilidade de fermentar pentoses (C5), atravs da incorporao de genes que
codificam a atividade de xilose isomerase, xiluloquinase, transquetolase e
transaldolase;
Selecionar clones que apresentassem maior produo de etanol, bem
como crescimento de biomassa celular a partir de glicose e xilose;
Estudar uma estratgia de adaptao metablica para propagao celular
em meio sinttico contendo diferentes concentraes de glicose e xilose;
Estudar uma estratgia para propagao celular em meio contendo
hidrolisado com alto teor de xilose (aclimatao celular);
Investigar a viabilidade da realizao de um processo simultneo de
hidrlise enzimtica de celulose e co-fermentao (SSCF), abordando o
desempenho da linhagem face utilizao de diferentes concentraes de
celulignina e de hidrolisado cido provenientes do bagao de cana, atravs de
anlise de superfcie de resposta mediante experimentos multivariados;
produo de etanol a partir de bagao de cana-de-acar, bem como do
hidrolisado hemicelsico (SSCF), segundo os experimentos conduzidos em
frascos agitados.
CAPTULO 4: Materiais e Mtodos

83

_____________________CAPTULO 4
MATERIAIS E MTODOS

Neste captulo so apresentados os materiais e as metodologias
utilizadas para a execuo do presente trabalho. Foram estabelecidos:
crescimento e manipulao do microrganismo naturalmente ocorrente e
recombinante. A metodologia experimental utilizada para obteno de etanol foi
desenvolvida, inicialmente, atravs de frascos agitados com posterior
reproduo das condies timas em biorreator instrumentado, atravs das
tecnologias SSF e SSCF. Para a otimizao do processo foram empregados
planejamentos experimentais, atravs de anlise de superfcie de resposta
mediante experimentos multivariados.

84
4.1. MATRIA-PRIMA
4.1.1. BAGAO DE CANA-DE-ACAR
O bagao de cana-de-acar (Saccharum spp.), utilizado no presente
trabalho, foi gentilmente cedido pela Destilaria Costa Pinto (SP-Brasil). Esta
biomassa de composio lignocelulsica foi inicialmente secada a 60
o
C em
estufa ventilada por 12 horas. Em seguida, a mesma foi cominuda e
acondicionada em sistemas hermticos para posterior uso.
4.1.2. RESDUO DA INDSTRIA DE CELULOSE
O resduo de papel, utilizado no presente trabalho, consiste na polpa
coletada aps a deslignificao na indstria de celulose. Nesta etapa do
processamento, a polpa proveniente do cozimento submetida a uma
deslignificao com oxignio a fim de remover o contedo de lignina da polpa
que alimenta a planta de branqueamento e enviar a lignina dissolvida de volta ao
sistema de recuperao.
A biomassa residual da indstria de celulose foi gentilmente cedida pela
empresa ARACRUZ Celulose e codificada como PM2, a qual contm 79,4% de
celulose, 15,1% de hemicelulose e 1,8% de lignina (SILVA, 2009). Dessa forma,
diferentemente do bagao, no foram necessrias execues de pr-
tratamentos qumicos, apenas lavagens em gua destilada e ajuste do pH para 5
(adio de H
2
SO
4,
1M; ou NaOH, 1M,

se necessrio).
4.2. PR-TRATAMENTOS DO BAGAO DE CANA-DE-ACAR
4.2.1. PR-TRATAMENTO CIDO
O pr-tratamento cido foi realizado para desorganizar a matriz
lignocelulsica e remover a frao hemicelulsica. As condies para a
realizao do pr-tratamento cido foram as preconizada por Betancur (2010) e
detalhadas a seguir: concentrao de H
2
SO
4,
1,09% (v/v)
;
relao slido-lquido
1:2.8 (g/ml); temperatura de 121
o
C e tempo de exposio de 27 minutos em
autoclave. A hemicelulose (fase aquosa) foi retirada utilizando uma prensa
hidrulica, atravs de um procedimento de filtrao simples do meio pr-tratado;

85
sendo a fase slida denominada de celulignina, em funo da sua composio
majoritria em celulose e lignina. As etapas descritas para a obteno do
hidrolisado hemicelulsico podem ser visualizadas na figura 4.1.

Figura 4.1. Etapas do pr-tratamento cido: bagao in natura (a), peneirao do
bagao (b), exposio do bagao ao cido (c), distribuio em frascos (d),
tratamento trmico em autoclave (e), distribuio em prensa hidrulica (f),
prensagem para separao do bagao acidificado (celulignina) (g).

A figura 4.2 ilustra o bagao de cana-de-acar in natura e aps remoo
da frao hemicelulsica. A lignina manteve-se mais concentrada aps a etapa
de pr-tratamento cido, fazendo com que a colorao do slido residual
passasse a ser mais escura, quando comparada ao bagao in natura (Figura
4.2. A).

Figura 4.2. Bagao de cana-de-acar in natura (A); Bagao de cana-de-acar
aps pr- tratamento cido (Celulignina) (B).

O hidrolisado, licor resultante deste processo (hemicelulose), teve seu pH
corrigido para 5 mediante a adio de Ca(OH)
2
sob banho de gua e gelo, para
evitar o aquecimento gerado em excesso durante este procedimento. Em
A B C
D E F G

86
seguida, a soluo contendo cerca de 80 g/L de xilose, foi filtrada a vcuo,
buscando retirar o precipitado formado, resultando no material desejado para ser
utilizado como base do meio de fermentao (FOGEL, 2005).
4.2.2. PR-TRATAMENTO ALCALINO
Este pr-tratamento alcalino se faz necessrio para aumentar a
acessibilidade das enzimas s fibras celulsicas (BARCELOS et al., 2012).
Dessa forma, a celulignina foi submetida deslignificao com uso de soluo
de NaOH a 4% (m/v), na relao slido-lquido de 1:20 (VSQUEZ, 2007) e
submetida a tratamento trmico (121
o
C por 30 minutos) em autoclave (Figura
4.3).

Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino: celulignina de bagao de cana aps
pesagem (a), tratamento alcalino com NaOH diludo (b), separao em prensa
hidrulica aps tratamento em autoclave (c), celulignina obtida/licor alcalino (d).
Posteriormente, sequncias de lavagens com gua destilada foram feitas,
no que tange remoo da alcalinidade intersticial na matriz slida e extrao
da lignina residual, at que a gua descartada fosse clara, constatando-se a
mxima remoo da lignina nas condies impostas (Figura 4.4).

Figura 4.4. Frao lquida aps pr-tratamento alcalino do bagao de cana (A),
sequncia de lavagens com gua destilada para a remoo da lignina residual
(B- E).
A B C D

87
4.2.3. PR-HIDRLISE ENZIMTICA
Aps os pr-tratamentos qumicos com cido e base diludos, foi realizada
a etapa de pr-hidrlise enzimtica, na qual a celulose pde ser convertida a
acares fermentveis. Dessa forma, a celulignina pr-tratada alcalinamente e
lavada com gua destilada foi submetida hidrlise enzimtica com uso de um
preparado celulsico comercial (Multifect, Genencor, USA), que continha
atividade FPsica de 100 FPU/mL. A atividade enzimtica foi determinada em
papel de filtro, como recomendado por Ghose (1987) e expressa como FPU
(Filter Paper Units) por mililitro da mistura. O experimento foi desenvolvido
utilizando-se diferentes valores de cargas enzimticas, que esto apresentados
nas tabelas 4.4 e 4.5, do item 4.3.3.2. A temperatura foi mantida em 50
o
C,
durante 12 horas para o bagao de cana e para o resduo da indstria de
celulose.
Na figura 4.5, observa-se um cromatograma tpico da pr-hidrlise
enzimtica, no qual se percebe a alta concentrao de glicose (tempo de
reteno de 11,07 min), resultante da ao das enzimas do complexo celulsico.
Em menor proporo, observa-se, ainda, a presena de celobiose (tempo de
reteno de 9,536 min) e de outras substncias que no foram identificadas,
mas que, provavelmente, referem-se presena de celo-oligosacardeos.

Figura 4.5. Perfil cromatogrfico tpico do hidrolisado celulsico pr-tratado
enzimaticamente.
4.3. A BACTRIA Zymomonas mobilis NATIVA
Neste trabalho foram empregadas duas linhagens nativas de Zymomonas
mobilis, AG11 e CP4, as quais foram gentilmente cedidas pelo Departamento de
Antibiticos da Universidade Federal de Pernambuco. Posteriormente, no item
8
,
1
6
7
8
,
1
9
7
9
,
2
4
7
c
e
l
u
b
i
o
s
e

-

9
,
5
3
6
1
0
,
3
2
8
g
l
i
c
o
s
e

-

1
1
,
6
7
6
1
2
,
6
6
9
3
7
,
0
0
8
m
V
20,00
40,00
60,00
80,00
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00

88
4.4, foram empregadas tcnicas de biologia molecular no que tange
transformao da linhagem CP4, seguidas de ensaios de fermentao.
Aps o crescimento bacteriano nos meios de cultura foram retiradas
amostras assepticamente com auxlio de uma ala de platina e, ento, foram
preparados esfregaos em lminas para posterior colorao, segundo o mtodo
Gram. As lminas com material microbiano foram analisadas em microscpio
binocular com aumento de 1000x. Na figura 4.6 (A e B) observa-se a diferena
entre as duas linhagens nativas, ressaltando o carter floculante da linhagem
CP4 (Fig. 4.6 A e Fig. 4.7).

Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Z. mobilis (aumento de 1000x). As
lminas foram coradas pelo mtodo Gram, mostrando que a bactria apresenta-
se como gram negativa. (A) Linhagem CP4 e (B) Linhagem AG11.

Figura 4.7. Linhagem floculante de Zymomonas mobilis CP4 crescida por 24
horas em meio de cultura.
4.3.1. MANUTENO DAS CULTURAS DE Z. mobilis
As culturas foram preservadas a 4C, aps crescimento em tubos tipo
Falcon, incubados em estufa a 30C por 24 horas em meio lquido, contendo
glicose (20 g/L) e extrato de levedura (5 g/L) (SWING & DE LEY, 1977). As
linhagens de Z. mobilis foram repicadas mensalmente.

89
O microrganismo tambm foi mantido em gar inclinado e em placa de
petri, empregando o meio Swing & De Ley (SDL), e armazenado a 4C, aps ser
incubado em estufa com temperatura controlada de 30
o
C durante
aproximadamente 48h (SWING & DE LEY, 1977). A composio do meio
agarizado est descrita na tabela 4.1. Com a finalidade de manter as clulas
ativas para a realizao dos diferentes experimentos, repiques peridicos a partir
do cultivo original foram realizados a cada trs meses em cmara assptica.
Tabela 4.1. Meio de manuteno de Z. mobilis.
Nutrientes Concentrao (g/L)
Glicose 20
Extrato de levedura 2,5
Agar 20

4.3.2. PR- INCULO E INCULO: COMPOSIO DE MEIO E
CONDIES DE CULTIVO
A tabela 4.2 apresenta a composio do meio de cultivo, adaptado de
Neto et al. (2005), o qual foi utilizado no preparo do pr-inculo e do inculo
para os ensaios de fermentao com as linhagens nativas.
Tabela 4.2. Meio de crescimento de Z. mobilis.
Nutrientes Concentrao (g/L)
Glicose 20
Extrato de levedura 2,5
(NH
4
)SO
4
1
KH
2
PO
4
0,5
MgSO
4
. 7H
2
0 0,5

Os meios de cultura foram autoclavados por 15 min., sob presso de 0.5
kgf/cm
2
e temperatura de 120C. A soluo de glicose foi esterilizada
separadamente dos outros componentes, de modo que esta representasse 50%
do volume total e a soluo de glicose os 50% restantes. Cabe ressaltar que
toda vidraria utilizada nos experimentos tambm foi esterilizada em autoclave
durante 20 minutos, sob presso de 1 kgf/cm
2
e temperatura de 120C, seguida
de secagem em estufa de esterilizao Mod. FIC. 05. FAMO (50 a 60 C).

90
O pr-inculo foi preparado em tubos tipo Falcon de 50 mL com 20 mL de
volume de meio de crescimento, acrescentado de 2 mL de meio lquido de
manuteno cultivado com a bactria. Os meios foram incubados a 30
o
C por 20
horas, sem agitao.
No preparo do inculo foram utilizados frascos cnicos de 500 mL. O
volume de trabalho foi de 200 mL de meio de crescimento, adicionado do volume
total de cada tubo Falcon (20 mL) do pr-inculo. O inculo foi incubado na
temperatura de 30
o
C, por 20 horas, sem agitao. Ao final da etapa de
propagao, procedeu-se quantificao de clulas e posterior clculo do
volume a ser centrifugado, visando obter as concentraes celulares pretendidas
para se inocular nos posteriores experimentos de fermentao (item 4.4.3.2).
4.4.3. ENSAIOS DE FERMENTAO
A tabela 4.3 apresenta um esquema geral, visando facilitar a
compreenso das etapas definidas para frascos agitados no que tange
produo de etanol por Z. mobilis AG11 e CP4 nativas.
Inicialmente, foram desenvolvidos experimentos preliminares, nas etapas
1 e 2; nas etapas 3 e 4 foram avaliadas diferentes condies do processo SSF a
partir de bagao de cana e resduos da indstria de celulose como substrato
para a produo de etanol, atravs de planejamentos de superfcie de resposta.

Tabela 4.3. Experimentos sequenciais avaliando a bactria Zymomonas mobilis
naturalmente ocorrente frente produo de etanol.
Experimentos preliminares
1 Desempenho das linhagens AG11 e CP4 nativas utilizando glicose e xilose
Otimizao atravs de Planejamentos de Superfcie de resposta
2 Otimizao do SSF atravs de anlise de superfcie de resposta
3 Avaliao da adio de nutrientes complementares ao hidrolisado celulsico
Onde: meio sinttico (1), bagao de cana e resduo da indstria de celulose (2-3);
S:L= slido: lquido.


91
4.4.3.1. Desempenho das linhagens nativas frente utilizao de glicose e
xilose
Inicialmente, para se verificar/avaliar a capacidade de utilizao de glicose
e xilose, foram realizados experimentos em meios quimicamente definidos com
as linhagens nativas de Z. mobilis AG11 e CP4, analisando-se o consumo de
substrato, produo de etanol e crescimento celular, bem como as variveis de
resposta dos cultivos (produtividade volumtrica em etanol e taxa especfica de
crescimento). Esses experimentos foram realizados em frascos cnicos de 500
mL com 200 mL de meio contendo glicose e xilose, separadamente, nas
concentraes de 20 g/L, sendo as concentraes dos outros nutrientes e as
condies operacionais as mesmas daquelas utilizadas no preparo do inculo,
descritas anteriormente (item 4.3.2).
Este ensaio foi de fundamental importncia, pois em funo dos
resultados se poderia inferir em relao estratgia mais adequada para a
produo de etanol com as linhagens bacterianas. Isto , caso se constatasse a
capacidade das linhagens nativas em consumir ambos os acares, o
aproveitamento da frao hemicelulsica (rica em xilose) seria incorporado em
nosso planejamento experimental; no caso de no haver metabolizao desse
acar, a transformao gentica seria recomendada para posteriores ensaios
envolvendo misturas de xilose e glicose pela linhagem recombinante (item
4.4.2).
4.4.3.2. Produo de etanol a partir do bagao de cana e resduos da
indstria de celulose por Z. mobilis nativa atravs do processo
SSF
A frao slida residual dos pr-tratamentos do bagao de cana, assim
como os resduos da indstria de celulose (PM2) possuem um alto contedo de
celulose, que pode ser utilizada para a obteno de etanol por fermentao
mediante tcnicas que possibilitem o aproveitamento de glicose contida nos
resduos. Entre as tcnicas que poderiam ser avaliadas encontram-se a hidrlise
enzimtica e a aplicao do processo SSF (Simultaneous Saccharification and
Fermentation).

92
Aps 12 horas de pr-hidrlise enzimtica do bagao de cana de PM2
(VSQUEZ, 2007), a cintica do processo SSF foi avaliada em frascos cnicos
de 500 mL contendo 200 mL de meio de fermentao, que apresentava a
mesma composio do meio de propagao, com exceo da adio de glicose,
que foi substituda pelo pr-hidrolisado da celulose, rico neste acar. A
fermentao ocorreu por aproximadamente 48 horas, com diferentes
concentraes de inculo (relatado a seguir), na temperatura de 30
o
C,
velocidade de agitao de 150 rpm, com amostragens de 2 mL a cada 3 horas.
O consumo de substrato e a formao de produto foram acompanhados durante
o tempo necessrio, para verificar o esgotamento da fonte de carbono.
Sumariamente, os experimentos de hidrlise e sacarificao simultneas
foram desenvolvidos atravs da construo de trs planejamentos experimentais
empregando-se o bagao de cana. No primeiro ensaio visou-se as condies
timas do processo SSF e no segundo avaliou-se a adio de diferentes
nutrientes no meio hidrolisado celulsico do bagao. Foram desenvolvidos dois
planejamentos experimentais empregando-se o PM2, referentes determinao
das condies timas do SSF, assim como a avaliao da adio de diferentes
nutrientes no meio hidrolisado celulsico.
III. Otimizao da produo de etanol a partir de bagao de cana e PM2
por Z. mobilis CP4 nativa

No presente trabalho, os planejamentos experimentais que aplicaram os
princpios da metodologia estatstica de superfcie de resposta objetivaram
avaliar os efeitos agregados de variveis com a finalidade de determinar as
condies timas para sistemas com multivariveis (BOX, 1978). Nesta etapa,
alm dos nveis inferiores e superiores apresentados na matriz usada no
Planejamento anterior, foram feitos o acrscimo dos pontos axiais para obteno
da curvatura de mximo absoluto.
Desta forma, foi construdo um planejamento experimental completo 2
3
,
com 6 pontos axiais e 6 repeties do ponto central, totalizando 20
experimentos. Os parmetros analisados foram a relao slido:lquido
(celulignina pr-tratada alcalinamente:meio), carga enzimtica e concentrao
celular, conforme a matriz apresentada nas tabelas 4.4 e 4.5. As variveis de

93
respostas escolhidas foram: glicose inicial do SSF, concentrao final de etanol
e produtividade volumtrica.
concentrao celular (g/L), avaliando a produo de etanol, produtividade
volumtrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando o bagao
de cana.
concentrao celular (%), avaliando a produo de etanol a partir do processo
SSF utilizando o resduo da indstria de celulose.
Uma vez que ensaios prvios utilizando as mesmas concentraes de
clulas empregadas no planejamento utilizando o bagao de cana no
resultaram em bom desempenho do microrganismo frente utilizao do resduo
da indstria de celulose; posteriormente, ao estruturarmos o planejamento
referente ao resduo da indstria de celulose, as clulas no foram adicionadas
no processo atravs de centrifugao.
IV. Anlise da adio de diferentes componentes do meio no hidrolisado
celulsico do bagao de cana e PM2 frente produo de etanol a
partir por Z. mobilis CP4 nativa

Foram desenvolvidos planejamentos sequenciais no intuito de verificar o
efeito estimado dos seguintes componentes do meio de fermentao, extrato de
levedura, KH
2
PO
4
, (NH4)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O, para obteno de etanol a partir
do processo SSF por Z. mobilis. Inicialmente, foi realizado um Planejamento
Experimental Fatorial 2
4
empregando o bagao de cana, o qual promoveu o total
de 19 experimentos (16 experimentos e 3 pontos centrais) (Tabela 4.6).
PARMETROS
Nveis
-o - 0 + +o
A Relao Slido:lquido (g:mL) 0,32:10 1:10 2:10 3:10 3,68:10
B Carga Enzimtica (FPU/g) 4,89 10 17,5 25 30,11
C Concentrao Celular (g/L) 0,02 1 2,5 4 5,02

PARMETROS
Nveis
-o - 0 + +o
A Relao Slido:lquido (g:mL) 0,32:10 1:10 2:10 3:10 3,68:10
B Carga Enzimtica (FPU/g) 4,89 10 17,5 25 30,11
C Concentrao Celular (g/L) 1,59 5,80 10 14,21 18,41

94
O planejamento fatorial geralmente foi escolhido por ser o mais
apropriado na determinao dos efeitos lineares das variveis, sendo os efeitos
da curvatura e das possveis interaes excludos da anlise estatstica. Porm,
a reduo do nmero de experimentos realizados acarreta perdas quanto
anlise da influncia de interaes entre as variveis de estudo sobre a resposta
de interesse (BRUNS, 1995). Dessa forma, em uma segunda estratgia, o
planejamento experimental composto central foi necessrio para visualizao da
curvatura com valor de mximo absoluto.
Tabela 4.6. Parmetros e nveis usados no Planejamento Experimental Fatorial
2
4
: extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH4)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L),
adicionados no hidrolisado celulsico do bagao de cana.
Parmetros (g/L)
Nveis
- 0 +
Extrato de Levedura 0,0 1,25 2,5
KH
2
PO
4
0,0 0,5 1,0
(NH
4
)
2
SO
4
0,0 0,25 0,5
MgSO
4
.7H
2
O 0,0 0,25 0,5

Nesse sentido, visando avaliar a superfcie de resposta frente adio de
diferentes componentes do meio no hidrolisado celulsico do bagao de cana e
no resduo da indstria de celulose no que tange produo de etanol a partir
por Z. mobilis CP4 nativa, posteriormente, foi desenvolvido o planejamento
composto central, onde os parmetros analisados foram mantidos. Tais
nutrientes adicionados biomassa celulsica no incio da hidrlise enzimtica,
juntamente com a glicose gerada, permitiram a execuo da tcnica SSF
(Tabela 4.7).
Tabela 4.7. Variveis independentes do planejamento central composto
avaliando a adio de extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH4)
2
SO
4
(g/L) e
MgSO
4
.7H
2
O (g/L) no hidrolisado celulsico do bagao e de PM2 frente
produo de etanol atravs do processo SSF por Z. mobilis CP4 nativa.

