SITUACIN DE LA VALIDACIN DE LOS ENSAYOS MICROBIOLGICOS EN LOS LABORATORIOS. J. Laso Snchez1 1- Gabinete de Servicios para la Calidad (GSC).

C/Cocheras, 4 Portal G Bajo 4 28007 Madrid. Tlfno.: 915519252. Fax: 915018898. E-mail: gscsal@gscsal.com RESUMEN. El presente artculo, desea dar una panormica de la situacin actual de los laboratorios espaoles sobre la validacin interna de los mtodos microbiolgicos, haciendo hincapi en los problemas ms acuciantes presentados, as como las necesidades de herramientas futuras requeridas. 2.- Caractersticas de la medida microbiolgica La investigacin de la presencia/ausencia de microorganismos, el recuento de las unidades formadoras de colonias (ufc) en una cantidad determinada de muestra se basan fundamentalmente en: 1) Utilizacin de una serie de pasos en las que se utilizan medios de composicin qumica especfica y temperatura de incubacin que permiten seleccionar en funcin de sus caractersticas a unos microorganismos de otros, a travs de favorecer dificultar su crecimiento.
ETAPAS DE SELECCIN

1.- Introduccin La validacin es La confirmacin mediante examen y la aportacin de evidencias objetivas que demuestren el cumplimiento de ciertos requisitos para el uso especfico previsto. En el campo microbiolgico y debido a las caractersticas propias de los mtodos de ensayo, en general se haba optado por la utilizacin de mtodos publicados, para evitar el requisito de validacin. En algn caso esto produca dificultades, ya que los mtodos no eran seguidos estrictamente por ejemplo en cuanto a tolerancias de temperaturas, composiciones de medios. Por otro lado, la informacin existente sobre caractersticas de los mtodos, era escasa, y en el periodo 1990-2000, se empieza a poner de manifiesto, a travs de ejercicios de intercomparacin, que los resultados obtenidos pueden ser dependientes del mtodo utilizado. Con la publicacin de la norma ISO 17025 y la interpretacin de la misma realizada por los organismos de acreditacin, la validacin de los mtodos microbiolgicos, cobra un papel fundamental, ya que se solicita que se validen internamente tambin, aquellos mtodos que no tienen parmetros definidos, de modo que una vez obtenidos estos, puedan compararse con requisitos preestablecidos que demuestren su aptitud para uso. Esto hace que en los ltimos aos, proliferen publicaciones, cursos y artculos sobre este tema. De hecho en el ltimo periodo se procede a la publicacin de un importante nmero de normas ISO: ISO 13843, ISO 16140, ISO 17994. Sin embargo las normas publicadas adolecen de un problema de cara a la validacin prctica. Su objeto no es la validacin interna, sino la normalizacin de mtodos alternativos, la introduccin de nuevos medios de cultivo, por lo que los experimentos solicitados sobrepasan en nmero y capacidad de organizacin los recursos generalmente disponibles en un laboratorio independiente. Por ello conviene realizar una reflexin sobre las caractersticas de la medida microbiolgica, y como afectan estas a la validacin.

2) Observacin de las caractersticas morfolgicas y fsicas (color forma) de los microorganismos en los medios utilizados.
ETAPAS DE DETECCIN

3) Realizacin de pruebas bioqumicas complementarias, que diferencian unos organismos de otros.

ETAPAS DE CONFIRMACIN

Todo este proceso que es el definido desde siempre para las pruebas microbiolgicas presenta las siguientes caractersticas diferenciadoras, con respecto a otros procesos de medida. 2.1 Taxonomas imprecisas En muchos casos no se ha realizado una separacin precisa desde un punto de vista taxonmico, e incluso se generan grupos de microorganismos que pueden no estar taxonmicamente relacionados. 2.2 Dependencia del comportamiento La adscripcin a un grupo especfico se produce por el comportamiento del individuo, y no por su constitucin interna. Para ello, se ha valorado, como se comportan generalmente individuos tpicos de ese grupo. Esto supone que pueden existir individuos no tpicos que se comporten de manera diferente que el comportamiento, y por tanto el resultado, pueda depender de la historia reciente (Ej.: cepas estresadas).

