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Universidade de Braslia Instituto de Qumica Programa de Ps-Graduao

DISSERTAO DE MESTRADO

Desenvolvimento de uma nova metodologia analtica para identificao e quantificao de truxilinas em amostras de cocana baseada em cromatografia lquida de alta eficincia acoplada espectrometria de massas (CLAE-EM)

lvio Dias Botelho

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Bastos Cunha Co-Orientador: Prof. Dr. Alex Fabiano Cortez Campos
Braslia-DF 2011

Universidade de Braslia Instituto de Qumica Programa de Ps-Graduao DISSERTAO DE MESTRADO

Desenvolvimento de uma nova metodologia analtica para identificao e quantificao de truxilinas em amostras de cocana baseada em cromatografia lquida de alta eficincia acoplada espectrometria de massas (CLAE-EM)

lvio Dias Botelho


Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao do Instituto de Qumica da Universidade de Braslia, como requisito parcial obteno do ttulo de mestre em Qumica.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Bastos Cunha Co-Orientador: Prof. Dr. Alex Fabiano Cortez Campos

Braslia-DF 2011 i

lvio Dias Botelho

Desenvolvimento de uma nova metodologia analtica para identificao e quantificao de truxilinas em amostras de cocana baseada em cromatografia lquida de alta eficincia acoplada espectrometria de massas (CLAE-EM)

Banca examinadora da Dissertao para obteno do grau de mestre

Prof. Dr. Ricardo Bastos Cunha orientador/presidente

____________________________ Prof. Dr. Marcelo Valle de Sousa 1 examinador

____________________________ Prof. Dr. Mrcio Talhavini 2 examinador

Braslia, 30 de novembro de 2011.

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Aos meus filhos Arthur e Ana Clara pelo amor, e pelos momentos de alegria. minha esposa Thas pela pacincia, incentivo, amor e companheirismo. Aos meus Pais Ronilson e Eluiza, que me deram a vida, carinho e educao. Aos meus irmos Erich e Tain pelo incentivo e motivao. toda minha famlia pelo apoio. Aos meus amigos, por todos os momentos de divertimento e descontrao.

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Agradecimentos Agradeo ao meu orientador Prof. Dr. Ricardo Bastos Cunha pela conduo dos trabalhos com tranquilidade, pacincia, e pela disposio e amplo conhecimento transmitido em diversas reas. Ao meu co-orientador e grande amigo Prof. Dr. Alex Fabiano Cortez Campos pelo incentivo e apoio no desenvolvimento desse trabalho. Agradeo ao chefe do SEPLAB/INC/DITEC/DPF e amigo Adriano Otvio Maldaner pela disponibilizao de tempo para cursar as disciplinas e execuo dos trabalhos, alm das muitas discusses e orientaes durante o planejamento, execuo das anlises e interpretao dos dados. Aos amigos e colegas de laboratrio e bancada Joo Carlos Laboisiere Ambrsio e Maurcio Leite Vieira pelo inestimvel apoio na parte experimental deste trabalho. Ao amigo e colega de laboratrio Jorge Jardim Zacca pelo auxlio na interpretao dos dados e nas discusses sobre o Projeto PeQui. toda equipe do SEPLAB/INC/DITEC/DPF pelo apoio nos experimentos, nas trocas de conhecimentos e interminveis conversas sobre futebol. Ao colega de mestrado Saulo Goulart e a Christiane Campos pelo auxlio nas anlises. Aos professores do IQ/UnB e amigos de graduao ngelo Henrique de Lira Machado e Wender Alves da Silva pela ajuda e conversas durante o desenvolvimento deste trabalho. Ao Instituto de Qumica e aos membros da banca examinadora pela oportunidade dada a mim para realizar este trabalho. Ao Special Testing & Research Laboratory do Drug Enforcement Administration (DEA) nos Estados Unidos pela disponibilidade dos padres de cocana e truxilinas. s direes do Instituto Nacional de Criminalstica e da Diretoria TcnicoCientfica da Polcia Federal pela liberao parcial de tempo para a execuo deste trabalho, pelos insumos qumicos, disponibilidade das instalaes fsicas e equipamentos do SEPLAB/INC/DITEC/DPF. FINEP/MCT e UNODC/i90, pelo apoio financeiro.

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RESUMO
Programas de perfil qumico de drogas podem gerar informaes importantes para as autoridades de represso ao trfico de entorpecentes. De fato, correlaes qumicas entre amostras podem ser estabelecidas, e os materiais podem ser classificados em grupos de amostras relacionadas e determina-se se diferentes apreenses foram oriundas de uma mesma fonte. Consequentemente, ligaes especficas entre diferentes fornecedores podem ser estruturadas, rotas e redes de distribuio podem ser identificadas. Desde 2007, a Polcia Federal tem trabalhado em seu prprio programa de perfil de impurezas de cocana (Perfil Qumico de Drogas tambm conhecido como PeQui). No esforo de estabelecer rotinas para o programa de perfil qumico brasileiro, este trabalho prope um mtodo alternativo para analisar alcaloides em amostras de cocana, que livre de reagentes de derivatizao, que so caros e txicos. No presente trabalho, um novo mtodo para identificao e quantificao de truxilinas proposto, o qual baseado em cromatografia lquida de alta eficincia acoplada espectrometria de massas (CLAE/EM). Pelo mesmo mtodo, tambm possvel detectar simultaneamente os principais alcaloides e adulterantes comumente encontrados em amostras de cocana, incluindo a benzoilecgonona, cis e trans-cinamoilcocana, ecgonina, metilecgonina, trimetoxicocana, tropacocana, benzocana, fenacetina, cafena, lidocana, levamisol, hidroxizina, diltiazem e procana. Essa metodologia analtica foi comparada com a metodologia j publicada, de quantificao de truxilinas por CG/DCE, e mostrou boa linearidade e preciso. Alm de ser mais rpida, fcil, econmica, e segura do que o mtodo de CG/DCE. Amostras de cocana apreendidas em 8 estados brasileiros, pela Polcia Federal em 2009, 2010 e 2011, foram analisadas, obtendo-se o teor de truxilinas, de cocana, de cis e transcinamoilcocanas, e determinando-se a presena de adulterantes. A determinao do teor total de truxilinas pelo mtodo de CG/DCE revelou teores variando entre 0,28-11,89% (m/m relativo cocana).

ABSTRACT
Drug impurity profiling can generate important information for drug law enforcement authorities. In fact, chemical correlation between samples can be established, and material from different seizures can be classified into groups of related samples and determined if different seizures were derived from the same source. Consequently, specific links between different suppliers can be structured, drug distribution routes and networks can be built up, and the geographic origin of drug samples may be identified. Since 2007 Brazilian Federal Police has been working on its own cocaine impurity profiling program (Perfil Qumico de Drogas also known as the PeQui project). In the effort of establishing the Brazilian signature program routines, this work suggested an alternative methodology to analyze alkaloids in cocaine samples, which is free of derivatization agents, which are expensive and toxic. In this work, a new LC/MS method is proposed for simultaneous identification and quantification of truxillines; other important cocaine alkaloids, like benzoylecgonine, cis and trans-cinnamoylcocaine, ecgonine, methylecgonine, trimethoxycocaine, tropacocaine; and typical cutting compounds: benzocaine, phenacetin, caffeine, lidocaine, levamisole, hidroxyzin, diltiazem and procaine. This analytical methodology was compared with published method of truxillines analysis by GC/ECD, and showed very good linearity and precision. The LC/MS methodology is faster, easier, economical, and safer than the method of GC/ECD. Cocaine samples from Brazilian Federal Police apprehensions, in the years 2009, 2010 and 2011, were analyzed, obtaining the content of truxillines, of cocaine, and cis and trans-cinnamoylcocaine. The truxillines analysis by GC/ECD methodology revealed that total levels ranged from 0,28-11,89% (w/w relative to cocaine).

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NDICE
1. 1.1. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.3. 1.4. 1.5. 1.5.1. 1.5.2. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9. 1.10. 1.10.1. 1.10.2. 1.10.3. 1.10.4. 1.10.5. 1.11. 1.11.1. 1.11.2. INTRODUO .................................................................................................. 1 Histrico de uso e controle da cocana .......................................................... 1 Botnica das plantas de coca ........................................................................ 4 Erythroxylum coca var. coca ...................................................................... 6 Erythroxylum coca var.ipadu ....................................................................... 8 Erythroxylum novogranatense var. novogranatense ................................... 9 Erythroxylum novogranatense var. truxillense .......................................... 10 Principais alcaloides presentes nas folhas de coca ..................................... 11 Truxilinas ...................................................................................................... 13 Propriedades da cocana ............................................................................. 17 Propriedades fsico-qumicas .................................................................... 17 Efeitos farmacolgicos .............................................................................. 19 Formas de apresentao da cocana ........................................................... 21 Processos de obteno da cocana a partir das folhas de coca ................. 23 Adulterantes e diluentes encontrados em amostra de cocana ilcita ........... 27 Trfico de drogas e a legislao brasileira ................................................... 32 Perfil qumico da cocana ............................................................................. 38 Teor e forma de apresentao da cocana ................................................. 41 Alcaloides minoritrios ................................................................................ 42 Teor total de truxilinas ................................................................................ 45 Anlise de Razo Isotpica (RI/EM) ........................................................... 46 Perfil de solventes oclusos. ........................................................................ 47 Aspectos analticos ..................................................................................... 48 Cromatografia Gasosa .............................................................................. 49 Tcnicas de Derivatizao Qumica .......................................................... 50

1.11.3. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia acoplada Espectrometria de Massas (CLAE/EM) ................................................................................................... 52 a) b) 2. 3. 3.1. Analisador de massas Triplo Quadrupolo (QqQ) ............................................. 54 Analisador de massas por Tempo de Voo (TOF) ............................................ 54 OBJETIVOS .................................................................................................... 58 MATERIAIS E MTODOS ............................................................................... 59 Materiais .......................................................................................................... 59

3.1.1. Equipamentos, vidrarias e acessrios ............................................................. 59


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3.2. 3.2.1. a) b) c) d) e) 3.2.2. a) b) c) d) e) f) g) 3.2.3. a) b) c)

Mtodos ....................................................................................................... 64 Anlises de truxilinas por CG/DCE ........................................................... 64 Procedimentos de reduo e derivatizao ..................................................... 64 Condies cromatogrficas ............................................................................. 65 Preparao das curvas analticas.................................................................... 65 Limite de deteco e limite de quantificao ................................................... 66 Anlise das amostras selecionadas por CG/DCE ........................................... 67 Anlises de CLAE/EM (TOF) .................................................................... 67 Condies cromatogrficas ............................................................................. 67 Condies do espectrmetro de massas ........................................................ 68 Otimizao das condies analticas............................................................... 68 Preparao das curvas analticas.................................................................... 71 Parmetros de confiana analtica .................................................................. 72 Preciso e Exatido......................................................................................... 72 Anlise das amostras selecionadas por CLAE/EM.......................................... 73 Quantificao de cocana por CG/DIC ...................................................... 74 Condies cromatogrficas ............................................................................. 74 Preparao das curvas analticas.................................................................... 74 Anlise das amostras selecionadas por CG/DIC ............................................. 75

3.2.4. Anlises de alcaloides e adulterantes por CLAE/EM-EM (Triplo quadrupolo) ............................................................................................................... 75 a) b) 4. 4.1. Condies cromatogrficas ............................................................................. 75 Condies do espectrmetro de massas ........................................................ 76 RESULTADOS ................................................................................................ 78 Anlises de truxilinas por CG/DCE .................................................................. 78

4.1.1. Curvas Analticas............................................................................................. 81 4.1.2. Limite de deteco e de quantificao ............................................................ 84 4.1.3. Resultados das anlises das amostras e classificao por origem geogrfica ... ........................................................................................................................ 85 4.2. Metodologia de identificao e quantificao de truxilinas por CLAE/TOF-EM ... ..........................................................................................................................86

4.2.1. Resultados qualitativos .................................................................................... 86 4.2.2. Otimizao das condies analticas............................................................... 90 4.2.3. Curva Analtica ................................................................................................ 91 4.2.4. Limite de deteco e limite de quantificao ................................................... 92 4.2.5. Preciso e exatido intra-ensaio e inter-ensaio ............................................... 93
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4.2.6. Resultados das anlises de amostras por CLAE/EM ...................................... 93 4.3. Anlises de alcaloides e adulterantes por CLAE/TOF-EM .............................. 93 4.3.1. Curvas Analticas............................................................................................. 96 4.3.2. Limite de deteco .......................................................................................... 99 4.4. 4.5. Identificao de adulterantes nas amostras .................................................... 99 Determinao dos teores de cocana nas amostras...................................... 102

4.6. Determinao dos teores de cis e trans-cinamoilcocana e grau de oxidao das amostras. .......................................................................................................... 105 4.7. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 6. 7. Anlises de alcaloides e adulterantes por CLAE/EM-EM .............................. 107 DISCUSSO ................................................................................................. 112 Introduo ..................................................................................................... 112 Desenvolvimento da metodologia proposta e anlise de truxilinas ............... 112 Determinao do teor de cocana nas amostras ........................................... 128 Determinao da presena de adulterantes nas amostras ........................... 129 Determinao do grau de oxidao das amostras ........................................ 130 Anlises por CLAE/EM-EM............................................................................ 130 CONCLUSES ............................................................................................. 131 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................. 132

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LISTA DE ABREVIATURAS
AA: Anidrido actico ANVISA: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria CG/DCE: cromatografia gasosa com deteco por captura de eltrons CG/DIC: cromatografia gasosa com deteco por ionizao em chama CG/DNP: cromatografia gasosa com deteco terminica especfica (detector seletivo de nitrognio e fsforo) CG/EM: cromatografia gasosa acoplada a espectrmetro de massas CG: cromatografia gasosa CLAE/DAD: cromatografia lquida de alta eficincia com deteco por arranjo de diodos CLAE/EM: cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrmetro de massas CLAE/EM-EM: cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrmetro de massas em tandem CLAE: cromatografia lquida de alta eficincia CV: coeficiente de variao ECVC: Erythroxylum coca var. coca ECVI: Erythroxylum coca var. ipadu EIC: do ingls, Extract ion chromatogram, cromatograma reconstrudo somente com a intensidade de on especfico de determinado analito. ENVC: Erythroxylum novogranatense var. novogranatense ENVT: Erythroxylum. novogranatense var. truxillense HFBA: Anidrido heptafluorobutrico LD: limite de deteco LQ: limite de quantificao MRM: do ingls, multiple reaction monitoring - monitoramento de mltiplas reaes PF: Polcia Federal PFPA: Anidrido pentafluoropropinico

PTV: injetor para cromatografia gasosa, do ingls, programmed temperature vaporization vaporizao com temperatura programada RTI/DEA: padro de cloridrato de cocana, contendo quantidades estabelecidas de cocana e alcaloides de coca, utilizado na construo das curvas de calibrao e controles dos mtodos de quantificao de truxilinas e demais alcaloides. SEPLAB/INC/DITEC/DPF: Servio de Percias de Laboratrio e Balstica/Instituto Nacional de Criminalstica/Diretoria Tcnico-Cientfica/Departamento de Polcia Federal SETEC: Setor Tcnico Cientfico SVS: Secretaria de Vigilncia Sanitria, substituda pela ANVISA TCAA: Anidrido tricloroactico TFAA: Anidrido trifluoroactico TOF: analisador de espectrmetro de massas por tempo de voo UHPLC: do ingls, ultra high performance liquid chromatography - cromatografia lquida de presso ultra-alta UPLC: do ingls, ultra performance liquid chromatography - cromatografia lquida de ultra eficincia

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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Teor de cocana em folhas de coca em funo da espcie de Erythroxylum. .............................................................................................................. 5 Tabela 2 - Teores de alguns alcaloides, em folhas de coca, em funo do pas de origem. ...................................................................................................................... 13 Tabela 3 - Teor de truxilinas em folhas de coca cultivadas na Amrica do Sul ........ 15 Tabela 4 - Teores mdios de truxilinas em amostras ilcitas de cloridrato de cocana da Amrica do Sul. .................................................................................................... 16 Tabela 5 - Algumas caractersticas fsicas e qumicas da cocana base e do cloridrato de cocana. ................................................................................................ 18 Tabela 6 - Frmacos presentes como adulterantes, em 51 amostras de cocana. ... 31 Tabela 7 - Quantidade de cocana (kg) apreendida pela PF por estado nos ltimos 5 anos. ...................................................................................................................... 35 Tabela 8 - Resumo das principais publicaes cientficas sobre perfil qumico baseado nos alcaloides de cocana. ......................................................................... 42 Tabela 9 - Concentraes dos alcaloides na soluo estoque para anlises por CLAE/EM................................................................................................................... 63 Tabela 10 - Concentraes das truxilinas nas solues utilizadas para a construo das curvas de calibrao. .......................................................................................... 66 Tabela 11 - Gradiente utilizado nas anlises por LC-EM. ......................................... 68 Tabela 12 - Concentraes totais dos analitos nas solues utilizadas para a construo das curvas de calibrao. ....................................................................... 71 Tabela 13 - Gradiente utilizado nas anlises por CLAE/EM-EM. .............................. 76 Tabela 14 - Transies de MRM monitorados, voltagem de fragmentao e energia de coliso (CID) para cada analito investigado por CLAE/EM-EM. ........................... 77 Tabela 15 - Tempos de reteno por CG/DCE dos derivados di-heptafluorobutricos dos diols truxilil e truxinil. ........................................................................................... 78 Tabela 16 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos ismeros e respectivos coeficientes de variao (%CV). .......................................... 80 Tabela 17 - Origem geogrfica das amostras analisadas por estado de apreenso de acordo com o teor total de truxilinas por CG/ECD..................................................... 86

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Tabela 18 - Medidas de massas exatas e abundncia isotpica experimentais e calculadas dos ons mono e duplamente carregados das truxilinas e cinamoilcocanas. ...................................................................................................... 89 Tabela 19 - Medidas de massas exatas experimentais e calculadas dos produtos detectados de hidrlise das truxilinas. ....................................................................... 89 Tabela 20 - Tempo de reteno, reteno relativa, fator de reteno e fator de alargamento dos picos cromatogrficos obtidos para as truxilinas e padro interno (PI). ........................................................................................................................... 91 Tabela 21 - Parmetros cromatogrficos utilizados para avaliar a eficincia na separao dos analitos nas condies cromatogrficas propostas........................... 91 Tabela 22 - reas relativas totais obtidas para a elaborao da curva analtica de truxilinas e respectivos desvio padro (DP) e coeficientes de variao (%CV). ....... 92 Tabela 23 - Preciso e exatido do mtodo proposto para quantificao de truxilinas, em trs concentraes diferentes. ............................................................................ 93 Tabela 24 - Medidas de massas exatas de padres de alcaloides e adulterantes em soluo de metanol por CLAE/TOF-EM. ................................................................... 96 Tabela 25 - Limites de deteco estabelecidos para os alcaloides pela metodologia proposta. ................................................................................................................... 99