PARMETROS
Nveis
-o - 0 + +o
A Extrato de Levedura (g/L) 0,0 6,25 12,5 18,75 25,0
B KH
2
PO
4
(g/L) 0,0 1,25 2,5 3,75 5,0
C (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) 0,0 0,75 1,5 2,25 3,0
D MgSO
4
.7H
2
O(g/L) 0,0 0,75 1,5 2,25 3,0

95
4.5. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis
4.4.1. APLICAO DA ENGENHARIA GENTICA EM Z. mobilis
Objetivando-se tornar a produo de etanol de segunda gerao mais
eficiente foram sintetizados os genes responsveis pela metabolizao da xilose
(XI, XK, TAL e TKT), os quais foram inseridos na linhagem CP4 do
microrganismo Zymomonas mobilis, segundo a metodologia adaptada de Zhang
et al. (1995), Liang et al. (1998) e Agrawal et al. (2011).
4.4.1.1. Desenho dos genes
Os genes sintticos que codificam para xilose isomerase, xiluloquinase,
transaldolase e transquetolase, assim como dois operons, cada um sob o
controle do forte promotor constitutivo Pgap de Z. mobilis, foram construdos
atravs de sntese qumica na empresa Life Sciences Advanced Technologies,
Inc., a partir de dados do genoma de E. coli e Z. mobilis. O plasmdio pZMO1
(1565 kb) de Z. mobilis (ARVANITIS et al., 2000), que demonstrou estabilidade
nesta bactria, tambm foi sintetizado quimicamente e clonado em um vetor
sinttico bifuncional para Z. mobilis e E. coli. Este vetor apresenta a origem de
replicao de E. coli, bem como a marca de seleo de resistncia a tetraciclina.
Neste contexto, os segmentos bem definidos de E. coli facilitam a manuteno
dos plasmdeos, enquanto os de Z. mobilis inclui sequncias genticas
responsveis pela replicao.
Adicionalmente, foi desenvolvido um controle contendo um plasmdeo que
possui apenas os genes de origem de replicao de Zymomonas mobilis e E.
coli, bem como a resistncia tetraciclina, sendo nomeado de ORI; o plasmdeo
contendo todos os genes descritos, alm dos genes de metabolizao da xilose
(XI, XK, TAL e TKT) foi nomeado de ORI ZYMO. A seguir, a figura 4.8 mostra a
organizao do sistema de operon duplo (em mdia ~3,2 kb) para os genes de
assimilao e metabolizao da xilose, sob o controle do promotor Pgap,
inseridos no plasmdeo pZMO1.

96

Figura 4.8. Mapa do plasmdeo pZM01, o qual apresenta o sistema de operon
duplo para os genes do metabolismo de xilose. Onde: Pgap, promotor
gliceraldedo-3-fosfato; XI, xilose isomerase; XK, xilulokinase; TAL,
transaldolase; TKT, transquetolase; Tc, gene de resistncia tetraciclina (4,2
kb); ZM22, origem de replicao de Zymomonas mobilis (5,9 kb).

4.4.1.2. Amplificao gnica em E. coli
Para a amplificao dos genes atravs de transformao gentica em E.
coli DH5 foram utilizados 1 l de pZM01 (50 ng). O plasmdeo foi adicionado
para cada alquota de clula competente e incubado no gelo por 45 minutos.
Posteriormente, o choque trmico foi realizado na temperatura de 42C, durante
90 segundos; seguido de incubao a 37C por 45 minutos, agitao de 200
rpm, empregando 1mL de meio LB. Em seguida, as clulas foram plaqueadas
em meio LB na presena do antibitico (tetraciclina, 10 mg/L) sob 37C de
temperatura, durante 24 horas. Este mtodo, adaptado de Sambrook & Russel
(2001), tem sido frequentemente utilizado por no prescindir equipamentos
sofisticados (AZEVEDO et al., 2003).
4.4.1.3. Extrao do DNA
Inicialmente, dois inculos das culturas transformadas de E. coli foram
cultivados em 200 mL de meio LB, contendo 10 mg/L de tetraciclina, na
temperatura de 37C, durante 24 h. A extrao de DNA em larga escala
(maxipreparao), desenvolvida segundo metodologia de Azevedo et al. (2003),
ocorreu aps o procedimento de transformao em E. coli (citado no item
anterior).

97
Adicionalmente, a lise das membranas plasmticas solubilizada por
agentes que rompem associaes hidrofbicas e destroem a bicamada lipdica.
Assim sendo, bactrias gram-negativas necessitam de detergentes inicos e
substncias alcalinas para o rompimento da parede celular (AZEVEDO et al.,
2003).
4.4.1.3. Transformao em Zymomonas mobilis
O processo de introduo de um DNA exgeno em uma clula hospedeira
pode ser desenvolvido atravs da conjugao, transduo e transformao. No
presente trabalho, a transformao do microrganismo Z. mobilis foi desenvolvida
atravs da eletroporao, baseada em estudos de Zou et al. (2012); Liang &
Lee (1998); e Zhang et al. (1995).
Cabe ressaltar que a eficincia desta tcnica afetada por alguns fatores,
como origem e tamanho do plasmdeo, fase de crescimento das clulas,
intensidade da corrente eltrica e tempo de crescimento aps transformao
(ZOU et al., 2012).
Neste contexto, alguns pesquisadores, tais como Carey et al. (1983) e
Dally et al. (1982) realizaram a conjugao para este procedimento; porm h
controvrsias sobre a sua eficcia, pois o crescimento da bactria reduzido no
meio mineral utilizado para a seleo, bem como a produo de substncias
anti-bactericidas podem provocar a morte do microrganismo doador dos genes
(GOODMAN et al., 1982). A eletroporao apresenta-se, portanto, como o
mtodo mais conveniente para a transformao gentica (LIANG & LEE, 1998).
I. Clulas competentes de Z. mobilis
No que tange insero de genes atravs da transformao faz-se
necessrio tornar as clulas competentes para viabilizar a introduo do DNA
exgeno no hospedeiro selecionado. Assim sendo, o protocolo de clulas
competentes de Zymomonas mobilis desenvolvido no presente trabalho foi
baseado na metodologia de Liang & Lee (1998).
Aps atingir a Abs
600
de 0,36, o inculo (100 mL) foi centrifugado a 4000
rpm por 5 minutos a 4
o
C, sendo o sobrenadante descartado e o pellet

98
ressuspendido em 10 mL de soluo contendo gua destilada estril (adicionada
de 10% de glicerol, suplementado com 0,85% de NaCl). A etapa de
centrifugao foi repetida nas mesmas condies, seguida da adio de soluo
contendo 2 mL de gua destilada (10% de glicerol).
II. Plasmdeo exgeno
O plasmdeo extrado, descrito no item 4.4.1.3, foi concentrado aps
liofilizao e, posteriormente, teve o volume ajustado para 30 l. Aps medio
de absorbncia (260-280 nm), a sua concentrao foi calculada em 10 mg/L
para ORI ZYMO e 23 mg/L para ORI.
III. Eletroporao
No seguinte, clulas de Z. mobilis foram transformadas por eletroporao,
atravs do equipamento BioRad GenePulser Xcell. As colnias foram
transferidas para a cubeta de eletroporao (0,2 cm), mantida em baixas
temperaturas e, ento, transformadas nas seguintes condies: 1,5KV por cm
3
,
75KV/cm, 25F e 200.
4.4.1.4. Etapa ps-transformao
Imediatamente aps diferentes culturas de Z. mobilis [ORI, ORI ZYMO e o
controle sem plasmdeo] serem transformadas por eletroporao, as mesmas
foram incubadas em meio RMG durante 16 horas, conforme descrito por
Picataggio et al. (1996). Posteriormente, as trs culturas foram plaqueadas (100
l de cada) em meio RMG agarizado (20 g/L), na temperatura de 30C, durante
7 dias. Desta forma, clones transformantes resistentes ao antibitico foram
crescidos em meio RM, adicionado de xilose e glicose em diferentes
concentraes, no intuito de avaliar e aperfeioar o crescimento bacteriano,
conforme indicado no item 4.4.2 ao 4.5.
No seguinte, as colnias isoladas que apresentaram maior produo de
biomassa e rpido crescimento nestes substratos foram testadas quanto
produo de etanol (item 4.4.2.1). Na figura 4.9 observa-se a linhagem CP4
aps transformao gentica, sob o aumento de 1000x.

99

Figura 4.9. Microscopia da linhagem de Zymomonas mobilis CP4 recombinante
(aumento de 1000x).
4.4.1.5. Meio de crescimento e manuteno
O meio sinttico RM (rich medium) foi utilizado nos ensaios de
fermentao com a linhagem recombinante, bem como para produo do
inculo, conforme descrito por Mohagheghi et al. (2002), Zhang (2003) e Jeon et
al. (2005). Os meios RMG, RMX e RMGX foram utilizados quando a glicose, a
xilose e a combinao dos dois acares foram empregadas como fonte de
carbono, respectivamente, nas concentraes de 20 g/L para cada acar
(Tabela 4.8).
Tabela 4.8. Composio do meio RM empregado na linhagem recombinante de
Zymomonas mobilis CP4. Onde: RMG: meio RM adicionado de 20 g/L de
glicose; RMX: meio RM adicionado de 20 g/L de xilose; RMGX: meio RM
adicionado de 20 g/L de glicose e 20 g/L de xilose; gli: glicose; xil: xilose.
Componente Concentrao
Tetraciclina 10 mg/L
Extrato de Levedura 10 g/L
KH
2
PO
4
2 g/L
Adio de glicose (RMG) 20 g/L
Adio de xilose (RMX) 20 g/L
Adio de glicose e xilose (RMGX) 20 g/L de gli, 20 g/L de xil
Adicionalmente, as colnias recombinantes foram preservadas de forma
semelhante s linhagens nativas, no entanto, o meio SDL foi substitudo pelo
meio RMGX. Conforme j sinalizado na literatura, Lawford et al. (2000), Song et
al (2005) e Zou et al. (2012) empregaram, de forma semelhante, 10 mg/L de

100
tetraciclina, assim como utilizaram o meio RM para repiques e conservao do
microrganismo.
4.4.2. ENSAIOS DE FERMENTAO
A tabela 4.9 apresenta um esquema geral, visando facilitar a
compreenso das etapas definidas para frascos agitados no que tange
produo de etanol por Z. mobilis CP4 recombinante. As etapas de 1-3
representam os ensaios avaliando o consumo de glicose e xilose, a seleo de
clones, bem como o processo de adaptao metablica em meio sinttico; nas
etapas 4 e 5 foram desenvolvidas estratgias de aclimatao celular e os
experimentos utilizando o bagao de cana como substrato para a produo de
etanol atravs do processo SSCF.
Tabela 4.9. Experimentos sequenciais avaliando o desempenho da bactria
Zymomonas mobilis recombinante frente produo de etanol.
Meio Sinttico
1 Ensaios preliminares avaliando o consumo de glicose e xilose;
2 Seleo de clones que apresentassem maior produo de etanol, bem como
crescimento de biomassa celular a partir de glicose e xilose;
3 Estratgia de adaptao metablica para propagao celular em meio
sinttico contendo diferentes concentraes de glicose e xilose;
SSCF
4 Estratgia para propagao celular em meio contendo hidrolisado cido
oriundo do bagao de cana (aclimatao celular);
5 Desenvolvimento de um processo simultneo de hidrlise enzimtica de
celulose e co-fermentao (SSCF);
Onde: meio sinttico (1-3); bagao de cana (4-5)
4.4.2.1. Ensaios preliminares para avaliar o consumo de glicose e xilose
em meio sinttico por Z. mobilis geneticamente modificada
Para se verificar/avaliar a capacidade de utilizao de glicose e xilose,
foram realizados experimentos em meios quimicamente definidos com a
linhagem recombinante de Z. mobilis, analisando-se o consumo de substrato,
produo de etanol e crescimento celular, bem como as variveis de resposta
dos cultivos.
Estes experimentos foram realizados em frascos cnicos de 500 mL com

101
200 mL, na temperatura de 30
o
C, sem agitao orbital, em meio sinttico
contendo glicose e xilose, separadamente e associadamente, nas concentraes
de 1,3 a 20 g/L, sendo as concentraes dos outros nutrientes descritas
anteriormente na tabela 4.9.
A tabela 4.10 apresenta o planejamento experimental de superfcie de
resposta 2
2
, com 5 repeties do ponto central, totalizando 13 experimentos,
onde as concentraes de glicose e xilose, em meio sinttico, foram os
parmetros analisados. Adicionalmente, os valores dos demais nutrientes,
extrato de levedura e KH
2
PO
4
, juntamente com a tetraciclina, foram fixados em
10 g/L, 2g/L e 10 mg/L, respectivamente.
Tabela 4.10. Variveis independentes do planejamento experimental, avaliando
diferentes concentraes de glicose e xilose, em g/L, quanto produo de
etanol por Z. mobilis recombinante.

I. Seleo de clones
Aps a realizao de ensaios em estado estacionrio (sem agitao),
priorizando o crescimento celular, diferentes clones foram testados quanto
produo de etanol e de biomassa a partir do meio RMGX, em frascos agitados,
sob 150 rpm de agitao e temperatura de 30
C.
II. Adaptao Metablica
O processo de adaptao metablica para otimizar a fermentao de
xilose foi empregado por diversos autores, tais como Zhang et al. (2002),
Viitanen et al. (2008) e Agrawal et al. (2011), uma vez que linhagens
recombinantes de Zymomonas mobilis apresentam dificuldades de
metabolizao deste acar. Desta forma, essa tcnica consiste na aclimatao
do microrganismo xilose atravs de repiques sucessivos em meios contendo,
inicialmente, elevadas concentraes de glicose e reduzidas de xilose; na

PARMETROS
Nveis
-o - 0 + +o
A Glicose (g/L) 1,3 4 10,5 17 19,7
B Xilose

(g/L) 1,3 4 10,5 17 19,7

102
medida em que os ciclos de repiques so realizados, as concentraes da
pentose se elevam e da hexose so reduzidas. A tabela 4.11 indica que foram
realizados 50 ciclos, no total de 160 dias, a partir de combinaes variando de
1,5 a 15 g/L de glicose e 5 a 18,5 g/L de xilose; sendo que o KH
2
PO4 e o extrato
de levedura, componentes do meio RM, assim como a tetraciclina, mantinham-
se em 2 g/L, 10 g/L e 10 mg/L, respectivamente .
Tabela 4.11. Processo de adaptao metablica mediante 50 ciclos sucessivos,
variando as concentraes de glicose e xilose em meio sinttico.
Ciclos Tempo (Dias) Glicose (g/L) Xilose (g/L)
1-10 70 15 5
11-19 30 10 10
20-25 20 7,5 13,5
26-30 15 5 15
31-40 15 2,5 17,5
41-50 10 1,5 18,5
4.4.2.2. Ensaios para produo de etanol a partir de bagao de cana atravs
do processo SSCF
Aps etapa de pr-hidrlise enzimtica, as clulas bacterianas foram
inoculadas no meio de fermentao (hidrolisado hemicelulsico e celulsico)
para produo de etanol atravs do processo SSCF (Simultaneous
Saccharification and Co-Fermentation).
I. Adaptao Metablica
A tabela 4.12 indica que foram realizados 25 ciclos adaptativos sucessivos,
no total de 90 dias, a partir de 2,5 a 10% de hidrolisado cido do bagao de cana
adicionado no meio RMG, no intuito de tornar a bactria recombinante mais
resistente a inibidores resultantes dos pr-tratamentos (descritos no item 2.5.3).
fermentativos, variando as concentraes de hidrolisado cido proveniente do
bagao de cana e mantendo a concentrao de glicose em 20 g/L.

Ciclos Tempo (Dias) Hidrolisado (%)
1-5 14 2,5
6-10 20 5
11-15 25 10
16-20 20 15
21-25 20 20

103
Conforme descrito por Nghuyem et al. (1996), citado no item 2.8.4.5; na
medida em que os ciclos de repiques sucessivos so realizados, as
concentraes de hidrolisado cido se elevam e as de glicose so mantidas de
acordo com o meio RMG.

II. Processo de propagao mediante diferentes estratgias de
aclimatao celular
Com o objetivo de investigar o efeito da aclimatao celular durante a
converso de glicose e xilose oriundas das fraes celulsicas e hemicelulsicas
em etanol, respectivamente, foram utilizadas quatro diferentes estratgias de
propagao celular para obteno do inoculo a ser adicionado nos frascos e
posterior execuo do processo SSCF.
Cabe ressaltar que ensaios prvios avaliando a adio de diferentes
concentraes de hidrolisado (5%, 10%, 20%, 30%, 40%) em meio sinttico
complementar, baseados nos estudos de Borges (2011) levaram-nos a
estabelecer as concentraes empregadas no processo de aclimatao. Todo
processo de aclimatao foi desenvolvido a partir de um pr-inculo inicial,
crescido em meio RMGX; sendo que todas as etapas posteriores, descritas a
seguir, foram realizadas em meio RMG, uma vez que a xilose presente no meio
sinttico foi substituda pela xilose oriunda da frao hemicelulsica.
a. Sem aclimatao: a propagao celular ocorreu usando meio sinttico
RMGX sem aclimatao; em seguida, 10% (v/v) do meio fermentado
anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio RMG contendo
10% de hidrolisado. As trs etapas seguintes referem-se ao procedimento de
aclimatao celular em meio contendo hidrolisado;
b. Duas etapas (Estratgia 1- aclimatao de 5% a 10% de hidrolisado): a
propagao celular ocorreu em um frasco cnico com 200 mL de meio
contendo 5% de hidrolisado; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado
anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio contendo 10% de
hidrolisado;
c. Duas etapas (Estratgia 2- aclimatao de 5% a 20% de hidrolisado): a
propagao ocorreu em um frasco cnico contendo 5% de hidrolisado em

104
meio; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente durante 48
h foram transferidos para o meio contendo 20% de hidrolisado;
d. Trs etapas (Estratgia 3- aclimatao inicial de 5% e 10%, seguida da
propagao em 20% de hidrolisado e posterior centrifugao): esta estratgia
foi desenvolvida aps as aclimataes descritas anteriormente, ou seja, dois
diferentes frascos cnicos contendo 200 mL de meio RMG com diferentes
concentraes de hidrolisado, 5% e 10%, foram inoculados em meio contendo
20% de hidrolisado, com 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente.
Porm, em seguida, as culturas foram centrifugadas (4000 rpm/10 min),
atingindo a concentrao de aproximadamente 4,0 g/L e, ento, ressuspensas
no meio de fermentao contendo 20% de hidrolisado (Figura 4.10).

Figura 4.10. Diagrama de blocos indicando a estratgia empregada para aclimatao
celular, a qual envolve 3 etapas: inculos em meio RMG adicionado de 5% e 10% de
hidrolisado hemicelulsico; seguidos de crescimento em meio RMG adicionado de 20%
de hidrolisado hemicelulsico; e posterior concentrao de clulas atravs de
centrifugao, a serem inoculadas na proporo definida de RMG adicionado de 20% de
hidrolisado hemicelulsico. Onde: (a) pr-inculo crescido em meio RMGX; (b) inculo
crescido em meio RMG, contendo 5% (v/v) de hidrolisado hemicelulsico; (c) inculo
crescido em meio RMG, contendo 10% (v/v) de hidrolisado hemicelulsico; (d)
concentrao de clulas (4000 rpm, 10 minutos), atingindo 4 g/L; (f) ressuspenso em
meio RMG, contendo 20% (v/v) de hidrolisado hemicelulsico.
III. Avaliao da produo de etanol a partir do processo SSCF
atravs de planejamentos experimentais sequenciais
O processo foi desenvolvido em frascos cnicos de 500 mL contendo 200
mL de meio de fermentao, que apresentava a mesma composio do meio de
propagao, com exceo da adio de glicose e xilose, que foram substitudas
pelo hidrolisado da celulose e da hemicelulose provenientes do bagao de cana,
respectivamente, ricos nestes acares.

105
As fermentaes ocorreram nas seguintes condies: 12 horas de pr-
hidrlise enzimtica, 10% (v/v) de inoculo (aclimatado segundo a estratgia
citada anteriormente que resultou em melhores resultados de produo de
biomassa celular), temperatura de 30
o
C, agitao de 150 rpm, suplementao
com meio RM, bem como diferentes concentraes de slidos e hidrolisado
hemicelulsico do bagao de cana. Tais concentraes foram avaliadas de
acordo com a execuo de dois planejamentos experimentais compostos
centrais 2
2
, visando buscar por valores timos de produo de etanol atravs do
processo SSCF (Tabelas 4.13 e 4.14).
Tabela 4.13. Variveis independentes do primeiro planejamento experimental:
percentual de hidrolisado hemicelulsico e relao slido:lquido (g:mL) do
bagao de cana, avaliando a produo de etanol pelo processo SSCF 1.

PARMETROS
Nveis
-o - 0 + +o
A Hidrolisado (%) 9,6 20 45 70 80,4
B Slido:lquido (g/mL) 0,8 1 1,5 2 2,2

Tabela 4.14. Variveis independentes do segundo planejamento experimental
avaliando o percentual de hidrolisado cido, bem como a relao slido:lquido
(g:mL) do bagao de cana no que tange produo de etanol pelo processo
SSCF 2.