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2.3 Cuantificacin de seres vivos Dado que el objetivo de la medida es un ser vivo, las condiciones de conservacin de la muestra, son muy importantes, y es difcil garantizar la estabilidad de un valor de referencia (necesario para pruebas de exactitud) por un largo periodo de tiempo (necesario para pruebas de reproducibilidad), a no ser que se utilicen tcnicas especiales. Ejemplo: liofilizacin. 2.4 Influencia de otros microorganismos La presencia ausencia de microorganismos acompaantes, puede alterar los resultados esperados debido a factores tales como: -Competencia en el uso de los recursos requeridos para crecimiento. -Enmascaramiento de la reaccin del microorganismo objetivo. -Comportamiento similar al microorganismo objetivo. 2.5 Falta de referencias comunes internacionales Dado que el nmero de microorganismos obtenido depende de las condiciones: medio de cultivo, tiempo y temperatura de incubacin, los valores de referencia son dependientes de su mtodo de obtencin y solo se puede hablar de recuperaciones relativas. 2.6 Pequeos nmeros y distribuciones Los recuentos contajes en general se realizan sobre placas que contienen un nmero pequeo de ufcs, menor de 200, de otro modo existiran dificultades para realizarlos. Esto plantea problemas importantes sobre todo cuando existe un nmero pequeo inferior a 15 ufcs, porque la distribucin es discreta (15 14 ufcs) y no continua como en el caso de la qumica. Por ello el modelo de distribucin gaussiano, no es aplicable, y debe utilizarse otro tipo de distribuciones como Poisson binomial negativa. Esta caracterstica supone que en las zonas de bajos recuentos no tendremos garanta cuantitativa de nuestros resultados, pudiendo incluso obtener resultados de cero por la propia libertad de las colonias, de situarse, en el mililitro de la solucin contiguo al que tomamos para hacer las diluciones. 3.- Parmetros de validacin Los parmetros de validacin son aquellas caractersticas del mtodo para las que: a) Se definen requisitos. b) Se realizan experimentos para conseguirlos. c) Se valoran los resultados obtenidos frente a requisitos para poder declarar vlido el mtodo. Los parmetros dependern del tipo de mtodo utilizado y definirn aquellas caractersticas que sean tiles para el uso previsto.

3.1 Tipos de mtodos En el anlisis microbiolgico existen diferentes tipos de mtodos: a) Mtodos cualitativos. Su objetivo es detectar la presencia ausencia de un microorganismo objetivo en una cantidad determinada de muestra. b) Mtodos cuantitativos. Su objetivo es detectar un valor numrico (n ufc/unidades de alimento), de un microorganismo objetivo. Dentro de esta categora se pueden distinguir: b1) Mtodos NMP. Que utilizan la estadstica para realizar una estimacin del valor numrico. Realmente se trata de mtodos semicuantitativos. b2) Mtodos de recuento. Se realiza un contaje real de las unidades formadoras de colonias, existentes en el cultivo final. 3.2 Parmetros de mtodos cualitativos Dados los objetivos de estos mtodos, estaremos interesados en: a) Estar seguros que detectamos pequeas cantidades de microorganismos. b) Estar seguros que la presencia de otros microorganismos, la presencia de matrices diferentes no produce resultados falsos (positivos negativos). Por ello los parmetros requeridos para estos mtodos pueden ser: -Lmite de deteccin -Falsos positivos -Falsos negativos -Sensibilidad -Especificidad -Eficiencia. Que segn las definiciones de la ISO 13843 son: 1) Lmite de deteccin. Nmero de partculas por porcin analtica cuya probabilidad p0 de obtener un resultado negativo es igual al 5%, o al asignado. NOTA 1 Probabilidad de un resultado positivo p(+) = 1p0. NOTA 2 - Clculo de x a travs de una distribucin de POISSON
x = In 1 p = In
0