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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura qumica da cocana. .................................................................... 5 Figura 2 - Arbusto de Erythroxylum coca var. coca.(a) fotografia. (b) desenho esquemtico ................................................................................................................ 6 Figura 3 - Principais alcaloides com ncleo tropnico presentes nas folhas de coca. .................................................................................................................................. 12 Figura 4 - Higrina e cuscohigrina, alcaloides presentes nas folhas de coca. ........... 13 Figura 5 - Estruturas dos 11 ismeros de truxilinas.................................................. 14 Figura 6 - Formao de truxilinas nas plantas de coca via fotoadio catalisada por UV. ............................................................................................................................ 16 Figura 7 - Reaes de hidrlise da cocana. ............................................................ 18 Figura 8 - Formao do cloridrato de cocana. ......................................................... 19 Figura 9 - Formas de apresentao da cocana. ...................................................... 22 Figura 10 - Produo da pasta base de cocana. ..................................................... 24 Figura 11 - Produo da cocana base. .................................................................... 25 Figura 12 - Produo do cloridrato de cocana. ........................................................ 25 Figura 13 - Produo do crack. ................................................................................ 26 Figura 14 - Produo da merla. ................................................................................ 26 Figura 15 - Alcaloides formados durante a oxidao da cocana. ............................ 27 Figura 16 - Estruturas qumicas dos principais adulterantes de cocana encontrados no Brasil. ................................................................................................................... 29 Figura 17 - Cultivo mundial de arbustos de coca, no perodo de 1990 a 2009. ........ 33 Figura 18 - Produo mundial de cocana, no perodo de 1990 a 2008. .................. 33 Figura 19 - Pontos de entrada e sada de cocana, utilizadas pelo narcotrfico passando em territrio brasileiro. .............................................................................. 34 Figura 20 - Formao de artefatos de truxilinas por cromatografia gasosa, sem derivatizao prvia. ................................................................................................. 46 Figura 21 - Espectro de massas da cocana em instrumento de CLAE/TOF-EM ..... 56 Figura 22 - Cromatograma tpico dos derivados di-heptafluorobutricos dos diols truxilil e truxinil por CG/DCE. Picos: mesma numerao utilizada na Tabela 15....... 79 Figura 23 - Reaes de reduo e derivatizao sofridas pelas truxilinas na sua preparao para anlise por CG/DCE. ...................................................................... 79
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Figura 24 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero psilon. ..................................................................................................................... 81 Figura 25 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Delta. .................................................................................................................................. 81 Figura 26 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Beta. .................................................................................................................................. 82 Figura 27 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Peri. .................................................................................................................................. 82 Figura 28 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Neo. .................................................................................................................................. 82 Figura 29 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Epi.. .................................................................................................................................. 83 Figura 30 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Alfa. .................................................................................................................................. 83 Figura 31 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero...... 83 Figura 32 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Gama. ....................................................................................................................... 84 Figura 33 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Zeta. .................................................................................................................................. 84 Figura 34 - Origem geogrfica das amostras, de acordo com o teor total de truxilinas por CG/ECD. ............................................................................................................. 85 Figura 35 - Origem geogrfica das amostras analisadas separadas conforme a sua forma de apresentao. ............................................................................................ 85 Figura 36 - Cromatograma reconstrudo (EIC), padro RTI-DEA em metanol, do on de m/z 659,3327, on [M+H]+ das truxilinas. .............................................................. 86 Figura 37 - Espectro de massas de CLAE/EM do pico 3 da Figura 22, no tempo de reteno 10,11 minutos. ............................................................................................ 87 Figura 38 - Comparao entre a ampliao dos espectros de massas do on duplamente carregado das truxilinas (a) e o on mono carregado da transcinamoilcocana (b). .................................................................................................. 87 Figura 39 - Ampliao dos cromatogramas reconstrudos (EIC), injeo do padro RTI-DEA em metanol. ............................................................................................... 88

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Figura 40 - Estruturas dos produtos de hidrlise do ismero beta das truxilinas, em amostras de cocana refinadas, de acordo com numerao da Tabela 19. .............. 90 Figura 41 - Representao da curva analtica para a determinao do total de truxilinas nas concentraes de 5,8 a 72,0 mg/L. ..................................................... 92 Figura 42 - Cromatogramas tpicos reconstrudos (EIC) dos ons [M+H]+ dos alcaloides investigados (padres) em uma mesma injeo... ................................... 94 Figura 43 - Cromatogramas tpicos reconstrudos (EIC) dos ons [M+H]+ dos adulterantes investigados (padres) em uma mesma injeo................................... 95 Figura 44 - Representao da curva analtica para a determinao de benzoilecgonina. ....................................................................................................... 97 Figura 45 - Representao da curva analtica para a determinao de ciscinamoilcocana......................................................................................................... 97 Figura 46 - Representao da curva analtica para a determinao de ecgonina .... 97 Figura 47 - Representao da curva analtica para a determinao da metilecgonina. .................................................................................................................................. 98 Figura 48 - Representao da curva analtica para a determinao da trimetoxicocana. ....................................................................................................... 98 Figura 49 - Representao da curva analtica para a determinao da tropacocana. .................................................................................................................................. 98 Figura 50 - Presena de adulterantes no total de amostras analisadas. ................ 100 Figura 51 - Presena de adulterantes nas amostras provenientes da Regio Norte. ................................................................................................................................ 100 Figura 52 - Presena de adulterantes nas amostras provenientes da Regio CentroOeste. ...................................................................................................................... 101 Figura 53 - Presena de adulterantes nas amostras provenientes da Regio Sudeste. .................................................................................................................. 101 Figura 54 - Presena de adulterantes nas amostras provenientes da Regio Sul. 101 Figura 55 - Teores mdio, mnimo e mximo de cocana por estado, nas amostras analisadas. .............................................................................................................. 102 Figura 56 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Acre................... 103 Figura 57 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Amazonas. ........ 103 Figura 58 - Distribuio dos teores de cocana das amostras de Rondnia. .......... 103 Figura 59 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Distrito Federal. . 104
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Figura 60 - Distribuio dos teores de cocana das amostras de Mato Grosso...... 104 Figura 61 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Mato Grosso do Sul. ................................................................................................................................ 104 Figura 62 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Paran. ............. 105 Figura 63 - Distribuio dos teores de cocana das amostras de So Paulo. ........ 105 Figura 64 - Grau de oxidao de todas as amostras analisadas. ........................... 106 Figura 65 - Grau de oxidao de amostras de cocana na forma de base. ............ 106 Figura 66 - Grau de oxidao em amostras de cocana na forma de sal cloridrato. ................................................................................................................................ 107 Figura 67 - Grau de oxidao: alto, mdio, e baixo das amostras analisadas por estado. .................................................................................................................... 107 Figura 68 - Cromatogramas das duas transies MRM de cada um dos alcaloides investigados (padres) em uma mesma injeo.. ................................................... 108 Figura 69 - Cromatogramas das duas transies MRM de cada um dos adulterantes investigados (padres) em uma mesma injeo.. ................................................... 109 Figura 70 - Espectros de massas da fragmentao (EM/EM) do on de m/z 330,0, no tempo de reteno da cis-cinamoilcocana, em trs energias de coliso................ 110 Figura 71 - Espectros de massas da fragmentao (EM/EM) do on de m/z 330,0, no tempo de reteno de um dos ismeros da truxilina ............................................... 110 Figura 72 - Espectros de massas da fragmentao (EM/EM) do on de m/z 659,0, no tempo de reteno de um dos ismeros da truxilina ............................................... 111

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

1. INTRODUO 1.1. Histrico de uso e controle da cocana1,2,3


Culturas nativas da Amrica do Sul tm mascado folhas de cocai por milhares de anos em ocasies religiosas e sociais, para inibir a fome, diminuir o cansao e aumentar a resistncia fsica. Vrios artigos foram publicados relatando achados de restos vegetais de plantas de coca no Peru, alm de artefatos de cermica encontrados na regio andina. O artefato arqueolgico mais antigo que sugere o uso de folhas de coca trata-se de um pequeno recipiente de cermica para cal, datado de cerca de 2100 A.C4 encontrado no sudoeste do Equador. Em publicaes mais recentes foram encontrados vestgios mais diretos: Cartmell et al.5 descreveram a deteco de benzoilecgonina (principal metablito da cocana) em 114 amostras de cabelo de mmias de populaes pr-hispnicas no Chile, sendo as amostras mais antigas datadas entre 250 e 350 A.C. Hastorf6 descreveu que foram encontrados no Peru, em escavaes de estruturas habitacionais, uma folha de coca e dois endocarpos identificados como da espcie Erythroxylum coca var. coca, datados entre 1300 e 1500 D.C. No Peru os Incas integravam o uso de folhas de coca na sua rotina e misturavam na boca as folhas de coca com cal ou cinzas para facilitar a absoro da mesma pelo sistema digestivo, deixando esta mistura (bola) na boca por horas. O uso era, originalmente, restrito aos sacerdotes e nobreza, mas quando os conquistadores espanhis subjugaram o Imprio Inca no sculo XVI, o cultivo e a disponibilidade das folhas aumentaram bastante. Os espanhis estimularam este aumento para benefcio prprio, para gerar impostos, e propiciar que os Incas trabalhassem de forma mais eficiente em altitudes elevadas e nas minas de prata, ouro, cobre e estanho. Muitos trabalhadores indgenas dessas minas morreram muito jovens, principalmente nas minas de prata. Tragicamente, essas mortes, combinadas com um aumento macio na mortandade devido a doenas importadas, provocou a morte de quase metade da fora de trabalho indgena entre 1540 e 1620.
O termo folhas de coca ser utilizado referindo se s folhas das plantas das variedades Erythroxylum coca var. coca, Erythroxylum coca var. ipadu, Erythroxylum novogranatense var. novogranatense e Erythroxylum novogranatense var. truxillense.
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Durante este perodo o cultivo de coca na regio andina se expandiu notavelmente na rea dos Yungas (Bolvia), onde fazendas de coca especializadas surgiram, muitas vezes em terrenos de propriedade dos prprios colonizadores espanhis. Na poca em que Pizarro chegou Amrica do Sul (1627), as folhas de coca eram mastigadas por quase todos os trabalhadores indgenas e a coca tinha emergido como uma importante atividade agrcola. O cultivo foi tratado de forma semelhante a outros produtos agrcolas, com os agricultores obrigados a pagar o dzimo para terras com plantaes de coca. Atualmente, o cultivo, o comrcio, a mastigao e o consumo de ch de coca so legais na Bolvia, Peru e Noroeste da Argentina. O uso das folhas de coca pelos indgenas sul-americanos conhecido na Europa desde o comeo do sculo XVI. Porm, somente em 1859, o qumico Albert Niemann isolou a cocana das folhas de coca, em Gottingen, Alemanha. Levaram-se pouco mais de 20 anos at que este alcaloide, considerado o primeiro anestsico local a ser descoberto, tivesse as suas propriedades relatadas por Von Anrep, em 1880. A partir de 1884, o mdico Karl Koller, que descobriu suas propriedades anestsicas, e Sigmund Freud difundiram o uso clnico da cocana refinada na forma de seu sal cloridrato. A cocana era recomendada para uma srie de doenas, incluindo depresso, tuberculose, problemas gstricos, asma, e como antdoto no tratamento das dependncias morfina e ao lcool. Em 1886, John Pemberton lanou a famosa bebida Coca-Cola, que continha cocana. No final dos anos 1860, vinhos contendo cocana se tornaram populares na Frana e Itlia. No entanto, devido s complicaes surgidas com o uso da cocana e as restries impostas a sua comercializao, a partir de 1902 todas as bebidas base de xarope de folhas de coca comearam a ser produzidas com extratos descocainizados. Entre a virada do sculo e 1912, o Peru e a colnia holandesa de Java, onde as plantas de coca foram introduzidas somente em 18757, tornaram-se os maiores produtores e exportadores de folha de coca do mundo, com uma produo em larga escala. Como a cocana j estava amplamente disponvel e algumas pessoas haviam se tornado usurios crnicos, a real natureza e os efeitos colaterais dela se tornaram evidentes, e os problemas com o vcio de cocana foram ento reconhecidos.

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Concomitantemente, foram descobertos anestsicos sintticos, como procana e lidocana, que vieram a substituir a cocana para uso medicinal. Em 1906 foi introduzida a nova legislao de controle nos EUA (leis estaduais e a lei federal denominada Pure Food and Drug Act, de 1906). Esta nova lei federal publicada pelo FDA (Food and Drug Administration) obrigava a classificar e regular drogas potencialmente nocivas e aditivos em medicamentos. A cocana caiu na categoria de potencialmente prejudicial e isso serviu para atenuar algumas das falsas alegaes sobre os efeitos benficos da cocana. Na Primeira Conveno Internacional sobre Drogas, realizada em Xangai em 1909, a Comisso do pio regulamentou a produo e a comercializao da cocana. Durante a Conveno Internacional do pio, realizada em Haia em 1912, um acordo internacional foi assinado, entrando em vigor em 1915, por meio do qual a cocana passou a ser controlada. Essa conveno tinha o objetivo de reduzir as remessas de entorpecentes que no eram usados para fins mdicos e, assim, o referido acordo emergiu como um instrumento verdadeiro de controle internacional. A partir de 1920, o controle internacional de drogas tornou-se parte das tarefas assumidas pela Liga das Naes. Sob seus auspcios, trs principais convenes foram realizadas: a Conveno de 1925 (por meio do qual a ecgonina e todos os seus derivados, utilizados como precursores na sntese da cocana foram submetidos a controle internacional), a Conveno de 1931 e a Conveno de 1936. Estas forneceram as bases para a prtica das operaes internacionais de controle de drogas, e, certamente, muito progresso foi feito na reduo do comrcio legal de entorpecentes durante este perodo. Os marcos seguintes foram a Conveno nica de Entorpecentes em 1961, que proibiu a produo, comercializao e uso de todos os narcticos, a no ser para fins mdicos e expandiu o controle s folhas de coca; a Conveno sobre Substncias Psicotrpicas, de 1971; e a Conveno das Naes Unidas contra o Trfico Ilcito de Entorpecentes e Substncias Psicotrpicas, de 1988. Cada uma dessas convenes respondeu a evolues especficas ou no resolvidas e acrescentou novos elementos para os regimes de controle. A Conveno de 1988 alm das proibies sobre a cocana e o cultivo dos arbustos de coca, instituiu o controle sobre precursores qumicos e solventes utilizados por laboratrios clandestinos de refino e estabeleceu bases para a
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colaborao entre as autoridades policiais das diversas naes no combate ao narcotrfico.

1.2. Botnica das plantas de coca


A famlia Erythroxylaceae constituda por quatro gneros: Aneulophus, Erythroxylum, Nectaropetalum e Pinacopodium. O gnero Erythroxylum contm cerca de 230 espcies de rvores tropicais e arbustos, sendo que aproximadamente 187 so nativas da regio neotropical, que abrange a parte sul da Amrica do Norte, e as Amricas Central e do Sul. As demais espcies esto distribudas em outras regies tropicais da frica e Madagascar.8 A cocana foi detectada em 23 espcies selvagens de Erythroxylum com teores inferiores a 0,001% para todas as espcies, exceto para a Erythroxylum laetevirens, encontrada na Venezuela, em que um teor 10 vezes maior foi determinado. Alm disso, tambm foram detectadas cinamoilcocanas, nesta ltima espcie9. Neste mesmo estudo, em plantas coletadas no Brasil, foram detectados entre 0,0001% e 0,0005% de cocana nas espcies Erythroxylum deciduum, Erythroxylum pulchrum, Erythroxylum frangulifolium, Erythroxylum subrotundum, e entre 0,001 e 0,005% de cocana na espcie Erythroxylum andrei. Porm somente quatro variedades de duas espcies: Erythroxylum coca var. coca (ECVC), Erythroxylum coca var. ipadu (ECVI), Erythroxylum novogranatense var. novogranatense (ENVN) e Erythroxylum. novogranatense var. truxillense (ENVT) apresentam maiores teores de cocana. Estas foram domesticadas em tempos pr-colombianos e so normalmente cultivadas para a produo de cocana10 (Figura 1), representando cerca de 97% da produo mundial1.

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CH3

N CO2CH3

7 6

1 5 4

3' 2' 4' 5' 6'


O

H O

3
H

Cocana
Figura 1 - Estrutura qumica da cocana.

As folhas destas quatro variedades, conhecidas como folhas de coca, apresentam teores de alcaloides totais (cerca de 20 substncias qumicas diferentes) que variam de 0,5% a 1,5%, dos quais aproximadamente 75% so correspondentes cocana. A Tabela 111 ilustra o teor de cocana encontrado nas espcies de Erythroxylum cultivadas.

Tabela 1 - Teor de cocana em folhas de coca em funo da espcie de Erythroxylum. Espcie/Variedadea E. coca var.coca E. coca var. ipadu E. novogranatense var. novogranatense E. novogranatense var. truxillense
a b

Teor de cocanab 0,23 0,96 0,11 0,41 0,55 0,93 0,42 1,02

Mdia 0,63 0,25 0,77 0,72

Amostras analisadas: ECVC (N=30), ECVI (N=6), ENVN (N=3), ENVT (N=14). em mg/100 mg de folhas secas.

Em 1997, foi publicado um estudo que apresentou a determinao do teor de cocana em 110 amostras de folhas de E. coca var. coca, oriundas de regies da Bolvia.12 Os resultados obtidos foram coerentes com os constantes da Tabela 1, tendo sido obtidos teores de cocana de 0,33 mg/100 mg (Yungas) e 0,32 mg/100 mg (Chapare), na estao chuvosa, e 0,60 mg/100 mg (Yungas) e 0,50 mg/100 mg (Chapare), na estao seca.

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A maior parte das folhas de coca cultivada em florestas tropicais nas encostas e vales orientais da Cordilheira dos Andes, ocupando reas da Bolvia, do Peru, do Equador e da Colmbia. A Figura 2 mostra a fotografia de um arbusto de Erythroxylum coca e uma representao esquemtica de suas folhas, com destaque para as duas linhas que se alongam paralelamente nervura central das folhas.

(b) (a)

Figura 2 - Arbusto de Erythroxylum coca var. coca.(a) fotografiaii. (b) desenho esquemtico.12

Existem poucas informaes sobre a funo natural da cocana nas plantas. Segundo Nathanson e colaboradores13, este alcaloide tem propriedades inseticidas em concentraes que ocorrem normalmente em plantas nativas, devido potencializao da neurotransmisso octopaminrgica dos insetos. 1.2.1. Erythroxylum coca var. coca4,10 Uma das principais variedades cultivadas na Amrica do Sul e que j foi a maior fonte de cocana para o comrcio ilcito at a dcada de 1990 a Erythroxylum coca var. coca, tambm conhecida como hunaco coca ou coca boliviana. um arbusto, cuja estatura atinge entre 1 e 3 m, cultivado principalmente entre 500 e 1.500 m, podendo atingir 2.000 m em algumas reas, em regies de
ii

USDA, NRCS. 2011. The PLANTS Database (http://plants.usda.gov, 8 June 2011). National Plant

Data Team, Greensboro, NC 27401-4901 USA. 6

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floresta tropical mida, nas encostas e vales orientais da Cordilheira dos Andes. Geograficamente, a ocorrncia da ECVC se estende do sul do Equador Bolvia, no sendo encontrada na Colmbia nem na Amaznia. Somente no Equador, onde se encontra floresta tropical mida dos dois lados dos Andes, ocorre tambm nas encostas ocidentais. Pode ser encontrada como plantas selvagens em regies prximas ou distantes das plantaes de coca, sendo normalmente impossvel distinguir plantas de ECVC selvagens daquelas cultivadas pelo homem. Acredita-se que a ECVC seja a nica de ocorrncia natural e selvagem, sendo, a partir dela, por interveno humana, derivadas as outras trs variedades de Erythroxylum: ECVI, ENVN e ENVT. O cultivo da ECVC realizado em plantaes de tamanhos variados em encostas ngremes de montanhas ou em vales ao longo dos Andes. Esta uma rea de precipitao geralmente elevada e solos frteis, coberta naturalmente por floresta tropical. Os arbustos so plantados em fileiras, em terraos cuidadosamente preparados. Terraos de coca so especialmente evidentes nos antigos distritos de coca de Cuzco, no Peru, e Yungas, na Bolvia. Em novas reas de expanso da produo de coca, como o Vale Huallaga, no Peru, e Chapare, na Bolvia, o terraceamento menos importante e os arbustos so simplesmente plantados em fileiras em encostas limpas recentemente. Na Bolvia, as duas principais regies de cultivo de coca so as florestas midas de montanha tropical ao longo das encostas orientais dos Andes, chamadas de Yungas, no departamento de La Paz (elevao: 1.000-2.000 m), e as plancies midas do Chapare, no departamento de Cochabamba (elevao: <500 m).12 A ECVC cultivada semeando-se viveiros, sendo as mudas depois transplantadas para os locais definitivos. Uma vez estabelecida, uma plantao de coca produzir sua primeira colheita em 1-2 anos e chegar produtividade mxima em cerca de cinco anos. As plantas podem manter-se produtivas por at 40 anos e de 5 a 10 anos aps o plantio, as plantas so geralmente arrancadas ou cortadas prximas do nvel do solo, devido diminuio dos teores de cocana nas novas folhas de plantas mais velhas. Na colheita das plantas de ECVC, todas as folhas so retiradas da planta com as mos e deixadas secar ao ar livre imediatamente, para evitar a decomposio e