PARMETROS
Nveis
-o - 0 + +o
A Hidrolisado (%) 0,7 6,5 20,5 34,5 40,3
B Slido:lquido (g/mL) 1,01:10 1,3:10 2:10 2,7:10 2,99:10
4.5. PRODUO DE ETANOL EM BIORREATOR INSTRUMENTADO
ATRAVS DOS PROCESSOS SSF E SSCF
Os ensaios em biorreator (BIOFLO III, New Brunswick) foram realizados
aps a determinao das melhores condies estabelecidas nos experimentos
em frascos agitados, utilizando-se clulas crescidas (No processo SSF, as
clulas foram centrifugadas; no SSCF, as clulas foram adicionadas na
proporo de 10% v/v) (Figura 4.11).
O volume nominal e de trabalho do biorreator instrumentado de 1,5 litros
e 500 mL, respectivamente, velocidade de agitao de 150 rpm, temperatura de

106
30C e pH 5, sendo monitorado atravs de um eletrodo de pH esterilizado e
controlado pela adio de KOH 1M.

Figura 4.11. Experimento em biorreator BIOFLO III (New .Brunswick).
4.6. MTODOS ANALTICOS
4.6.1. DETERMINAO DE ETANOL E ACARES POR CLAE
Em todos os experimentos foram retiradas alquotas de 2 mL, com rigor
assptico, em mdia, a cada trs horas. No decorrer dos experimentos, tais
amostras foram devidamente tratadas atravs de centrifugao (11300 g por 10
minutos), filtradas em membrana de acetato de celulose 0,22 m e
adequadamente diludas para quantificao por CLAE (Figura 4.12).

Figura 4.12. Sistema cromatrogrfico CLAE com deteco por ndice refrao.

107
Foram determinadas as concentraes de glicose, celobiose e etanol,
utilizando o sistema cromatogrfico (WATERS) composto por uma coluna HPX-
87P (Bio-Rad), operante a 80C com fluxo de 0,6 mL/min de fase mvel (gua
MILLIQ), bomba WATERS 510, detector de ndice de refrao WATERS 410
com software Empower. Os padres de glicose, celobiose e etanol foram
utilizados nas concentraes de 5 g/L, 10 g/L e 15 g/L, respectivamente.
4.6.2. QUANTIFICAO DO MICRORGANISMO
O meio contendo a massa celular, aps centrifugao em microcentrfuga
(UNIVERSAR IGR HETTICH) a 11.300g/min, foi separado da massa celular. O
sedimentado foi posteriormente ressuspendido em gua destilada e as clulas
quantificadas pela medida da absorbncia em espectrofotmetro
(SPECTRUMLAB 22PC) a 600 nm, segundo Leal (1998). As absorbncias
medidas foram correlacionadas com os valores de massa seca de clulas
atravs das curvas-padro apresentadas na tabela 4.15. A determinao da
massa seca de clulas foi feita aps filtrao em membrana Millipore (0,22 m),
seguida de secagem em balana de infravermelho (Sartorius- LJ16) e pesagem
at massa constante.
Tabela 4.15. Curvas padro de absorbncia versus concentrao da massa
celular para as linhagens de Z. mobilis.
LINHAGEM CORRELAO
Z. mobilis AG11 nativa Abs = 2,875 * concentrao celular (R= 0,992)
Z. mobilis CP4 nativa Abs = 1,959 * concentrao celular (R= 0,994)
Z. mobilis CP4 Recombinante
1
Abs = 4,016 * concentrao celular (R= 0,923)
Z. mobilis CP4 Recombinante
2
Abs = 2,608* concentrao celular (R= 0,923)
Onde: 1. Sem adaptao metablica; 2. Aps 26 ciclos adaptativos.

4.7. ANLISE DOS RESULTADOS
4.7.1. ESTATSTICA
Os efeitos estimados das variveis e condies de processo sobre a
concentrao final de etanol (varivel de resposta) foram analisados em um
intervalo de 90% de confiana, mediante a Anlise de Varincia (ANOVA) e
Metodologia de Superfcie de Resposta, atravs do Software Design Expert
Software (verso 7.1.6. Stat-Ease, Inc., Minneapolis, EUA).

108
4.7.2. CLCULO DE EFICINCIA
A eficincia de produo de etanol medida de acordo com a quantidade
de etanol produzido/1 g de substrato consumido (expressos em porcentagem), a
partir do valor de Y
p/s
terico.
Clculo de eficincia:
100
) (
) (
/
/
x
terico Y
processo Y
E
S P
S P
f
=
4.7.3. TAXA INSTANTNEA ESPECFICA DE CRESCIMENTO
Durante o intervalo de tempo (dt), o aumento de nmeros de
microrganismos (dx), na fase exponencial, onde as clulas absorvem os
nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando, pode ser
representado por:

X =
dt
dX

dt
dX
.
X
1
=
| |
1
= T
dt
LnX
d. (Equao 4.2)
Onde: a taxa especfica de crescimento por unidade de tempo =
x

(taxa especfica de crescimento, na fase exponencial). Ao plotar o grfico Ln X
versus Tempo, a tangente a cada ponto da curva obtida fornece o valor de ,
durante a fase exponencial de crescimento. Analogamente, as taxas especficas
para formao de produto e consumo de substrato, em g/g.h, so representados
por:
dt
dP
.
X
q
p
1
= e
dt
dS
.
X
q
s
1
= (Equao 4.3)
Os valores das taxas de crescimento celular (r
x
), de consumo de substrato
(r
g
), formao de produto (r
p
) foram obtidas plotando-se a concentrao celular,
substrato ou produto com o tempo.
(Equao 4.1)

109
4.7.4. TEMPO DE DUPLICAO
Tempo de gerao (tg) que o tempo de duplicao da massa celular
pode ser representado por:
Ln 2X
0
/X
0
=
x
t
g
t
g
= Ln 2 /
x
t
d
= 0,693/
x

(Equao 4.4)
4.7.5. VARIVEIS DE RESPOSTA
Os parmetros prprios de processos de fermentao foram considerados
da seguinte forma:
a) Fator de rendimento de produo de etanol (g/g)

Sendo: P: Concentrao final de etanol (g/L)
P
o
: Concentrao inicial de etanol (g/L)
S: Concentrao final de substrato (g/L)
S
o
: Concentrao inicial de substrato (g/L)

b) Fator de rendimento para crescimento celular (g/g)

Sendo: X: Concentrao final de biomassa (g/L)
X
o
: Concentrao inicial de biomassa (g/L)
S: Concentrao final de substrato (g/L)
S
o
: Concentrao inicial de substrato (g/L)

c) Produtividade volumtrica (g/L.h)

Sendo: P: Concentrao final de etanol (g/L)
P
o
: Concentrao inicial de etanol (g/L)
t
f
: Tempo de fermentao (h)
(Equao 4.7)
( )
f o P
t P P Q =
(Equao 4.6)
( ) ( ) ( ) S S X X S X Y
o o S X
= A A =
/
( ) ( ) ( ) S S P P S P Y
o o S P
= A A =
/

(Equao 4.5)
CAPTULO 5: Resultados e Discusses

110

_____________________CAPTULO 5
RESULTADOS E DISCUSSO

O presente captulo foi destinado exposio e discusso dos
resultados referentes s linhagens de Zymomonas mobilis naturalmente
ocorrentes, assim como a modificada geneticamente. Tais resultados foram
obtidos a partir da concluso dos experimentos planejados para elaborao da
tese. Nos estudos sobre a otimizao dos parmetros operacionais foram
desenvolvidos planejamentos experimentais sequenciais e os efeitos de
impacto sobre a varivel de resposta foram analisados a partir de metodologias
de superfcie de resposta, definindo as condies timas para a conduo do
processo.

111
5.1. ENSAIOS DE FERMENTAO EMPREGANDO A BACTRIA
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE
5.1.1. Desempenho das linhagens nativas frente utilizao de glicose e
xilose
Visando avaliar a capacidade de consumo dos principais acares
encontrados nas fraes polissacardicas de resduos de composio
lignocelulsica, nomeadamente glicose e xilose, realizou-se um ensaio, em
meio sinttico, com as duas linhagens de Z. mobilis.
Os perfis cinticos que representam o desempenho de ambas as
linhagens esto apresentados nas figuras que se seguem. Analisando o grfico
da cintica de Z. mobilis AG11 (Figura 5.1), observa-se que o substrato foi
consumido em um perodo de 15 horas. O desempenho da linhagem Z. mobilis
CP4 foi similar, no entanto, o tempo para o consumo total da glicose foi
ligeiramente superior (18 horas) (Figura 5.2).

Figura 5.1. Cintica de consumo de glicose, produo de etanol e crescimento
celular pela linhagem de Z. mobilis AG11.


112

Figura 5.2. Cintica de consumo de glicose, produo de etanol e crescimento
celular pela linhagem de Z. mobilis CP4.
Conforme sinalizado pela literatura, clulas de Z. mobilis apresentam
reduzido crescimento, destinando grande parte do substrato para a sntese de
etanol; contudo, observa-se, em ambas as linhagens, uma associao do
crescimento celular com a produo de etanol. Rogers et al. (1982) j haviam
reportado que apenas 2% do carbono encontrado na molcula do substrato so
convertidos plasticidade celular.
As variveis medidas e calculadas desta srie de experimentos foram
reunidas e esto apresentadas na tabela 5.1.
Tabela 5.1. Desempenho das linhagens AG11 e CP4 de Z.mobilis na
fermentao de glicose (concentrao inicial de 20 g/L).
Variveis medidas e calculadas AG11 CP4
Etanol (g/L) 7,5 6,3
Clulas (g/L) 0,48 0,43
Produtividade (g/L.h) 0,50 0,33
Taxa especfica de crescimento (h
-1
) 0,147 0,169
Fator de converso em produto (Y
P/S
), em g.g
-1
0,255 0,106
Fator de converso em clulas (Y
X/S
), em g.g
-1
0,024 0,019
Eficincia de fermentao (%) 54 22
Tempo de duplicao (h) 4,7 4,1

113
Pode-se constatar, que em meio sinttico, ambas as linhagens
apresentaram resultados semelhantes quanto produo de etanol e
crescimento celular. Embora, a linhagem AG11 tenha apresentado valores
ligeiramente superiores de produtividade volumtrica e fatores de converso
tanto de clulas quanto de produto, a linhagem CP4 exibiu valor superior para a
taxa especfica de crescimento.
Na Figura 5.3 observa-se um cromatograma tpico de incio de
fermentao por Z. mobilis CP4, no qual a glicose apresenta-se em altas
concentraes e a produo de etanol iniciada, verificando-se, ainda, a
presena de alguns subprodutos.

Figura 5.3. Perfil cromatogrfico tpico da fermentao por Z.mobilis.
No tocante ao consumo de xilose, foi constatada a incapacidade de
ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose. No houve
crescimento celular, assim como no houve produo de etanol, conforme
mostrado na figura 5.4.

Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose.
g
l
i
c
o
s
e

-

1
1
,
7
0
5
1
2
,
7
1
2
e
t
a
n
o
l

-

1
5
,
9
0
7
1
8
,
9
6
2
2
3
,
7
1
5
3
6
,
9
4
6
3
7
,
0
6
7
3
7
,
1
5
0
m
V
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00

114
Como colocado anteriormente, este ensaio se mostrou de suma
importncia, pois permitiu definir a estratgia para a produo de etanol de
segunda gerao; levando-se, inicialmente, a optar pelo aproveitamento
apenas da frao celulsica pelas linhagens nativas, atravs da concepo de
hidrlise enzimtica simultnea fermentao alcolica.
5.1.2. Otimizao do processo de hidrlise enzimtica simultnea
fermentao alcolica por Zymomonas mobilis CP4
I. Bagao de cana-de-acar pr-tratado
Visando-se definir uma condio que resultasse em elevadas
concentraes de etanol a partir do processo SSF, um planejamento
experimental 2
3
, empregando o mtodo de superfcie de resposta, foi realizado.
A matriz experimental est apresentada na tabela 5.2, a qual contm os valores
das condies empregadas, avaliando a concentrao de clulas, carga
enzimtica e relao slido:lquido do bagao pr-tratado (g:mL); assim como
as respectivas respostas (concentrao de etanol e produtividade volumtrica).
Os ensaios foram conduzidos de acordo com a metodologia descrita na
seo 4.3.3.2, empregando-se o processo de hidrlise enzimtica da celulose
simultnea fermentao, com um tempo de pr-hidrlise enzimtica de 12 h.
Na figura 5.5 A, observa-se a celulignina de bagao de cana-de-acar pr-
tratada e submetida a lavagens com gua destilada e secagem, sem a adio
de meio e de enzimas, que se apresenta em estado slido.
Na sequncia, adicionou-se meio de cultivo, descrito no item 4.3.2, com
exceo da glicose, carga enzimtica de 25 FPU/g, como preconizado por
Vsquez (2007), e relao slido:lquido de 3:10 (g:mL) (Fig. 5.5. B). Aps o
pr-tratamento enzimtico o material slido hidrolisado foi liquefeito, atingindo
cerca de 80 g/L de glicose, tornando-o prprio para a fermentao (Fig. 5.5. C).
Observa-se que as maiores concentraes de etanol foram obtidas para as
mais elevadas relaes slido:lquido, a exceo do experimento 4, no qual se
utilizou a carga enzimtica em seu valor mnimo. Conforme reportado por
Vsquez (2007), a relao slido: lquido e a carga enzimtica so fatores
essenciais para a otimizao do processo SSF, uma vez que o aumento no

115
teor de slidos associado ao aumento da carga enzimtica resultou em um
aumento nas concentraes de etanol.
Tabela 5.2. Planejamento Experimental de Superfcie de Resposta 2
3
,
avaliando a relao slido:lquido, carga enzimtica e concentrao celular
frente produo de etanol a partir do bagao de cana pr-tratado atravs do
processo SSF por Z. mobilis CP4.

Ex.
Condies Respostas
S:L
(g:L)
CE
(FPU/g)
X
o
(g/L)
Glicose
(g.L
-1
)
Etanol
(g.L
-1
)
Q
P
(g/L.h)
1 0,32:10 17,5 2,5 12,3 6,5 0,23
2 2:10 17,5 5,02 70,7 35,2 1,49
3 2:10 17,5 2,5 69,9 33,8 1,42
4 3:10 10,0 4,0 33,8 13,7 0,5
5 2:10 17,5 2,5 69,9 33,8 1,45
6 3:10 10,0 1,0 35,5 14,9 0,5
7 1:10 10,0 1,0 17,2 5,9 0,2
8 3:10 25,0 4,0 80,3 60,7 1,52
9 2:10 17,5 2,5 70,5 30,6 1,38
10 2:10 17,5 2,5 69,5 33,4 1,42
11 1:10 10,0 4,0 20,1 13,4 0,41
12 1:10 25,0 1,0 26,3 14,7 0,85
13 1:10 25,0 4,0 33,8 17,9 0,88
14 2:10 30,11 2,5 76,6 36,8 0,94
15 3:10 25,0 1,0 80,7 48,7 0,98
16 2:10 17,5 0,02 50,5 6,9 0,06
17 3,68:10 17,5 2,5 10,6 6,2 0,42
18 2:10 17,5 2,5 70,6 29,1 1,41
19 2:10 4,89 2,5 12,8 5,4 0,21
20 2:10 17,5 2,5 70,6 34,9 1,39
Onde: S:L: relao slido:lquido, CE: carga enzimtica, Q
P=
produtividade
volumtrica, X
0
=concentrao celular.

Figura 5.5. Material celulsico deslignificado (A), logo aps a adio de
enzimas e meio (B) e aps a pr-hidrlise enzimtica (C).


116
A significncia estatstica das equaes do respectivo modelo foi
verificada utilizando-se o teste de Fisher da anlise de varincia (ANOVA). No
tocante concentrao inicial de glicose, o modelo quadrtico reduzido foi o
melhor modelo ajustado para o processo (aps pr-hidrlise enzimtica), pois
apresentou o maior valor de R
2
(0,8884).
Na tabela 5.3, observa-se que o Lack of Fit apresentado como
significativo (p<0,05), embora o modelo tenha permanecido significativo (p-
valor inferior a 0,0001), no sendo invalidado. O Parmetro C (concentrao
celular) e suas interaes foram removidos do modelo, uma vez que no
apresentam influncia na liberao de glicose, pois esta produzida durante a
pr-hidrlise enzimtica, ou seja, antes da inoculao da bactria. Por este
motivo, provavelmente, o Lack of Fit mostrou-se significativo. O parmetro B
(carga enzimtica) foi o mais influente na liberao de glicose, pois apresentou
os maiores valores de soma dos quadrados e de mdia quadrtica, seguido do
parmetro A (relao slido:lquido) e logo, da interao AB.
Tabela 5.3. Anlise de varincia da concentrao de glicose inicial do processo
SSF a partir do bagao de cana pr-tratado por Z. mobilis CP4, atravs do
Planejamento Experimental de Superfcie de Resposta 2
3
, avaliando a relao
slido:lquido, carga enzimtica e concentrao celular.
SQ GL MQ F p >F
Modelo 1694,875 5 2338,97 22,29 < 0,0001
A 1313,64 1 1313,64 12,52 0,0033
B 3460,54 1 3460,54 32,98 < 0,0001
A
2
5681,33 1 5681,33 54,15 < 0,0001
B
2
944,23 1 944,23 9,00 0,0096
AB 662,48 1 662,48 6,31 0,0248
Resduo 1468,91 14 104,92
Lack of Fit 1467,84 9 163,09 759,75 < 0,0001
Erro 1,07 5 0,21
Cor Total 13163,78 19
[Glicose]: [R
2
= 0,8884, R
2
Aj = 0,8486]
Onde, SQ= Soma Quadrtica, GL= Grau de Liberdade, MQ= Mdia
Quadrtica, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher.
A= relao slido:lquido, B= carga enzimtica, C= concentrao celular.
O modelo de glicose resultante aps a pr-hidrlise enzimtica
representado pela seguinte equao (1):

117
[Glicose] = -69.28050+67.60248 A+4.70742 B+1.21333 AB-19.75705 A
2
-
0.14319B
2

(1)

Os grficos 3-D de superfcie de resposta representam as equaes de
regresso, mostrando a interao entre relao slido:lquido, carga enzimtica
e concentrao celular para a concentrao final etanol, produtividade
volumtrica e concentrao inicial de glicose do processo SSF. Na figura 5.6,
observa-se o contorno de superfcie resposta para a otimizao da
concentrao inicial de glicose do SSF. Os efeitos da relao slido:lquido (A)
e carga enzimtica (B) indicam que a concentrao de glicose do SSF maior
nos maiores nveis de carga enzimtica e na maior relao slido:lquido,
obviamente, pois quanto maior for o contedo slido e maior for a carga
enzimtica, maiores concentraes de acares sero liberadas no processo.

relao slido:lquido (parmetro A) e carga enzimtica (parmetro B) sobre a
concentrao inicial de glicose do processo SSF a partir do bagao de cana
pr-tratado.

No que concerne concentrao de etanol, o modelo utilizado para a
avaliao foi o Cbico Reduzido, uma vez que apresentou maior valor para R
2

(0,9926), indicando 99,2% de ajuste da resposta. Na tabela 5.4. observa-se
que o modelo manteve-se significativo, com valor de Fisher de 78,31 e Lack of
Fit no significativo (p>0,05). A probabilidade de p-valor inferior a 0,0001

118
indicou igualmente que o modelo foi altamente significativo e que os dados
experimentais obtidos esto em um bom ajuste com o modelo. Todos os trs
parmetros avaliados (relao slido: lquido, carga enzimtica e concentrao
clular) foram significativos e foram mantidas no modelo. Embora, dentre as
trs interaes existentes, apenas a interao AB (relao slido: lquido
associada a carga enzimtica) foi mantida no modelo, apresentando-se muito
representativa (alto valor de Fisher).
A equao do modelo apresentada na equao (2):
[Etanol] = +32.60 +16.70 A+13.09 B+ 808.35 C 9.28 A
2
4.07 B
2
+ 4.48 C
2
+
8.44AB - 5.93 A
3
1.33 B
3
287.21 C
3
516.46 A
2
C + 2.19 ABC (2)
Analisando os valores de soma dos quadrados e mdia quadrtica,
observa-se que a relao slido:lquido (parmetro A) teve o efeito mais
significativo, seguida pela carga enzimtica (parmetro B) e, finalmente, a
concentrao celular (parmetro C), que teve menor influncia na concentrao
Tabela 5.4. Anlise de varincia da concentrao de etanol atravs do
utilizando o Planejamento Experimental de Superfcie de Resposta 2
3
,
SQ GL MQ F p >F
Modelo 4693,84 12 391,15 78,31 < 0,0001
A 792,07 1 792,07 158,58 < 0,0001
B 486,79 1 486,79 97,46 < 0,0001
C 44,36 1 244,36 48,92 0,0002
A
2
1033,59 1 1033,59 206,94 < 0,0001
B
2
198,37 1 198,37 39,72 0,0004
C
2
76,08 1 76,08 15,23 0,0059
AB 569,53 1 569,53 114,03 < 0,0001
A
3
390,22 1 390,22 78,13 < 0,0001
B
3
19,52 1 19,52 3,91 0,0886
C
3
239,23 1 239,23 47,90 0,0002
A
2
C 244,67 1 244,67 48,99 0,0002
ABC 38,28 1 38,28 7,66 0,0278
Resduo 34,96 7 4,99
Lack of Fit 9,90 2 4,95 0,99 0,4350
Erro Puro 25,06 5 5,01
Cor Total 4728,80 19
[Etanol]: [R
2
= 0,9926, Adj R
2
= 0,9 799]
Quadrtica, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher. A= relao
slido:lquido, B= carga enzimtica, C= concentrao celular.