1 = In(20) = 3,00 (1) 0,05

2) Falsos positivos. Cuando el mtodo alternativo da un resultado positivo sin confirmacin y el mtodo de referencia da un resultado negativo. Cuando resultado verdadero es negativo. 3) Falsos negativos. Cuando el mtodo alternativo da un resultado negativo sin confirmacin y el mtodo de referencia da un resultado positivo. Cuando resultado verdadero es positivo. 4) Sensibilidad: Fraccin del nmero total de colonias positivas correctamente asignado en la inspeccin previa.

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5) Especificidad: Fraccin total del nmero de colonias negativas asignado correctamente en la inspeccin previa. 6) Eficiencia: Fraccin del total de experimentos en los que los resultados finales coinciden con los asignados en la inspeccin previa. 3.2.1 Requisitos para parmetros cualitativos 3.2.1.1 Lmite de deteccin Los requisitos suponen la definicin de un valor mnimo de ufc detectado, con una probabilidad determinada. Para fijar criterios hay que valorar: a) La probabilidad de deteccin exigida no puede ser mayor del 90%, para asegurar que no se exigen ms de 10 repeticiones por nivel. b) Cuando el nmero de ufcs es pequeo la distribucin de Poisson, supone que pueden encontrarse porciones, sin microorganismo por lo que el nmero mnimo de ufcs para detectar, debe ser razonable en torno a 10 5 ufcs. 3.2.1.2 Otros parmetros Los requisitos para asegurar la correcta deteccin de casos positivos y negativos depender del nmero de muestras que razonablemente se puedan exigir. Inicialmente se podran establecer los siguientes criterios: -Sensibilidad, selectividad: 90% -Falsos positivos y/o negativos: 90% -Eficacia: 90% 3.2.2 Sistema de obtencin de parmetros Para la obtencin de los parmetros deberemos disponer de muestras con valor de referencia (Ver apartado 4). En el caso de lmite de deteccin deberemos disponer de muestras con valores de referencia iguales menores al n de ufcs establecido como lmite en una cantidad adecuada para cumplir el criterio de probabilidad establecido. Un sistema es el dopaje de muestras estriles con volmenes de una suspensin de cepas de coleccin de cultivo de la que conocemos su valor de referencia mediante su cultivo en condiciones normalizadas, y el anlisis de dichas muestras para valorar presencia ausencia. Ejemplo: Si deseamos verificar que nuestro mtodo de Salmonella tiene un lmite de deteccin inferior a 5 ufcs, con una probabilidad de deteccin del 90%. Prepararemos al menos 10 muestras de por ejemplo 3 niveles de concentracin (10, 5, 3 ufcs por 25 g) y las analizaremos obteniendo:
Tabla 1. Nivel 10 5 3 N presencia N ausencias 10 0 9 1 7 3 Por tanto nuestro lmite es 5. Probabilidad deteccin 100% 90% 70%

Para el resto de los parmetros se dispondr de al menos 10 muestras positivas y 10 negativas, que incluyan otros microorganismos acompaantes, que puedan interferir, por ejemplo: Listeria innocua para Listeria monocytogenes, etc Dichas muestras sern analizadas con el mtodo que se pretende validar. Los resultados obtenidos se clasificarn de acuerdo a lo indicado en la norma ISO 13843 como:
Tabla 2. Valor mtodo a validar Muestra Muestra + Valor inicial + a c b d a+b c+d