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preservar o teor de cocana. Normalmente, a colheita ocorre a cada trs meses, sob condies climticas favorveis, embora tenham sido relatadas colheitas ocorrendo a cada dois, quatro meses ou cinco vezes por ano, conforme resumiu Acock14. A ECVC possui casca de colorao vermelho-amarronzada, folhas dispostas de maneira espiral, rgos florais de cor branca (ou amarelada) nas axilas, e frutas pequenas e vermelhas. 1.2.2. Erythroxylum coca var.ipadu4,10,15 O Brasil, embora no figure entre os maiores produtores de cocana, tambm possui na regio amaznica condies climticas favorveis ao plantio da espcie Erythroxylum coca. A variedade chamada de Ipadu, Patu ou Epadu (Erythroxylum coca var. ipadu), encontrada na regio norte do pas (Acre, Amazonas e Par8), a apresenta teor de cocana mais baixo, conforme Tabela 1, o que provavelmente uma das razes pela qual o extrativismo ilcito dessa substncia no seja considerado vivel e, praticamente, no tenha sido observado no pas. A ECVI est intimamente ligada ECVC, da qual se originou em tempos relativamente recentes. Essa variedade era cultivada em pequena escala, em pequenas parcelas de floresta por uma srie de tribos indgenas do alto Amazonas, principalmente na sua parte ocidental, em partes da Colmbia, do Equador, do Peru e do Brasil. propagada por estaquia e no por sementes, e as plantaes inteiras podem representar um nico clone e, como tal, est bem adaptada ao padro de agricultura itinerante praticada por povos seminmades da regio amaznica. A ECVI no encontrada na forma de indivduos selvagens e pode ser considerada um cultivo. A ECVI era desconhecida dos europeus at meados do sculo XVIII. Detalhes do seu cultivo, uso e distribuio geogrfica no foram registrados at o sculo passado. A ECVI no tem registro arqueolgico que determine a data de sua origem na Amaznia. Baseado em evidncias lingusticas, etnogrficas, histricas e botnicas, esta variedade parece ter apresentado desenvolvimento relativamente recente. Parece certo que a ECVI evoluiu da ECVC introduzida por indgenas dos Andes por meio da seleo de caractersticas favorveis ao seu cultivo na Amaznia e encontra-se geograficamente isolada de outras variedades de coca cultivadas da regio andina.
8

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At meados da dcada de 1970, no houve produo comercial de coca na Amaznia. No entanto, os traficantes de cocana da Colmbia, em seguida, descobriram o cultivo de coca entre algumas tribos amaznicas. Os traficantes descobriram que teriam mais facilidade em produzir a cocana clandestina em regies amaznicas planas e remotas do leste e sudeste da Colmbia, o que compensaria o fato de esta variedade possuir teores menores de cocana. 1.2.3. Erythroxylum novogranatense var. novogranatense4,10 Existem evidncias que sugerem que a espcie Erythroxylum novogranatense tambm surgiu como uma planta domesticada por meio da seleo humana de ECVC. A E. novogranatense var. novogranatense conhecida como "coca colombiana". As duas variedades da Erythroxylum novogranatense so mais fortemente diferenciadas uma da outra que a ECVC da ECVI. Isto sugere um maior isolamento entre as variedades e uma diferenciao mais antiga da E. novogranatense com relao s variedades de E. coca. As duas variedades de E. novogranatense so conhecidas atualmente apenas como plantas cultivadas, so bem adaptadas s condies ridas e geralmente so cultivadas em reas onde a E. coca no sobreviveria. A E. novogranatense difere fundamentalmente da E. coca nos teores de alcaloides e flavonoides. Por exemplo, ambas as variedades de E. novogranatense produzem altos nveis de cinamoilcocanas, que so encontradas apenas em pequenas quantidades na E. coca. A ENVN difere morfologicamente das outras variedades por sua folhagem brilhante verde-amarela e pela falta de estpulas persistentes. Tal como a EVNT, esta variedade est bem adaptada s condies ridas e geralmente cultivada nos vales mais secos, interandinos da Colmbia e ao longo da costa do Caribe. No incio da dcada de 1980, contudo, era cultivada principalmente por algumas tribos indgenas isoladas, principalmente na Serra Nevada de Santa Marta, e nos departamentos de Santander, Cauca e Huila, a cerca de 1.800 m de altitude. Arbustos de ENVN no so cultivados em fileiras de terraos, como a ECVC, mas sim em pequenas parcelas em terreno plano ou levemente inclinado. Os arbustos so muito espaados e podem crescer muito em comparao com ECVC.

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Por apresentar um alto teor de alcaloides difceis de serem extrados das folhas de coca, por muito tempo a ENVN foi pouco cultivada para produo de cocana. A ENVN tambm utilizada para a mastigao e, na medicina caseira. Alm disso, comumente plantada como planta ornamental ao longo dos Andes na Colmbia. Ao contrrio das outras trs variedades de coca, a ENVN bastante resistente e tolerante a diversas condies ecolgicas. Por esta razo, foi a variedade introduzida amplamente na horticultura no sculo passado e distribuda para muitos pases tropicais, tanto como planta ornamental como fonte de cocana. Durante a primeira parte do sculo XX, tornou-se uma importante fonte de lucro para Java, onde foi introduzida por agricultores holandeses. Na Amrica do Sul, a ENVN est isolada geograficamente de outras variedades de coca, em contraste com os padres de distribuio mais complexos vistos para a EVCV. Esse isolamento levou a mudanas fundamentais na sua qumica de flavonoides e biologia reprodutiva. 1.2.4. Erythroxylum novogranatense var. truxillense4,10 A E. novogranatense. var truxillense, que tambm conhecida como "a coca de Trujillo", cultivada nos vales dos rios da costa norte do Peru entre 200 e 1.800 m de altitude, e prximo dali no vale rido de Maraon. Uma populao cultivada separada foi observada na provncia de Carchi no noroeste do Equador. Ela cultivada hoje em uma escala relativamente pequena para mascar coca, e no norte do Peru, como um extrato aromtico do refrigerante Coca-Cola. Apesar de a ENVT ser um arbusto muito resistente seca, ele ainda requer alguma irrigao. Nos tempos pr-colombianos, as plantas foram cultivadas em terraos irrigados nos lados dos vales dos rios em toda a costa do Peru. Hoje, as plantaes tendem a ocorrer em reas planas no fundo do vale onde as plantas so regadas com canais de irrigao. Nas plantaes os arbustos de ENVT so bem afastados devido escassez de gua, assim os arbustos individuais crescem muito e de maneira densa. Estes arbustos relativamente grandes so capazes de resistir secas severas, apresentando resistncia superior da maioria das outras plantas cultivadas na rea. As folhas de ENVT so menores, mais claras e mais frgeis que as folhas de E. coca. Por conter mais substncias aromatizantes no encontradas em E. coca, a
10

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ENVT foi valorizada no sculo XIX pelas indstrias farmacuticas europeia e norteamericana. Por ser mais difcil extrair e cristalizar cocana de suas folhas, esta variedade no comumente usada para produo comercial4. A ENVT est isolada geogrfica e ecologicamente das outras variedades de coca. Com base em relaes genticas e geogrficas, altamente sugestivo que a ENVT evoluiu diretamente da E. coca var. coca com uma seleo intensiva para o cultivo em ambientes secos, possivelmente por apresentar folhas mais delicadas e saborosas e um arbusto com mais folhas. A ENVT posteriormente deu origem variedade ENVN colombiana no norte dos Andes, em condies semelhantes de isolamento geogrfico e de contnua seleo humana. Existem poucas informaes sobre quais variedades so plantadas atualmente para a produo ilcita de cocana na Colmbia. Segundo trabalho publicado por Casale16, em 2007, sobre o efeito de glifosato, um herbicida que tem sido utilizado para erradicao area de cultivos de coca, foram coletadas amostras de plantaes de coca na regio de Putamayo (sul da Colmbia), sendo que dos 80 campos de cultivo investigados, 45 eram de ECVI, 34 de ENVN e 1 de ENVT.

1.3. Principais alcaloides presentes nas folhas de coca


A cocana , possivelmente, o mais conhecido entre todos os alcaloides tropnicos, principalmente em virtude do seu uso como droga de abuso. Os alcaloides tropnicos so produzidos por um grande nmero de plantas da famlia Erythroxylaceae, e apresentam uma estrutura bicclica em comum, denominada 8-metil-8azabiciclo[3,2,1]octano. Pode-se considerar que esta estrutura bicclia formada pela fuso da pirrolidina e da N-metil piperidina. Os alcaloides tpicos das folhas de coca possuem um ncleo de ecgonina e um cido tropanol-carboxlico. Os alcaloides naturais so todos steres metlicos, pela carboxila da ecgonina, sendo que sua hidroxila alcolica encontra-se esterificada pelos cidos benzico, cinmico ou truxlico. O poder anestsico desses alcaloides relaciona-se a esta estrutura em particular, e mostra-se presente somente nos casos em que se encontrem simultaneamente esterificadas a carboxila e a hidroxila por um cido carboxlico especfico, cuja natureza determina suas propriedades fisiolgicas. Por esta razo, a
11

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ecgonina, a benzoilecgonina e a metilecgonina no possuem propriedades anestsicas. O grupo de alcaloides encontrados apenas em folhas de coca pode ser classificado em trs tipos bsicos, segundo Bacchi17: derivados da ecgonina: cocana, cinamoilcocana, truxilinas, benzoilecgonina, metilecgonina (Figura 3); - derivados da tropina: tropacocana e valerina, diferenciados dos anteriores pela ausncia da carboxila em C-2 e posio da hidroxila (Figura 3); - derivados da higrina: higrina e cusco-higrina, caracterizam-se pelo anel Nmetil-pirrolidina monocclico (Figura 4).
CH3 N CO2CH3 H O O CH3 N CO2CH3 H O

H H H

trans-Cinamoilcocana

cis-Cinamoilcocana

CH3

CH 3

N CO2CH 3

CH 3 O O H CH 3

O O

CH3

Tropacocana

3',4',5'-Trimetoxicocana

CH 3

N COOH

CH 3

CH 3 N CO2 CH 3

N COOH

H OH

H OH H

H O

Ecgonina

Metilecgonina

Benzoilecgonina

Figura 3 - Principais alcaloides com ncleo tropnico presentes nas folhas de coca.

12

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CH3 CH3

CH 3

CH 3

Higrina

Cusco-higrina

Figura 4 - Higrina e cusco-higrina, alcaloides presentes nas folhas de coca.

Os teores de alguns desses alcaloides, em folhas de coca, em relao cocana e ao pas de origem, esto sumarizados na Tabela 2, adaptado de Moore18.
Tabela 2 - Teores de alguns alcaloides, em folhas de coca, em funo do pas de origem.a
Pas Bolvia Peru Equador Colmbia
a

cis-Cinamoilcocana 8,6 5,8 6,6 28

trans-Cinamoilcocana Tropacocana 6,0 2,9 7,4 33 0,34 0,25 1,6 4,9

Cuscohigrina 78 51 11 33

Os teores dos alcaloides esto apresentados em % (m/m) relativos cocana.

Apesar de estarem presentes em teores significativos nas folhas de coca, nenhuma publicao reportou a presena da higrina e da cuscohigrina em amostras de cocanaiii refinada de origem ilcita. Como estes alcaloides so removidos durante o processo de refino da cocana, eles no tem tido relevncia nas metodologias de caracterizao qumica de amostras de cocana refinada.

1.4. Truxilinas
As truxilinas so um grupo de 11 estereoismeros presentes nas folhas de coca, que so extradas juntamente com a cocana e outros alcaloides durante o processo de refino. Na Figura 5 a seguir pode-se observar a estrutura qumica destes alcaloides.

O termo amostra de cocana ser utilizado frequentemete se referindo a uma mistura de diluentes, adulterantes e alcaloides e a substncia cocana, que na maioria dos casos a substncia majoritria. Trata-se do produto traficado, da forma que foi apreendido pelas foras policiais. 13

iii

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CH3

CO2CH3 H O H H Ph H O H H3CO2C N H 3C O H H Ph O H CH3 N H 3CO 2C H H O Ph O H H N H H H O Ph O H CO2CH3 H3C CH3 N H3CO2C H H O Ph O H Ph H H H O H3CO2C H O H N H3C

truxilina

truxilina
CH3

truxilina

CH3 N H3CO2C H O Ph O H O H H H H Ph

CH3

CO2CH3 H

CO2CH3 H O H Ph H H Ph O O H H O H N

H3C H CO 2CH 3 Ph

O H

O Ph O H H3CO 2C N H

O H

H3CO2C N H3C

truxilina truxilina
CH3 N CO 2CH3 H N H3C CH3 N H 3CO2C H H O Ph O H Ph H O H H H H O H CO 2CH3 H O H H3CO2C N O N H3C H H Ph H H O O Ph

H3C

truxilina

CH3 N H3CO 2C H O Ph O H H H H O

H3CO2C H O

Ph

neotruxilina

truxilina epi -truxilina

H 3C

CH3

CO 2CH 3 H O H H Ph H H O Ph O H O H H3CO2C N H3C H H H Ph H H H Ph CH3 N CO2CH3 H O O O N H3C

H3CO2C H O H

peri truxilina

truxilina

Figura 5 - Estruturas dos 11 ismeros de truxilinas. 14

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Os primeiros compostos truxlicos naturais descritos em plantas foram os alcaloides conhecidos como truxilinas. As mais abundantes, - e -truxilinas, foram isoladas e identificadas a partir de folhas de coca cultivadas, no final do sculo 19. No final da dcada de 1980, todos os ismeros das truxilinas foram detectados em amostras de cocana refinada de origem ilcita19,20. Dados quantitativos mais detalhados sobre o teor de truxilinas em folhas de coca de origem sul-americana foram publicados em 1994, por Moore et al.18 (Tabela 3). Tem-se muito pouca informao a respeito do teor de truxilinas e outros alcaloides tropnicos na cocana traficada no Brasil e em alguns pases sul-americanos. Somente alguns resultados preliminares foram publicados por Moore et al.21 (Tabela 4), que tambm concluram que o teor do ismero Mu das truxilinas insignificante em amostras de cocana ilcita, e, portanto, no consta nas Tabelas a seguir.

Tabela 3 - Teor de truxilinas em folhas de coca cultivadas na Amrica do Sul.a Truxilina AlfaBetaDeltaEpsilonOmegaGamaNeoPeriZetaEpiTotal
a

Bolvia
0,74 0,62 0,46 0,30 0,11 0,11 0,09 0,05 0,03 0,02 2,53

Peru
0,87 0,74 0,50 0,35 0,15 0,15 0,11 0,05 0,05 0,02 2,99

Equador
3,51 3,22 1,82 1,36 0,84 0,64 0,61 0,33 0,50 0,21 13,04

Colmbia
20,4 14,5 9,2 6,2 2,8 2,5 2,4 1,4 1,2 0,64 61,2

Os teores de truxilinas esto apresentados em % (m/m) relativo cocana.

15

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Tabela 4 - Teores mdios de truxilinas em amostras ilcitas de cloridrato de cocana da Amrica do Sul.a,b
Pas AlfaBetaDeltapsilonMdia OmegaGamaZetaEpiPeri- + Neo0,07 0,08 0,09 0,20 0,22 Total

Peru Bolvia Brasil Equador Colmbia


a b

0,41 0,51 0,63 1,21 1,33

0,43 0,49 0,54 1,05 1,07

0,21 0,25 0,27 0,46 0,51

0,15 0,19 0,22 0,34 0,39

0,05 0,07 0,09 0,19 0,23

0,04 0,05 0,07 0,15 0,19

0,04 0,01 0,01 0,04 0,04

0,01 0,02 0,02 0,03 0,03

1,38 1,66 1,92 3,66 4,01

Teores de truxilinas esto apresentados em % (m/m) relativo cocana. Amostras analisadas: Peru (N=16), Bolvia (N=19), Brasil (N=14), Equador (N=16) e Colmbia

(N=52).

As truxilinas so sintetizadas naturalmente nas folhas de coca por meio de uma fotodimerizao 2+2 das cis- e/ou trans-cinamoilcocana. Essa ciclizao favorecida pela radiao solar ultravioleta (UV) a que a planta est exposta (Figura 6).

CH 3

CH3 CO2CH 3 H O O

CO 2CH3 H O O

h
H O O H H3CO 2C N

H O O H H 3CO2 C H 3C N

H3 C

2 Cinamoilcocanas

Truxilina

Figura 6 - Formao de truxilinas nas plantas de coca via fotoadio catalisada por UV.

As espcies de Erythroxylum que so cultivadas para a produo de cocana evoluram e crescem em ambientes de alta incidncia de radiao UV. Nveis desta radiao geralmente aumentam com a elevao da altitude e com o decrscimo da

16

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

latitude, que exatamente a situao dos locais onde ocorre a maioria dos cultivos de folhas de coca na Amrica do Sul. Lydon et al.22 demonstraram que ambientes com elevado ndice de radiao UV podem alterar significativamente a razo de teores de truxilina/cinamoilcocana em folhas de E. novogranatense var. novogranatense. Os autores confirmaram uma diminuio dos nveis de trans-cinamoilcocana e de cis-cinamoilcocana nas folhas das plantas expostas radiao UV em comparao quelas no expostas. J os nveis de truxilinas apresentaram comportamento oposto, ou seja, aumentaram nas folhas das plantas expostas radiao UV em relao quelas no expostas. Alm disso, a proporo entre truxilinas e cinnamoilcocanas totais nas folhas aumentou significativamente com a maior exposio aos raios UV. Os resultados comprovaram que a radiao UV est envolvida na formao das truxilinas a partir das cinamoilcocanas. Este fato explica a razo de o teor de truxilinas ser um importante componente para a determinao da origem geogrfica de amostras de cocana. Assim, a razo de teores de truxilinas/cinamoilcocanas pode ser uma informao mais til para determinao de origem das folhas de coca, do que o simples resultado de teor total de truxilinas. Segundo Costa23, as truxilinas no possuem propriedades anestsicas e atuam como violentos venenos para o corao e podem ser consideradas graves impurezas da cocana.

1.5. Propriedades da cocana


1.5.1. Propriedades fsico-qumicas O nome da cocana definido pela IUPACiv ster metlico do cido [1R(exo,exo)]-3-(benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxlico. resumidas na Tabela 5. Algumas caractersticas fsicas e qumicas desse alcaloide e de seu sal mais comum esto

IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry - Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada (UIQPA). 17

iv

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Tabela 5 - Algumas caractersticas fsicas e qumicas da cocana base e do cloridrato de cocana.24


Forma de Apresentao Frmula Molecular Massa Molar (g. mol ) 303,4 339,8
-1

Caractersticas de p.f. ( C)
o

pK H2O pKb = 5,4 pKa = 8,6 i s

solubilidade MeOH s s Et2O s i CHCl3 s s

Cocana Cocana.HCl

C17H21NO4 C17H21NO4.HCl

96-98 195-197

Notas: s, solvel; i, insolvel.

A estrutura ster importante, pois este grupo funcional facilmente hidrolisado durante o seu metabolismo e excreo no organismo. A cocana em presena de gua ou de substncias alcalinas ou cidas sofre hidrlise parcial ou total, como mostrado na Figura 7.

CH 3

CO2CH3 H O H O

CH3

Hidrlise cida

COOH H OH H

HO O

CH3OH
Metanol

Cocana Hidrlise cida

Ecgonina

cido Benzico

Hidrlise Neutra ou Bsica

Esterificao

CH3

CH3 COOH H O H O

CO2CH3 H OH H H3C O

Benzoilecgonina

Metilecgonina Benzoato de Metila (odor de cocana)

Figura 7 - Reaes de hidrlise da cocana.

18

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

A ecgonina, a benzoilecgonina, e a metilecgonina (ou metil ster da ecgonina) podem ser encontradas nas folhas de coca, porm acredita-se que no sejam extradas juntamente com a cocana nas etapas do processo de refino. A presena recorrente destes alcaloides nas amostras de cocana refinada deve-se principalmente s reaes de hidrlise da cocana (Figura 7). Alm daqueles alcaloides, essas reaes de hidrlise podem gerar metanol, cido benzico e benzoato de metila, substncia responsvel pelo odor caracterstico de cocana. A cocana na forma de base livre muito mais suscetvel ao processo de hidrlise, enquanto o cloridrato de cocana mais estvel. Este fato pode ser facilmente observado em amostras de cocana base apreendidas e armazenadas por mais tempo. A cocana uma base fraca, capaz de reagir com solues aquosas de cidos, orgnicos ou inorgnicos, formando sais, como o cloridrato de cocana e o sulfato de cocana. Essa rpida reao qumica (Figura 8) uma das mais eficazes ferramentas para se realizar o isolamento de alcaloides de matrizes complexas, j que, normalmente, as propriedades de solubilidade dos produtos so antagnicas s da base livre correspondente.

CH3

H3C N CO2CH3 H O

ClN
+

H CO2CH3 H

+ HCl
O

Cocana

Cloridrato de cocana

Figura 8 - Formao do cloridrato de cocana.