119
de etanol. A interao entre carga enzimtica e concentrao celular (BC), bem
como a interao entre relao slido:lquido e concentrao celular (AC) no
tiveram influncia significativa na presente anlise, com valores de p>F
inferiores a 0,05, e, portanto, foram removidas do modelo.
O aumento da relao slido:lquido associada ao aumento da carga
enzimtica fez com que a eficincia de hidrlise fosse maior e,
consequentemente, gerado uma maior concentrao inicial de glicose
disponvel no meio. Kim et al. (2008) analisaram o processo de fermentao
SSF e, da mesma maneira, observou que a eficincia de fermentao depende
da concentrao inicial de glicose produzida durante a hidrlise enzimtica.
A figura 5.7 mostra que a mxima concentrao de etanol ocorre quando
a relao slido:lquido (A) e a carga enzimtica (B) esto em seus maiores
nveis, aumentando-se significativamente a partir do ponto central dos dois
parmetros analisados para os seus nveis mais elevados.

Figuras 5.7. Superfcie de resposta mostrando os efeitos combinados da
relao slido:lquido (parmetro A) e carga enzimtica (parmetro B) sobre a
concentrao de etanol atravs do processo SSF a partir do bagao de cana
pr-tratado por Z. mobilis CP4.

120
Embora exista uma tendncia para uma curvatura no grfico de
superfcie de resposta referente concentrao de etanol, o valor mximo
claramente atingido, conforme plotado no grfico de produtividade volumtrica,
em que a curvatura muito evidente. Analisando os resultados desta srie de
experimentos, constata-se que a hidrlise foi ineficiente quando a carga
enzimtica e a relao slido:lquido eram baixas, assim como quando haviam
altas concentraes de slidos associados baixos nveis de carga enzimtica,
liberando baixas concentraes de glicose ao meio e, consequentemente,
produzindo baixas concentraes de etanol. Portanto, a carga enzimtica deve
aumentar em associao relao slido:lquido.
No tocante produtividade volumtrica, o melhor modelo ajustado
para a anlise estatstica desta varivel de resposta tambm foi o modelo
cbico reduzido, uma vez que resultou no melhor valor de R
2
(0,8848).
Segundo a anlise da soma dos quadrados e mdia quadrtica, o parmetro B
(carga enzimtica) foi o mais influente, seguido do parmetro C (concentrao
celular). O parmetro A (relao slido:lquido) foi o menos influente no modelo
de produtividade volumtrica de etanol (Tabela 5.5).
O Lack of Fit foi mostrado como significativo (p<0,05), porm no
invalidou o modelo, uma vez que os valores preditos esto em conformidade
com os valores experimentais. O modelo hierrquico foi mantido, com os
respectivos parmetros e interaes, visando uma maior anlise do decorrer da
fermentao atravs dos grficos de superfcie de resposta (Figura 5.8).
A figura 5.8 representa o modelo de superfcie de resposta para a
otimizao de produtividade volumtrica. O efeito da relao slido:liquido (Fig.
5.8 A) e carga enzimtica, mantendo-se a concentrao celular no ponto
central, indica claramente que o ponto timo para a mxima produtividade
volumtrica em torno do nvel mximo de carga enzimtica e do ponto central
da relao slido liquido. No entanto, quando o processo SSF ocorre em nveis
elevados de slidos, o tempo de fermentao e a concentrao de etanol so
afetados, sendo reduzidos, conforme analisado nos experimentos 4, 6 e 17
(Tabela 5.2). Quando h um aumento no contedo de slidos e a carga

121
enzimtica no aumenta proporcionalmente, a hidrlise enzimtica ocorre
lentamente e, assim, a liberao de glicose no processo baixa, reduzindo-se
a concentrao de etanol e a produtividade volumtrica, pois a taxa de
fermentao limitada pela baixa concentrao do substrato.
Tabela 5.5. Anlise de varincia da produtividade volumtrica de etanol
atravs do processo SSF a partir do bagao de cana pr-tratado por Z. mobilis
CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfcie de Resposta 2
3
,
Quadrtica, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher, A= relao
slido:lquido, B= carga enzimtica, C= concentrao celular.

O efeito das interaes entre a relao slido:liquido e a concentrao
celular (AC), mantendo-se a carga enzimtica em seu ponto central, indica que
a maior produtividade volumtrica ocorre nos nveis mximos de concentrao
celular e em torno do ponto central para a relao slido: lquido. Desta forma,
quando a relao slido:lquido baixa, a liberao de glicose no processo
igualmente reduzida, fazendo com que baixas concentraes deste acar
sejam disponveis no meio de fermentao e, consequentemente, com que a
concentrao de etanol e de produtividade volumtrica diminuam. Alm disso,
observou-se que quando haviam concentraes elevadas de slidos, sem
proporcional aumento de carga enzimtica, o mesmo no era hidrolisado por
completo, mantendo-se baixas as concentraes de glicose disponveis no
SQ GL MQ F p >F
Modelo 4,63 10 0,46 6,92 0,0038
A 0,14 1 0,14 2,11 0,1800
B 1,14 1 1,14 16,97 0,0026
C 0,79 1 0,79 11,85 0,0074
A
2
1,60 1 1,60 23,96 0,0009
B
2
0,87 1 0,87 12,94 0,0058
C
2
0,43 1 0,43 6,47 0,0315
AB 0,011 1 0,011 0,16 0,7011
AC 5,513E-003 1 5,513E-003 0,082 0,7806
BC 0,025 1 0,025 0,38 0,5538
ABC 0,050 1 0,050 0,74 0,4116
Resduo 0,60 9 0,067
Lack of Fit 0,60 4 0,15 242,90 <0,0001
Erro Puro 3,083E-003 5 6,167E-004
Cor Total 5,23 19
Produtividade Volumtrica: [R
2
= 0,8848, R
2
Aj = 0,7569]

122
meio, conforme os experimentos 4, 6 e 17 (Tabela 5.2). A relao slido:
lquido em seus nveis timos, quando associada a altas concentraes de
clulas, proporcionou aumento de produtividade volumtrica de etanol.

Figura 5.8. Superfcies de resposta mostrando os efeitos combinados da entre
(A) relao slido: lquido (parmetro A) e carga enzimtica (parmetro B), (B)
relao slido: lquido (parmetro A) e concentrao celular (parmetro C), (C)
carga enzimtica (parmetro B) e concentrao celular (parmetro C) sobre a
produtividade volumtrica de etanol atravs do processo SSF a partir do
bagao de cana pr-tratado por Z. mobilis CP4.

123
A interao entre a carga enzimtica (B) e a concentrao celular (C),
mantendo-se a relao slido:lquido no seu ponto central, indica que os
maiores valores de produtividade volumtrica ocorrem nos nveis mximos de
carga enzimtica e de concentrao de clulas (Fig. 5.8 C). Quando a carga
enzimtica baixa, a liberao de glicose no processo muito lenta, fazendo
com que a concentrao de etanol e a produtividade volumtrica diminuam.
Desta forma, quando eram aplicados altos nveis de carga enzimtica, a glicose
era hidrolisada mais rapidamente, promovendo aumento da produtividade
volumtrica de etanol; uma vez que este carboidrato era simultaneamente
metabolizado pelas clulas bacterianas, as quais tambm estavam presentes
em altas concentraes.
O modelo resultante da produtividade volumtrica em etanol
apresentado na equao (3):
Produtividade Volumtrica = - 3.17128 + 1.61333 + 0.20374B + 0.67448C-
0.012667AB - 0.10500AC - 9.00000E-003BC - 0.33342A
2

- 4.35605E-003B
2
-
0.078147C
2

+7.00000E-003ABC (3)
O melhor resultado do planejamento experimental apresenta-se a seguir:
concentrao inicial de glicose do SSF (76 g/L), concentrao final etanol (60
g/L) e produtividade volumtrica (1,5 g/L.h); a partir da relao slido:lquido de
3:10, carga enzimtica de 25 FPU/g e concentrao celular de 4 g/L (Figura
5.9).
Observou-se que os resultados esto de acordo com as respostas
previsveis pelo modelo. Neste experimento, realizado em frascos agitados, a
glicose foi convertida a etanol no perodo de 36 horas de fermentao, sem
controle pH, na temperatura de 30C e agitao orbital de 150 rpm. O tempo de
fermentao foi um fator decisivo na fermentao quando a glicose era gerada
em altas concentraes; segundo Cazetta et al. (2007), a concentrao de
etanol pode aumentar em at 60% de 24 para 48 h.


124
processo SSF por Z. mobilis CP4, em frascos agitados. Condies
P.H.= pr-hidrlise enzimtica, SSF: fermentao e sacarificao simultneas.
A reproduo da melhor condio alcanada no planejamento
experimental, o qual foi realizado em frascos agitados (Figura 5.9), ocorreu em
biorreator sob condies controladas, obtendo-se a concentrao inicial de
glicose do SSF em 80 g/L, concentrao final de etanol de 55 g/L e
produtividade volumtrica de 2,3 g/L.h, com um tempo de fermentao de
aproximadamente 24 horas, na temperatura de 30C, agitao orbital de 150
rpm e pH 5 (Fig. 5.10). Observa-se que os resultados de produo de etanol
obtidos em frascos agitados foram semelhantes aos obtidos em biorreator,
embora a produtividade volumtrica tenha sido maior no experimento em
biorreator.
O presente estudo apresentou os melhores resultados de produo de
etanol de lignocelulsicos por Zymomonas mobilis no recombinante
reportados na literatura, atingindo a concentrao de etanol de 60 g/L, valor
prximo ao obtido por Vsquez (2007), que atingiu 70 g/L de etanol a partir de
P.H. SSF

125
processo SSF de bagao de cana sob condies semelhantes, utilizando a
levedura Saccharomyces cerevisae.

fermentao simultneas a partir de bagao de cana pr-tratado por Z. mobilis
CP4, em biorreator instrumentado. Condies operacionais: relao slido
lquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de clulas. P.H.= pr-hidrlise enzimtica,
SSF: fermentao e sacarificao simultneas.
As maiores diferenas entre os resultados da fermentao pela bactria
Z. mobilis no presente estudo e pela levedura S. cerevisae, reportadas por
Vsquez (2007) foram: composio do meio, no qual foram utilizados meios de
fermentao com nutrientes e tampo-citrato, e temperatura de fermentao
em torno de 37C e de 30C, respectivamente, o que possibilitou uma hidrlise
mais eficiente no experimento com a levedura, pois a temperatura se mantinha
mais prxima da tima para a atividade de celulases (50C), alm da presena
do tampo possibilitar uma maior estabilidade do pH.

P.H.
SSF

126
II. Resduos da indstria de celulose
Visando comparar a produo de etanol a partir de resduos da indstria
de celulose com a utilizao do bagao de cana como matria-prima atravs do
processo de fermentao por Zymomonas mobilis e sacarificao simultnea,
um planejamento experimental do tipo delineamento superfcie de resposta 2
3

avaliando o processo SSF a partir de PM2 tambm foi utilizado, onde os
parmetros analisados foram a relao de slido:lquido (g:mL), carga
enzimtica (FPU/g) e concentrao clulas (%). Na sequncia, na tabela 5.6,
so apresentados os experimentos referentes utilizao do resduo PM2
como fonte de carbono para a produo de etanol por Z. mobilis.
4
Relao slido:lquido (g:mL), Carga enzimtica (FPU/g) e Concentrao
celular (%) na produo de etanol a partir de resduos da indstria de celulose
por Z. mobilis CP4.

Ex.
Condies Resposta
S:L (g:L) CE (FPU/g) X
o
(%) Etanol (g/L)
1 0,32:10 17,5 10,00 3,7
2 2:10 17,5 18,41 29,2
3 2:10 17,5 10,00 29,7
4 3:10 10,0 14,21 5,5
5 2:10 17,5 10,00 31,1
6 3:10 10,0 5,80 5,5
7 1:10 10,0 5,80 4,0
8 3:10 25,0 14,21 19,4
9 2:10 17,5 10,00 28,3
10 2:10 17,5 10,00 28,3
11 1:10 10,0 14,21 7,2
12 1:10 25,0 5,80 4,3
13 1:10 25,0 14,21 2,5
14 2:10 30,1 10,00 2,1
15 3:10 25,0 5,80 20,7
16 2:10 17,5 1,59 53,9
17 3,68:10 17,5 10,00 12,8
18 2:10 17,5 10,00 29,8
19 2:10 25,0 10,00 9,6
20 2:10 4,89 10,00 29,8
Onde: S:L: relao slido:lquido, CE: carga enzimtica, Q
P=
produtividade
volumtrica, X
0
=concentrao celular.
Observa-se que nos experimentos 1, 7, 11, 12 e 13, os quais
apresentaram baixas relaes de slidos (varivel A), as concentraes de

127
etanol foram reduzidas quando comparados s outras condies, entretanto,
nos experimento 4, 6 e 17, que possuam elevada relao slido:lquido, a
produo de etanol foi inibida de forma semelhante. Contudo, analisando os
experimentos 8 e 15 nota-se que as variveis A e B, quando duplamente
alteradas, no causam inibio no processo por apresentarem elevado grau de
sinergismo. Este fato tambm observado nos experimentos 14 e 19, onde,
respectivamente, a carga enzimtica manteve-se no nvel +o e no nvel -o e a
relao slido:lquido manteve-se no ponto central.
Quando as 3 variveis avaliadas estatisticamente encontravam-se em
seus pontos centrais, nos experimentos 3, 5, 9, 10, 18 e 20, a produo de
etanol ocorreu eu torno de 30 g/L, mostrando elevada reprodutibilidade no
processo. Ao compararmos os experimentos 2 e 16 nota-se que a elevada
concentrao celular provocou inibio no processo, atingindo 29,2 g/L e 53,9
g/L de etanol, quando a mesma apresentava-se em seu nvel inferior e superior,
respectivamente.
Na tabela 5.7 observa-se a anlise de varincia obtida pelo
planejamento experimental, o qual se mostrou significativo, permitindo a
avaliao preditiva dos valores gerados pelo mtodo. O modelo quadrtico foi o
escolhido para a anlise estatstica, por apresentar maior significncia
(p<0,05), bem como maior valor de R
2

observado para a produo de etanol,
em 0,8535. O parmetro A (Relao slido:lquido) apresentou a maior
influncia, seguido do parmetro C (Concentrao celular), que, por sua vez foi
superior ao parmetro B (Carga enzimtica), que apresentou baixos valores de
Soma dos Quadrados. Apesar de apenas a varivel A apresentar relevncia
estatstica, o modelo foi mantido hierrquico, ou seja, completo com seus
parmetros e interaes, se mantendo altamente significativo. Dentre as
interaes duplas, a mais influente foi a AB (Relao slido:lquido e Carga
enzimtica), seguida de BC (Carga enzimtica e Concentrao celular), e AC
(Relao slido:lquido e Concentrao celular), apresentando-se pouco
significativa.

128
A equao referente concentrao de etanol apresentada na
equao (4).
[Etanol]= + 29,78 + 3,56A + 0,88B - 3,04C + 4,18AB - 0,33AC - 0,78BC -
9,47A
2
- 10,32B
2
+ 2,30C
2
(4)
Tabela 5.7. Anlise de Varincia da concentrao de etanol atravs do
processo SSF a partir de resduos da indstria de celulose por Z. mobilis CP4,
utilizando o Planejamento Superfcie de Resposta 2
4
, o qual avaliou os efeitos
da Relao slido:lquido (g:mL), Carga enzimtica (FPU/g) e Concentrao
celular (%).
SQ GL MQ F-Valor p-valor
Modelo 3272,84 9 363,65 6,47 0,0037
A 173,22 1 173,22 3,08 0,1096
B 10,46 1 10,46 0,19 0,6753
C 125,95 1 125,95 2,24 0,1652
AB 139,86 1 139,86 2,49 0,1457
AC 0,88 1 0,88 0,016 0,9030
BC 4,88 1 4,88 0,087 0,7742
A
2

1292,08 1 1292,08 23,00 0,0007
B
2

1534,04 1 1534,04 27,30 0,0004
C
2

76,54 1 76,54 1,36 0,2702
Residual 561,88 10 56,19
Lack of Fit 556,42 5 111,28 101,75 <0,0001
Erro Puro 5,47 5 1,09 6,47 0,0037
SQ= Soma dos Quadrados, GL= Grau de Liberdade, MQ= Mdia Quadrtica,
A= relao slido:lquido, B= carga enzimtica, C= concentrao celular.

A figura 5.11 indica as interaes entre Relao slido:lquido e Carga
enzimtica, mantendo-se a Concentrao celular

no Ponto Central. Nota-se
que a produo de etanol alcanada foi em torno de 25 g/L, quando ambos
parmetros (A e B) esto em seus nveis mdios. Experimentalmente, foram
alcanados 29,75 g/L quando todos os parmetros mantinham-se em seus
pontos centrais, resultado prximo do terico indicado pelo modelo.
No entanto, as condies timas obtidas para a produo de etanol
atravs do processo SSF a partir de PM2 ocorreram quando a Relao
slido:lquido estava em seu nvel mdio (2:10 g/mL), a Carga enzimtica
estava em seu nvel mdio

(17,5 FPU/g) e a Concentrao celular estava no
seu menor nvel (1,59 % v/v), resultando na mxima concentrao de etanol

129
em 58 g/L, a partir de 82 g/L de glicose inicial do processo e produtividade
volumtrica de 2,76 g/L.h, em biorreator instrumentado, na temperatura de
30C, 150 rpm de agitao e pH 5 (Figura 5.12).

Figura 5.11. Superfcie de resposta mostrando os efeitos da relao slido:lquido,
carga enzimtica e suas interaes na produo de etanol atravs do processo
SSF a partir de resduos da indstria de celulose por Z. mobilis CP4.

fermentao simultneas a partir de resduos da indstria de celulose por Z.
mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condies operacionais: relao
P.H. SSF

130
slido:lquido (2:10 g/mL), carga enzimtica (17,5 FPU/g) e concentrao celular
(1,59 %).
5.1.3. Anlise da adio de diferentes componentes do meio no processo
SSF frente produo de etanol a partir por Z. mobilis CP4 nativa
I. Bagao de cana-de-acar pr-tratado
Foram desenvolvidos planejamentos sequenciais objetivando-se avaliar
a influncia dos nutrientes dos componentes complementares ao processo de
sacarificao e fermentao simultneas, tais como extrato de levedura,
KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O, para posterior produo de etanol por
Zymomonas mobilis.
Delineamento fatorial
Inicialmente, foi realizado um delineamento fatorial completo 2
4
, o qual
gerou o de total de 19 experimentos, sendo 16 experimentos correspondentes
distribuio fatorial e 3 rplicas do ponto central (Tabela 5.8). A maior
produo de etanol (53 g/L) foi atingida com as concentraes de 2,5 g/L de
extrato de levedura, 1 g/L de KH
2
PO
4
, 0,5 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
e 0,5 g/L de
MgSO
4
.7H
2
O.
A presena de extrato de levedura promoveu um aumento na produo
de etanol, conforme observado nos experimentos 1 e 18, os quais possuem as
mesmas concentraes dos outros nutrientes (exceto de extrato de levedura).
Dessa forma, quando tal fonte de nitrognio foi adicionada, a concentrao de
etanol variou de 11 g/L para 53 g/L, respectivamente.
No experimento 10 no houve adio de nutrientes complementares, no
entanto, a produo de etanol ocorreu em 7 g/L, que pode ser explicada pela
presena de 44,6% de carbono, 5,8% de hidrognio, 44,5% de oxignio, 0,6%
de nitrognio, 0,1% de enxofre e 4,4% de outros elementos no bagao de cana
(SIMES et al., 2005). Embora, visando obteno de resultados mais
promissores, a bactria Z. mobilis necessita de outros nutrientes que
contenham alguns elementos qumicos, como o magnsio e o fsforo, no que
tange ao melhor funcionamento do metabolismo e sntese celular

131
(OTHUMPANGAT et al., 1999). Portanto, como mostrado na literatura e
confirmado nos experimentos do presente estudo, os seguintes nutrientes,
extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O, foram essenciais para
a produo de etanol nestes experimentos.
Tabela 5.8. Planejamento fatorial 2
4
, avaliando efeitos da concentrao de
2
PO
4
(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L) na
produo de etanol atravs do processo SSF a partir de bagao de cana pr-
tratado, na relao slido:lquido 3:10 (g:mL) e carga enzimtica de 25 FPU/ g,
por Z. mobilis CP4.