Se calcularn los parmetros requeridos como: -Sensibilidad = a/(a+b) porcentaje positivos reales correctamente asignados. -Especificidad = d/(c +d) porcentaje de negativos reales correctamente asignados. -Falsos positivos = c/ (a + c) porcentaje de positivos detectados incorrectamente asignados. -Falsos negativos = b/ (b + d) porcentaje de negativos detectados incorrectamente asignados. -Eficiencia (e) E = (a + d) /n Aciertos respecto de casos totales. 3.3 Parmetros cuantitativos En el caso de anlisis cuantitativos, ya sean de recuento directo NMP, los objetivos previstos inicialmente deberan ser: 1) Que todos los laboratorios den resultados iguales para muestras con cargas similares. 2) Que los resultados sean repetibles. 3) Que no hay errores en la asignacin de microorganismos. Por ellos los parmetros requeridos sern: a) Exactitud, expresada como recuperacin, y que depender siempre del sistema con el que se ha obtenido, el valor de referencia. b) Precisin expresada como coeficiente de variacin de reproducibilidad. -Definicin exactitud: Grado de concordancia entre el resultado de la medicin y el valor de referencia aceptado NOTA: El trmino exactitud cuando se aplica a un conjunto de resultados de mediciones implica la combinacin de los componentes aleatorios y de un error sistemtico comn o de un componente del sesgo. (ISO 5725-1, 3.6:94) (ISO 3534-1, 3.11:93) El resultado final se puede expresar como:
Re cuperacin= Valor Obtenido 100 ( 2) Valor Re ferencia

-Definicin precisin: "El grado de concordancia entre los resultados obtenidos al aplicar el procedimiento

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experimental repetidas establecidas".

veces

bajo

las

condiciones

es posible realizar ( 10 20) pueden requerir establecer criterios de aceptacin en torno a 75%. 3.3.2.2 Precisin Los criterios de precisin aceptable estarn basados, en el modelo de distribucin que se asume siguen las dispersiones de ufcs. Por ello suponiendo que siguen una distribucin de Poisson.

3.3.1 Parmetros adicionales, que no son de aplicacin en el campo microbiolgico. 3.3.1.1 Linealidad Que en general se aplica a mtodos instrumentales, por lo que no tiene sentido en microbiologa. Se ha especulado con su uso para valorar el mantenimiento de exactitud y reproducibilidad a partir de diluciones. 3.3.1.2 Rango de medida En cuanto a lmite superior, depende del nmero de ufcs que pueden detectarse en una placa, sin problemas de invasin dificultad de recuento. Puede estimarse a partir de experimentos pero en muchos casos, y dado que los mtodos microbiolgicos estn basados en normas pueden tomarse los criterios establecidos en las mismas en torno a 150 200 ufcs, dependiendo del mtodo. En cuanto a lmite inferior tambin llamado lmite de cuantificacin con el seguimiento de la distribucin de Poisson, para pequeo nmero de unidades formadoras de colonias, ya las normas indican que tericamente podr oscilar entre 15 y 20 ufcs dependiendo de los requisitos de exactitud y precisin solicitados. -Definicin lmite de cuantificacin aplicado a anlisis microbiolgicos cuantitativos: Nmero mnimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones experimentales del mtodo evaluado. El autor considera que no es de utilidad mientras no puede ser utilizado en la expresin de resultados (Ver apartado 5.2). 3.3.2 Requisitos para parmetros cuantitativos 3.3.2.1 Recuperacin relativa El valor aceptable depender de: a) El sistema de obtencin del valor de referencia. b) El nmero de repeticiones realizadas. c) El tipo de mtodo recuento NMP. En el caso de mtodos de recuento, con valores de referencia obtenidos de Materiales de referencia, mtodos alternativos intercomparaciones, es aconsejable que se obtengan resultados similares y por tanto la recuperacin suponga al menos el 90%. En el caso de mtodos de recuento cuyos rangos de referencia provengan de dopaje de soluciones estandarizadas puede existir una influencia de la recuperacin del medio selectivo frente a un medio no selectivo, lo que obligue a aceptar valores inferiores por ejemplo 60%. En el caso de mtodos NMP, la propia variabilidad del mtodo (elevada), y el pequeo nmero de repeticiones que

CV =

1 NU

100 ( 3)