1.5.2. Efeitos farmacolgicos1,17,23 A cocana pode ser absorvida a partir de todas as mucosas e membranas. Aplicada localmente, bloqueia o incio da conduo do impulso nervoso. O tomo de nitrognio, possivelmente na forma de ction, combina-se com receptores da membrana celular e bloqueia a conduo de ons sdio e potssio, impedindo assim
19

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

tanto a gerao como a conduo do impulso nervoso. A reduo no apetite tambm est relacionada ao anestsica local. A cocana um potente estimulante do sistema nervoso central (SNC). Seus efeitos estimulantes esto relacionados sua habilidade de inibir o transportador de dopamina, ligado a membrana (DAT). Ela inibe a monoaminoxidase (MAO), aumentando a noradrenalina e a serotonina, causando, portanto, midrase e vasoconstrio perifrica. Alm das aes citadas, a cocana inibe a recaptura de catecolaminas (norepinefedrina e dopamina) nas terminaes adrenrgicas, aumentando suas concentraes na sinapse. Este processo o principal responsvel pela estimulao do sistema cardiovascular e do SNC. No incio, ocorre uma sensao de bem estar e euforia. Aps pequenas quantidades de cocana, a atividade motora bem coordenada, com o aumento da dose podem ocorrer tremores e crises convulsivas. Os centros vasomotor e do vmito podem tambm participar da estimulao, provocando mese. Uma dose de 50 mg de cocana, por via oral, j provoca alucinaes. A estimulao central rapidamente seguida por depresso. Os centros medulares vitais so deprimidos, podendo resultar em morte por insuficincia respiratria. Em doses elevadas ocorre parania, ansiedade, comportamento estereotipado, alucinaes visuais, auditivas e tteis. A cocana por via endovenosa pode causar morte imediata por insuficincia cardaca, devido ao txica direta sobre o msculo cardaco. Aps a absoro, a cocana degradada pelas esterases plasmticas e pequenas quantidades so excretadas inalteradas pela urina. A cocana rapidamente metabolizada metilecgonina, bezoilecgonina, e, se etanol estiver presente, cocaetileno. Seu tempo de meia vida de 30 a 90 minutos, sendo usualmente detectada na urina at 36 horas aps seu uso. Por esta razo, os efeitos da cocana no organismo se dissipam mais rapidamente que os das anfetaminas, por exemplo.

20

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

1.6. Formas de apresentao da cocana


A cocana pode ser consumida e apreendida em algumas formas de apresentao. A seguir sero apresentadas as principais formas de apresentao, conforme definies adotadas pelo SEPLAB/INC/DITEC/DPF: Pasta base cocana na forma de base livre, primeiro produto obtido a partir da extrao de folhas de coca. Ao contrrio do nome poucas vezes se apresenta na forma pastosa, mas sim em p e/ou grumos. A preparao para o transporte, que muitas vezes envolve a prensagem do material, pode produzir pedras maiores, possibilitando (em uma anlise preliminar) confuso com a forma de apresentao crack. A diferenciao feita utilizando-se mtodos cromatogrficos: observa-se que o teor de cis e trans-cinamoilcocana maior do que na cocana base e do que no crack. Apresenta colorao bege ou amarelada mais escura. Consome-se na forma fumada pura ou fumada misturada com tabaco ou maconha. Cocana base cocana na forma de base livre a pasta base refinada, isto , que sofreu processos de oxidao ou lavagens (com permanganato de potssio ou etanol, por exemplo), que retiram significativamente os alcaloides cis e trans-cinamoilcocana. Apresenta colorao amarelada mais clara na forma de p e/ou grumos. Consome-se na forma fumada pura ou fumada misturada com tabaco ou maconha. Crack cocana na forma de base livre, de colorao marfim ou amarelada na forma de pedras. Sua manufatura envolve uma etapa de aquecimento onde a cocana base fundida e, quando resfriada, solidifica formando pedras. Ao contrrio da ideia corrente, o crack no um subproduto do refino, mas sim uma forma de apresentao preparada especialmente para mercados consumidores exclusivos, normalmente apresenta um baixo valor de mercado. Muitas vezes apresenta resduos de sais de sdio (sulfato, carbonato, bicarbonato) em sua constituio. A definio da forma de apresentao de uma amostra como crack depende da caracterstica da pedra fundida, que no frivel, isto , no se esfarela com facilidade (como as pedras de pasta base ou cocana base). Consome-se, principalmente, na forma fumada pura.
21

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Merla cocana na forma de base livre, apresentada na forma de pasta branca molhada, com altos teores de gua (at 70%) e de sais de sdio (sulfato, carbonato, bicarbonato). O grande teor de umidade propicia grande taxa de decomposio da cocana, formando majoritariamente benzoilecgonina. A merla uma forma de apresentao exclusivamente encontrada no Brasil, mais especificamente no Distrito Federal e entorno. Consome-se na forma fumada misturada com tabaco ou maconha.

Cloridrato de cocana cocana na forma de sal, na forma de p de colorao branca, destinado primordialmente ao uso por aspirao intranasal, tambm pode ser usado via intravenosa.

A Figura 9 mostra fotografias de trs formas de apresentao da cocana usualmente utilizadas no Brasil, retirado de Almeida25. (a) (b) (c)

Figura 9 - Formas de apresentao da cocana, (a) pasta base, (b) cloridrato de cocana e (c) crack.

Dependendo da sua forma de consumo a cocana leva diferentes tempos para ser absorvida e atingir o crebro humano: se a folhas de coca forem mastigadas e ingeridas a cocana leva 20 a 30 minutos; bebidas contendo cocana dissolvida se ingeridas oralmente leva de 15 a 30 minutos para atingir o crebro; por via intravenosa leva 30 segundos; p por via intranasal leva 3 a 5 minutos; fumada na forma de pedra (crack) de 5 a 8 segundos, mais rpido at que no consumo via intravenosa1. No inicio dos anos 1970, produtores sul-americanos de cocana perceberam que a pasta base de cocana poderia ser fumada sem destruir seus efeitos eufricos e estimulantes. A partir de ento, os traficantes comearam a produzir o crack, o termo vem do ingls crackling sound, devido ao som de estalos produzido, quando
22

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

as pedras so aquecidas. As pedras de crack podem ser produzidas a partir de cocana na forma de base livre ou de seu sal cloridrato. (Figura 13) A cocana fumada na forma de crack atinge o crebro to rapidamente que causa efeitos muito intensos antes de ser prontamente metabolizada. Esta rpida variao da concentrao de cocana no crebro gera um desejo dramtico pela droga e um padro de uso de compulso extrema. Conforme mostrado na Tabela 5, o crack, que est na forma de base livre, apresenta um ponto de fuso mais baixo, por isso pode ser aquecido facilmente em um cachimbo, e vaporizado a baixas temperaturas para ser fumado. A cocana base livre mais facilmente absorvida pelas clulas gordurosas do crebro, causando uma ao mais intensa. Os usurios tambm so capazes de tomar uma dose mais alta de cocana em um curto perodo de tempo, em virtude da grande rea superficial dos pulmes.

1.7. Processos de obteno da cocana a partir das folhas de coca10


Os procedimentos de obteno da cocana a partir das folhas de coca normalmente seguem duas etapas principais: a) extrao da cocana por imerso das folhas de coca em solues aquosas cidas ou alcalinas ou diretamente em solventes orgnicos; b) processos de purificao baseados em etapas de precipitaes e solubilizaes sucessivas, com o objetivo de branquear a cocana e aumentar seu grau de pureza. Tais procedimentos de extrao e purificao, independentemente de suas particularidades individuais, so conhecidos como refino da cocana, e tambm podem incluir as transformaes da cocana em suas diversas formas de apresentao. As etapas de refino podem ser executadas por diferentes laboratrios clandestinos localizados longe das plantaes de coca, e podem at estar em pases diferentes. Tambm podem existir situaes onde nem todas as etapas do refino at a obteno do cloridrato de cocana so executadas, de modo que podem
23

___________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________1. Introduo

ser comercializadas tanto a pasta pasta base quanto a cocana base para o mercado consumidor. H uma grande variedade de produtos qumicos capazes de atuar com eficincia em cada uma das etapas de refino, e que, portanto, poderiam poderia substituir os reagentes mostrados na Figura a seguir. A produo o ilcita de cocana envolve, envolve preferencialmente, solventes e reagentes mais baratos e de pronta disponibilidade, disponibilidade isto , com a escassez de determinado reagente, os traficantes utilizam outro. Os processos descritos critos nos fluxogramas a seguir (Figuras 10 a 14) so considerados os mais tradicionais e antigos descritos na literatura especializada.

Folhas de Coca (secas e trituradas)


CaO (cal)

Folhas de Coca (secas e trituradas)


H2SO4 diludo Filtrao

Folhas + soluo aquosa alcalina


Querosene, Retirar fase orgnica

Soluo aquosa cida


Na2CO3 + Querosene, Retirar fase orgnica

Querosene com cocana


H2SO4 diludo, Retirar fase aquosa

Querosene com cocana


H2SO4 diludo, Retirar fase aquosa

Soluo aquosa cida (sulfato de cocana)


Na2CO3 Filtrao

Soluo aquosa cida (sulfato de cocana)


Na2CO3 Filtrao

Pasta Base

Pasta Base

Extrao Bsica

Extrao cida

Figura 10 - Produo da pasta base de cocana.

24

___________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________1. Introduo

Pasta Base
H2SO4 diludo

Soluo aquosa cida (sulfato de cocana)


KMnO4 (soluo) Filtrao

Soluo aquosa cida (sulfato de cocana purificado)


NH4OH diludo Filtrao

Cocana Base Figura 11 - Produo da cocana base.

Cocana Base
ter Etlico Fitrao

Soluo aquosa cida (sulfato de cocana purificado)


HCl concentrado em acetona Filtrao

Cloridrato de Cocana Figura 12 - Produo do cloridrato de cocana.

25

___________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________1. Introduo

Cloridrato de Cocana
gua Filtrao

Pasta Base ou Cocana Base


HCl Filtrao

Soluo aquosa (cloridrato de cocana)


NaHCO3 Aquecimento Resfriamento

Soluo aquosa (cloridrato de cocana)


NaHCO3 Aquecimento Resfriamento

Crack Figura 13 - Produo do crack.

Crack

Pasta Base ou Cocana Base


Querosene

Querosene com cocana


H2SO4 diludo H2SO4 diludo

Soluo aquosa cida (sulfato de cocana)


Na2CO3

Merla Figura 14 - Produo da merla.

A produo de cocana base base a partir de pasta base realizada por meio de uma reao de oxidao (Figura ( 11), uma etapa de purificao, com o objetivo de extrair a cis e trans-cinamoilcocana e branquear a amostra para torn-la torn mais atraente para os consumidores. Neste processo, processo as cinamoilcocanas so transformadas em ecgonina, que facilmente separada da cocana em virtude das suas diferenas de solubilidade. No entanto, quando se utiliza permanganato de
26

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

potssio (KMnO4) a cocana tambm pode sofrer oxidao, conforme dois trabalhos publicados26,27 em 1991, em que foram detectados subprodutos deste processo. Atravs da oxidao da cocana so formados dois subprodutos principais N-formilcocana e norcocana (Figura 15). Alm disso, pela oxidao da cocana podem ser formados ecgonina, benzoilecgonina e metilecgonina, porm a principal fonte destes alcaloides nas amostras de cocana refinada a hidrlise.
O H CO2CH3 H O H

N CO 2CH 3 H O

N-formilcocana

Norcocana

Figura 15 - Alcaloides formados durante a oxidao da cocana.

1.8. Adulterantes e diluentes encontrados em amostra de cocana ilcita


Diversas substncias so adicionadas pelos narcotraficantes cocana com o objetivo de aumentar a sua massa, visando a proporcionar maior margem de lucro no comrcio da droga. Os adulterantes so substncias com efeito farmacolgico, que podem potencializar ou mimetizar algum dos efeitos da cocana no usurio. J os diluentes so inativos, ou seja, so substncias sem efeito farmacolgico, que visam apenas a diluir a cocana a ser comercializada. Qualquer substncia qumica que tenha aparncia semelhante cocana, principalmente em termos de colorao, pode ser utilizada. Por exemplo, aquelas que possuem propriedade anestsica, sabor amargo, e colorao esbranquiada so mais difceis de serem percebidas pelos usurios, j que apresentam propriedades similares ao do referido alcaloide.

27

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Apesar de diversos estudos laboratoriais terem descrito os efeitos da cocana no corpo humano e no tipo de dependncia que ela causa, a cocana de origem ilcita varia consideravelmente da cocana de grau farmacutico, que usada em ensaios laboratoriais deste tipo. Reaes adversas e outros riscos sade podem ocorrer quando outro componente farmacologicamente ativo encontrado junto com a cocana. importante ressaltar que os diversos mercados regionais e mundiais apresentam tendncias prprias, com variaes temporais e geogrficas provavelmente ditadas pela tentativa de ludibriar o consumidor potencializando os efeitos da cocana e/ou pela disponibilidade e preo de adulterantes e diluentes. Os adulterantes e diluentes mais comumente encontrados misturados a cocana podem ser divididos nas seguintes categorias:28,29 adulterantes: benzocana, cafena, fenacetina, lidocana, levamisol, diltiazem, hidroxizina, procana, tetracana, prilocana, efedrina, dipirona, cido acetilsaliclico, paracetamol (Figura 16); diluentes: acares e derivados: lactose, sacarose, glicose, manitol, amido, sorbitol; compostos inorgnicos: bicarbonato de sdio, carbonato de sdio, carbonato de clcio, sulfato de clcio, sulfato de magnsio, sulfato de sdio, cloreto de sdio, cloreto de magnsio, borato de sdio, cido brico; produtos diversos: produtos alimentcios (leite em p, amido de milho, farinhas em geral). Um grande nmero destes adulterantes tem efeitos toxicolgicos importantes que podem, em concentraes elevadas, amplificar os efeitos da cocana. As principais categorias de adulterantes so: estimulantes e anestsicos locais, que so absorvidos pela superfcie da mucosa e simulam o efeito da cocana; e sedativos, que so muitas vezes adicionados cocana para reduzir a intensidade de seus efeitos colaterais indesejveis.

28

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

O O NH2
Benzocana (Anestsico local)
O O O S N N O

O N O N N N

Cafena (Estimulante do SNC)

O N H

Diltiazem (Anti-hipertensivo)

Fenacetina (Analgsico)

N HO N O Cl

N N
Levamisol (Anti-helmntico)
O

Hidroxizina (Anti-histamnico e tranquilizante)

H N O

N
H2N

N O

Lidocana Procana (Anestsico local) (Anestsico local) Figura 16 Estruturas qumicas dos principais adulterantes de cocana encontrados

no Brasil.

29

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Em diversas provncias da Espanha entre 1985 e 1993, Barrio et al.30 selecionaram 9.681 amostras de cocana apreendidas para anlise. Somente amostras de Madrid e Sevilha foram investigadas para deteco de adulterantes. Em 1992 e 1993 a cafena foi basicamente o nico adulterante encontrado. Em anos anteriores (1985 a 1987) a lidocana foi o principal adulterante, encontrado em 69,6% das amostras em 1985, mas desapareceu nos ltimos dois anos do estudo. Piracetam tambm foi detectado em 10-25% das amostras nos anos de 1986 a 1988. Fucci e De Giovanni31 analisaram 156 amostras de cocana ilcita apreendidas em Roma, na Itlia, em 1996 e 1997. Foram detectados 14 adulterantes diferentes, com destaque para lidocana, encontrada em 16,5% em 1996 e 12,3% em 1997, para a cafena encontrada em 11% das amostras em 1996 e 6,1% em 1997 e para a fenacetina encontrada em 6,1% das amostras de 1997. E em 60% das amostras foram detectados diluentes, principalmente acares. Pesquisadores do Drug Enforcement Administration (DEA) nos Estados Unidos, em 2004, encontraram pela primeira vez em diferentes amostras de cocana, hidroxizina em teores variando de 2 a 20%. (Odeneal II et al.32) e diltiazem (na forma de sal cloridrato) em teores variando de 8 a 20% (Peters33). Alm desta descoberta, a primeira publicao sobre a deteco de levamisol em amostras de cocana foi em 2007, Valentino e Fuentecilla34 do Drug Enforcement Administration (DEA) descreveram que desde 2005 tm sido recebidas para anlise amostras contendo levamisol, que se tornou atualmente o principal adulterante encontrado em amostras de cocana nos EUA. Brunt et al.35 (2009) divulgou resultados do monitoramento de adulterantes adicionados a cocana na Holanda, no perodo de 1999 a 2007. Sendo que os principais adulterantes observados foram: benzocana, cafena, fenacetina, lidocana, levamisol, diltiazem, hidroxizina, procana, e atropina. O principal adulterante encontrado, desde 2003 foi a fenacetina, detectada em 40,6% das amostras em 2007. A partir de 2004, sugiram os novos adulterantes levamisol, diltiazem e hidroxizina, que a cada ano foram encontrados em maior nmero de amostras. Alm disso, outro dado importante que a porcentagem de amostras de cocana com adulterantes cresceu de 6,5% em 1999, para 53,6% em 2007.

30

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Maietti et al.29 (2009) detectaram diltiazem ou levamisol em nveis de trao, em 44,8% das amostras analisadas, no perodo de maro de 2006 a setembro de 2008 na rea de Padova, Itlia. Traos de levamisol e hidroxizina j haviam sido observados em amostras de cocana, em Roma em 2007.36 Em publicao de 2003, 209 amostras coletadas em 2001 no interior do estado de Minas Gerais, sendo 186 positivas para cocana, foram analisadas por Bernardo et al.37. Foram detectados os seguintes adulterantes e diluentes: cafena (50,2%), lidocana (65%), prilocana (11%), carbonatos/bicarbonatos (41,2%), amido (5,2%), glicose (11,5%), sacarose (14.8%), lactose (6,2%) e frutose (3,3%). Em 2003, Carvalho e Mdio38 analisaram 389 amostras de cocana ilcita apreendidas na cidade de So Paulo no ano de 1997. Observou-se uma grande variedade de diluentes: carbonatos/bicarbonatos em 19,3% das amostras, silicatos em 13,9%, amido em 5,6%, borato em 3,1%, sulfatos em 2,8% e aucares em 9,6%. Os principais adulterantes detectados foram lidocana, procana e cafena. Ainda em 2003 Almeida25, em um estudo detalhado sobre a composio de amostras de cocana apreendidas em diferentes estados do Brasil, observou que o principal frmaco presente como adulterante no estado do Amazonas (AM) em amostras de cocana a fenacetina; mas esse adulterante no foi encontrado em nenhuma das amostras do estado do Rio Grande do Sul (RS), onde a maioria das amostras foi diluda com a lidocana e cafena. Em 48,2% do total de amostras do AM foi detectada a adulterao com um ou mais frmacos enquanto no RS este valor foi de 60,9%. A Tabela 6 apresenta um detalhamento dos resultados.
Tabela 6 Frmacos presentes como adulterantes, em 51 amostras de cocana. Frmaco Cafena Lidocana Benzocana Fenacetina Dipirona
a b

Amazonasa
7,4% 11,1% 7,4% 40,7% ------

Rio Grande do Sulb


30,4% 56,5% 4,3% -----4,3%

23 amostras do Rio Grande do Sul. 27 amostras do Amazonas.

31

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Alm disso, Almeida observou, no mesmo trabalho, que a diluio com acares e derivados em amostras de cocana provenientes do AM menos comum: esses diluentes estavam presentes em somente 11,1% das amostras. Entretanto, 73,9% das amostras do RS foram diludas com acares e derivados, principalmente com manitol e sorbitol.

1.9. Trfico de drogas e a legislao brasileira


A rea mundial de cultivo de coca diminuiu 28% durante o perodo de 20002009. Em 2009, as plantaes de coca na Colmbia representavam cerca de 43% do cultivo mundial, enquanto no Peru representavam 38% e na Bolvia representavam 19%.39 O perfil da produo global de cocana mudou significativamente nos ltimas quatro dcadas. A partir do final da II Guerra Mundial at o final da dcada 1990, quase toda a folha de coca do mundo era cultivada no Peru e na Bolvia, e desde a dcada de 1970, a maior parte desta produo era refinada em cocana na Colmbia. As plantaes de coca aumentaram ao longo do tempo e, em 1997, o cultivo de coca na Colmbia superou o dos produtores tradicionais, pela primeira vez na histria. Em virtude de diversas aes tomadas pelo governo colombiano, como erradicao em larga escala, o cultivo de coca na Colmbia voltou a cair a partir do ano 2000, chegando a uma rea plantada de 62.000 hectares em 201039, uma reduo de 62% no perodo. Em compensao, no mesmo perodo as reas de cultivo de coca aumentaram tanto na Bolvia quanto no Peru, apesar disso a rea total de cultivo est apresentando uma tendncia de queda. (Figura 17)

32

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Figura 17 - Cultivo mundial de arbustos de coca, no perodo de 1990 a 2009. (Fonte: UNODC )

39

A produo mundial de cocana caiu aproximadamente 16% de 2007 para 2008, uma queda mais acentuada quando comparado com quatro anos anteriores em que se observou uma tendncia estabilidade da produo. Pode-se observar, ainda, que a queda da produo de cocana colombiana foi a responsvel por essa reduo na produo mundial (Figura 18).