Ex.
VARIVEIS RESPOSTA
E. L.
(g/L)
KH
2
PO
4

(g/L)
(NH
4
)
2
SO
4

(g/L)
MgSO
4
.7H
2
O
(g/L)
Etanol
(g/L)
1 0,00 1,0 0,50 0,50 11
2 0,00 1,0 0,50 0,00 6
3 2,50 0,0 0,50 0,50 38
4 2,50 0,0 0,50 0,00 38
5 0,00 1,0 0,00 0,00 15
6 0,00 0,0 0,50 0,00 11
7 1,25 0,5 0,25 0,25 40
8 2,50 1,0 0,50 0,00 14
9 2,50 1,0 0,00 0,00 13
10 0,00 0,0 0,00 0,00 7
11 0,00 0,0 0,50 0,50 12
12 2,50 0,0 0,00 0,00 12
13 1,25 0,5 0,25 0,25 43
14 0,00 0,0 0,00 0,50 15
15 2,50 0,0 0,00 0,50 34
16 2,50 1,0 0,00 0,50 9
17 1,25 0,5 0,25 0,25 45
18 2,50 1,0 0,50 0,50 53
19 0,00 1,0 0,00 0,50 13
Onde: E.L.= extrato de levedura.
A anlise estatstica da varincia obtida pelo planejamento fatorial,
conforme indicada na tabela 5.9, mostra que o modelo foi significativo,
apresentando p<0,05, assim como o valor do coeficiente de determinao total
(R
2
) observado para a resposta de produo de etanol, em 0,995, sugerindo
um bom ajuste do modelo aos dados experimentais.
Alm disso, o resduo foi baixo, mostrando-se no significativo (p>0,05),
o que no invalidou o modelo para fins preditivos. As interaes duplas entre
os nutrientes complementares apresentaram-se significativas, sendo a

132
interao AC (Extrato de levedura e (NH
4
)
2
SO
4
) a mais influente, seguida da
interao AD (Extrato de levedura e MgSO
4
.7H
2
O) e entre BD (KH
2
PO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O), mostrando-se mais significativas do que as variveis
independentes. Dentre os influncias individuais de cada varivel avaliada, o
efeito linear do extrato de levedura (parmetro A) se apresentou mais influente,
seguido do KH
2
PO
4
(parmetro B), que por sua vez foi mais significativo do que
o MgSO
4
.7H
2
O (parmetro D) e, por fim, o (NH
4
)
2
SO
4
(parmetro C), que
possui baixos valores de Fisher. A interao entre as quatro variveis tambm
apresentou elevados valores de Fisher, o que indica o grande sinergismo
existente entre os nutrientes na fermentao por Z. mobilis, proporcionando
maiores concentraes de etanol.
Tabela 5.9. Anlise da varincia da produo de etanol, empregando
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O, atravs do processo SSF a partir de bagao de cana pr-
tratado por Zymomonas mobilis CP4.
SQ GL MQ Fisher p>F
Modelo 3546,6 15 236,6 25,4 0,038
A 295,6 1 295,6 31,6 0,030
B 303,0 1 303,0 32,4 0,029
C 7,9 1 7,9 0,8 0,455
D 67,1 1 67,1 7,1 0,115
AB 13,9 1 12,91 1,3 0,360
AC 794,8 1 794,8 85,6 0,011
AD 449,1 1 449,1 48,1 0,020
BC 309,5 1 309,5 33,1 0,028
BD 383,8 1 383,9 41,1 0,023
CD 282,5 1 282,5 30,2 0,031
ABC 21,1 1 21,1 2,2 0,271
ABD 11,6 1 11,6 1,2 0,380
ACD 14,5 1 14,6 1,5 0,338
BCD 0,4 1 0,4 0,03 0,864
ABCD 595,7 1 595,7 63,8 0,015
Curvatura 1963,9 1 1963,9 210,4 0,004
Erro 18,7 2 9,3
Cor. Total 5532,1 18
SQ: Soma quadrtica, GL: Grau de liberdade, MQ:Mdia quadrtica, p>F: p-valor.
A: Extrato de levedura, B: KH
2
PO
4
, C: (NH
4
)
2
SO
4
, D: MgSO
4
.7H
2
O.

Os experimentos em frascos agitados foram reproduzidos em biorreator
sob condies controladas, nas seguintes condies operacionais: relao
slido lquido de 3:10 (g:mL), carga enzimtica de 25 FPU/g de celulignina e

133
concentrao inicial de clulas de 4 g/L (SANTOS et al., 2010) (Figura 5.13).
Aps a pr-hidrlise enzimtica, a bactria foi inoculada, dando incio ao
processo SSF, atingindo 53 g/L de etanol e produtividade volumtrica de 2,20
g/L.h.

fermentao simultneas a partir de bagao de cana pr-tratado por Z. mobilis
CP4, nas melhores condies preconizadas pelo modelo: 2,5 g/L de extrato de
levedura, 1 g/L de KH
2
PO
4
, 0,5 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
e 0,5 g/L de MgSO
4
.7H
2
O,
atingindo 53 g/L de etanol, em biorreator instrumentado. Condies
operacionais: relao slido lquido de 3:10 (g:mL), carga enzimtica de 25
FPU/g e concentrao inicial de clulas de 4 g/L. P.H.= pr-hidrlise
enzimtica, SSF: fermentao e sacarificao simultneas.
Atravs deste estudo preliminar foi possvel constatar que os nutrientes
analisados: KH
2
PO
4
(g/L), MgSO
4
.7H
2
O(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
e extrato de levedura
(g/L) promoveram maiores concentraes de etanol quando estavam em seus
maiores nveis: 1 g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. No entanto,
houve a necessidade de ser feito um planejamento experimental completo
visando otimizao da produo de etanol, uma vez que a curvatura
apresentou-se significativa (p<0,05). Desta forma, foram adicionados pontos
axiais, promovendo os graus de liberdade necessrios para a elaborao de
um modelo quadrtico que permita maximizar a concentrao de etanol.
SSF P.H.

134
Planejamento Composto Central Rotacional
Conforme descrito anteriormente, um planejamento fatorial 2
4
foi
realizado; no entanto, foi recomendado empregar o mtodo de Superfcie de
Resposta, adequado para identificar o efeito de variveis individuais, buscando
ento por melhores condies para um sistema multivarivel eficiente,
conforme demonstrado na tabela 5.10 (YU et al., 2009).
Tabela 5.10. Planejamento Composto Central 2
4
, avaliando efeitos da adio
de extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O
(g/L) na produo de etanol atravs do processo SSF a partir de bagao de
cana pr-tratado, na relao slido:lquido 3:10 (g:mL) e carga enzimtica de
25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.

Exp.
Variveis Resposta
E. L.
(g/L)
KH
2
PO
4
(g/L)
(NH
4
)
2
SO
4
(g/L)
MgS0
4
.7H
2
0
(g/L)
Etanol
(g/L)
1 6,25 1,25 0,75 0,75 54,2
2 18,75 1,25 0,75 0,75 62,6
3 6,25 3,75 0,75 0,75 45,7
4 18,75 3,75 0,75 0,75 59,3
5 6,25 1,25 2,25 0,75 38,1
6 18,75 1,25 2,25 0,75 60,3
7 6,25 3,75 2,25 0,75 34,8
8 18,75 3,75 2,25 0,75 52,4
9 6,25 1,25 0,75 2,25 32,9
10 18,75 1,25 0,75 2,25 57,8
11 6,25 3,75 0,75 2,25 33,2
12 18,75 3,75 0,75 2,25 56,4
13 6,25 1,25 2,25 2,25 28,5
14 18,75 1,25 2,25 2,25 54,7
15 6,25 3,75 2,25 2,25 48,1
16 18,75 3,75 2,25 2,25 63,0
17 0,0 2,5 1,5 1,5 30,4
18 25,0 2,5 1,5 1,5 65,4
19 12,5 0,0 1,5 1,5 33,6
20 12,5 5,0 1,5 1,5 38,2
21 12,5 2,5 0,0 1,5 34,9
22 12,5 2,5 3,0 1,5 37,3
23 12,5 2,5 1,5 0,0 34,1
24 12,5 2,5 1,5 3,0 62,7
25 12,5 2,5 1,5 1,5 65,2
26 12,5 2,5 1,5 1,5 63,4
27 12,5 2,5 1,5 1,5 62,6
28 12,5 2,5 1,5 1,5 61,3
29 12,5 2,5 1,5 1,5 62,8
30 12,5 2,5 1,5 1,5 60,0
Onde: E.L.: extrato de levedura.

135
Os parmetros analisados foram os mesmos do Planejamento Fatorial,
concentraes de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O,
adicionados celulignina pr-tratada no incio da hidrlise, que junto com a
glicose gerada, permitiu a implementao do processo de sacarificao e
fermentao simultneas. A maior concentrao de etanol obtida foi de 65 g/L,
com 12,5 g/L de extrato de levedura, 2,25 g/L de KH
2
PO
4
, 1,5 g/L (NH
4
)
2
SO
4
e
1,5 g/L de MgSO
4
.7H
2
O. A presena de maiores concentraes de extrato de
levedura, rico em nitrognio, aumentou significativamente a produo de
etanol, como indicado pela comparao dos experimentos 9 e 10. Estes
possuem as mesmas concentraes de nutrientes, entretanto, quando o extrato
de levedura foi acrescentado, a produo de etanol aumentou de 18 g/L a 40
g/L.
Nos experimentos de 17, 19, 21 e 23, os quais no foram adicionados de
2
PO
4
(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L), o
etanol foi produzido nas concentraes de 11, 37, 26 e 26 g/L,
respectivamente. Adicionalmente, comparando os resultados entre os
experimentos 1 e 15, nota-se que o efeito sinrgico entre os parmetros
analisados faz-se necessrio, uma vez que foram empregadas baixas
concentraes de todos os nutrientes adicionados, assim como elevadas
concentraes dos mesmos, com exceo de extrato de levedura, atingindo 38
g/L e 15 g/L de etanol, respectivamente.
A anlise estatstica de varincia obtida pelo Planejamento Composto
Central Rotacional, indicado na tabela 5.11, mostra que o modelo foi muito
significativo, com p<0,05, apresentando elevado coeficiente de determinao
total (R
2
) observado para a resposta ao etanol, em 0,995. Alm disso, o resduo
foi baixo e no significativo (p>0,05), o que no invalidou o modelo para fins de
preditivos.
O modelo da concentrao de etanol apresentado na equao (5).
[Etanol]=+52.17+131,29A+3,05B+2,50C+6,59D1,00AB+0,38AC+2,00AD+1,50B
C+3,63BD+3,50CD+8,65A
2
-5,07B
2
-5,04C
2
-59D
2
-0,88ABC-1,25ABD-
1,88ACD+1,50BCD-2,43A
2
B-3,50A
2
C-8,96A
2
D-85,12AB
2
-36,42A
3
(5)

136
Tabela 5.11. Anlise de varincia da produo de etanol, empregando diferentes
concentraes de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O, atravs
do processo SSF a partir do bagao de cana pr-tratado, na relao slido:lquido
3:10 (g:mL) e carga enzimtica de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
SQ GL MQ F-Valor p > F
Modelo 4892,51 22 222,39 69,32 < 0,0001
A 481,44 1 481,44 150,06 < 0,0001
B 749,55 1 749,55 233,62 < 0,0001
C 72,52 1 72,52 22,60 0,0021
D 301,53 1 301,53 93,98 < 0,0001
AC 7,56 1 7,56 2,36 0,1686
AD 45,56 1 45,56 14,20 0,0070
BC 52,56 1 52,56 16,38 0,0049
BD 175,56 1 175,56 54,72 0,0001
CD 162,56 1 162,56 50,67 0,0002
A
2

360,80 1 360,80 112,46 < 0,0001
B
2

174,42 1 174,42 54,37 0,0002
C
2

1046,50 1 1046,50 326,18 < 0,0001
D
2

534.53 1 534.53 166.61 < 0.0001
ABC 22.56 1 22.56 7.03 0.0329
ABD 14.06 1 14.06 4.38 0.0746
ACD 39.06 1 39.06 12.18 0.0101
BCD 52.56 1 52.56 16.38 0.0049
A
2
B
749.31 1 749.31 233.55 < 0.0001
A
3

13.48 1 13,48 4,20 0,0795
B
3

726,28 1 726,28 226,37 < 0,0001
C
3

103,83 1 103,83 32,36 0,0007
D
3

567,00 1 567,00 176,73 < 0,0001
Resduo 22,46 7 3,21
Lack of Fit 7,62 2 3,81 1,29 0,3545
Erro Puro 14,83 5 2,97
Cor Total 4914,97 29
SQ= Soma dos Quadrados, GL=Grau de Liberdade, MQ=Mdia Quadrtica,
A: Extrato de levedura, B: KH
2
PO
4
, C: (NH
4
)
2
SO
4
, D: MgSO
4
.7H
2
O.

A varivel B (KH
2
PO
4
) apresentou maior influncia no modelo, seguida
da A (extrato de levedura), por sua vez a D (MgSO
4
.7H
2
O) e, finalmente, a C
([NH
4
]
2
SO
4
), que possui baixos valores de Soma dos Quadrados. A interao
das variveis tambm resultou em altos valores de Fisher, o que aponta para
um elevado sinergismo entre os nutrientes na fermentao por Z. mobilis,
promovendo maior produo de etanol. A interao entre B e D (KH
2
PO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O) mostrou-se a mais significativa estatisticamente, seguida da
interao entre C e D ([NH
4
]
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O) e entre B e C (KH
2
PO
4
e
[NH
4
]
2
SO
4
). As interaes duplas entre os nutrientes analisados para a

137
produo de etanol indicam que a interao entre KH
2
PO
4
(g/L) e extrato de
levedura (g/L) reduzida, sendo retirada do modelo. No entanto, o KH
2
PO
4
,
possui elevadas interaes entre as variveis representadas por (NH
4
)
2
SO
4

(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L).
A Figura 5.14 mostra os grficos de superfcie de resposta,
apresentando a interao entre os parmetros A, B, C e D, que representam o
extrato de levedura, o KH
2
PO
4
, o (NH
4
)
2
SO
4
, assim como

o MgSO
4
.7H
2
O,
respectivamente.

Figura 5.14. Superfcie de resposta mostrando efeitos de MgSO
4
.7H
2
O (g/L) e
(NH
4
)
2
SO
4
(A),

KH
2
PO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L) (B), KH
2
PO
4
(g/L) e (NH
4
)
2
SO
4
(C)e suas interaes para a produo de etanol atravs do processo SSF por Z.
mobilis CP4 a partir do bagao de cana pr-tratado, na relao slido:lquido 3:10
(g:mL) e carga enzimtica de 25 FPU/ g.

138
Na figuras 5.14 (A) (interao entre o MgSO
4
.7H
2
O e o (NH
4
)
2
SO
4
) e
5.14 (B) (interao entre o MgSO
4
e o KH
2
PO
4
), a produo de etanol
encontra-se em seu nvel timo quando os mesmos encontram-se dos seus
nveis mnimos aos pontos centrais, mantendo os outros parmetros nos nveis
mdios. J a figura 5.14 (C) mostra que a produo de etanol est em seu nvel
timo quando as variveis B e C, KH
2
PO
4
(g/L) e (NH
4
)
2
SO
4
, respectivamente,
esto nos seus pontos centrais.
Os resultados obtidos nos presentes experimentos so semelhantes aos
relatados por Yu et al. (2009), que otimizaram as concentraes de nutrientes
em meio sinttico e notaram um efeito significativo do extrato de levedura sobre
a biomassa, quando o mesmo est associado fonte de carbono. Os autores
observaram que o aumento da concentrao de sulfato de amnio resulta em
um aumento na produo de etanol; entretanto, em nveis elevados podem
causar inibio. Assim como tais pesquisadores, nenhuma variao
significativa foi observada com a adio de fontes de fosfato e nitrognio,
tornando o fosfato de potssio, bem como o sulfato de amnio estatisticamente
insignificantes. Provavelmente, o excesso de nitrognio pode promover maior
produo de biomassa em relao produo de etanol.
A reproduo das melhores condies estabelecidas pelo planejamento
experimental, relao de slido:lquido de 3:10 (g:mL), carga enzimtica de 25
FPU/g e concentrao celular de 4 g/L, foi realizada em biorreator
instrumentado, atingindo 65 g/L de concentrao de etanol, e produtividade
final de 2,70 g/L.h, a partir de 85 g/L de glicose inicial do processo, na
temperatura de 30C, agitao orbital de 150 rpm e pH 5 (Figura 5.15).
Os resultados obtidos mostraram que foi possvel otimizar a produo de
etanol atravs da anlise da adio de nutrientes no meio de fermentao,
aps a execuo de planejamentos experimentais sequenciais. Foi constatado
que o aumento da concentrao de KH
2
PO
4
, o qual possui fsforo, utilizado
nas vias metablicas do mecanismo energtico das clulas, foi o principal
responsvel pelo aumento da concentrao de etanol, seguido do extrato de
levedura, MgSO
4
.7H
2
O e (NH
4
)
2
SO
4
. Dessa forma, as condies timas obtidas

139
para o processo SSF a partir do bagao de cana foram as seguintes: extrato de
levedura (12,5 g/L), KH
2
PO
4
(2,5 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(1,5 g/L) e MgSO
4
(1,5 g/L),
resultando na concentrao mxima de etanol em 65 g/L, com 85 g/L de
concentrao inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumtrica de
2,63 g/L.h, na temperatura de 30C, agitao orbital de 150rpm e pH 5 em
biorreator instrumentado.

Figura 5.15. Perfil cintico da produo de etanol a partir de bagao de cana
pr-tratado, na relao slido:lquido 3:10 (g:mL) e carga enzimtica de 25
FPU/ g, atravs do processo SSF por Z. mobilis CP4, utilizando 12,5 g/L de
extrato de levedura, 2,5 g/L de KH
2
PO
4
, 1,5 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
e 1,5 g/L
MgSO
4
.7H
2
O no meio fermentativo. P.H.= pr-hidrlise enzimtica, SSF:
fermentao e sacarificao simultneas.
II. Resduo da indstria de celulose
O mesmo planejamento experimental utilizado anteriormente, para a
avaliao da adio de nutrientes adicionados na fermentao a partir do
bagao de cana pr-tratado, foi empregado no processo SSF a partir de
resduo da indstria de celulose, avaliando diferentes concentraes de
nutrientes adicionais, extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O
(Tabela 5.12).
P.H. SSF

140
4
adio de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH4)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O na
produo de etanol a partir de resduos da indstria de celulose, na relao
slido:lquido 2:10 (g:mL) e carga enzimtica de 17,5 FPU/ g, por Z. mobilis
CP4.

Ex.
Variveis Resposta
E. L.
(g/L)
KH
2
PO
4

(g/L)
(NH
4
)
2
SO
4

(g/L)
MgS0
4
.7H
2
0
(g/L)
Etanol
(g/L)
1 6,25 1,25 0,75 0,75 38,1
2 18,75 1,25 0,75 0,75 33,5
3 6,25 3,75 0,75 0,75 18,6
4 18,75 3,75 0,75 0,75 14,3
5 6,25 1,25 2,25 0,75 39,3
6 18,75 1,25 2,25 0,75 44,0
7 6,25 3,75 2,25 0,75 37,7
8 18,75 3,75 2,25 0,75 40,6
9 6,25 1,25 0,75 2,25 18,2
10 18,75 1,25 0,75 2,25 40,8
11 6,25 3,75 0,75 2,25 32,5
12 18,75 3,75 0,75 2,25 32,6
13 6,25 1,25 2,25 2,25 45,4
14 18,75 1,25 2,25 2,25 29,3
15 6,25 3,75 2,25 2,25 19,1
16 18,75 3,75 2,25 2,25 35,0
17 0,0 2,5 1,5 1,5 11,7
18 25,00 2,5 1,5 1,5 34,8
19 12,5 0,0 1,5 1,5 37,9
20 12,5 5,0 1,5 1,5 24,1
21 12,5 2,5 0,0 1,5 26,3
22 12,5 2,5 3,0 1,5 3,2
23 12,5 2,5 1,5 0,0 26,9
24 12,5 2,5 1,5 3,0 37,0
25 12,5 2,5 1,5 1,5 13,3
26 12,5 2,5 1,5 1,5 34,5
27 12,5 2,5 1,5 1,5 35,6
28 12,5 2,5 1,5 1,5 23,1
29 12,5 2,5 1,5 1,5 34,7
30 12,5 2,5 1,5 1,5 38,2
Onde: E.L.= extrato de levedura
Os resultados obtidos nestes experimentos mostram que as
concentraes dos nutrientes precisam ser alteradas proporcionalmente, pois,

141
em geral, quando ocorre um aumento excessivo de apenas um componente do
meio, observa-se um decrscimo na produo de etanol. Como exemplo, nos
experimentos 21 e 22, as concentraes de etanol foram alteradas de 26

g/L
para 3 g/L quando (NH
4
)
2
SO
4

teve a sua concentrao aumentada e a dos
outros nutrientes mantiveram-se constantes, respectivamente.
Nos experimentos 6 e 13 nota-se que maiores propores de MgSO
4
e
menores propores de extrato de levedura resultaram em altas concentraes
de etanol, uma vez que os melhores resultados foram obtidos quando estas
variveis encontravam-se nos seus nveis (+) e (-), alcanando 44 e 45 g/L,
respectivamente.
A anlise estatstica de varincia obtida pelo planejamento experimental,
apresentada na tabela 5.13, indica que o modelo quadrtico foi o mais
adequado, por apresentar maior significncia (p<0,05) e maior valor de R
2

(0,770) para a produo de etanol. O Lack of fit mostrou-se significativo, pois
apenas o parmetro A (extrato de levedura) teve elevada influncia
individualmente, embora as interaes duplas tambm tenham se apresentado
significativas (com exceo da AD, entre extrato de levedura e MgSO
4
).
Portando, o modelo foi mantido hierrquico, ou seja, completo com seus
parmetros e interaes, apresentando-se significativo.
equao (6).
[Etanol] = +37,42+4,81 A + 0,81B -1,52C +2,70D -0,22AB-3,28AC+5,00AD
+3,42BC-1,56BD+5,16CD -2,81A
2
-1,81B
2
- 2,19C
2

-2 44D
2
(6)
Dentre os nutrientes analisados do Planejamento Composto Central, a
varivel A (extrato de levedura) apresentou a maior influncia, seguida da
varivel D (MgSO4.7H
2
O), que, por sua vez foi superior varivel C
((NH4)
2
SO
4
) e, finalmente, varivel B (KH
2
PO
4
), a qual apresentou baixos
valores de Soma dos Quadrados (SQ). Dentre as interaes duplas, a mais
influente foi entre C e D ([NH
4
]
2
SO
4
), seguida da interao entre A e D (extrato
de levedura e MgSO
4
.7H
2
O), entre B e C (KH
2
PO
4
e (NH4)
2
SO
4
), A e C (extrato

142
de levedura e (NH
4
)
2
SO
4
), B e D (KH
2
PO
4
e (NH
4
)2SO
4
) e, por fim, entre A e B
(extrato de levedura e KH
2
PO
4
), apresentando-se pouco significativa.
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O, atravs do processo SSF por Zymomonas mobilis CP4 a partir
de resduo da indstria de celulose.
Modelo 2452,78 14 175,20 3,59 0,0097
A 554,25 1 554,25 11,34 0,0042
B 15,71 1 15,71 0,32 0,5791
C 55,11 1 55,11 1,13 0,3051
D 175,22 1 175,22 3,59 0,0777
AB 0,76 1 0,76 0,016 0,9025
AC 171,66 1 171,66 3,51 0,0805
AD 399,90 1 399,90 8,18 0,0119
BC 186,98 1 186,98 3,83 0,0693
BD 39,18 1 39,18 0,80 0,3847
CD 426,66 1 426,66 8,73 0,0098
A
2

216,81 1 216,81 4,44 0,0524
B
2

90,01 1 90,01 1,84 0,1948
C
2

131,13 1 131,13 2,68 0,1222
D
2

162,83 1 162,83 3,33 0,0879
Resduo 732,97 15 48,86
Lack of Fit 712,08 10 71,21 17,04 0,0030
Erro Puro 20,90 5 4,18
Cor. Total 3185,75 29
SQ= Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Mdia Quadrtica
A: Extrato de levedura; B: KH
2
PO
4
; C: (NH
4
)
2
SO
4
; D: MgSO
4
.7H
2
O.