Siendo NU el nmero de unidades formadoras de colonias. Teniendo en cuenta que este coeficiente de variacin, es terico, se aconseja aumentar el intervalo de aceptacin, admitiendo que el laboratorio realiza operaciones que pueden aumentar la variabilidad terica. El autor propone aceptar valores que suponen un aumento del 20% de la variabilidad terica por lo que el coeficiente aceptable sera:

CV

MXIMO

120 NU

(4)

Para el caso de mtodos NMP, la distribucin no sigue la de Poisson. Cochran realiz una aproximacin terica calculando la desviacin estndar en logaritmos (Bibliografa 2). Este valor da lugar a unos CVaproximados del 40%. 3.3.3 Obtencin de valores de las caractersticas El problema fundamental para obtener valores, es debido a la falta de estabilidad de las muestras microbiolgicas. Por ello, en principio, es difcil conseguir valores de precisin en reproducibilidad. Sin embargo se han desarrollado tcnicas que permiten valorar la precisin, mediante la comparacin de un conjunto de pares de valores. El sistema se basa en obtener un conjunto de pares en el que: -Valor 1, es el valor de referencia. -Valor 2, es el del mtodo a validar. A partir de este conjunto se realiza una transformacin, sustituyendo los valores por sus logaritmos, y se calcula la diferencia de cada pareja. La diferencia media est relacionada con la recuperacin, una vez invertida la transformacin. La desviacin estndar de las diferencias est relacionada con el valor del coeficiente de variacin de reproducibilidad. Una sistemtica ms completa se desarrolla en la referencia bibliogrfica.

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4.- Tipos de muestras para obtencin de valores de referencia

La validacin ya sea de mtodos cualitativos como de cuantitativos requiere disponer de muestras con un valor de referencia conocido (positivo/negativo valor de recuento) que siempre ser relativo a la fuente de obtencin. Por ello es necesario definir las caractersticas de dichas muestras y las fuentes de donde deben ser obtenidas. 4.1 Caractersticas a) Las muestras deberan contener matrz (alimento, agua, etc) representativa de lo que se desea analizar, para valorar el comportamiento fsico-qumico de nuestro proceso, dificultad de homogenizacin, reacciones inespecficas, etc b) Las muestras deberan incluir en general microorganismos acompaantes, que pueden ser naturales, adicionadas artificialmente. Las acompaantes deberan ser de dos tipos: b1) Organismos similares al objetivo que demuestran la selectividad del mtodo. Por ejemplo: coliformes no fecales, para mtodo de coliforme fecal, Shigella spp para Salmonella spp, Listeria innocua para mtodo Listeria monocytogenes. Generalmente deben ser adicionadas. b2) Otra flora acompaante habitual. Ejemplo Pseudomonas. Generalmente se obtiene de muestras naturales. En algn caso es necesario adicionarla porque debe partirse de muestra estril ante la dificultad inseguridad de disponer de muestras en las que conozcamos el valor del microorganismo objetivo su ausencia. c) Cuando se trate de muestras con valores de referencia para validacin de mtodos cuantitativos es aconsejable que los valores sean tales que los de recuentos superen las 30 ufcs en placa para evitar la influencia de las distribuciones de POISSON binomial en los resultados de los recuentos. Probablemente no es necesario que superen el valor ms alto de recuento en placa (por ejemplo 200), ya que en ese caso estaramos validando, la capacidad del laboratorio de realizar diluciones. d) En el caso de lmites de deteccin de mtodos cualitativos requerirn muestras de varios niveles descendentes del microorganismo objetivo y sin flora acompaante para valorar la capacidad del mtodo sin interferencias. En el caso de otros parmetros cualitativos los niveles del microorganismo objetivo deben ser superiores a los de la zona de deteccin y deben ir acompaados de microorganismos naturales e interferentes para poder valorar las caractersticas del mtodo. 4.2 Procedencia de las muestras Las muestras con valor de referencia pueden provenir de cuatro fuentes que se describen a continuacin.