Figura 18 - Produo mundial de cocana, no perodo de 1990 a 2008. (Fonte: UNODC )

39

Em virtude de sua posio estratgica na Amrica do Sul e de suas enormes fronteiras, o Brasil, apesar de no estar entre os grandes produtores de cocana, constitu-se no pas mais proeminente de trnsito desta droga nas Amricas40, em nmero de casos reportados de apreenses de cocana na Europa vindas do Brasil.

33

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

principalmente atravs dos portos e aeroportos brasileiros que a cocana produzida na Colmbia, no Peru e na Bolvia remetida para a Europa e frica. Acredita-se que os principais pontos de entrada da cocana colombiana so os estados do Amazonas e de Roraima, enquanto que da cocana peruana so os estados da Amazonas e do Acre, e, finalmente, da cocana boliviana so os estados do Acre, de Rondnia, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Paran. O transporte at o territrio brasileiro feito por vias terrestre, area e fluvial, e principalmente por via terrestre at os grandes centros urbanos e portos brasileiros, de onde a cocana exportada, predominantemente por via martima. Principais pontos de entrada e sada utilizados pelo narcotrfico e que incluem o territrio brasileiro so ilustradas na Figura 19.

Europa frica EUA

Figura 19 Pontos de entrada e sada de cocana, utilizadas pelo narcotrfico passando em territrio brasileiro.

O surgimento de novos voos internacionais em diversos aeroportos brasileiros tem aumentado as apreenses de cocana nestes locais, com traficantes tentando viajar com a droga escondida no corpo ou nas bagagens. Tradicionalmente estas

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

apreenses so realizadas majoritariamente nos aeroportos internacionais do Rio de Janeiro e So Paulo. Alm de se tratar de grande rota de trfico internacional, importante esclarecer que o Brasil constitui-se, para o narcotrfico, em um grande mercado consumidor. Parte da cocana proveniente dos pases produtores destina-se a abastecer o mercado brasileiro. O Brasil o pas com maior nmero de usurios de cocana na regio das Amricas do Sul e Central e Caribe, com 33% do total de usurios desta regio40. A Tabela 7, baseada em dados retirados do Sistema Nacional de Dados Estatsticos de Represso a Entorpecentes (SINDRE) da Polcia Federal (PF), em consulta realizada em junho de 2011, mostra os totais de cocana apreendidos pela PF nos ltimos cinco anos, em cada estado brasileiro. Levando-se em conta as apreenses de cocana de todas as polcias no Brasil, segundo o World Drug Report 201140, a quantidade de cocana apreendida no pas triplicou de 2004 (8 toneladas) a 2009 (24 toneladas), o que torna o Brasil o 8 pas do mundo em quantidade de cocana apreendida. Cabe ressaltar, que as amostras analisadas neste trabalho foram originrias dos estados com as maiores quantidades de cocana apreendida nos ltimos anos, alm das amostras do Distrito Federal, que foram includas pela pronta disponibilidade das mesmas por terem sido apreendidas na mesma cidade do laboratrio onde as anlises foram executadas.
Tabela 7 - Quantidade de cocana (kg) apreendida pela PF por estado nos ltimos 5 anos. a Estado 2010 2009 2008 2007 2006 AC 852 594 632 727 361 AL 134 39 11 32 5 AM 1.837 1.071 3.170 2.696 2.245 AP 48 14 272 30 22 BA 368 22 189 335 186 CE 718 483 640 478 577 DF 225 360 249 537 81 ES 455 213 251 388 170 GO 942 880 365 353 489 MA 136 72 91 223 126 MG 468 73 392 417 214 MS 2.987 2.163 1.678 2.038 1.813 MT 3.570 2.021 3.279 1.660 1.705
35

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

PA PB PE PI PR RJ RN RO RR RS SC SE SP TO TOTAL
a

291 95 109 38 1.004 759 154 1.446 84 870 237 368 8.791 81 11.153

496 116 123 25 4.386 104 34 2.097 6 178 193 0 2.623 383 18.768

949 98 66 73 634 634 187 1.211 43 250 794 55 4.748 371 21.332

1.050 840 103 83 953 390 178 2.133 58 476 217 49 2.150 18 18.610

863 30 81 25 923 279 125 953 326 222 359 0 18.269 14 30.463

Somadas todas as apreenses cadastradas como Cocana, Crack, Merla e Pasta Base.

O Brasil como pas membro das Naes Unidas (ONU) promulgou por meio do Decreto n 54.216, de 27/08/1964, a Conveno nica sobre Entorpecentes e aprovou no Decreto n 162, de 1991, o texto da Conveno contra o Trfico Ilcito de Entorpecentes e de Substncias Psicotrpicas de 1988. A preveno, a fiscalizao, o controle e a represso produo, ao uso e ao trfico ilcito de produtos, substncias ou drogas ilcitas que causem dependncia fsica ou psquica, assim relacionadas pelo Ministrio da Sade (MS), so regulamentados pela Lei n 11.343, de 23/08/2006 e pelo Decreto n 5.912, de 27/09/2006. O Ministrio da Sade por meio da Portaria n 344, publicada em 12/05/1998 pela Secretaria de Vigilncia Sanitria (SVS/MS), aprovou o Regulamento Tcnico sobre substncias e medicamentos sujeitos a controle especial, que regulamentou diversos nveis de controle a que esto sujeitos os produtos, substncias e drogas listadas e classificadas em seus anexos. As listas de substncias constantes do Anexo I - Listas de Substncias Entorpecentes, Psicotrpicas, Precursoras e Outras sob Controle Especial - so constantemente atualizadas por resolues publicadas pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA). A cocana e a ecgonina encontram-se relacionadas na Lista de Substncias Entorpecentes (Lista F1), de uso proscrito no Brasil, consideradas capazes de causar dependncia fsica e/ou psquica, de acordo com a Resoluo da Diretoria
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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Colegiada - RDC n 21 da ANVISA, de 17/06/2010, em conformidade com a Portaria n 344-SVS/MS, de 12/05/1998. Todos os sais e ismeros da cocana e da ecgonina, bem como todos os steres e derivados da ecgonina que possam ser convertidos em ecgonina e cocana, ganham a mesma classificao e so proscritos no Brasil. A Resoluo RDC n 21/2010-ANVISA/MS, em sua Lista de Plantas que Podem Originar Substncias Entorpecentes e/ou Psicotrpicas Lista E, estabelece ainda o controle sobre a planta Erythroxylum coca Lam., e ficam tambm sob controle, todas as substncias obtidas a partir das plantas elencadas acima, bem como os sais, ismeros, steres e teres destas substncias. A Lei n 10.357 de 27/12/2001, regulamentada pelo decreto n 4.262 de 10/06/2002, estabeleceu normas de controle e fiscalizao sobre produtos qumicos que direta ou indiretamente possam ser destinados elaborao ilcita de substncias entorpecentes, psicotrpicas ou que determinem dependncia fsica ou psquica. A Portaria n 1.274 de 25/08/2003, do Ministrio da Justia, alterada pela Portaria n 113 de 14/01/2004, submeteu a controle e fiscalizao os produtos qumicos relacionados nas suas Listas I, II, III, IV e nos seus respectivos Adendos, constantes do Anexo I. Finalmente, de acordo com a Lista de Insumos Qumicos Utilizados para a Fabricao e Sntese de Entorpecentes e/ou Psicotrpicos (Lista D2) constante da Resoluo RDC n 21/2010-ANVISA/MS, esto submetidos a controle 12 reagentes qumicos: acetona, cido clordrico, cido sulfrico, anidrido actico, cloreto de etila, cloreto de metileno, clorofrmio, ter etlico, metiletilcetona, permanganato de potssio, sulfato de sdio e tolueno. Os rgos governamentais das polticas nacionais de controle e represso ao narcotrfico so as polcias civis e militares, subordinadas aos governos estaduais, a Secretaria Nacional Antidrogas (SENAD), a SENASP (Secretaria Nacional de Segurana Pblica) a Polcia Federal e a Polcia Rodoviria Federal (PRF), rgos do Ministrio da Justia. Dentro desse contexto, a Polcia Federal responsvel pelo combate ao narcotrfico interestadual e internacional, pelo controle das fronteiras do pas e pelo

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

combate a evaso de divisas, sendo todos esses fatores componentes de um problema social maior, que o consumo e o trfico de drogas de abuso.

1.10. Perfil qumico da cocana


A investigao da composio qumica das drogas de abuso pode fornecer informaes muito importantes para os rgos de segurana pblica, tais como: a origem geogrfica da droga, se diferentes apreenses esto relacionadas quimicamente, o mtodo usado para processar esta droga, os reagentes qumicos que esto sendo usados no processo de refino, e os que esto sendo utilizados para diluir ou adulterar a droga29,41. Conforme mostrado anteriormente, alm de consumidor, o Brasil mostra-se tambm como importante rota de trfico de cocana, principalmente para a Europa. Todavia, no existem informaes cientificamente embasadas que possam relacionar diferentes apreenses e a origem geogrfica do produto de trfico. Os programas institucionais de perfil qumico de drogas de abuso podem determinar ou indicar a origem geogrfica de grande parte das apreenses e de possveis rotas de trfico, que, somadas s informaes tradicionais de investigao policial, direcionam em quais regies os rgos de segurana pblica tm que efetivamente concentrar seu combate ao narcotrfico. Segundo Moore e Casale42, esses principais objetivos que so buscados em um programa de perfil qumico de drogas de abuso podem ser resumidos da seguinte forma: a) Comparao de amostras pode-se correlacionar amostras apreendidas com diferentes traficantes ou em locais e momentos diferentes. As apreenses podem ser ligadas como sendo de um mesmo distribuidor ou de um mesmo lote de produo/refino. Embasando a investigao policial na formao de convico sobre a estrutura de uma organizao criminosa de narcotrfico; b) Origem geogrfica mais trabalhosa que a comparao entre amostras, e s faz sentido para drogas de origem vegetal, como cocana e maconha e no para drogas sintticas. A partir de amostras de referncia dos pases produtores estabelecido o perfil qumico de amostras de referncia
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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

oriundas dos diferentes produtores. Com esse perfil das amostras de referncia estabelecido possvel determinar ou indicar a origem geogrfica de amostras apreendidas rotineiramente. importante ressaltar que, sempre que possvel necessrio atualizar com novas amostras de referncia os perfis qumicos de cada localidade, visto que os mesmos podem sofrer variaes; c) Rotas de distribuio por meio da comparao de amostras e da determinao/indicao da sua origem geogrfica podem ser construdas rotas de distribuio de drogas de alguma organizao criminosa. Se forem apreendidas amostras de drogas correlacionadas (similares) quimicamente, em um determinado perodo de tempo, em pontos de fronteira, em diferentes estados e em portos/aeroportos, pode-se estabelecer ou ao menos sugerir como determinado traficante realiza a distribuio da droga; d) Avaliao dos reagentes qumicos analisar a composio das amostras de drogas com objetivo de identificar substncias precursoras ou intermedirias utilizadas no refino ou sntese, para o monitoramento dos produtos qumicos utilizados no processo de produo das drogas. Um resultado muito claro desta abordagem subsidiar os rgos de controle de produtos qumicos no pas, como a Polcia Federal, a reforar ou direcionar o controle mais restrito de determinados insumos qumicos mais comumente encontrados em amostras de determinadas drogas; e) Diferenciao entre droga de origem ilegal ou legal esta abordagem no muito importante no Brasil, j que as principais drogas de abuso traficadas no pas so de origem exclusivamente ilcita. Porm, tem por objetivo determinar se determinada amostra de droga apresenta compostos minoritrios em sua composio que permitam a diferenciao entre a origem ilegal ou a legal, por exemplo, na indstria farmacutica; f) Determinao de adulterantes com efeitos toxicolgicos muitas impurezas encontradas nas drogas de abuso tm efeitos srios na sade humana, a caracterizao das mesmas importante para que os rgos de vigilncia sanitria e hospitais possam tomar medidas que minimizem os efeitos destas substncias em usurios de drogas.
39

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

A cocana um dos principais focos de investigao dos laboratrios forenses no mundo, incluindo o Servio de Percias de Laboratrio e Balstica (SEPLAB) do Instituto Nacional de Criminalstica da Polcia Federal, em Braslia. Um primeiro estudo sobre diluentes e adulterantes presentes e comparao de amostras de cocana j foi realizado em nosso laboratrio em 200325. Muitas impurezas esto presentes nas amostras de cocana traficada e comercializada ilicitamente. Em geral este perfil de impurezas reflete a histria desta amostra. Durante o processo de refino da cocana, alcaloides minoritrios naturais, presentes na folha de coca, so extrados juntamente com a cocana. Alm destes componentes naturais, uma amostra de cocana composta tipicamente por: resduos de solventes, subprodutos gerados durante o processo de refino, e substncias qumicas utilizadas para diluir e adulterar a cocana. Desta forma, estas impurezas podem ser divididas em quatro categorias29: a) Compostos naturais: co-extrados a partir do material vegetal bruto, durante o processo de extrao da cocana; b) Impurezas e subprodutos: formados durante toda a cadeia de produo e distribuio da droga: i. ii. Formadas durante os processos de refino (incluem os alcaloides produtos de oxidao, e os solventes oclusos); Formadas durante o transporte, distribuio e armazenagem (incluem os alcaloides produtos de degradao da cocana). Um dos processos qumicos mais comuns a hidrlise da cocana, que usualmente ocorre nos grupos ster, em que so formados benzoilecgonina, metilecgonina, ecgonina e cido benzico, conforme mostrado na Figura 7. Outros alcaloides tambm podem ser hidrolisados nos grupos ster, como cinamoilcocana, tropacocana e truxilinas.

c) Diluentes e adulterantes: adicionados em qualquer ponto da cadeia de distribuio da droga, inclui os frmacos que so adicionados droga;

40

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

d) Artefatos gerados durante os procedimentos de anlise: o analista deve estar sempre atento a este tipo de interferentes artificiais para desconsider-los. Uma de suas fontes o injetor do cromatgrafo gasoso.

Os programas de perfil qumico de cocana, j estabelecidos em grupos forenses de outros pases, e publicados na literatura, realizam uma srie de anlises instrumentais, que juntas fornecem informaes para a determinao da origem geogrfica da cocana e comparao de amostras com objetivo de correlacion-las. As abordagens analticas para estabelecer o perfil qumico de cocana j foram detalhadamente revisadas em duas publicaes da dcada de 1990, por Moore e Casale42 (1994) e Chiarotti e Fucci43 (1999), porm desde ento alguns avanos foram publicados, e sero detalhados a seguir. 1.10.1. Teor e forma de apresentao da cocana A determinao do teor de cocana e a diferenciao da sua forma de apresentao entre sal cloridrato ou base livre so as primeiras etapas deste processo. Inmeras metodologias so utilizadas para quantificao de cocana44: cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) acoplada com detector de ultravioleta/visvel (UV/Vis)45 ou com espectrmetro de massas (CLAE/EM), cromatografia gasosa com deteco por ionizao em chama (CG/DIC)46 ou com deteco por massas (CG/EM), e por espectroscopia na regio do ultravioleta (UV), entre outros. um parmetro muito importante para que seja possvel comparar adequadamente os teores dos alcaloides minoritrios, naturais das folhas de coca, em diferentes amostras, j que esses alcaloides devem ser expressos em teores relativos ao teor de cocana para normalizar a comparao entre amostras muito adulteradas (com baixo teor de cocana e outros alcaloides) com amostras sem adulterao ou diluio. Alm disso, se a amostra encontra-se excessivamente adulterada ou diluda pode ser invivel realizar a comparao de amostras. E, finalmente, o teor de cocana pode ser usado como mais um parmetro de comparao entre amostras.
41

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

A determinao da forma de apresentao da cocana pode ser realizada facilmente atravs de testes de solubilidade com gua e ter etlico e testes de precipitao com cidos e bases. Esta diferenciao tambm pode ser realizada por Espectroscopia na regio do Infravermelho (FT-IR) ou por Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC), em virtude da grande diferena entre os pontos de fuso do cloridrato de cocana e da cocana base. 1.10.2. Alcaloides minoritrios A identificao de alcaloides minoritrios em amostras de cocana refinada vem sendo descrita na literatura desde pelo menos 1973, quando Moore47 descreveu a identificao da cis e trans-cinamoilcocana neste tipo de matriz. Desde ento inmeros artigos tem sido publicados sobre a descoberta de novos alcaloides de coca: naturais ou subprodutos do refino, ou com enfoque para determinao de perfil qumico de amostras de cocana baseado nos teores ou reas cromatogrficas destes alcaloides. Os principais alcaloides utilizados para determinao de perfil qumico de cocana tem sido: a ecgonina, benzoilecgonina, metilecgonina, norcocana, N-formilcocana, cis e trans-cinamoilcocana, tropacocana e trimetoxicocana. Uma das primeiras publicaes sobre comparao do perfil cromatogrfico de alcaloides por CG/EM e CLAE foi publicada em 1988 por LeBelle48, e o artigo mais recente, de 2011, em que alcaloides, adulterantes de cocana e a prpria cocana so analisados na mesma corrida por CG/EM.49 Na Tabela 8, a seguir, esto resumidos os principais artigos cientficos sobre perfil qumico de cocana, com enfoque na determinao dos seus principais alcaloides, excetuando-se as truxilinas, que sero tratadas no prximo item.

Tabela 8 - Resumo das principais publicaes cientficas sobre perfil qumico baseado nos alcaloides de cocana. Ano 1987 Autor Lurie al.
50

Tcnica et CLAE/UV C18

Condies gradiente, DAD:

Analitos cidos cinmicos, truxlicos e truxnicos, benzoilecgonina, cis e trans-cinamoilcocana.

215 e 277nm

42

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

1988

LeBelle al.

48

et

CLAE/UV

C8 isocrtico 220 e 280 nm

Benzoilecgonina, cis e transcinamoilcocana, metilecgonina, tropacocana e adulterantes. Comparao de amostras

CG/EM

DB-5

1991

LeBelle al.

51

et

CLAE/UV CG/DIC CG/EM

C8, DAD, 280nm DB-5

Cis e trans-cinamoilcocana. Comparao de amostras

1991

Casale Waggoner

e
52

CG/DIC CG/EM

DB-1701 Derivatizao BSA

cidos cinmico, truxlico e truxnico, benzoilecgonina, cis e trans-cinamoilcocana, ecgonina metilecgonina, N-formilcocana norcocana, tropacocana. Comparao de amostras

1992

Janzen ** et al.

53

CG/DNP

HP-1

cis e trans-cinamoilcocana, norcocana, tropacocana, benzoilecgonina*, metilecgonina.* Comparao de amostras

1992

Ensing al.

54

et

CG/DIC

OV-1 e OV-17 (colunas de vidro)

Cis e trans-cinamoilcocana, Nformilcocana, norcocana, tropacocana, ster metlico da N-benzoilnorecgonina. Comparao de amostras

1993

Casale al.

55

et

CG/DIC CG/EM

DB-1701 Derivatizao BSA

cidos cinmico, truxlico e truxnico, benzoilecgonina, cis e trans-cinamoilcocana, ecgonina, metilecgonina, Nformilcocana norcocana, tropacocana, ster metlico da N-benzoilnorecgonina. Comparao de amostras

43

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

1993

Moore Cooper
56

CG/DCE CG/EM

DB-1701: Derivatizao HFBA

Ecgonina, ster metlico da Nnorecgonina, ster metlico da N-formilnorecgonina, ster metlico da Nbenzoilnorecgonina, hidroxicocanas, metilecgonina, N-nortropacocana, Nnortropina, norcocana. Comparao de amostras

1993

Moore al.
57

et

1) CG/DCE

1) DB-1701: Derivatizao HFBA

1) ster metlico da Nbenzoilnorecgonina, ster metlico da N-norecgonina, hidroxicocanas, metilecgonina, N-nortropacocana, norcocana,

2) CG/DIC

2) DB-1701: Derivatizao BSA

2) Benzoilecgonina, cis e transcinamoilcocana, ecgonina, metilecgonina, norcocana, tropacocana. Comparao de amostras

1994

Casale Moore
58

CG/DIC CG/EM

DB-1

3,4,5-trimetoxicocana, 3,4,5trimetoxitropacocana, 3,4,5trimetoxi-cis-cinamoilcocana, 3,4,5-trimetoxi-transcinamoilcocana.

1994

Janzen al.

59

et

CG/DNP

HP-1

Cis e trans-cinamoilcocana, norcocana, tropacocana. Comparao de amostras.