De acordo com a anlise de superfcie de resposta, na figura 5.16 (A)
possvel observar as interaes entre extrato de levedura e MgSO
4
.7H
2
O
(mantendo (NH
4
)
2
SO
4

e

KH
2
PO
4

em seus pontos centrais), constatando que a
maior produo de etanol ocorre quando AD esto em seus nveis mximos, o
que aponta para a ampliao das faixas de estudo deste planejamento. A figura
5.16 (B) indica para a reduo das concentraes de KH
2
PO
4
e de (NH4)
2
SO
4

(g/L); assim como a figura 5.16 (C) avalia as interaes entre (NH
4
)
2
SO
4
e

MgSO
4
.7H
2
O

e indica que a maior produo de etanol ocorre na faixa dos
pontos centrais.

143

Figura 5.16. Superfcies de resposta mostrando efeitos de extrato de levedura
e MgSO
4
.7H
2
O

(A);

KH
2
PO
4
e (NH4)
2
SO
4
(B); (NH
4
)
2
SO
4
e

MgSO
4
.7H
2
O

(C) e
suas interaes na produo de etanol atravs do processo SSF por Z. mobilis
CP4 a partir de resduo da indstria de celulose.


144
As condies timas obtidas para a produo de etanol atravs do
processo SSF a partir de PM2 foram: extrato de levedura (6,25 g/L), KH
2
PO
4

(1,25 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(2,25 g/L) e MgSO
4
(2,25 g/L), resultando na mxima
concentrao de etanol (54 g/L), a partir de 91 g/L de glicose inicial do
processo, aps pr-hidrlise enzimtica de 12 horas, na temperatura de 50C,
relao slido:lquido de 2:10 g/mL e carga enzimtica de 17,5 FPU/g; seguida
de posterior adio de 1,59% (v/v) de clulas (aps 20 h de crescimento
celular), na temperatura de 30C, 150 rpm de agitao e pH 5, em biorreator
instrumentado (Figura 5.17).

Figura 5.17. Perfil cintico da melhor condio obtida (extrato de levedura, 6,25
g/L; KH
2
PO
4
, 1,25 g/L; (NH
4
)
2
SO
4
, 2,25 g/L e MgSO
4
, 2,25 g/L) para a
produo de etanol atravs do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de
resduo da indstria de celulose, em biorreator instrumentado. P.H.= pr-
hidrlise enzimtica, SSF: fermentao e sacarificao simultneas.
Neste contexto, conclui-se que a presena de todos os nutrientes
analisados (extrato de levedura, (NH
4
)
2
SO
4
,
KH
2
PO
4
e

MgSO
4
) so de extrema
importncia para o crescimento bacteriano nestes experimentos, assim como
para a produo de etanol. Nota-se que a produo de etanol a partir de PM2
foi inferior alcanada por Silva et al. (2009), de aproximadamente 78 g/L,
SSF P.H.

145
contudo, estes autores reportaram o valor de produtividade volumtrica de 1,23
g/L.h, ao passo este parmetro foi de 3,6 g/L.h no presente trabalho.
5.1.4. Anlise Comparativa
Os resultados deste trabalho foram superiores aos alcanados por
diversos autores que empregaram a levedura Saccharomyces cerevisiae no
que tange produo de etanol atravs do processo SSF. Kang et al. (2010)
utilizaram lama de cal proveniente da indstria de celulose como matria-prima,
tendo sido atingido 45 g/L de etanol aps 150 h. J Ruiz et al. (2010) utilizaram
madeira de oliva e caule de girassol, alcanando apenas 29,4 g/L e 20,9 g/L de
etanol, respectivamente, aps 72 h. Linde et al. (2006) reportaram a
concentrao de 25 g/L de etanol aps 120 h de processo realizado com palha
de cevada. E, Martin et al. (2002) obtiveram apenas 12 g/L de etanol a partir de
bagao de cana, aps 48 h; enquanto Zhu et al. (2010) atingiram 41,8 g/L de
etanol a partir de cavaco de pinus.
A tabela 5.14 compara os resultados obtidos no presente trabalho com
outros reportados na literatura empregando linhagens nativas da bactria
Zymomonas mobilis, em termos de produtividade e produo de etanol 2G,
para o processo utilizando materiais de composio lignocelulsica.
Tabela 5.14. Principais resultados relatados na literatura para o processo a partir
de matria-prima lignocelulsica com linhagens nativas de Z. mobilis.
Onde: MP: matria-prima; S: substrato; P: produto; Q
p
: produtividade
volumtrica; gli: glicose; sig: sigmacell; ART: accares redutores totais; SR:
sistema reacional; FA: frascos agitados; BR: biorreator. Referncia Bibliogrfica:
1. Golias et al. (2002); 2. Eklund & Zachi (1995); 3. Ma et al. (2009); 4. este
trabalho.
MP/Meio S (g/L) X
o
SR P (g/L) Q
p
(g/L.h) Ref.
Sigmacell 100 sig 0,3 g/L FA 36 0,3 1
Salgueiro 61 gli 3 g/L FA e BR 29 0,6 2
Lixo de Cozinha 70 ART 10% (v/v) FA 52 1,44 3
Bagao de cana 80 gli 4 g/L FA e BR 60 1,66 4

146
No experimento realizado por Golias et al. (2002), em que foi utilizada
uma associao de Z. mobilis com K. oxytoca P2 termotolerante, foi obtida uma
concentrao de etanol de 36 g/L, em 120 horas de processo, possivelmente
porque a cargas enzimtica e as concentraes celulares foram baixas (15
FPU/g e 0.320 g/L, respectivamente), alm da temperatura de 35C no ser a
ideal para linhagens da bactria Z. mobilis, o que pode ter causado lentido no
processo, conforme sinalizado anteriormente. Os autores tambm analisaram o
desempenho de Saccharomyces pastorianus e de Z. mobilis separadamente, e
o resultado de produo de etanol foi semelhante, em torno de 37 g/L e 40 g/L
respectivamente.
O trabalho de Eklund & Zachi (1995) foi o mais semelhante ao presente
estudo em relao s condies operacionais do processo fermentativo, pois
foi utilizado um resduo lignocelulsico (Salgueiro, espcie Salix caprea),
empregando Z. mobilis sem a associao com outros microrganismos. Os
autores visaram otimizar o processo atravs de um planejamento experimental,
no qual as melhores condies alcanadas foram as seguintes: carga
enzimtica (18 FPU/g), concentrao celular (3 g/L) e nutrientes adicionais ao
meio, extrato de levedura (2,5 g/L), (NH
4
)
2
HPO
4
(0,25 g/L), MgSO
4
.7H
2
0 (0,025
g/L) e 0,1 M de tampo fosfato (pH 5).
Ainda segundo Eklund & Zachi (1995), foram feitas comparaes entre o
processo SSF e SHF, e, embora os autores tenham alcanado concentraes
de etanol de 29 g/L, em 48 horas de fermentao, o processo SSF reduziu a
formao de subprodutos em relao ao processo SHF. Alm deste estudo, foi
feita uma comparao entre o desempenho da bactria Zymomonas mobilis
com a levedura Saccharomyces cerevisae, apresentando resultados
semelhantes nas mesmas condies operacionais. Adicionalmente, estes
autores verificaram que um aumento na concentrao celular da levedura de 4
para 10 g/L resultava em um acrscimo na produo de etanol de 29 para a 39
g/L. Contudo, o mesmo no foi observado quando a bactria Z. mobilis foi
utilizada, uma vez que o aumento na concentrao celular para 10 g/L no
apresentou influncia significativa na concentrao final de etanol, a qual
manteve-se em torno de 29 g/L. Cabe ressaltar que a temperatura de 37C

147
pode ter promovido uma reduo na produo de etanol, uma vez que 30C a
temperatura ideal tima para o metabolismo de Zymomonas mobilis. De forma
semelhante, no presente trabalho, quando concentraes elevadas de clulas
eram empregadas na fermentao por PM2, os resultados de produo de
etanol alcanados tambm se mostraram reduzidos.
Ma et al. (2009) empregaram lixo de cozinha, que continha resduos de
celulose, amido, gordura, protena e glicose, e, empregando a estratgia SSF,
atingiram resultados semelhantes aos obtidos no presente estudo (Tabela
5.10). Os autores tambm avaliaram a utilizao de uma linhagem cido-
tolerante (Z. mobilis GZNS1), sob condies estreis e no estreis,
apresentando resultados semelhantes aos obtidos com a linhagem selvagem,
atingindo-se concentraes de etanol de 48 g/L e 46 g/L, respectivamente, em
36 h de processo, na temperatura de 30C.
O bagao de cana de acar pr-tratado e o resduo da indstria de
celulose (PM2) apresentaram grande potencial para a produo de etanol de
segunda gerao por Z. mobilis, obtendo a maior produo de etanol em 65 g/L
e 58 g/L; assim como 2,70 e 3,6 g/L.h de produtividade volumtrica,
respectivamente (Tabela 5.15).
Tabela 5.15. Resultados obtidos pela linhagem nativa de Zymomonas mobilis
CP4 a partir do processo SSF e a partir da fermentao em meio sinttico.
Experimentos
Condies Valores mximos
S
o
(g/L) t
f
(h) X
o
P (g/L) Q
P
(g/L.h)
Ensaios prvios
Meio sinttico 17 19 10% (v/v) 6,3 0,33
Bagao de cana-de-acar
1 80,3 40 4 g/L 60,7 1,52
2 85 24 4 g/L 65 2,70
Resduo da indstria de celulose
3 82 21 1,59% (v/v) 58 2,76
4 91 15 1,59% (v/v) 54 3,6
Onde: S
0
: concentrao inicial de glicose, t
f
(h): tempo de fermentao, X
0
:
concentrao inicial de clulas, P: concentrao final de etanol, Qp: produtividade
volumtrica. 1 e 3: avaliao da concentrao inicial de clulas, carga enzimtica
e relao slido:lquido (g:mL) no processo a partir do bagao de cana e de PM2,
respectivamente; 2 e 4: avaliao da adio de extrato de levedura, KH
2
PO
4
,
(NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
no meio pr-hidrolisado a partir do bagao de cana e de
PM2, respectivamente.

148
Analisando-se comparativamente os resultados do presente trabalho no
que tange ao processo SSF empregando o microrganismo Z. mobilis
naturalmente ocorrente, aps o pr-tratamento enzimtico de 12 horas, as
concentraes iniciais de glicose a partir do bagao de cana foram inferiores s
alcanadas a partir de PM2, obtendo-se 85 e 91 g/L deste acar,
respectivamente, embora as concentraes de etanol tenham sido ligeiramente
superiores s atingidas a partir do resduo de celulose. O fato do PM2 ter
apresentado valores superiores de glicose inicial pode ter sido o motivo pelo
qual a produtividade volumtrica foi superior obtida a partir do bagao, em
torno de 3,6 g/L.h e 2,7 g/L.h, respectivamente.
Os nveis de celobiose permaneceram praticamente inalterados ao longo
do processo SSF empregando resduos da indstria de celulose, ao passo que
utilizando o bagao de cana, tais nveis apresentaram uma pequena reduo,
mostrando que a enzima |-glucosidase manteve boa atividade, uma vez que as
concentraes de celobiose encontraram-se prximas de zero ao final do SSF.
A glicose foi consumida de forma integral ao final do processo, o que mostra
que este acar foi facilmente fermentado pela bactria.
Atravs dos resultados obtidos no presente estudo e dos experimentos
reportados na literatura conclui-se que Z. mobilis tem o potencial de
revolucionar a indstria de etanol combustvel comercialmente no que tange ao
aproveitamento da frao celulsica, no s em escala laboratorial, mas
tambm piloto e industrial, pois a bactria pode gerar um rendimento prximo
ao mximo terico a partir de vrias matrias-primas, incluindo a cana-de-
acar (RODRIGUEZ et al., 1986), mandioca; sagu (LEE et al., 1986) e
hidrolisados enzimticos de derivados de celulose de madeira (PARK et al.,
1993; PAREKH et al., 1989). No entanto, uma limitao ao potencial da
bactria Z. mobilis naturalmente ocorrente para a produo industrial de etanol
a sua capacidade de utilizar apenas glicose, frutose ou sacarose como fonte
de energia, como descrito no captulo de Reviso Bibliogrfica, alm de no
fermentar a xilose (acar abundante na frao hemicelulsica do bagao de
cana), conforme observado no item 5.1.1, a menos que seja geneticamente
modificada (LAWFORD et al., 1997 e YANASE et al., 2005).

149
5.2. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis
Devido ao limitado espectro de acares fermentveis pela bactria Z.
mobilis nativa, buscamos pela construo de uma linhagem recombinante
deste microrganismo, atravs da incorporao de genes responsveis pela
metabolizao da xilose, acar mais abundante da frao hemicelulsica do
bagao de cana-de-acar.
5.2.1. Etapa ps-transformao
Aps a alterao gentica do microrganismo Z. mobilis notou-se que o
mesmo apresentou crescimento em glicose (20 g/L) adicionada ao meio RM,
incluindo 10 mg/L de tetraciclina, conforme se observa na figura 5.18.
A linhagem naturalmente ocorrente apresentou crescimento
praticamente nulo, diferentemente das linhagens geneticamente modificadas,
ORI e ORI ZYMO, que apresentaram crescimento de diversas colnias,
mostrando estarem devidamente transformadas para a resistncia
tetraciclina. Uma vez que o gene de resistncia ao antibitico est associado
ao gene de metabolizao da xilose, a linhagem ORI ZYMO aparentemente
tambm seria modificada de forma simultnea, conforme observado nos
prximos experimentos.

Figura 5.18. Crescimento de diferentes linhagens de Z. mobilis aps 168 h de
crescimento frente utilizao de meio RMG, contendo glicose (20 g/L),
KH
2
PO
4
(2 g/L), extrato de levedura (10 g/L), gar (20 g/L) e tetraciclina (10
mg/L), na temperatura de 30
C. (A) Z. mobilis naturalmente ocorrente; (B) ORI:

bactria cujo plasmdeo contm apenas o gene de resistncia ao antibitico;
(C) ORI ZYMO: bactria cujo plasmdeo contm o gene de resistncia ao
antibitico, assim como o gene da metabolizao de xilose.

150
5.2.2. Adaptao Metablica em meio sinttico
Yanase et al. (2007) j haviam afirmado sobre a necessidade de
aclimataes sucessivas na espcie recombinante Zymobarcter palmae no que
se refere a maiores rendimentos em etanol. Aps tal procedimento, os autores
obtiveram aumento de 91% a 95% na eficincia da produo de etanol, bem
como reduo de 5 a 8 horas de processo, quando as clulas eram crescidas
em xilose. Contudo, utilizando misturas de glicose e xilose, os resultados no
apresentaram alteraes significativas. Visando otimizar a metabolizao desta
pentose, buscando pela reduo da produo de xilitol, Zhang et al. (2002) e
Viitanem et al. (2008) constataram que as linhagens de Zymomonas mobilis,
transformadas geneticamente, necessitam de um processo de adaptao para
posterior converso da pentose.
A produo de 90 g/L de etanol, alcanada por Agrawal et al. (2011) foi
obtida aps a aplicao do processo de adaptao metablica, durante 80 dias,
atravs de 30 ciclos de aclimataes. As primeiras colnias foram crescidas no
meio RMGX e, posteriormente, os autores realizaram um aumento gradual da
concentrao da pentose. Posteriormente, as culturas selecionadas
apresentaram maiores valores de atividade da enzima xilose isomerase, a qual
promoveu maior converso a etanol e menor produo de xilitol pela pentose;
todavia, a atividade de XI ainda se apresentou baixa quando comparada s
outras trs enzimas, XK, TAL, TKL. Adicionalmente, as colnias adaptadas e
as originais foram sequenciadas, porm nenhuma diferena gentica pde ser
comprovada. Os autores relataram sobre uma possvel mutao envolvendo a
transcrio de XI das duas culturas. No entanto, tal fato no foi confirmado
atravs da tcnica de SDS-PAGE, devido aos baixos nveis enzimticos.
Dessa forma, os primeiros ciclos adaptativos desenvolvidos no presente
trabalho continham glicose em altas concentraes e baixas concentraes de
xilose; na medida em que os repiques eram realizados, as concentraes de
glicose eram reduzidas e as de xilose eram elevadas (Tabela 5.16). Conforme
relatado anteriormente, imediatamente aps a transformao gentica, o
microrganismo apresentava crescimento lento, em cerca de 170 horas, quando
comparado com os resultados desenvolvidos pela linhagem nativa, que cresciam

151
e fermentavam em at 48 horas. Aps o 20
o
ciclo de repiques, o tempo de
crescimento bacteriano reduziu para cerca de 72 horas, aumentando lentamente
o consumo de xilose e acelerando o crescimento celular.
Tabela 5.16. Processo de adaptao metablica mediante 50 ciclos, variando
as concentraes de glicose e xilose em meio sinttico.
Ciclos
Tempo
(Dias)
Glicose inicial
(g/L)
Xilose inicial
(g/L)
Etanol*
(g/L)
Biomassa*
(g/L)
1-10 70 15 5 2,3 0,05
11-19 30 10 10 4,1 0,08
20-25 20 7,5 13,5 3,9 0,100
26-30 15 5 15 4,6 0,166
31-40 15 2,5 17,5 4,1 0,159
41-50 10 1,5 18,5 4,2 0,158
*Ao final do ltimo ciclo.
A fase exponencial celular se estendeu aps o 25
o
ciclo, atingindo 0,17 g/L
em cerca de 70 horas, nas concentraes de 15 g/L de xilose e 5 g/L de glicose,
adicionados do meio RM lquido. Por outro lado, as culturas dos primeiros ciclos
adaptativos atingiram valores de 0,05 g/L de clulas, durante 96 horas, nas
mesmas condies de processo, adicionadas de 15 g/L de glicose e 5 g/L de
xilose, concentraes favorveis ao crescimento. Portanto, apesar de serem
necessrias melhorias na fermentao por Zymomonas mobilis geneticamente
modificada, o tempo de fermentao, assim como a tolerncia pentose foram
alterados.
Adicionalmente, a tabela 5.17 compara as variveis de resposta deste
processo, avaliando diferentes etapas da adaptao metablica em meio
sinttico. Atravs destes clculos foi confirmado que essa tcnica tende a
promover melhores resultados de crescimento bacteriano, produo de etanol e
produtividade volumtrica, indicando que as colnias adaptadas (ciclo 40 a 50)
obtiveram em torno de duas vezes os valores alcanado nos primeiros ciclos (1
ao 10), em 0,05 g/L e 0,158 g/L de crescimento bacteriano; 2,3 g/L e 4,2 g/L de
produo de etanol; assim como 0,02 g/L.h e 0,04 g/L.h de produtividade
volumtrica para as colnias dos ciclos 1 a 10 e dos ciclos 40 a 50,
respectivamente.

152
Tabela 5.17. Comparao das variveis de resposta entre diferentes etapas de
adaptao metablica.
Variveis medidas e calculadas Ciclo 1-10 Ciclo 40- 50
Etanol (g/L)* 2,3 4,2
Clulas (g/L)* 0,05 0,158
Produtividade (g/L.h)* 0,02 0,04
*Ao final do ltimo ciclo
A figura 5.19 sumariza o processo de adaptao metablica em meio
sinttico, indicando que as colnias de Z. mobilis recombinante aumentaram os
nveis de produo de etanol nos ciclos iniciais (1-30), porm mantiveram tais
nveis nos ciclos posteriores (31-50). Entretanto, cabe ressaltar que a tcnica
aplicada nesta linhagem necessita de adaptaes posteriores, no intui to de
reduzir integralmente as concentraes de glicose e aumentar a de xilose,
reduzindo o tempo de crescimento e de fermentao do microrganismo em
questo.

Figura 5.19. Histograma representando os 50 ciclos de adaptao metablica,
empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis em meio sinttico.