4.2.1 Materiales de referencia certificados. Existen en la actualidad materiales de referencia con valores numricos de microorganismos. Generalmente se presentan en cpsulas liofilizadas, por lo que ser necesario aadirlas sobre matrices que no contengan el microorganismo objetivo. Se pueden obtener por ejemplo de IRRM (Referencia bibliogrfica). Es necesario que sus certificados contengan una mnima informacin: -Valor de referencia y especificacin del microorganismo objetivo. -Intervalo de confianza del valor requisitos incertidumbre (debe ser adecuada a los requisitos de validacin). -Mtodos utilizados en la determinacin del valor de referencia. (Deben ser compatibles con el mtodo a validar). -Nmero de laboratorios participantes. -Sistema de uso y conservacin. Existen dificultades para conseguir MRCS para algunos de los microorganismos, como ventaja cabe indicar que conserva su valor durante largos periodos de tiempo permitiendo pruebas de reproducibilidad. 4.2.2 Muestra analizada con mtodo alternativo Requiere que el mtodo alternativo est validado, y que se tome su valor como referencia. En general no se puede realizar una comparacin en un largo periodo de tiempo a no ser que se comparen, pares de muestras distintas. 4.2.3 Muestras intercomparacin procedentes de un ensayo de

Se toma como valor de referencia el valor indicado por el organizador, pero requiere: -Que se conozca la forma de estimacin de dicho valor. Preferentemente media de los valores logartmicos. -Que la variabilidad sea conocida, y suficientemente pequea. -Que las muestras incluyan matriz y no solo liofilo. -Que el nmero de participantes para obtener el valor medio sea suficiente, mayor de 30. 4.2.4 Muestras dopadas con cantidades conocidas de suspensiones de cepas de referencia procedentes de colecciones de cultivo internacionales En general los laboratorios disponen de este tipo de cepas, con objeto de controlar sus medios de cultivo y realizar operaciones de control de calidad. Estas cepas se caracterizan por una tipificacin clara del microorganismo objetivo con trazabilidad internacional, pero no disponen de un valor cuantitativo de recuento. Por ello es necesaria una operacin previa simultnea de estandarizacin, consistente en el cultivo en general en un

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medio no selectivo, y en condiciones de tiempo y temperatura definidas, de una alcuota de la suspensin con que se dopan las muestras para, calculada la concentracin de dicha suspensin, y teniendo en cuenta el volumen dopado y la cantidad de muestra sobre la que se produjo el dopaje, disponer de un valor de referencia, con el que comparar el obtenido por la aplicacin de nuestro mtodo, sobre la muestra dopada.

5.- Problemas actuales en la validacin

5.1 Definicin de requisitos a los parmetros En la actualidad no se dispone aun de suficiente informacin para definir valores aplicables como criterios, y no existen normativas al respecto, como han surgido en el campo de la qumica, donde algunas legislaciones nacionales europeas fijan criterios para exactitud precisin. Por otro lado el nmero mnimo de pruebas a realizar para garantizar el cumplimiento de determinadas probabilidades (por ejemplo: Lmite de Deteccin probabilidad del 95%), ya que no se estima mediante una desviacin estndar, sino con un nmero de casos positivos negativos, puede resultar muy elevada.