2007

Casale al.
60

et

CG/DIC CG/EM CLAE/EM RMN

DB-1701 - MSTFA DB-1 C18

Novos subprodutos, gerados pela oxidao incompleta das cinamoilcocanas.

44

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

2007

Lociciro al.
61

et

CG-DIC

DB-1: MSTFA

derivatizao

Benzoilecgonina, cis e transcinamoilcocana, ecgonina, metilecgonina, tropacocana, norcocana, 3,4,5trimetoxicocana. Comparao de amostras.

2011

Esseiva al.
49

et

CG-EM

HP-5MS: MSTFA

derivatizao

Benzoilecgonina, cis e transcinamoilcocana, ecgonina, metilecgonina, tropacocana, norcocana, 3,4,5trimetoxicocana. Comparao de amostras.

*compostos no foram usados na comparao de amostras. **os autores concluram que as razes de tropacocana, norcocana, e cinamoilcocana versus cocana so estveis, e no se alteram pelas condies de armazenagem e adulterantes.

1.10.3. Teor total de truxilinas Como discutido anteriormente, o teor de truxilinas presente nas folhas depende da variedade de Erythroxylum e das condies ambientais da regio de cultivo22,62. Assim, o emprego de tcnicas cromatogrficas de caracterizao e determinao do teor total de truxilinas, isto da soma dos teores dos 10 ismeros de truxilinas, revelou-se uma metodologia muito promissora como ferramenta analtica para auxiliar na determinao da origem geogrfica de amostras de cocana ilcita refinada, bem como para comparaes de amostras de cocana de diferentes apreenses. A metodologia atualmente mais utilizada para determinao do teor total de truxilinas em cocana refinada, por conseguir resolver todos os ismeros cromatograficamente, envolve reaes de reduo e derivatizao, com posterior anlise por cromatografia gasosa com deteco por captura de eltrons (CG/DCE).21,63 Tambm foram publicados alguns mtodos para determinao de truxilinas por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)20,50, por eletroforese capilar (EC)64, por cromatografia de camada delgada (CCD)65, e por cromatografia gasosa

45

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

acoplada espectrometria de massas (CG/EM), por meio de derivatizao. Porm nenhum destes mtodos revelou ser mais eficiente do que o mtodo de CG/DCE. As truxilinas so substncias no cromatografveis por CG, j que possuem grande massa molecular e sofrem degradao trmica no injetor, gerando a formao de metil ecgonidina e cido truxlico (Figura 20). Por isso a soluo mais vivel e em uso atualmente para anlise quantitativa envolve a derivatizao das mesmas, para somente ento serem analisadas por CG.
CH3 N CO2CH3 N CO2CH3 H O H H H O H

CH3

2
H

Metil Ecgonidina
Degradao Trmica

H O O H H

+
HO O H H H

H3CO2C

N H3C H

-Truxilina

O OH

cido -Truxllico
Figura 20 - Formao de artefatos de truxilinas por degradao trmica, que ocorre em sistemas de cromatografia gasosa, sem derivatizao prvia.

O limite de deteco (LOD) de 1-5 pg (2-10 ng/mL) foi obtido na metodologia de quantificao de truxilinas aps reduo com hidreto de ltio e alumnio (LiAlH4), derivatizao com anidrido heptafluorobutrico (HFBA) e anlise por CG/DCE.21 1.10.4. Anlise de Razo Isotpica (RI/EM) A partir da dcada de 1990, a determinao das propores relativas dos istopos naturais de carbono e nitrognio, principalmente, tem sido utilizada como uma metodologia promissora para o estabelecimento da origem geogrfica de drogas ilcitas, e para anlises comparativas entre amostras, sendo que as primeiras publicaes referiam-se determinao da origem geogrfica da herona.
46

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

A quantidade relativa de istopos de carbono, nitrognio, oxignio e hidrognio absorvidos em uma planta e nos produtos derivados dela caracterizada pelo ciclo de fotossntese e pelo ciclo metablico. Alm disso, as condies ambientais, tais como temperatura, umidade e composio isotpica de dixido de carbono na atmosfera em que a planta cresceu podem influenciar na sua composio isotpica. Em uma das primeiras publicaes sobre anlises de cocana por RI/EM, Ehleringer et al.66 demonstraram pela primeira vez que as origens geogrficas de herona e cocana podem ser identificadas com base nas variaes naturais das razes de isotpicas de
13

C/12C e

15

N/14N, que esto relacionadas s variaes das

condies ambientais das reas de cultivo. Como existem grandes diferenas ambientais nas regies de plantio de coca da Amrica do Sul, foi investigada a variao de 13C e 15N na cocana extrada de folhas de coca de plantas de diferentes pases ao longo da Cordilheira do Andes. Combinando-se os teores de truxilinas e trimetoxicocana com as anlises de razo isotpica foi possvel determinar o pas de origem das amostras de diferentes regies da Amrica do Sul. Usando esta abordagem analtica, os autores foram capazes de prever com preciso o pas de origem de 96% das 200 amostras analisadas.62 Segundo Casale67, em mais um estudo sobre razo isotpica, ocorre um fracionamento isotpico mnimo de carbono na transformao de cocana base para cloridrato e os valores no foram afetados por diferentes metodologias de preparao. Alm disso, o fracionamento de
15

N em cocana refinada s

significativo quando toda a cocana ainda no foi precipitada. 1.10.5. Perfil de solventes oclusos. Como visto anteriormente, durante o processo de refino, as etapas de purificao envolvem a extrao da cocana da planta, sua converso de pasta base para cocana base e em alguns casos sua converso para cocana na forma de sal cloridrato, nesta ltima etapa quando ocorre a precipitao do cloridrato de cocana, na forma de uma matriz cristalina, os solventes usados no processo ficam oclusos.

47

___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Tambm j foram detectados solventes oclusos em amostras de cocana na forma de base livre, embora as principais publicaes se restrinjam a determinaes de solventes oclusos em amostras de cloridrato de cocana. Os solventes mais comuns detectados em amostras de cocana so: acetona, tolueno, ter etlico, acetatos de etila e propila, metil-etil-cetona, metil-isobutil-cetona, hidrocarbonetos alifticos leves (componentes do ter de petrleo), xilenos e metanol. A tcnica de cromatografia gasosa utilizando a amostragem por headspace (HS-CG) a mais indicada para a determinao de compostos orgnicos volteis e semivolteis em amostras nos estados slido, lquido e gasoso. No headspace esttico a amostra aquecida em um frasco selado e os gases so removidos do frasco para deteco, e a escolha ideal para analitos volteis, tais como solventes ou aditivos residuais de baixa massa molecular. Este tipo de anlise resulta em um cromatograma rico em picos e bem caracterstico, que revela quais solventes foram utilizados no processo de refino, podendo at indicar o tipo de processo de refino que a cocana sofreu, alm de ser possvel estabelecer uma correlao entre amostras. Morello e Meyers68 conseguiram detectar e quantificar, por HS-CG/EM, metiletil-cetona, hexanos, tolueno, benzeno, acetona, diclorometano, xilenos, ter etlico, ciclohexano e acetato de etila, em amostras de cloridrato de cocana de origem ilcita. Em 2008, Dujourdy e Besacier69 executaram um estudo detalhado de perfil de solventes oclusos em amostras de cloridrato de cocana, por HS-CG/DIC. Foram detectados praticamente os mesmos solventes do trabalho de Morello e Meyers, porm foi apresentada uma anlise estatstica de dados para permitir uma comparao entre amostras, para correlacion-las ou no de maneira mais robusta e confivel.

1.11. Aspectos analticos


As tcnicas instrumentais utilizadas durante o desenvolvimento deste trabalho sero brevemente discutidas a seguir, com enfoque para a sua importncia para a

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

determinao de alcaloides e adulterantes, especialmente os encontrados em amostras de cocana. 1.11.1. Cromatografia Gasosa Neste trabalho a cromatografia gasosa foi aplicada na quantificao de cocana nas amostras analisadas, utilizando deteco por ionizao em chama (CG/DIC). E para determinao de truxilinas, utilizando deteco por captura de eltrons (CG/DCE), conforme o mtodo original j publicado, a ser comparado com o novo mtodo proposto por CLAE/EM. A CG aplicvel a uma ampla variedade de compostos de interesse forense, toxicolgico, farmacutico, industrial, ambiental e clnico. Se um composto possui volatilidade suficiente para que suas molculas passem para a fase gasosa a altas temperaturas (300-400 C) sem se decomporem, ento este composto pode ser provavelmente analisado por CG. uma tcnica utilizada na separao de substncias gasosas ou volatilizveis. A volatilizao dos compostos pode ser conseguida aumentando-se a temperatura no local de injeo da amostra e (ou) na coluna. Em alguns casos, preciso derivatizar esses compostos transformando-os em outros termicamente mais estveis A utilizao de cromatografia gasosa na determinao de alcaloides tropnicos remonta ao incio da dcada de 1960, bem anterior poca em que os primeiros mtodos de CLAE foram desenvolvidos, assim como ocorre na anlise de drogas de abuso, em que o uso da CG anterior ao de CLAE. Como descrito nos itens 1.10.2 e 1.10.3, o uso de cromatografia gasosa em determinaes de alcaloides em mtodos de perfil qumico predominante nas publicaes cientficas da rea de qumica forense. O desenvolvimento das colunas capilares com revestimentos quimicamente ligados melhorou muito a anlise de CG para alcaloides tropnicos, j que elas so mais adequadas para a separao de alcaloides em temperaturas mais elevadas. Alm disso, atualmente as colunas capilares esto em aproximadamente todas as metodologias desenvolvidas para cromatografia gasosa. A deteco por ionizao em chama a mais largamente utilizada para cromatografia gasosa, j que responde a praticamente todas as classes de compostos. O efluente que sai da coluna misturado com hidrognio e a mistura
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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

queimada em um pequeno bocal em um fluxo de ar. Uma corrente polarizada aplicada entre este bocal e um eletrodo situado acima dele. Quando um analito elui da coluna ele queimado na chama e gera ons que alteram a corrente entre os eletrodos e produz um sinal. A sensibilidade moderada, com uma boa faixa de linearidade de at seis ordens de magnitude. A resposta dependente do nmero de carbonos na molcula, mas a resposta reduzida se oxignio e nitrognio estiverem presentes. O DIC de fcil operao e limpeza e quando utilizado com colunas capilares, praticamente livre de manuteno. O detector por captura de eltrons consiste em uma pequena cmara com um par de eletrodos e uma fonte radioativa, usualmente
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Ni, colocada prxima ao

ctodo para ionizar o gs carreador. O potencial aplicado aos eletrodos produz uma corrente de fundo. Substncias capturadoras de eltrons chegando cmara removem alguns dos eltrons e diminuem a corrente do detector. O DCE um detector seletivo com uma sensibilidade muito alta para compostos que tenham uma alta afinidade por eltrons, para muitos compostos esta sensibilidade maior que o de um EM. 1.11.2. Tcnicas de Derivatizao Qumica As principais razes para o uso da derivatizao qumica em anlises cromatogrficas so: o aumento da sensibilidade na deteco dos compostos e a melhora do comportamento cromatogrfico dos mesmos, o que pode ocorrer por meio de alguns fatores como atribuio de volatilidade, melhora da estabilidade trmica, melhora da resoluo cromatogrfica (separao de picos), melhora da quantificao. Alm dessas razes, inmeras outras podem ser citadas, como possibilitar uma deteco seletiva, e, no caso de espectrometria de massas, produzir deslocamento de massa no espectro de massas ou modificao na fragmentao, para permitir anlise de grupos funcionais ou a elucidao estrutural de determinado composto desconhecido. Esta abordagem analtica aplicada principalmente aos compostos que possuem prtons lbeis em heterotomos com grupos funcionais, tais como RNH2, R1R2NH2, -COOH, -OH e -SH. Em resumo, as trs principais reaes de derivatizao que so comumente usadas para anlise de drogas, so a sililao, a acilao e a alquilao.
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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

Derivatizaes so muitas vezes realizadas para ajudar a alcanar uma melhor condio de anlise. Para trazer o tempo de reteno para uma faixa mais desejvel, drogas de baixa massa molecular podem ser convertidas em steres ou amidas utilizando-se cidos ou alcois de massas moleculares mais altos, enquanto que as drogas de maior massa molecular podem ser convertidas em steres ou amidas com maior volatilidade utilizando-se cidos ou alcois de menor massa molecular contendo flor. 70 Os anidridos fluorados (TFAA, PFPA, HFBA, AA, TCAA) so reagentes derivatizantes utilizados para acilao de compostos, amplamente utilizados para converter alcois, fenis, aminas em seus derivados fluoracilados. Enquanto o aumento da volatilidade do analito, atravs da introduo de tomos de flor, pode ser desejvel em algumas aplicaes, a elevada volatilidade dos produtos resultantes pode evitar o uso de temperaturas mais altas no CG, o que pode ser desejvel para a determinao de analitos de baixa massa molecular, tais como anfetamina e metanfetamina. Alm disso, a introduo desses tomos de flor aumenta muito o limite de deteco nos casos em que a deteco por captura de eltrons utilizada. Por exemplo, a DCE foi utilizada para se obter 2 pg como limite de deteco de derivados heptafluorobutricos de morfina70. No caso da determinao de truxilinas por CG/DCE atravs da derivatizao com anidrido heptafluobutrico (HFBA), alguns motivos foram citados por Moore22 para a escolha da derivatizao com HFBA: as truxilinas so difceis de serem cromatografadas diretamente por CG, em virtude da sua grande massa molecular e instabilidade trmica (conforme citado no item 1.10.3); a derivatizao de truxilinas com BSA ou MSTFA gera produtos trimetisililados (TMS), que no so suficientemente eletroflicos para provocar uma boa resposta do detector de DCE, e no so completamente separados por CG; e o fato de ao se ligarem dois grupos heptafluorobutricos (HFB) em cada molcula das dez truxilinas, formando produtos di-HFB, ou derivados di-heptafluorobutricos dos diois truxilil e truxinil (di-O-HFB), isso gera um aumento da sensibilidade da tcnica.

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

1.11.3. Cromatografia

Lquida

de

Alta

Eficincia

acoplada

Espectrometria de Massas (CLAE/EM) A maioria das publicaes de anlises por CLAE/EM na rea forense da rea de toxicologia, envolvendo anlises de drogas de abuso em diferentes matrizes biolgicas, como sangue, urina e cabelo. Na toxicologia forense a tcnica de CLAE/EM extremamente importante e complementar cromatografia gasosa. possvel analisar diversos compostos sem a necessidade de derivatizao e em muitos casos obtm-se limites de deteco menores que os de outras tcnicas disponveis, o que muito importante nessa rea. Esta crescente demanda nas anlises de toxicologia forense resultado das suas inmeras aplicaes, por exemplo, no controle anti-doping de atletas, na investigao de uso de drogas de abuso em acidentes de trnsito, envenenamentos, homicdios, suicdios, determinao de resduos de agrotxicos em alimentos, anlises de contaminao ou uso de drogas por trabalhadores. Esta demanda possibilitou um rpido desenvolvimento das anlises de toxicologia forense e de aplicaes paras as tcnicas de CLAE/EM e CLAE/EM/EM, que comearam a ser utilizadas em anlises de perfil qumico de drogas. Anlises de perfil qumico ou de screening em toxicologia forense so tradicionalmente executadas em equipamentos de CG/EM, em virtude das vastas bibliotecas eletrnicas de espectros de massas disponveis, porm limitaes como instabilidade trmica, falta de volatilidade ou necessidade de derivatizao tem aumentado o uso da tcnica de CLAE/EM. Em relao ao uso de CLAE na anlise de alcaloides tropnicos, em recente artigo de reviso Aehle e Drger71, constataram que desde a primeira separao dos alcaloides tropnicos: atropina, apoatropina, escopolamina e homatropina, em 1973, a anlise desse grupo de alcaloides por cromatografia lquida de alta eficincia tornou-se cada vez mais comum. Essas separaes so geralmente realizadas em colunas de fase reversa, como a maioria das aplicaes desenvolvidas para CLAE. Alm disso, diversos mtodos de separao foram construdos e aplicados para os alcaloides tropnicos, em preparaes farmacuticas, em material vegetal, e na rea forense. A baixa absoro de luz UV pela maioria desses alcaloides e quase

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

nenhuma absoro da luz UV de muitos de seus produtos de degradao geram baixa sensibilidade na suas deteces em CLAE equipado com detector de UV de comprimento de onda fixo convencional ou com detectores de arranjo diodos (DAD). Nos ltimos anos, muito progresso foi feito na identificao e quantificao dos alcaloides tropnicos por CLAE, o que est relacionado principalmente a quatro motivos diferentes71: deteco do analito por espectrometria de massa em comparao com a deteco por UV supera as limitaes de sensibilidade; CLAE acoplado a EM, em particular EM/EM, oferece mais confiabilidade na identificao; cromatografia lquida de ultra eficincia substituindo o CLAE convencional reduz o tempo de anlise e mantm a separao satisfatria; diversificao dos materiais para cromatografia liquida, tais como colunas com novos materiais de empacotamento, permitiram melhor separao e economia de tempo no preparo de amostras.

Nos ltimos anos tem se desenvolvido a tcnica de cromatografia lquida de ultra eficincia (UPLC) ou cromatografia lquida de presso ultra-alta (UHPLC) que possibilita tempos de anlise muito menores com resoluo melhor ou comparvel as anlises tradicionais. baseado em colunas com dimetros internos de 1 mm ou 2 mm e partculas de dimetros menores que 3,5 m, equipamentos que suportem presses de at 1.300 bar, com fluxos prximos aos utilizados em CLAE convencional e temperaturas altas para o compartimento de coluna, acima dos 60C. J em 200572 foi demonstrado o alto poder de separao do UPLC com colunas C18 hbridas com partculas de 1,7 m para determinao de anfetaminas, esteroides anabolizantes, perfil qumico de MDMA e screening de drogas de abuso. importante ressaltar que em todos os artigos citados neste item a fonte de ionizao escolhida para as anlises de CLAE/EM foi a de ionizao por eletronebulizao, tambm conhecida como electrospray (ESI), que a fonte de ionizao mais utilizada atualmente, embora diversas outras sejam empregadas h

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

mais de uma dcada, como MALDI, APCI, APPI, enquanto outras tm sido desenvolvidas, como EASI, vEASI e DESI. a) Analisador de massas Triplo Quadrupolo (QqQ)

Anlises de screening com analisadores de massas hbridos do tipo EM/EM, como triplo quadrupolo, so realizadas utilizando o modo de monitoramento de reaes mltiplas (MRM), isto o primeiro quadrupolo monitora os ons-precursores, no segundo quadrupolo esses ons so fragmentados, e no terceiro quadrupolo os ons-produtos so monitorados, o que a torna uma tcnica de alta seletividade e sensibilidade. H mais de dez anos, grande parte dos mtodos propostos para deteco de drogas e seus metablitos em matrizes biolgicas, que utilizam CLAE/EM/EM, baseada em uma varredura (screening) dos compostos alvo, neste perodo dezenas de trabalhos tm sido publicados sobre este tipo de abordagem de screening em toxicologia forense. Em uma publicao de 200573, proposta a identificao de 301 substncias simultaneamente em uma corrida de 33 minutos, por CLAE/EM/EM. Cinco anos mais tarde um novo artigo utilizando o mesmo modelo de espectrmetro de massas aumentou o nmero de substncias identificadas simultaneamente para 700.74 A maioria dessas metodologias desenvolvidas para toxicologia forense inclui em suas varreduras os alcaloides cocana e seus principais metablitos benzoilecgonina e metilecgonina e a maior parte dos adulterantes citados no item 1.8. Duas publicaes recentes propuseram a aplicao de cromatografia liquida de ultra eficincia acoplada com espectrometria de massas tandem (UPCLAE/EM/EM) em modo MRM para o estabelecimento do perfil qumico de amostras de herona.75,76 b) Analisador de massas por Tempo de Voo (TOF) Trabalhos recentes tm desenvolvido mtodos usando cromatografia liquida acoplada com espectrometria de massas por tempo de voo (CLAE/TOF-EM) para anlises qualitativas e quantitativas.