153
5.2.3. Ensaios preliminares avaliando o consumo de glicose e xilose em
meio sinttico por Z. mobilis geneticamente modificada
I. Planejamento Experimental
O intuito desta srie experimental foi promover maior crescimento de
biomassa, portanto, os experimentos foram desenvolvidos em cultivo
estacionrio (sem agitao), assim como em baixas concentraes de
substrato. Dessa forma, foi desenvolvido um planejamento experimental de
superfcie de resposta avaliando a produo de etanol e o crescimento de
biomassa frente ao consumo de glicose e xilose em diferentes concentraes.
Os ensaios foram realizados aps a execuo de 10 ciclos de adaptao
metablica e os resultados esto apresentados na tabela 5.18. Adicionalmente,
a tabela 5.19 indica outras condies empregadas de concentraes destes
acares, baseados nos estudos de Agrawal et al. (2011).
Aparentemente, nota-se que tal microrganismo utiliza os acares, em
sua maior proporo para o crescimento celular, atingindo 0,180 g/L. A maior
produo de etanol (7,5 g/L) ocorreu no experimento 13, a partir de 20 g/L de
glicose, 20 g/L de xilose, 2 g/L de KH
2
PO
4
, 10 g/L de extrato de levedura, e 10
mg/L de tetraciclina, no perodo de 72 horas. Cabe ressaltar que todos os
experimentos apresentaram consumo de xilose e glicose, assim como
produo de etanol e crescimento de biomassa; exceto o experimento 7
(Tabelas 5.18 e 5.19), cujo substrato era apenas a xilose e os nutrientes
complementares do meio RM. A dificuldade de crescimento exclusivamente em
xilose foi tambm relatada por Agrawal et al. (2011), sendo relacionada ao
deficiente transporte deste acar por Z. mobilis, dentre outras justificativas
relatadas na Reviso Bibliogrfica.
Observa-se em todos os experimentos desenvolvidos, exceto no
experimento 3 da tabela 5.19, a presena de elevadas concentraes de xilose
residual, variando de 70 a 60% em relao concentrao inicial. Jeon et al.
(2002), Yanase et al. (2007), Zhang & Lynd (2010), Davis et al. (2005) e
Joachimsthal et al. (1999) tambm reportaram a presena de xilose residual no
processo de converso de pentoses a etanol, em 21 g/L, 20 g/L, 2,5 g/L, 2,6

154
g/L,12 g/L, respectivamente. Adicionalmente, Lawford & Rousseau (2002)
reportam que apenas 50% da xilose foi consumida em meio com concentrao
inicial de 30 g/L desta pentose (DIEN & COTTA, 2003).
Neste contexto, os experimentos empregando glicose e xilose em
concentraes variando de 0 a 20 g/L de cada acar pela linhagem
recombinante, comparativamente aos experimentos empregando apenas a
frao da glicose pela linhagem naturalmente ocorrente CP4 (item 5.1.1),
constatando-se diferenas significativas no crescimento celular e na
produtividade volumtrica de etanol, respectivamente, em 0,43 g/L e 0,33 g/L.h
para a linhagem nativa, assim como 0,180 g/L e 0,107 g/L.h para a linhagem
recombinante. Leksawasdi et al. (2001) j haviam reportado que a limitao
pelo substrato para o crescimento de biomassa cerca de 3 vezes maior para
o consumo de xilose do que para a glicose.
Tabela 5.18. Planejamento experimental preliminar avaliando diferentes
concentraes de glicose e xilose no meio RM frente produo de etanol e
crescimento de biomassa a partir de meio sinttico pela linhagem recombinante
de Zymomonas mobilis CP4, realizado aps a execuo de 10 ciclos de
adaptao metablica.

Ex.
Glicose (g/L) Xilose (g/L) Respostas
Inicial Final Inicial Final
Etanol
(g/L)
Biomassa
(g/L)
1 10,5 0,0 10,5 6,0 5,0 0,080
2 1,3 0,0 10,5 6,2 1,9 0,046
3 10,5 0,0 10,5 5,8 4,3 0,112
4 10,5 0,0 10,5 6,7 3,4 0,116
5 4,0 0,0 4,0 2,5 2,7 0,065
6 17,0 0,0 17,0 11,3 6,9 0,165
7 4,0 0,0 17,0 10,8 2,5 0,073
8 10,5 0,0 19,7 13,2 3,6 0,062
9 10,5 0,0 10,5 6,9 4,9 0,123
10 17,0 0,0 4,0 2,7 6,8 0,166
11 10,5 0,0 1,3 1,0 5,4 0,127
12 10,5 0,0 10,5 9,2 3,8 0,102
13 19,7 0,0 10,5 7,5 8,6 0,090


155
Tabela 5.19. Avaliao de diferentes concentraes de glicose e xilose na
produo de etanol a partir de meio sinttico pela linhagem recombinante de
Zymomonas mobilis CP4, aps a execuo de 10 ciclos de adaptao
metablica.

Ex.
Inicial Final Inicial Final
Etanol
(g/L)
Biomassa
(g/L)
1 1,0 0,0 20,0 13,5 1,7 0,044
2 2,5 0,0 20,0 13,5 2,3 0,064
3 5,0 0,0 20,0 0,1 2,1 0,096
4 10,0 0,0 20,0 13,7 4,6 0,133
5 15,0 0,0 20,0 12,6 3,4 0,155
6 20,0 0,0 20,0 11,6 7,5 0,180
7 0,0 0,0 20,6 20,6 0,0 0,044
O baixo rendimento em etanol a partir de misturas de glicose e xilose,
conforme descrito na Reviso Bibliogrfica, pode ser justificado pela posterior
metabolizao da pentose frente hexose, gerando maiores concentraes de
inibidores nesta etapa, como o etanol e cido ltico, reduzindo a taxa de
utilizao da pentose (LEKSAWASDI et al., 2001). Outra justificativa est
relacionada competio pela nica via de transporte de acares, causando
lentido do processo, havendo uma represso do consumo de xilose pela
glicose (DiMARCO & ROMANO, 1985; PARKER et al., 1995; ROGERS &
LAWFORD, 1999; LAWFORD et al., 2000; LEKSAWASDI et al., 2001;
MOHAGHEGHI et al., 2002; KIM et al., 2010).
De acordo com a anlise de varincia (Tabela 5.20) nota-se que o
modelo linear foi significativo, apresentando um ajuste adequado aos
resultados experimentais para este tipo de planejamento, com um coeficiente
de correlao R
2
de 0,9069; um baixo erro puro (mdia quadrtica de 0,48) e,
uma falta de ajuste (mdia quadrtica de 0,39) sem significncia para o
intervalo de confiana de 90% (p-level < 0,1).
equao (7).
[Etanol] =+1,32556 +0,36200A-0,050877B (7)


156
Tabela 5.20. Anlise de Varincia da concentrao de etanol a partir de
diferentes concentraes de glicose e xilose pela linhagem recombinante de Z.
mobilis CP4, aps a execuo de 10 ciclos de adaptao metablica.
Modelo 41,26 2 20,63 48,70 <0,0001
A 40,39 1 40,39 95,33 <0,0001
B 0,87 1 0,87 2,07 0,1812
Resduo 4,24 10 0,42
Lack of Fit 2,33 6 0,39 0,81 0,6093
Erro Puro 1,91 4 0,48
Cor. Total 45,50 12
Onde: A=glicose; B=xilose; SQ= soma dos quadrados; GL= grau de
liberdade; MQ= mdia quadrtica.
A glicose apresentou maior efeito do que outra varivel independente, a
xilose, sendo pouco significativa para o modelo. Adicionalmente, a figura 5.20
mostra a superfcie de contorno, que representa as equaes ajustadas para
concentrao final de etanol a partir de xilose e glicose. Pode-se observar que
maiores concentraes de glicose, assim como menores concentraes de
xilose contribuem para o aumento da produo de etanol.

Figura 5.20. Superfcie de contorno avaliando efeitos combinados entre a
glicose e a xilose sobre a produo de etanol por Z. mobilis recombinante,
aps a execuo de 10 ciclos de adaptao metablica.

157
II. Comparao do desempenho de diferentes clones
Aps o 20
o
ciclo de adaptao foram realizados ensaios em frascos
agitados, a 150 rpm e temperatura de 30
C, nas melhores condies do

planejamento anterior: 20 g/L de glicose, 20 g/L de xilose, adicionados do meio
RM, conforme observa-se na tabela 5.21.
Tabela 5.21. Avaliaes de diferentes clones frente ao consumo de glicose e
xilose provenientes no meio RMGX, assim como produo de etanol por
Zymomonas mobilis recombinante, aps o 20
o
ciclo de adaptao metablica.
A figura 5.21 representa a cintica de crescimento das colnias,
consumo de substratos e produto obtido, indicando que a pentose foi
metabolizada em cerca de 72 horas.
Nota-se que os clones se comportaram de forma semelhante,
apresentando cerca de 35% de consumo de xilose, consumo completo de
glicose, mdia de 0,16 g/L

de crescimento de biomassa e cerca de 4 g/L de
etanol. Os grficos observados apontam para a grande necessidade de
contnuas adaptaes metablicas visando obteno de resultados mais
promissores, assim como relatado por Jeon et al. (2002), indicando que o
crescimento inicial das colnias ocorria em at 5 dias, sendo reduzido aps
repiques sucessivos. Adicionalmente, o etanol pode estar sendo consumido
para a manuteno das clulas, aps a saturao do consumo da glicose.
Apesar de Kim et al. (2010) terem reportado que apenas 10% da xilose
foi consumida na presena de glicose em concentrao equimolar, os melhores
resultados obtidos neste trabalho foram alcanados nestas condies,
semelhante ao relatado por Zhang et al. (1995), que utilizaram 2,5% (m/v) dos
dois carboidratos.
Inicial Final Inicial Final Etanol (g/L) Biomassa (g/L)
20,0 0,0 20,0 12,99
3,25
0,158
20,0 0,0 20,0 13,25
4,80
0,136
20,0 0,0 20,0 13,33
3,66
0,193
20,0 0,0 20,0 13,70
4,93
0,153

158

Figura 5.21. Cintica comparativa de diferentes clones de Z. mobilis recombinante,
selecionados aps crescimento em meio RMGX durante 72 horas, em 30
C de
temperatura e agitao de 150 rpm, aps o 20
o
ciclo de adaptao metablica.

5.2.4. Produo de etanol atravs do processo SSCF por Zymomonas
mobilis recombinante
I. Adaptao metablica em meio SSCF
Conforme sinalizado na Reviso Bibliogrfica, Zaldivar et al. (1999) e
Song et al. (2005) relataram que a presena de compostos inibitrios presentes
no hidrolisado hemicelulsico, em concentraes elevadas, provocam
modificaes morfolgicas nas clulas de Z. mobilis, tornando-se
arredondadas, cilndricas e translcidas. Delgenes et al. (1996) indicaram que
na presena de 2 g/L de furfural, o crescimento e a produo de etanol por tal
microrganismo foi inibido em at 64 e 44%, respectivamente. Lawford &
Rousseau (2002) apontaram para a inibio atravs da adio de 2,5 g/L de
cido actico, em pH 5,5, reportando tambm que apenas 50% da xilose foi
consumida, a qual possua a concentrao de 30 g/L (DIEN et al., 2003).

159
Desta forma, estudos desenvolvidos por Lawford et al. (2002) sugerem
uma adaptao gradual ao cido actico por Z. mobilis, assim como descrito
por Song et al. (2005), indicando que aps longo perodo de crescimento na
presena destes compostos, as clulas adaptadas apresentam modificaes
em sua superfcie, tornando-se mais alongadas, dentre outras caractersticas.
Tais alteraes morfolgicas no foram detectadas no presente trabalho, no
entanto, ao longo de alguns ciclos adaptativos notou-se que a linhagem
transformada de Z. mobilis apresentou melhor performance quanto produo
de etanol e crescimento celular frente ao hidrolisado cido (Tabela 5.22).
Nos ciclos de 1 a 5, o microrganismo apresentava baixa produo de
biomassa (0,086 g/L), assim como lentido de crescimento, uma vez que foi
utilizado o meio complementar RM, contendo 20 g/L de glicose, adicionado de
2,5% v/v de hidrolisado hemicelulsico. Quando comparado aos resultados das
colnias adaptadas (ciclo 21-25), a concentrao de clulas foi ligeiramente
superior, em 0,117 g/L, no entanto, o hidrolisado hemicelulsico apresentava-
se em uma maior concentrao no ltimo ciclo, em 20% v/v.
fermentativos, variando as concentraes de hidrolisado cido proveniente do
bagao de cana e mantendo a concentrao de glicose em 20 g/L, aps o 26
o

ciclo de adaptao metablica em meio sinttico.
Onde: H.H.=hidrolisado hemicelulsico; A.A.= cido actico.
Adicionalmente, a tabela 5.23 indica as variveis de resposta calculadas
comparando-se os primeiros e os ltimos ciclos, indicando que a tcnica de
adaptao metablica tende a promover melhores resultados de crescimento e
produo de etanol (5,2 g/L a 5,9 g/L), variando de diferentes propores de
hidrolisado hemicelulsico, de 2,5 a 20% v/v, respectivamente; contudo, a
produtividade volumtrica foi inferior, variando de 0,074 g/L.h e 0,0614 g/L.h.

Ciclos
Tempo
(Dias)
H.H.
(%) v/v
A.A.
(g/L)
HMF
(mg/L)
Furfural
(mg/L)
Etanol
(g/L)
Biomassa
(g/L)
1-5 14 2,5 0,28 1,3 13,2 5,2 0,086
6-10 20 5 0,53 16,0 27,6 4,8 0,137
11-15 25 10 0,92 9,4 54,1 5,3 0,139
16-20 20 15 1,2 13,2 83,3 4,7 0,107
21-25 20 20 2,1 15,6 108,7 5,9 0,117

160
Tabela 5.23. Comparao das variveis medidas e calculadas entre diferentes
etapas de adaptao metablica.
Variveis medidas e calculadas Ciclo 1-5 Ciclo 20-25
Etanol (g/L)* 5,2 5,9
Clulas (g/L)* 0,086 0,117
Produtividade (g/L.h)* 0,074 0,061
*Ao final do ltimo ciclo
Observa-se que alguns fatores, como a inibio por compostos
presentes no hidrolisado e o tempo de crescimento foram superados; no
obstante, so necessrias melhorias na fermentao a partir do hidrolisado
cido, atravs da continuao dos ciclos adaptativos, visando elevar os nveis
de tolerncia dos inibidores, assim como os valores de produtividade
volumtrica.
II. Processo de propagao mediante diferentes estratgias de
aclimatao celular
Segundo Betancur et al. (2010), os microrganismos consomem o
substrato de forma mais eficiente quanto maior o grau de aclimatao, a
exemplo de processos de fermentao por Pichia stipitis a partir de hidrolisado
hemicelulsico. Portanto, mesmo que as clulas estejam previamente
adaptadas com a presena de inibidores, faz-se necessria a aclimatao
anteriormente ao inculo. No presente trabalho, foram desenvolvidas 4
diferentes estratgias, conforme descrito no item 4.4.2.2 (Captulo 4), cujos
resultados so apresentados na tabela 5.24.
Tabela 5.24. Crescimento celular em diferentes estratgias de aclimatao.
Estratgias
Tempo*
(Dias)
H.H.*
% (v/v)
A.A.*
(mg/L)
HMF*
(g/L)
Furfural*
(mg/L)
Biomassa*
(g/L)
A 5 10 0,85 7,0 52,7 0,058
B 3 10 0,91 9,6 47,2 0,145
C 2 20 1,88 17,8 97,1 0,109
D 2 20 1,96 20,4 101,3 0,129
E 2 20 2,06 17,5 105,6 0,115
Onde: H.H.= hidrolisado hemicelulsico; A.A.= cido actico; A=sem aclimatao;
B=aclimatao de 5% a 10% v/v de H.H.; C= aclimatao de 5% a 20%v/v de H.H.;
D=aclimatao inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagao em H.H., 10% v/v e
posterior centrifugao; E=aclimatao inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagao em
H.H., 20% v/v, e posterior centrifugao. *Valores referentes ltima etapa de
propagao.
O processo de aclimatao empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado
hemicelulsico adicionado do meio RMG apresentou o melhor resultado, com

161
uma concentrao celular de 0,09 g/L, superior aos valores encontrados para
uma nica etapa de aclimatao celular (0,03 g/L) ou mesmo atravs de
centrifugao empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado (D), assim como de
5% a 20% v/v de hidrolisado (D), promovendo 0,08 e 0,07 g/L. Dessa forma,
pode-se concluir que a incluso de duas etapas de aclimatao, de 5% v/v a
10% v/v de hidrolisado hemicelulsico (B), apresentaram efeito positivo sobre a
produo de biomassa, sendo a condio escolhida para propagao celular
nos experimentos futuros.
III. Avaliao da produo de etanol a partir do processo SSCF atravs
de planejamentos experimentais sequenciais
Foram desenvolvidos dois Planejamentos Sequenciais de Superfcie de
Resposta 2
2
, avaliando a concentrao de slidos do bagao de cana pr-
tratado (g:mL), assim como a proporo de hidrolisado hemicelulsico no
processo SSCF, atingindo a maior produo de etanol em 25,04 g/L, a partir de
2,21:10 g:mL e 20% v/v, respectivamente, no primeiro Planejamento (Tabela
5.25).
Tabela 5.25. Primeiro Planejamento 2
2
hemicelulsico (%), bem como a relao slido:lquido (g:mL) do bagao de cana-
de-acar pr-tratado atravs do processo SSCF 1 para a produo de etanol
pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, aps o 25
o
ciclo de
adaptao metablica em meio sinttico.

Ex.
Variveis independentes Condies Resposta
H. H. (%) S:L (g:mL) Glicose inicial(g/L) Xilose inicial(g/L) Etanol (g/L)
1 45,00 2,21:10 67,3 24,5 7,5
2 20,00 2,0: 10 57,4 9,6 25,0
3 80,36 1,5: 10 38,9 61,1 0,0
4 70,00 2,0: 10 61,4 53,6 0,0
5 9,64 1,5: 10 36,5 5,3 7,4
6 45,00 1,5: 10 33,8 27,9 11,0
7 45,00 1,5: 10 39,2 30,1 2,2
8 45,00 1,5: 10 36,1 32,0 2,2
9 70,00 1,0: 10 25,0 51,7 1,5
10 45,00 1,5: 10 34,6 33,3 4,3
11 20,00 1,0: 10 23,3 10,1 7,6
12 45,00 0,79: 10 14,9 40,5 3,3
13 45,00 1,5: 10 37,5 35,0 4,0
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulsico; S:L= relao slido:lquido.

Cabe ressaltar que no experimento 6 houve a segunda maior produo
de etanol, em 10 g/L, sob a presena do hidrolisado hemicelulsico (varivel A)

162
em seu nvel mdio. Todavia, nota-se que os outros experimentos que
possuam propores deste licor acima de 45% v/v apresentaram baixa
produo de etanol, o que nos remete a uma inibio pela presena de HMF,
furfural e cido actico.
Posteriormente, foi desenvolvido outro Planejamento Experimental
avaliando os mesmos parmetros, porm em propores inferiores para a
varivel A (hidrolisado) e superiores para a varivel B (relao slido:lquido).
Observa-se, na tabela 5.26, que a maior concentrao de etanol alcanada foi
de 27,32 g/L, nas seguintes condies: 2,99:10 de bagao de cana pr-tratado
(g:mL), assim como a proporo de hidrolisado hemicelulsico de 20% v/v.
Quando a concentrao de slidos mantinha-se baixa, associadamente ao
percentual de hidrolisado cido, as concentraes de etanol eram reduzidas,
como exemplo do experimento 10, contudo, nas condies contrrias
(experimento 6) foram alcanados 24 g/L.
Tabela 5.26. Segundo Planejamento 2
2
hemicelulsico (%), bem como a relao slido:lquido (g:mL) do bagao de cana-
de-acar pr-tratado atravs do processo SSCF 2 para a produo de etanol pela
linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, aps o 25
o
ciclo de adaptao
metablica em meio sinttico.

Ex.
Variveis independentes Condies Resposta
H. H. (%) S:L (g:mL) Glicose inicial (g/L) Xilose inicial (g/L) Etanol (g/L)
1 20,50 2,0:10 59,3 12,5 18,2
2 6,50 1,3:10 34,0 5,1 1,6
3 20,50 2,99:10 48,9 11,0 27,3
4 34,50 1,3:10 36,1 18,7 5,1
5 20,50 2,0:10 57,8 14,2 15,2
6 0,70 2,0:10 62,6 0,6 24,0
7 40,30 2,0:10 65,2 23,4 5,70
8 20,50 2,0:10 63,7 8,0 15,6
9 6,50 2,7:10 51,3 3,9 23,3
10 20,50 1,0:10 23,5 7,7 4,5
11 34,50 2,7:10 73,0 21,3 5,2
12 20,50 2,0:10 62,1 8,2 17,0
13 20,50 2,0:10 60,4 12,6 8,8
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulsico; S:L= relao slido:lquido.
De acordo com a anlise de varincia do Planejamento SSCF 1 e do
Planejamento SSCF 2 (Tabelas 5.27 e 5.28) nota-se que o modelo linear (2FI:
two-factor interactions) e o modelo quadrtico, respectivamente, apresentaram
um ajuste adequado aos resultados experimentais, com um coeficiente de

163
correlao R
2
de 0,7 e 0,8; sendo o erro puro e a falta de ajuste insignificantes
para o intervalo de confiana de 90%.
primeiro Planejamento Experimental do processo SSCF1 a partir do bagao-
de-cana por Z. mobilis recombinante.
Modelo 366,91 3 122,30 6,76 0,0111
A 217,04 1 217,04 12,00 0,0071
B 60,22 1 60,22 3,33 0,1013
AB 89,66 1 89,66 4,96 0,0530
Resduo 162,73 9 18,08
Lack of Fit 109,96 5 21,99 1,67 0,3204
Erro Puro 52,77 4 13,19

segundo Planejamento Experimental do processo SSCF2 a partir do bagao-
de-cana por Z. mobilis recombinante.
Modelo 700,29 5 140,06 5,71 0,0205
A 201,31 1 201,31 8,20 0,0242
B 360,93 1 360,93 14,71 0,0064
AB 114,43 1 114,43 4,66 0,0677
A
2
18,21 1 18,21 0,74 0,4175
B
2
8,19 1 8,19 0,33 0,5817
Resduo 171,80 7 24,54
Lack of Fit 120,36 3 40,12 3,12 0,1502
Erro Puro 51,43 4 12,86
Onde: A= hidrolisado hemicelulsico, B= relao slido:lquido; SQ=
Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Mdia Quadrtica.
Os modelos do processo SSCF1 e SSCF2 so representados pelas
equaes (8) e (9), respectivamente:
[Etanol]: +5,84 - 5,21A + 2,74B - 4,73AB (8)
[Etanol]: +14,96 - 5,06A + 6,75B- 1,70A
2
1,17 B
2
5,42 AB (9)
Os modelos foram significativos, sendo que para o SSCF 1, o parmetro
A (hidrolisado hemicelulsico) apresentou maior influncia na concentrao
final de etanol, seguido da interao AB e do parmetro B (relao

164
slido:lquido). Segundo o modelo referente ao SSCF 2, o parmetro B (relao
slido:lquido) foi o mais influente, seguido do parmetro A (hidrolisado
hemicelulsico); somado a isso, as combinaes que apresentaram maior
influncia foram entre AB, seguido de A
2
e B
2
.
Adicionalmente, a figura 5.22 mostra a superfcie de contorno, avaliando
o percentual de hidrolisado hemicelulsico (%), bem como a relao
slido:lquido (g:mL) do bagao de cana-de-acar pr-tratado atravs do
processo SSCF 1, no que tange produo de etanol pela linhagem
recombinante de Zymomonas mobilis CP4. Observa-se que o grfico aponta
para a reduo do parmetro A (hidrolisado hemicelulsico) e ao aumento das
concentraes do parmetro B (relao slido:lquido), sendo necessria a
execuo de outro planejamento para que os experimentos sejam otimizados.

parmetros sobre a produo de etanol a partir do primeiro Planejamento
Experimental referente ao processo SSCF 1 pela linhagem recombinante de
Zymomonas mobilis.