4) Por ello, an si se calculase el lmite de cuantificacin, debera poderse continuar dando valores inferiores al calculado, por lo que su determinacin no tiene una utilidad excesiva en la expresin de resultados, como en otros campos (qumica). 5) La realizacin de las pruebas experimentales en la zona del lmite de cuantificacin conlleva la necesidad de establecer requisitos de aceptacin muy amplios debido a la variabilidad de las medidas. Por ello determinadas normas por ejemplo ISO TR 13843 aconsejan que las pruebas de exactitud y precisin se realicen en zonas de recuentos superiores (al menos 30 ufc de recuento), para asegurar que se pueden establecer criterios exigentes, e indican, que si se cumplen los criterios en zonas superiores, tambin se cumplirn en inferiores. Todo ello indica que ser necesaria una reflexin general para valorar la utilidad y necesidad de determinacin del lmite de cuantificacin. 5.3 Tipos de muestras utilizadas Otro de los debates existentes en la actualidad es la posibilidad de utilizar muestras estriles dopadas con microorganismos, muestras naturales dopadas. Ambos sistemas tienen sus ventajas e inconvenientes. 5.3.1 Muestras estriles Garantizan la falta de microorganismo objetivo por el propio proceso. Son el nico sistema posible para algn tipo de anlisis, por ejemplo aerobios, sino disponemos de mtodo alternativo intercomparacin. Por el contrario los microorganismos acompaantes deben ser dopados, y probablemente no presentan una riqueza de flora natural como en el caso de muestras naturales. 5.3.2 Muestras naturales La garanta de no existencia del microorganismo objetivo se obtiene aplicando en muchos casos el mtodo que se quiere validar, lo cual supone un riesgo. En muchos casos es necesario un dopaje de microorganismos acompaantes, debido a que pueden no existir algunos interesantes para valorar las interferencias. Tienen la ventaja de la existencia de flora natural por lo que son representativos de situaciones reales. 5.4 Obtencin de valores de referencia Uno de los sistemas de obtencin de los valores de referencia, lo constituyen los valores procedentes de circuitos de intercomparacin. Es imprescindible sin embargo que los organizadores de los mismos tengan en cuenta una serie de particularidades para que sus datos puedan ser aprovechados por los laboratorios.

N mnimo =

100 (5) 100 Pr ob

Esto supone la necesidad de aceptar como vlidas probabilidades no muy elevadas (por ejemplo 90%) que permiten la realizacin de un n de repeticiones costosa (10), pero posible. 5.2 Rangos de validacin lmite cuantificacin En los ltimos tiempos se ha creado un debate sobre la necesidad no de realizar pruebas experimentales para obtener un lmite de cuantificacin. En opinin del autor la necesidad de estimar experimentalmente un lmite de cuantificacin es dudosa ya que: 1) Debido a la suposicin de las distribuciones que siguen los valores de ufcs de las muestras (Poisson binomial negativa) se espera que tericamente este lmite sea superior a 16 ufcs (CV = 25% para Poisson y superior para binomial). 2) Este hecho ya ha sido indicado por numerosas normas de anlisis microbiolgicos que indican que a partir de 15 a 25 ufcs los recuentos son aproximados. 3) Sin embargo la importancia de detectar una nica ufc puede ser importante para valorar posibles riesgos patgenos. Por ello la comunidad microbiolgica ha aceptado expresar numricamente, e informar de los resultados que proviniesen de la existencia de una sola ufc, aunque su reproducibilidad fuese dudosa.

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a) Utilizacin de muestras reales con matriz para que los datos sean vlidos. b)Necesidad de microorganismos acompaantes. c)Obtencin de valores de referencia bien definidos (poca variabilidad) y descripcin del mtodo de determinacin del valor de referencia. d)Nmero de participantes suficiente. Otro de los sistemas utilizados es la adicin de volmenes de una suspensin con una concentracin de ufcs determinada, mediante el cultivo en unas condiciones de tiempo y temperatura de incubacin determinados, usando un medio de cultivo no selectivo. Es imprescindible establecer normas comunes que permitan estandarizar el contenido de las suspensiones, haciendo comparables los resultados de los diferentes laboratorios, y generando una referencia comn que nos permita valorar las caractersticas de los mtodos.

Bibliografa
Curso Validacin y Clculo de Incertidumbre en ensayos microbiolgicos. J. Laso. Gabinete de Servicios para la Calidad (GSC). Cochran W.G. Estimation of bacterial densities by means of the Most probable Number. Biometrics 6, 1950 App 39-52. ISO TR 13843 Water quality Guidance on validation of microbiological methods. ISO/DIS 17994 Water quality. Criteria for establishing de equivalency of two microbiological methods. ISO 16140 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of alternative methods. Institute for reference materials and measurements

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