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

A importncia de se utilizar TOF para anlises de drogas est relacionada com a determinao exata da massa molecular dos analitos, com preciso de at quatro casas decimais. A capacidade de determinar a relao massa/carga (m/z) de um on com preciso de at 5 ppm77 permite a determinao de uma frmula molecular nica baseada na massa atmica dos tomos constituintes, ou pelo menos sugere poucas frmulas possveis. A capacidade de se obter uma massa observada prxima da massa terica esperada permite a identificao positiva do analito, removendo-se efetivamente os efeitos da matriz, reduzindo-se o rudo e o nmero de outras possibilidades para a identificao. Resumindo, quanto melhores forem a exatido e a preciso da medio de massa molecular, menor ser o nmero de compostos teoricamente possveis. Atualmente, a maior parte dos instrumentos de CLAE-TOF so capazes de oferecer precises de massa menores que 5 ppm. Alm disso, quando operados em modo de varredura completa, esses instrumentos podem fornecer sensibilidades significativamente melhores quando comparados com instrumentos do tipo triplo quadrupolo78. Tambm tm-se observado alguns desenvolvimentos importantes em hardware e software que levaram a um aumento da robustez geral de CLAE-TOF, por exemplo, a facilidade de permitir a introduo simultnea de uma soluo de referncia, que serve para garantir a obteno de massas moleculares exatas durante toda a corrida analtica, utilizando fontes de electrospray com duas sondas, uma para a amostra e outra para a soluo de referncia. Alm da determinao da massa molecular exata e proposio de possveis frmulas moleculares a partir da massa obtida, espectrmetros de massa do tipo TOF apresentam resoluo suficiente para que seja observada a distribuio isotpica das massas das substncias, isto a contribuio dos istopos dos tomos (13C, 2H,
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O,

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O,

15

N,

33

S,

34

S,

37

Cl,

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Br, etc) que compem a molcula em

questo. (Figura 21)

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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

x10 5 +ESI Scan (5,782-5,903 min, 12 scans) Frag=120,0V pq_atropina_RTI_1c.d Subtract 3,3 3,2 3,1 3 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 302,5 303 303,5 304 304,5 305 305,5 306 Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) 306,5 307 307,5 308 308,5 309 306,1601 (M+H)+ 305,1577 (M+H)+ 304,1549 (M+H)+

Figura 21 - Espectro de massas da cocana em instrumento de CLAE/TOF-EM, os ons [M+H]+ esperados para a distribuio isotpica da cocana apresentam os seguintes m/z com as respectivas abundncias relativas: m/z 304,1543 (abund. 100%); 305,1576 (abund. 17,41%); 306,1601 (abund. 2,24%); e 307,1627 (abund. 0,21%).

Esta anlise permite a reduo ainda maior do nmero de frmulas moleculares possveis a partir da massa molecular exata obtida ou mesmo a confirmao da frmula molecular. Softwares de alguns equipamentos j realizam este tipo de anlise, propondo a distribuio isotpica terica de determinada frmula molecular para ser comparada pelo analista com o espectro de massas obtido e ou at mesmo fazendo comparaes automatizadas, que retornam um resultado percentual desta comparao. Alm disso, equipamentos de CLAE/EM podem fragmentar ons na fonte de ionizao. Com isso, so formados menos ons do que em fragmentaes tpicas de instrumentos de CLAE/EM/EM, porm esses ons podem ser muito importantes para a caracterizao/confirmao de substncias. Essa gerao de ons de confirmao acontece s custas da intensidade do on molecular, isto quanto maior a intensidade do on molecular, menor ser a formao de ons produto. Na tcnica de CLAE/EM-TOF este parmetro pode ser particularmente importante, porque fornece informaes estruturais valiosas (fragmentao caracterstica para cada substncia), tornando possvel determinar a massa exata de cada on produto caracterstico e
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___________________________________________________________________________________________1. Introduo

juntamente com a massa molecular de seu on precursor. Dessa forma, pode-se cumprir os critrios de identificao de um composto. As tcnicas de screening por espectrometria de massas tandem (EM/EM) com monitoramento MRM so capazes de detectar somente os compostos alvos previamente definidos no mtodo, enquanto o espectrmetro de massas por TOF pode-se pesquisar compostos no alvo, que no eram originalmente suspeitos, j que os arquivos so salvos no modo de varredura completa (full scan data) com massa exata e pode-se atravs da anlise dos resultados, buscar as massas moleculares exatas de novos compostos, sem a necessidade de reinjetar as amostras. No passado, uma das desvantagens da tcnica de CLAE/TOF-EM era o pequeno intervalo dinmico para anlises quantitativas, porm a instrumentao moderna agora capaz de manter a linearidade da resposta em mais de 3 ou 4 ordens de magnitude, como pode ser observado em diversas publicaes recentes. Em 2010, Nielsen79 desenvolveu um mtodo de screening e quantificao de 52 substncias em cabelo, incluindo cocana e benzoilecgonina, por UPLC/TOF-EM. Alm disso, em toxicologia forense, diversos mtodos de screening de drogas e seus principais metabolitos em matrizes biolgicas utilizando CLAE/TOF-EM tm sido publicados. 80,81,82 Outras reas tambm tm utilizado este mesmo tipo de abordagem de screening de substncias por meio da determinao de sua massa exata por CLAE/TOF-EM. Zhou et al.83 desenvolveram metodologia para a identificao e quantificao simultnea de 26 alcaloides naturais de origem vegetal por CLAE/TOFEM. Desde 2002 Thurman e Ferrer84,85 tm publicado uma srie de artigos sobre a identificao e quantificao de agrotxicos e outras substncias em gua e vegetais utilizando CLAE/TOF-EM. Em 2007, eles publicaram uma metodologia para a determinao simultnea de 101 agrotxicos e seus produtos de degradao em gua e comida por CLAE/TOF-EM.86

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_____________________________________________________________________________________________2.Objetivos

2. OBJETIVOS
Desenvolvimento de metodologia analtica mais simples e direta para a quantificao das truxilinas, que envolva menos etapas de preparao de amostras, utilizando cromatografia lquida de alta eficincia acoplada espectrometria de massas (CLAE/EM). Para esse desenvolvimento, so propostas as seguintes etapas: (a) testes e otimizao das condies cromatogrficas; (b) construo das curvas de calibrao experimentais; (c) comparao com a metodologia publicada na literatura, que emprega cromatografia gasosa com deteco por captura de eltrons (CG/DCE). Determinao dos perfis e teores de truxilinas em amostras de cocana provenientes dos estados do Acre, Amazonas, Distrito Federal, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paran, Rondnia, So Paulo e avaliao da possibilidade de distino entre as amostras, por origem geogrfica, com base nos perfis obtidos. Para essa investigao, so propostas as seguintes etapas: (a) determinao do teor de cocana; (b) avaliao da forma de apresentao da cocana (cocana base ou cloridrato de cocana); (c) determinao dos teores de cada uma das truxilinas; (d) determinao dos teores dos alcaloides. Desenvolvimento de metodologia analtica para determinao simultnea dos principais adulterantes e outros alcaloides tropnicos em amostras de cocana, utilizando cromatografia lquida de alta eficincia acoplada espectrometria de massas (CLAE/EM). Para esse desenvolvimento, so propostas as seguintes etapas: (a) testes e otimizao das condies cromatogrficas; (b) construo das curvas de calibrao experimentais para os alcaloides; (c) determinao dos limites de deteco dos alcaloides.

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___________________________________________________________________________________3. Materiais e Mtodos

3. MATERIAIS E MTODOS 3.1. Materiais


3.1.1. Equipamentos, vidrarias e acessrios CG/DIC: cromatgrafo gasoso Agilent Technologies 6890N, detector por ionizao em chama, injetor tipo split/splitless, amostrador automtico Agilent Technologies 7693 O sistema cromatogrfico foi acoplado a um microcomputador, e controlado com uso do software MSD Chem Station, verso E.02.01.1177; e os dados analisados com auxlio do software Enhanced Data Analysis, ambos da Agilent Technlogies. Foi utilizada coluna para CG DB1-MS (35 m x 0,20 mm, filme 0,33 m), Agilent Technlogies; CG/DCE: cromatgrafo gasoso Agilent Technologies 6890N, detector por captura de eltrons Ni63 (-ECD - G2379A), injetor tipo PTV, amostrador automtico Combi Pal-CTC Analytics, Agilent Technologies (G6500CTC). O sistema cromatogrfico foi acoplado a um microcomputador, e controlado com uso do software MSD Chem Station, verso E.02.00.493; e os dados analisados com auxlio do software Enhanced Data Analysis, ambos da Agilent Technlogies. Foi utilizada coluna para CG OV-1701 (30 m x 0,25 mm, filme 0,25 m), Ohio Valley Specialty Company-OV; CLAE/EM-EM: cromatgrafo lquido de ultra alta eficincia Agilent Technologies modelo 1290 Infinity, composto por bomba binria (G4220A), injetor automtico (G4226A), mdulo para controle de temperatura do injetor (G1316C), compartimento de coluna com termostato (G1316A), detector de arranjo de diodos DAD (G4212A) e espectrmetro de massas triplo quadrupolo 6460 Triple Quad LC/MS (G6460A). O sistema cromatogrfico foi acoplado a um microcomputador, e controlado com uso do software Mass Hunter Workstation Acquisition para QQQ, verso B.03.00; e os dados analisados com auxlio dos softwares Mass Hunter Worksation Software Qualitative Analysis, verso B.03.00 e Quantitative Analysis QQQ, verso B.03.00, Agilent

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Technologies. Foi utilizada coluna cromatogrfica para UHPLC Zorbax Eclipse Plus (100 x 2,1 mm, 1,8 m), Agilent Technologies; CLAE/EM: cromatgrafo lquido de alta eficincia Agilent Technologies modelo 1100 Series, composto por degaseificador a vcuo (G1379A), bomba quaternria (G1311A), injetor automtico (G1329A), mdulo para controle de temperatura do injetor (G1330B), compartimento de coluna com termostato (G1316A), detector de arranjo de diodos DAD (G1315B) e espectrmetro de massas por tempo de voo LC/MSD TOF (G1969A). O sistema cromatogrfico foi acoplado a um microcomputador, e controlado com uso do software Mass Hunter Workstation Acquisition para TOF/QTOF, verso B.02.01; e os dados analisados com auxlio dos softwares Mass Hunter Worksation Software Qualitative Analysis, verso B.03.01 e Quantitative Analysis TOF, verso B.04.00, Agilent Technlogies. Foram utilizadas colunas cromatogrficas para CLAE: Zorbax 300SB-C18 (250 x 2,1 mm, 5 m), Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 2,1 mm, 5 m), Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 2,1 mm, 3,5 m) e Zorbax Eclipse Plus C18 (150 x 2,1 mm, 3,5 m), todas da Agilent Technologies; agitador de tubos Denley Vibromix, Thermo Electron Corporation; balana analtica XP 205, capacidade mxima 220 g, 0,01 mg, Mettler Toledo; bales volumtricos em vidro borosilicato de 10, 25, 50 e 1000 mL, Pyrex; banho de ultra-som Bransonic 1510, Branson; bomba seringa KDS-100-CE, KD Scientific; centrfuga CR4i, Jouan, Thermo Electron Corporation; chapa de aquecimento Denley MagMix, Thermo Electron Corporation; conjunto para filtrao a vcuo composto de funil, base e tampa tubulada em vidro borosilicato e garra de alumnio anodizado, Millipore;

erlenmeyers em vidro incolor de 25 mL; filtros de amostras Millex em polietileno com membrana de PTFE modificada, poro de 0,45 m, 25 mm de dimetro, no estril, Millipore;

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frascos incolores de vidro com capacidade de 1,8 mL, lacrveis, sem inscries, Wheaton, tampas tipo lacre com septos de teflon/borracha Sun Sri; membrana de LCR em PTFE modificado, poro de 0,45 m e 47 mm de dimetro, Millipore; peagmetro digital 780 pH Meter, Metrohm; pipeta automtica Discovery +, com capacidade de 1 a 10 mL, High Tech Lab PZ HTL; pipeta automtica Discovery +, com capacidade de 1 a 5 mL, High Tech Lab PZ HTL; pipeta automtica P100, com capacidade de 20 a 100 L, Pipetman, Gilson; pipeta automtica P1000, com capacidade de 200 a 1000 L, Pipetman, Gilson; seringa de vidro com capacidade para 1mL, Hamilton; seringas de plstico descartveis com capacidade para 3 mL, Injex; sistema de purificao de gua Direct-Q 5, Millipore.

3.1.2. Solventes e reagentes acetonitrila e metanol, grau de pureza adequado cromatografia lquida, J.T. Baker; formiato de amnio de grau analtico, Sigma-Aldrich; isooctano, grau de pureza adequado para espectrofotometria, Carlos Erba; anidrido heptaflurobutrico (HFBA) 99,0%, Fluka; cido sulfrico, cido frmico, bicarbonato de sdio e hidrxido de amnio, grau P.A., Merck; ter etlico, Chromasolv, grau de pureza adequado cromatografia lquida, Sigma-Aldrich; clorofrmio, grau de pureza adequado cromatografia lquida, Tedia.

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3.1.3. Padres 2,2,2-trifenil-acetofenona e dipentil-ftalato, Acros Organics; aldrin, Pestanal, Riedel De Haen AG; atropina, Sigma; benzocana 99,9%, Fluka; cafena 98,5%, Acros Organics; cloridrato de lidocana mono-hidratado, cloridrato de procana 97%, cloridrato de tetramisol (levamisol), cloridrato de diltiazem, > 99% dicloridrato de hidroxizina 98%, todos da Sigma; dimetil-mu-truxinato, Special Testing & Research Laboratory do Drug Enforcement Administration (DEA); fenacetina 99,9%, TCI-EP; padro de cloridrato de cocana (RTI-DEA), contendo teores variando de 0,04 a 1,51% (m/m) de cada um dos ismeros das truxilinas; 0,37% (m/m) de benzoilecgonina; cis-cinamoilcocana; 3,10% (m/m) de transcinamoilcocana; 0,80% (m/m) de ecgonina; 0,51% de metilecgonina; 2,72% (m/m) de 0,06% (m/m) de N-formilcocana; 0,08% (m/m) de trimetoxicocana; e 0,05% (m/m) de tropacocana e 83,4% de cocana, Special Testing & Research Laboratory do Drug Enforcement Administration (DEA); 3.1.4. Solues-padro e de trabalho Solues-padro estoque de benzocana, cafena, fenacetina, lidocana, procana, levamisol, diltiazem, hidroxizina e do padro interno atropina foram preparadas na concentrao de 1,0 mg/mL em metanol, para as anlises de CLAE/EM e CLAE/EM-EM. Foram preparadas solues de trabalho de benzocana, cafena, fenacetina, lidocana, procana, levamisol, diltiazem, hidroxizina e do padro interno atropina, a partir de diluies das solues-padro, obtendo-se concentrao final de 1,0 mg/L. Solues-padro de benzoilecgonina e norcocana com concentrao de 1,0 mg/mL em metanol foram obtidas da Cerilliant, Round Rock, TX, USA, foram

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preparadas solues de trabalho, de concentrao final de 1,0 mg/L destes analitos, e utilizadas somente para anlises qualitativas de CLAE/EM e CLAE/EM-EM. Para as anlises de alcaloides tropnicos por CLAE/EM e CLAE/EM-EM, foi utilizado o padro de cloridrato de cocana (RTI-DEA), gentilmente cedido pelo Special Testing & Research Laboratory do Drug Enforcement Administration (DEA), fortificado com quantidades estabelecidas de truxilinas, benzoilecgonina, ecgonina, metilecgonina, trimetoxicocana, tropacocana, cis e trans-cinamoilcocana. Este padro foi pesado e diludo em soluo de 106 g/mL de atropina em metanol, sendo que esta soluo estoque resultante apresentava as concentraes de cada alcaloide, descritas na Tabela 9.
Tabela 9 - Concentraes dos alcaloides na soluo estoque para anlises por CLAE/EM.

Alcaloide Tropnico Truxilinas (total) Benzoilecgonina Ecgonina Metilecgonina Trimetoxicocana Tropacocana Cis-cinamoilcocana Trans-cinamoilcocana

Concentrao (mg/L) 72,02 5,80 12,60 8,07 1,32 0,78 42,91 48,98

Todas as solues (padro e de trabalho) foram acondicionadas em frascos de vidro mbar ou incolor e mantidas sob refrigerao (-20C). 3.1.5. Amostras de cocana As 160 amostras de cocana analisadas neste trabalho so provenientes de apreenses realizadas pela Polcia Federal no perodo compreendido entre os anos de 2009 a 2011 e encaminhadas pelos Setores Tcnico-Cientficos (SETECs) das Superintendncias Regionais da Polcia Federal nos estados do Acre (16 amostras), Amazonas (15), Distrito Federal (16), Mato Grosso (16), Mato Grosso do Sul (14), Paran (39), Rondnia (20) e So Paulo (24). Todas as amostras de cocana foram homogeneizadas antes das anlises, com auxilio de almofariz e pistilo de vidro, sendo que para as amostras de cocana na forma de base foi utilizado nitrognio liquido para aumentar a eficincia do processo.
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3.2. Mtodos
3.2.1. Anlises de truxilinas por CG/DCE A metodologia de CG/DCE foi utilizada neste trabalho para a quantificao dos dez ismeros das truxilinas nas amostras e comparao com o novo mtodo proposto por CLAE/EM. O mtodo de CG/DCE empregado foi o mesmo publicado por Moore et al.21, com pequenas modificaes implementadas pelo Special Testing & Research Laboratory, grupo responsvel pelo desenvolvimento deste mtodo. Como esta foi considerada a metodologia de referncia no foi necessria a otimizao da mesma, somente foram aplicados controles dirios de solues padro para verificao da preciso e exatido da metodologia em nosso laboratrio, durante o perodo de construo da curva de calibrao e anlise das amostras. a) Procedimentos de reduo e derivatizao Foi preparada uma soluo estoque do padro interno dimetil-mu-truxinato (C20H20O4) com concentrao 0,987 mg/mL em clorofrmio. Tal soluo foi diluda 50 vezes obtendo-se a concentrao de 19,74 g/mL para a soluo de padro interno de trabalho. Foram transferidos 500 L dessa ltima soluo para tubos de ensaio e deixou-se evaporar o clorofrmio a temperatura ambiente em capela. As amostras, controles e padres de calibrao foram adicionados nos tubos anteriormente preparados com padro interno. Para amostras de cloridrato de cocana foram pesados entre 3,5 e 4,5 mg e para amostras de cocana base foram pesados entre 2,5 e 3,5 mg. Em seguida adicionaram-se 100 L de clorofrmio seco e 4 mL de ter etlico seco em cada tubo. Depois foram adicionados 200 L de soluo 1 mol/L de hidreto de alumnio e ltio em ter etlico para amostras de cloridrato de cocana e 400 L para amostras de cocana base. Aps breve agitao em vrtex, os tubos foram colocados em banho-maria a 55 C at a evaporao total dos solventes. Adicionaram-se 5 mL de soluo de cido sulfrico 2 mol/L e 5 mL de ter etlico em cada tubo, fechando-os e agitando-os, em seguida, por cerca de 2 minutos. Ento, o material foi centrifugado e a fase de ter obtida foi transferida para
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novos tubos, que foram submetidos evaporao em banho-maria a 55 C at restarem cerca de 100 L de ter etlico. O restante do ter foi evaporado em fluxo de nitrognio. Depois foi adicionado 1 mL de acetonitrila e 50 L de HFBA em cada tubo, que foram colocados em banho-maria a 75 C durante 15 minutos. Depois, os tubos foram retirados do banho-maria e esperou-se 15 minutos para que os mesmos retornassem a temperatura ambiente e foram adicionados 5 mL de soluo de aldrin (200 g/L) em isooctano e 5 mL de soluo aquosa saturada de bicarbonato de sdio em cada tubo. Finalmente, aps agitao vigorosa os tubos foram centrifugados e foi transferido 1 mL da fase de isooctano para vials de vidro de 1,8 mL, que foram analisados por CG-DCE. b) Condies cromatogrficas A temperatura do forno foi programada inicialmente a 100 C (5 min), rampa de 25 C/min at 160 C (1 min), depois de 4 C/min at 245 C (1 min), e ento de 25C/min at 280 C (5 min), tempo total de 37,45 minutos. Gs Hlio (He) foi usado como gs de arraste a um fluxo de 1,0 mL/min. O injetor foi mantido a 250 C, com injeo de 1,0 L de amostra em modo splitless. O detector por captura de eltrons (DCE) foi mantido a uma temperatura de 300 C, com fluxo de nitrognio (N2) de 60,0 mL/min. c) Preparao das curvas analticas Foram adicionadas a tubos de ensaio, contendo 9,87 g de padro interno (dimetil-mu-truxinato), massas de aproximadamente 1, 2, 4, 6, 8 e 10 mg do padro de cloridrato de cocana RTI-DEA. Cada um destes tubos foi submetido ao processo de reduo e derivatizao descrito no subitem 3.2.2.a. As curvas analticas foram obtidas pela projeo das razes das concentraes de cada um dos ismeros das truxilinas pela concentrao do padro interno no eixo das abscissas e das relaes de reas referentes a cada um deles e o padro interno no eixo das ordenadas, utilizando-se a regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados para a obteno da equao da reta. A linearidade, definida como a capacidade do mtodo gerar resultados proporcionais das espcies em estudo, foi avaliada atravs do