165
Desta forma, aps execuo do segundo Planejamento, a figura 5.23
mostra a superfcie de contorno avaliando o hidrolisado hemicelulsico (%) v/v,
bem como a relao slido:lquido (g:mL); os mesmos parmetros utilizados no
Planejamento anterior, embora em maiores concentraes de slidos e
menores propores de hidrolisado cido. Segundo o grfico de contorno, a
regio tima (em vermelho) foi alcanada atravs destes experimentos,
alcanando a maior produo de etanol em cerca de 25 g/L, valor prximo ao
mximo atingido experimentalmente, que ocorreu em 27 g/L.

parmetros sobre a produo de etanol a partir do segundo Planejamento
referente ao processo SSCF 2 pela linhagem recombinante de Z. mobilis.
A reproduo da condio tima do segundo Planejamento referente ao
processo de hidrlise enzimtica e co-fermentao simultneas por
Zymomonas mobilis recombinante ocorreu em biorreator instrumento, na
temperatura de 30C, 150 rpm de agitao, pH 5, durante 52 horas totais;
resultando na mxima concentrao de etanol em 25,3 g/L e produtividade
volumtrica de 0,63 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulsico

166
e 2,99:10 (g:mL) da relao slido:lquido do bagao de cana de acar pr-
tratado (Figura 5.24). Constatou-se que a glicose foi inicialmente metabolizada,
seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%, havendo desvio da
via metablica para a produo de xilitol. Viitanem et al. (2008) tambm
relataram sobre a problemtica da formao deste subproduto, assim como
lentido do processo SSCF, constatando que 30 g/L desta pentose foi
consumida durante o perodo de 50 h. Conforme detalhado na Reviso
Bibliogrfica, o xilitol produzido atravs de aldose redutases inespecficas,
presente no citoplasma de Zymomonas mobilis, entretanto pouco se sabe as
causas do desvio da via metablica. J segundo Zhang & Chen (2009), a
enzima periplasmtica GFOR, responsvel pela produo de sorbitol , catalisa
tambm tal reao juntamente com o cofator NADPH.

Figura 5.24. Processo SSCF 2 a partir de bagao de cana pr-tratado por Z.
mobilis geneticamente modificada em biorreator instrumentado, empregando
20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulsico e 2,99:10 (g:mL) de relao
slido:lquido. P.H.= pr-hidrlise enzimtica, SSCF: co-fermentao e
sacarificao simultneas.
P.H. SSCF

167
A tabela 5.29 representa a evoluo dos ensaios de fermentao
empregando a linhagem recombinante atravs de planejamentos sequenciais.
Inicialmente, em meio sinttico, a produo de etanol foi 7,5 g/L e produtividade
volumtrica correspondente de 0,180 g/L.h. Nos planejamentos sequenciais
avaliando o processo SSCF foram produzidos 25 g/L e 0,347 g/L.h (primeiro
planejamento), assim como 27 g/L e 0,683 g/L.h (segundo planejamento) de
produo de etanol e produtividade volumtrica, respectivamente.
Tabela 5.29. Evoluo dos resultados obtidos pela linhagem recombinante de
Z.mobilis a partir da fermentao em meio sinttico e do processo SSCF com
bagao de cana pr-tratado.
Experimentos
Condies Valores mximos
S
o
(g/L) t
f
(h) X
o
(%) v/v P (g/L) Q
P
(g/L.h)
Ensaios prvios
1. RMGX
20 g/L gli
20 g/L xil
70 10 7,5 0,107
Bagao de cana-de-acar
2. SSCF 1
57 g/L gli
9 g/L xil
72 10 25 0,347
3. SSCF 2
22 g/L gli
6,4 g/L xil
40 10 27 0,683
Onde: S
0
: concentrao inicial de glicose; t
f
(h): tempo de fermentao; X
o
:
concentrao inicial de clulas; P: concentrao final de etanol; Qp: produtividade
volumtrica; RMG: Meio contendo glicose (20 g/L), xilose (20 g/L), extrato de levedura
(10 g/L), KH
2
PO
4
(2 g/L) e tetraciclina (10 mg/L); SSCF: hidrlise enzimtica e co-
fermentao simultneas; xil: xilose inicial; gli: glicose inicial. 1. Avaliao do consumo
de glicose e xilose em meio sinttico por Z. mobilis geneticamente modificada; 2 e 3.
Avaliao da produo de etanol a partir do processo SSCF atravs de planejamentos
experimentais sequenciais.
Apesar dos resultados no se mostrarem to promissores quanto os
alcanados atravs da fermentao da glicose oriunda da frao celulsica
pelas linhagens naturalmente ocorrentes, atingindo 65 g/L de etanol, a bactria
recombinante apresenta melhores resultados na medida em que os ciclos de
adaptao metablica so efetuados. Cabe ressaltar que, conforme descrito na
Reviso Bibliogrfica, outros pesquisadores tambm constataram dificuldades
na fermentao a partir de pentoses, gerando xilose residual e baixas
concentraes de etanol, conforme descrito por Davis et al. (2005), que
atingiram 11 g/L deste biocombustvel, frente 6 g/L de glicose e 16 g/L de
xilose, e posterior adio de 10 g/L de glicose, gerando 12 g/L de xilose
residual, durante 11 horas de processo.

168
Segundo Kim et al. (2000), as clulas de Zymomonas mobilis
recombinantes que metabolizam a xilose demonstram lento e incompleto
consumo da mesma. As possveis causas relacionadas para tal deficincia
remetem ao microrganismo no possui transportador especfico para a xilose, o
que prejudica a sua metabolizao devido represso catablica pelo
monossacardeo preferencial, a glicose. Adicionalmente, estudos de
modelagem indicam que a captao de glicose e xilose ocorre em 65% e 35%,
respectivamente, quando estes carboidratos esto presentes na proporo de
1:1 (LEKSAWASDI et al., 2001). Jeon et al. (2005); Zhang & Chen (2009) e
Agrawal et al (2011) tambm afirmam que a maior problemtica da
fermentao de pentoses est relacionada produo e acumulao de xilitol,
mesmo em concentraes reduzidas, promovendo o desvio da via das
pentoses em linhagens recombinantes de Z. mobilis. Segundo Kim et al.
(2000), apenas 1 g/L de xilitol presente no meio pode provocar reduo de 50%
do crescimento de biomassa.
Agrawall et al. (2011) reportaram sobre a importncia da adaptao
metablica frente produo de etanol por Z. mobilis ZM4 (pZB5), visando
obteno de resultados mais promissores. Adicionalmente, tal linhagem tem
sido apontada como uma das mais indicadas para a metabolizao da xilose,
alm de possuir maior resistncia ao etanol, ao cido actico e furfural. Zhang
(2003) indicaram que a linhagem CP4, a qual produziu 24 g/L de etanol a partir
de 15 g/L de glicose e 35 g/L de xilose, no seria to eficiente quanto
linhagem 8b (ZHANG et al., 2010), a qual atingiu 40 g/L de etanol a partir de
resduo de papel, um dos motivos pelos quais os resultados da presente tese
podem no estar atingindo elevados nveis de etanol.
Neste contexto, as dificuldades de metabolizao de xilose pela
linhagem recombinante de Z. mobilis CP4, desenvolvida neste trabalho, podem
tambm estar relacionadas inibio do crescimento microbiano pela produo
de xilitol, uma vez que tal composto foi detectado nos ensaios de fermentao
do presente trabalho. Portanto, conforme indicado por diversos autores e
comprovado neste trabalho, os processos de adaptao metablica, assim
como otimizaes empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis devem

169
ser contnuos no que tange maximizao da produo de etanol e de
biomassa microbiana, assim como reduo da produo de xilitol.
5.3. CONSIDERAES GERAIS
Atravs de estudos realizados neste trabalho, assim como o
levantamento bibliogrfico de diversas pesquisas cientficas sobre a biologia
molecular e bioqumica do microrganismo Zymomonas mobilis, conclui-se que
a engenharia gentica e a metablica ainda apresentam-se como as melhores
e possivelmente as nicas alternativas para tornar esta bactria capaz de
fermentar a nveis industriais. No entanto, a tecnologia de fermentao a partir
de materiais lignocelulsicos ainda no superou alguns fatores inibitrios
responsveis pela reduo do rendimento do processo; dentre eles,
temperaturas elevadas, estresse osmtico, elevados nveis de etanol, bem
como a limitada gama de substratos fermentveis, juntamente com a
problemtica de metabolizao de pentoses.
Contudo, uma vez que a bactria Zymomonas mobilis desponta como
um dos microrganismos mais promissores para a produo de etanol, diversos
pesquisadores tentam contornar algumas dificuldades relacionadas
fermentao na presena de compostos inibitrios, dentre outros estresses
fisiolgicos. Neste contexto, o grupo de pesquisa NREL (EUA), o qual estuda
h cerca de duas dcadas a fermentao por Z. mobilis um dos pioneiros no
desenvolvimento e aprimoramento de diversas tecnologias utilizando tal
microrganismo. Buscando superar as dificuldades metablicas citadas
anteriormente, no intuito de que a fermentao por Z. mobilis atinja nveis cada
vez mais elevados, pesquisadores avaliam o emprego de diferentes linhagens,
o isolamento de diferentes colnias, assim como o aprimoramento das
tecnologias de adaptao metablica e engenharia gentica. Pesquisas
preliminares realizadas por Yang et al. (2010) avaliaram a adio do gene Hfq,
o qual coordena diversas respostas ao estresse fisiolgico de alguns
microrganismos. Zhou et al. (2011) avaliaram a integrao XI, XK, TAL, TKL no
genoma de Z. mobilis ZM-mtc9xt, obtendo resultados promissores, assim como
outros grupos de pesquisa apontaram para a otimizao do processo sem que

170
houvesse outra interveno gentica, atravs da utilizao do processo SSCF
empregando-se baixos nveis de carga enzimtica, conforme relatado por
Olofsson et al. (2010). No Brasil, estudos empregando tcnicas de biologia
molecular neste microrganismo so muito recentes. O centro de pesquisa
LADEBIO pioneiro nesta temtica, empregando tal bactria, transformando-a
e desenvolvendo otimizaes do processo de hidrlise enzimtica e co-
fermentao simultneas (SSCF) a partir de um resduo agro-industrial, o
bagao de cana-de-acar. Desta forma, almeja-se que em um futuro prximo
se possam empregar recursos renovveis no que tange bioconverso de
acares a etanol por tal microrganismo.
Sumariamente, o objetivo e o desenho experimental adotado para a
execuo do presente trabalho, pautaram-se, fundamentalmente, no
desenvolvimento de tecnologias para a otimizao da produo de etanol a
partir de resduos lignocelulsicos, mediante o uso de linhagens nativas (AG11
e CP4), atravs do processo SSF e da linhagem recombinante CP4, a qual
capaz de fermentar a xilose e a glicose simultaneamente, atravs do processo
SSCF. Baseado no teste de fermentabilidade empregando as linhagens nativas
de Z. mobilis, realizado com o bagao de cana-de-acar e com resduos da
indstria de celulose, conclui-se que estas matrias-primas apresentaram
significativos potenciais para a produo de etanol 2G, sendo facilmente
fermentados. Constatou-se, portanto, que a celulose constitui uma excelente
fonte de carboidratos para a execuo do processo de hidrlise enzimtica e
fermentao simultneas por Zymomonas mobilis, que se apresentou
promissora para a produo deste biocombustvel, em virtude de sua elevada
capacidade de absoro de glicose, altas taxas especficas de produo de
etanol, resultando em altos valores de produtividade. Os resultados alcanados
com o presente trabalho foram satisfatrios, no entanto, so necessrias
continuaes no que tange elaborao de novas estratgias para que as
questes inibitrias e insatisfatrias colocadas ao longo do texto sejam
contornadas, assim como o desenvolvimento de tcnicas de biologia molecular
para a comprovao da transformao gentica, gerando oportunidades para
futuros e interessantes desenvolvimentos tecnolgicos.
CAPTULO 6: Concluses e Sugestes

171

_____________________CAPTULO 6
CONCLUSES

6.1. CONCLUSES
Aps anlise da capacidade de utilizao de glicose em meio sinttico
pelas linhagens de Z. mobilis AG11 e CP4, observou-se que o substrato foi
consumido eficientemente em um perodo de 15 e 18 horas,
respectivamente. No tocante ao consumo de xilose, foi constatada a
incapacidade de ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose.
Atravs de tcnicas de planejamento experimental foi possvel constatar
que o uso do tampo-citrato (1M, pH 5, 50% v/v) adicionado celulignina
de bagao de cana pr-tratada alcalinamente, influenciou negativamente a
produo de etanol pelas linhagens de Zymomonas mobilis. Neste
planejamento, as linhagens de Z.mobilis AG11 e CP4 atingiram
concentraes de etanol de 25 e 34 g/L, correspondendo a valores de
produtividade volumtrica de 1,04 e 1,25 g/L.h, respectivamente. Tendo em
vista que os melhores resultados foram alcanados com a linhagem CP4,
os estudos posteriores foram realizados com esta linhagem.
Foi construdo um novo planejamento experimental, otimizando-se a
concentrao de glicose inicial do SSF, a produo etanol e a
produtividade volumtrica do processo SSF com bagao de cana pr-
tratado. As melhores condies experimentais, apontadas pelo
planejamento experimental foram: relao slido:lquido de 3:10 (g:mL),

172
carga enzimtica de 25 FPU/g e concentrao inicial de clulas de 4 g/L.
As concentraes mximas atingidas foram de 76 g/L de glicose inicial, 60
g/L de etanol, e produtividade volumtrica de 1,52 g/L.h, na temperatura de
30C e velocidade de agitao de 150 rpm, em frascos agitados. A
validao em biorreator instrumentado resultou em uma concentrao de
etanol de 55 g/L, iniciando-se o processo SSF com a concentrao de
glicose de 80 g/L (aps etapa de pr-hidrlise enzimtica). O valor de
produtividade volumtrica atingido nesta escala foi de 2,29 g/L.h, em
temperatura de 30C, velocidade de agitao de 150 rpm e pH 5.
Atravs da execuo de um Planejamento Fatorial 2
4
foi possvel constatar
que os nutrientes analisados: KH
2
PO
4
(g/L), MgSO
4
.7H
2
O(g/L) e (NH
4
)
2
SO
4

e extrato de levedura (g/L), adicionados no processo SSF, promoveram
maiores concentraes de etanol quando estavam em seus maiores nveis:
1 g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. Posteriormente, foi
desenvolvido um Planejamento Experimental de Superfcie de Resposta,
aumentando-se a faixa de estudo dos nutrientes, alm da adio dos nveis
axiais. As condies timas foram: extrato de levedura (12,5 g/L), KH
2
PO
4

(2,5 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(1,5 g/L) e MgSO
4
(1,5 g/L), resultando na
concentrao mxima de etanol de 65 g/L, com 85 g/L de concentrao
inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumtrica de 2,70 g/L.h,
na temperatura de 30C, agitao orbital de 150 rpm, pH 5 em biorreator.
O resduo da indstria de celulose, PM2, foi avaliado quanto produo de
etanol a partir do processo SSF, sendo as condies timas as seguintes:
relao slido:lquido (2:10 g/mL), carga enzimtica (17,5 FPU/g) e
concentrao celular (1,59% v/v), resultando na mxima concentrao de
etanol em 58 g/L, a partir de 82 g/L de glicose inicial e produtividade
volumtrica de 2,76 g/L.h. As condies timas obtidas atravs da anlise
da adio de nutrientes no meio SSF para a produo de etanol a partir
dos resduos da indstria de celulose, foram: extrato de levedura (6,25 g/L),
KH
2
PO
4
(1,25 g/L), (NH
4
)
2
SO
4

(2,25 g/L) e MgSO
4
(2,25 g/L), resultando na
mxima concentrao de etanol de 54 g/L, a partir de 91 g/L de glicose

173
inicial e produtividade volumtrica de 3,6 g/L.h, em biorreator
instrumentado, na temperatura de 30C, 150 rpm de agitao e pH 5.
No que tange transformao gentica no microrganismo em estudo,
observou-se que aps tal procedimento, o mesmo apresentou crescimento
em meio RMG (20 g/L de glicose, 2 g/L de KH
2
PO
4
e 10 g/L de extrato de
levedura) adicionado de tetraciclina (10 mg/L). A adaptao metablica em
meio sinttico foi desenvolvida com o intuito de promover resultados mais
promissores de crescimento e produo de etanol. Este procedimento
constituiu de 50 ciclos nos quais aumentava progressivamente a
concentrao de xilose e reduzia-se proporcionalmente a de glicose. Aps
o 20
o
ciclo de repiques, o tempo de crescimento bacteriano reduziu para
cerca de 70 horas, aumentando lentamente o consumo de xilose e
acelerando o crescimento celular. Aps a realizao de 50 ciclos de
adaptao metablica, a bactria apresentou maiores valores de
crescimento de biomassa, produo de etanol e produtividade volumtrica,
indicando que as colnias adaptadas (ciclo 40 a 50) apresentaram melhor
desempenho do que aquelas cultivadas nos primeiros ciclos, com valores
destes parmetros aumentando no mnimo em 2 vezes. Atravs de
experimentos avaliando diferentes concentraes de glicose e xilose foram
alcanados 7,5 g/L de etanol aps 72 horas, a partir de 20 g/L de glicose,
20 g/L de xilose, em meio RMGX na temperatura de 30
o
C, sem agitao.
O processo de hidrlise enzimtica e co-fermentao simultneas foi
avaliado segundo Planejamentos Experimentais seqenciais 2
2
,
empregando a bactria Zymomonas mobilis recombinante, na temperatura
de 30C, 150 rpm de agitao, pH 5, durante 52 horas totais, resultando na
mxima concentrao de etanol de 25,3 g/L e produtividade volumtrica de
0,65 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulsico, 2,99:10
(g:mL) de relao slido:lquido de bagao de cana de acar pr-tratado,
em biorreator instrumento. Constatou-se que a glicose foi inicialmente
metabolizada, seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%,
havendo desvio da rota para a produo de xilitol.

174
6.2. SUGESTES
I. Processo SSF empregando a linhagem nativa de Z. mobilis
As concentraes timas de hidrolisado celulsico do bagao de cana,
bem como do resduo da indstria de celulose podem ser selecionadas para
alimentar um processo de fermentao contnuo ou em batelada alimentada.
Esta forma de conduo permitiria estender a fase exponencial de crescimento
e controlar os nveis de substrato, evitando assim, os efeitos repressores sobre
o metabolismo da bactria.
II. Processo SSCF empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis
Conforme descrito anteriormente, o mecanismo gnico de tal bactria
no regula corretamente a expresso dos genes inseridos. Visando contornar
esta problemtica, as sugestes abaixo visam superao dos resultados
obtidos pela linhagem recombinante de Z. mobilis desenvolvida no
LADEBIO/UFRJ, em colaborao com o Laboratrio de Biologia
Molecular/UnB.
Quantificar nveis enzimticos atravs de anlise qumica das atividades de
xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase;
Caracterizao das protenas heterlogas inseridas na linhagem parental,
atravs de Cromotografia Eletrofortica;
Sequenciar o DNA da linhagem recombinante, bem como da linhagem
nativa, com a finalidade de comprovar a insero dos genes no
microrganismo e de detectar possveis mutaes;
Desenvolver uma linhagem recombinante que possua, alm dos genes de
metabolizao da xilose, os genes que codificam o transporte especfico da
pentose;
Investigar a integrao cromossomal de genes responsveis pela
metabolizao de xilose e arabinose.

CAPTULO 8: Referncias Bibliogrficas 175


_____________________CAPTULO 7
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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