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coeficiente de determinao (r2) da curva. As concentraes obtidas para cada ismero das truxilinas esto descritas na Tabela 10.
Tabela 10 - Concentraes das truxilinas nas solues utilizadas para a construo das curvas de calibrao. Concentrao (mg/L) Truxilina epsilon delta beta peri neo epi alfa omega gama zeta 1 0,84 1,09 2,10 0,16 0,50 0,08 3,00 0,61 0,49 0,16 2 1,69 2,20 4,22 0,32 1,01 0,16 6,03 1,23 0,99 0,31 3 3,40 4,41 8,46 0,64 2,02 0,32 12,08 2,47 1,98 0,63 4 5,15 6,69 12,83 0,97 3,06 0,48 18,32 3,74 3,01 0,95 5 6,90 8,96 17,18 1,29 4,10 0,65 24,53 5,01 4,02 1,28 6 8,50 11,05 21,18 1,60 5,05 0,80 30,25 6,18 4,96 1,57

d) Limite de deteco e limite de quantificao O limite de deteco (LD) foi determinado por meio da anlise de solues de padro de cocana RTI-DEA preparadas de acordo com o mtodo descrito no item 3.2.2.a, em concentraes decrescentes. Considerou-se como LD aquele referente menor concentrao na qual foi possvel obter picos integrados pelo equipamento, em seis replicatas, nas condies especificadas, com relao sinal/rudo (altura do pico) maior que 3. O limite de quantificao (LQ) foi determinado da mesma forma que o LD, sendo a menor concentrao que pde ser determinada com preciso (coeficiente de variao menor que 20%) e exatido adequada (erro relativo de 20%). Como o padro de referncia RTI-DEA utilizado, contm teores diferenciados de cada um dos ismeros das truxilinas, os procedimentos para determinao de LD e LQ foram realizados para quatro (peri, epi, gama e zeta) dos dez ismeros e em virtude da semelhana dos ismeros e resposta similar no detector, considerou-se

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por aproximao o LD e LQ destes quatro ismeros como sendo os mesmos dos demais ismeros. e) Anlise das amostras selecionadas por CG/DCE Aps a homogeneizao, as 160 amostras de cocana foram preparadas para anlise conforme descrito no subitem 3.2.2.a. 3.2.2. Anlises de CLAE/EM (TOF) A metodologia de CLAE/EM proposta neste trabalho foi desenvolvida para a deteco simultnea dos adulterantes benzocana, cafena, diltiazem, fenacetina, hidroxizina, lidocana e levamisol e para deteco e quantificao prioritria das truxilinas, alm dos demais alcaloides minoritrios benzoilecgonina, ecgonina, metilecgonina, trimetoxicocana, tropacocana, cis e trans-cinamoilcocana, utilizando como padro interno a atropina. As condies cromatogrficas e do espectrmetro de massas foram otimizadas, conforme descrio detalhada no item 3.2.4.c, a seguir. Todas as amostras de cocana objeto deste trabalho foram analisadas por esta tcnica, alm das solues padro e controles. a) Condies cromatogrficas Eluente A: soluo de formiato de amnio/cido frmico foi preparada em gua purificada no sistema Direct-Q 5, na concentrao de 2 mmol/L (2 mL da soluo estoque de formiato de amnio 1 mol/L 65,01 g de formiato de amnio em 1000 mL de gua purificada - em 1000 mL de gua purificada) e de 0,1% de cido frmico, (adio de 1 mL de cido frmico em 1000 mL da soluo 2 mmol/L de formiato de amnio). O pH desta soluo de 4,0; Eluente B: metanol. A fase mvel foi utilizada nas anlises atravs de gradiente, conforme a Tabela 11, com fluxo constante de 0,45 mL/min, e o tempo de equilbrio ps-corrida para retornar a composio inicial da fase mvel foi de 5 minutos, sendo o tempo total de anlise igual a 23 minutos e a temperatura da coluna mantida a 40C. O volume de injeo foi de 1 L.

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Tabela 11 - Gradiente utilizado nas anlises por LC-EM.

Tempo (min) Inicial 1,0 13,0 14,0 18,0

Eluente A - % (v/v) 90 80 45 0 0

Eluente B - % (v/v) 10 20 55 100 100

b) Condies do espectrmetro de massas As condies da fonte de ionizao ESI foram as seguintes: ionizao positiva; temperatura e fluxo do gs secante (drying gas) (N2), 350 C, 12 L/min; presso do gs nebulizador (nebulizer), 40 psi; voltagem do capilar (capillary voltage), 3500V; voltagem de fragmentao (fragmentor), 200V. Os espectros de massas foram adquiridos na faixa de m/z 100 a 1000, no modo scan. Foram selecionados os ons protonados [M+H]+ de cada analito investigado e para fins de quantificao os cromatogramas foram reconstrudos ps-anlise, extraindo-se a intensidade de cada on, atravs da sua massa exata, com uma janela de 0,01 (m/z). c) Otimizao das condies analticas A metodologia foi otimizada para atingir a melhor seletividade possvel, com objetivo de minimizar co-eluies que porventura pudessem causar supresso de ons ou aumento artificial na suas intensidades no espectrmetro de massas. Foram testadas as diversas condies descritas a seguir. Como eluentes aquosos testaram-se (eluente A): H2O/0,1% cido frmico/2 mmol/L formiato de amnio (pH = 2,8), H2O/0,1% cido frmico/2 mmol/L formiato de amnio (pH = 4,0), e H2O/0,03% dietilamina (pH = 11,3); como eluentes orgnicos (eluente B): acetonitrila/0,1% cido frmico, e metanol; temperaturas do compartimento de colunas: 30 C, 40 C e 50 C; colunas: Zorbax 300SB-C18 (250 x 2,1 mm, 5 m), Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 2,1 mm, 5 m), Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 2,1 mm, 3,5 m) e Zorbax Eclipse Plus C18 (150 x 2,1 mm, 3,5 m); e gradientes de fase mvel: o mesmo descrito na Tabela 13, um de 5% a 95% de eluente B em 15 minutos, e um de 5% a 95% de eluente B em 25 minutos.
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Uma soluo de trabalho do padro de cocana RTI/DEA foi enriquecida com solues padro dos frmacos mais comuns encontrados em amostras de cocana, como benzocana, cafena, diltiazem, fenacetina, hidroxizina, lidocana, levamisol e procana obtendo concentrao igual a 100 mg/L de cada frmaco. Esta soluo foi aliquotada em dezenas de vials que foram mantidos a -20C. Ento, a soluo foi injetada em cada uma das combinaes de condies cromatogrficas descritas acima. Para a determinao das melhores condies cromatogrficas foram avaliados os parmetros de fator de reteno (k), simetria do pico obtido, fator de separao () e resoluo (Rs). Foram otimizadas, ainda, as voltagens de fragmentao e do capilar do espectrmetro de massas para as truxilinas. Uma soluo padro de truxilinas em metanol foi infundida diretamente no equipamento com fluxo de 50 L/min, a voltagem de fragmentao foi variada de 60 a 270 V e a voltagem do capilar testada a 3500 e 4000 V. Fator de reteno (k) O fator de reteno a medida de quando o pico de interesse elui em relao ao tempo de eluio de compostos no retidos. O fator de reteno foi calculado atravs da equao descrita abaixo87: ( )

(1)

em que t1 e t0 so respectivamente os tempos de reteno do analito e de um composto no retido. O tempo de reteno do composto no retido foi determinado atravs da injeo, nas condies cromatogrficas, de 10 L de metanol (substncia que sabidamente no interage com a coluna cromatogrfica octadecil).

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Fator de separao () O fator de separao foi obtido atravs da razo entre os fatores de reteno de dois compostos de eluies adjacentes, conforme a equao87: = 2 1 (2)

Resoluo (Rs)

A separao entre dois picos tende a ser gaussiana e dada pela distncia entre o centro dos picos dividido pela largura mdia desses picos, ento quanto maior a separao nos tempos de reteno e mais estreitos os picos mais alta a resoluo obtida. A equao para definir a resoluo est descrita a seguir87:

2 ( )

(3)

em que t1 e t2 representam os tempos de reteno dos analitos 1 e 2 e w1 e w2 representam as larguras dos picos dos analitos 1 e 2.

Fator de alargamento (Tf)88

Um pico considerado assimtrico quando ele desvia do comportamento simtrico ideal de um pico gaussiano. O problema de assimetria mais comum em CLAE alargamento no final do pico (ou na cauda). A exatido de uma quantificao pode diminuir com o aumento no alargamento do pico em virtude das dificuldades encontradas pelos sistemas de integrao em determinar onde o pico comea e termina, na determinao da rea a ser integrada. Uma das medidas para mensurar o alargamento de picos o fator de alargamento (Tf , do ingls Tailing Factor), que pode ser determinado pela equao abaixo: 2

(4)

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em que W x representa a largura do pico a 5% da sua altura, a partir da linha de base e f representa a distncia entre o mximo do pico e a parte frontal do pico a 5% da sua altura. d) Preparao das curvas analticas A partir da soluo estoque preparada conforme descrio do item 3.1.4, foram realizadas diluies em triplicata para obter as concentraes descritas na Tabela 12. As curvas analticas foram obtidas pela projeo das razes das concentraes de cada um dos analitos pela concentrao do padro interno no eixo das abscissas e das mdias das relaes de reas referentes a cada um deles e o padro interno no eixo das ordenadas, utilizando-se a regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados para a obteno da equao da reta. No caso das truxilinas foram somadas as reas de todos os picos de m/z 659,3327 em cada concentrao para a construo da curva, j que o padro disponvel RTI-DEA, possua uma mistura dos ismeros, no sendo possvel diferenci-los, ou seja foi construda uma nica curva de total de truxilinas e no uma curva para cada ismero. A linearidade foi avaliada por meio do coeficiente de determinao (r2) da curva.
Tabela 12 - Concentraes totais dos analitos nas solues utilizadas para a construo das curvas de calibrao.
Concentrao (mg/L) Analito 1 Truxilinas Benzoilecgonina Cis-cinamoilcocana Trans-cinamoilcocana Ecgonina Metilecgonina Trimetoxicocana Tropacocana 0,116 0,858 0,980 0,252 0,161 0,026 0,016 0,290 2,146 2,449 0,630 0,404 0,066 0,039 2 3 5,762 0,464 3,433 3,918 1,008 0,646 0,105 0,062 4 11,52 0,928 6,866 7,836 2,016 1,292 0,211 0,124 5 23,048 1,857 13,731 15,673 4,032 2,584 0,421 0,249 6 34,572 2,785 20,597 23,509 6,047 3,876 0,632 0,373 7 46,096 3,713 27,462 31,346 8,063 5,167 0,842 0,498 8 57,620 4,642 34,328 39,182 10,079 6,459 1,053 0,622 9 72,025 5,802 42,910 48,978 12,599 8,074 1,316 0,777

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e) Parmetros de confiana analtica Especificidade e seletividade Um mtodo que produz resposta para apenas um analito chamado especfico. Um mtodo que produz respostas para vrios analitos, mas que pode distinguir a resposta de um analito da de outros, chamado seletivo89. A fim de se avaliar possveis substncias que viessem a interferir nas anlises, solues de trabalho do padro de cocana RTI/DEA foram enriquecidas com solues padro dos frmacos mais comuns encontrados em amostras de cocana, benzocana, cafena, diltiazem, fenacetina, hidroxizina, lidocana, levamisol e procana obtendo concentrao igual a 1 mg/L de cada frmaco. Estas amostras enriquecidas foram ento submetidas aos procedimentos analticos propostos. Limite de deteco e limite de quantificao O limite de deteco (LD) foi determinado por meio da anlise de solues de padro de cocana RTI/DEA preparadas de acordo com o mtodo descrito no item 3.2.2.a, em concentraes decrescentes. Considerou-se como LD aquele referente menor concentrao na qual foi possvel obter picos integrados pelo equipamento, em sete replicatas, nas condies especificadas, com relao sinal/rudo (altura do pico) maior que 3. O limite de quantificao (LQ) foi determinado da mesma forma que o LD, sendo a menor concentrao que pode ser determinada com preciso (coeficiente de variao menor que 20%) e exatido adequada (erro relativo 20%). f) Preciso e Exatido Preciso intra-ensaio e inter-ensaio A preciso de um mtodo analtico trata-se uma medida do erro aleatrio e definida como a concordncia de resultados obtidos durante as anlises de replicatas de amostras. Este parmetro avalia a proximidade entre vrias medidas efetuadas em uma mesma amostra90. Neste estudo, a preciso intra-ensaio foi determinada por meio da anlise, em um mesmo dia, de seis replicatas de solues do padro RTI-DEA em concentraes totais de truxilinas: baixa (9 mg/L), mdia (23mg/L) e alta (46 mg/L), com padro interno, dentro da faixa de linearidade dos
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analitos. Para determinao da preciso inter-ensaio foram analisadas, em seis dias diferentes, trs replicatas de solues do padro RTI-DEA em concentraes baixa, mdia e alta, com padro interno. Em ambos os casos a preciso foi calculada atravs do coeficiente de variao (CV) das reas relativas (razo entre rea absoluta dos analitos e a rea absoluta do padro interno), segundo a equao a seguir: % = 100 (4)

Exatido A exatido de um mtodo analtico definida como sendo a concordncia entre o resultado de um ensaio e o valor de referncia aceito como convencionalmente verdadeiro89. Pode ser definido como a proximidade entre a concentrao do analito determinado pela metodologia proposta e a real concentrao desta substncia no material analisado. Neste estudo, a exatido foi determinada atravs da anlise de seis replicatas de solues do padro RTI-DEA em concentraes baixa, mdia e alta com padro interno, dentro da faixa de linearidade dos analitos. Os valores de rea relativa foram convertidos de concentrao de analito por mililitro de amostra atravs das respectivas equaes de regresso linear obtidas das curvas analticas. As concentraes obtidas foram comparadas com as concentraes reais de cada analito presentes nas solues padro. Uma forma de avaliar a exatido do mtodo por meio do clculo do erro relativo (ER), expresso em percentagem por meio da equao89:

( ) 100

(5)

g) Anlise das amostras selecionadas por CLAE/EM Aps a homogeneizao, foram transferidos entre 8 e 10 mg das amostras de cocana na forma de base livre e entre 10 a 12 mg das amostras de cloridrato de cocana para erlenmeyers de 25 mL, depois foram adicionados 10 mL de soluo de
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106,4 g/L de atropina em metanol. Em seguida procedeu-se leve agitao manual da soluo e transferiram cerca de 1 mL dessa soluo para vials de vidro de 1,8 mL, que foram lacrados e injetados no equipamento. As amostras, que aps a adio da soluo de atropina em metanol, apresentavam material particulado visvel e no dissolvido foram filtradas com um conjunto de seringa descartvel e filtro de amostra, diretamente nos vials de vidro. 3.2.3. Quantificao de cocana por CG/DIC A tcnica de CG/DIC foi utilizada neste trabalho para a determinao do teor de cocana das amostras, j que os teores de alcaloides minoritrios devem ser expressos em relao ao teor de cocana como forma de normalizar as diluies que as amostras possam ter sofrido. Alm disso, atravs desta tcnica foi possvel determinar os teores dos alcaloides cis e trans-cinamoilcocana e confirmar a presena dos adulterantes benzocana, cafena, diltiazem, fenacetina, hidroxizina, lidocana, levamisol, e procana.

a) Condies cromatogrficas A temperatura do forno foi programada inicialmente a 150 C (2 min), rampa de 40 C/min at 315 C (3,87 min), tempo total de 9,99 minutos. Gs Hlio (He) foi usado como gs de arraste a um fluxo de 1,0 mL/min. O injetor foi mantido a 280 C, com injeo de 1,0 L de amostra com razo de split 50:1. O detector por ionizao em chama (DIC) foi mantido a uma temperatura de 320 C, com fluxo de hidrognio (H2) de 60 mL/min, fluxo de ar sinttico de 350 mL/min e fluxo de nitrognio (N2) de 35 mL/min. b) Preparao das curvas analticas Foram preparadas em triplicata solues com concentraes de 8,0; 40,2; 80,4; 160,8; 321,7; 482,5; 603,2; 804,2 mg/L de cocana e 2,68; 5,35; 10,71; 13,38; 20,01 mg/L de trans-cinamoilcocana. A soluo de padres internos utilizada foi preparada em clorofrmio com as seguintes concentraes 51,0 mg/L de 2,2,2trifenil-acetofenona (padro interno para as cinamoilcocanas), 490,1 mg/L de dipentil-ftalato (padro interno para a cocana), e 3% (v/v) de dietilamina. A curva analtica foi obtida pela projeo das concentraes de cada um dos analitos
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(cocana e trans-cinamoilcocana) no eixo das abscissas e das relaes de reas referentes a cada um deles e dos respectivos padres internos no eixo das ordenadas, utilizando-se a regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados para a obteno da equao da reta. A linearidade, definida como a capacidade do mtodo gerar resultados proporcionais da espcie em estudo, foi avaliada atravs do coeficiente de determinao (r2) da curva (CHASIN et al., 1998). A resposta obtida para o padro de trans-cinamoilcocana foi utilizado para construir a curva da ciscinamoilcocana. c) Anlise das amostras selecionadas por CG/DIC Aps a homogeneizao, foram transferidos entre 8 e 10 mg das amostras de cocana para erlenmeyers de 25 mL. Depois foram adicionados 10 mL de soluo de 0,051 mg/mL de 2,2,2-trifenil-acetofenona, 0,4901 mg/mL de dipentil-ftalato, e 3% (v/v) de dietilamina em clorofrmio. Em seguida procedeu-se leve agitao manual da soluo e transferiram cerca de 1 mL dessa soluo para vials de vidro de 1,8 mL, que foram lacrados e injetados no equipamento. 3.2.4. Anlises de alcaloides e adulterantes por CLAE/EM-EM (Triplo quadrupolo) A tcnica de CLAE/EM-EM foi utilizada neste trabalho apenas com propsitos qualitativos. O mtodo empregado no foi otimizado, somente uma condio cromatogrfica e coluna foram testadas. O mtodo foi construdo para a deteco, em uma mesma corrida, dos alcaloides truxilinas, benzoilecgonina, ecgonina, metilecgonina, norcocana, trimetoxicocana, tropacocana, cis e transcinamoilcocana e dos adulterantes benzocana, cafena, diltiazem, fenacetina, hidroxizina, lidocana e levamisol. As amostras de cocana objeto deste trabalho no foram analisadas por esta tcnica, somente solues padro e de controle foram testadas com objetivo de verificar as potencialidades desta tcnica em anlises de perfil qumico de cocana. a) Condies cromatogrficas Eluente A: soluo de formiato de amnio/cido frmico foi preparada em gua purificada no sistema Direct-Q 5, na concentrao de 5 mol/L (5 mL da soluo
75

___________________________________________________________________________________3. Materiais e Mtodos

estoque de formiato de amnio 1 mol/L 65,01 g de formiato de amnio em 1000 mL de gua purificada - em 1000 mL de gua purificada) e de 0,01% de cido frmico, (adio de 100 L de cido frmico em 1000 mL da soluo 5 mmol/L de formiato de amnio). O pH desta soluo de 4,0; Eluente B: soluo de acetonitrila com 0,01% de cido frmico. A fase mvel foi utilizada nas anlises por meio de gradiente, conforme a Tabela 13, com fluxo constante de 0,5 mL/min, e o tempo de equilbrio ps-corrida para retornar a composio inicial da fase mvel foi de 3 minutos, tempo total de anlise de 9 minutos e temperatura da coluna mantida a 60 C. O volume de injeo foi de 2 L.
Tabela 13 Gradiente utilizado nas anlises por CLAE/EM-EM.

Tempo (min) Inicial 0,5 3,0 4,0 6,0

Eluente A - % (v/v) 90 85 50 5 5

Eluente B - % (v/v) 10 15 50 95 95

b) Condies do espectrmetro de massas As condies da fonte de ionizao AP-ESI foram as seguintes: ionizao positiva; temperatura e fluxo do sheath gas (N2), 380 C, 12 L/min; nozzle voltage, 500V; temperatura e fluxo do gs secante (drying gas) (N2), 320 C, 8 L/min; presso do gs nebulizador (nebulizer), 27 psi; voltagem do capilar (capillary voltage), 3750V. No software de aquisio de dados o mtodo foi programado para adquirir duas transies de MRM de cada composto, sendo que os ons precursores selecionados eram protonados [M+H]+. A voltagem de fragmentao (fragmentor) e a energia de coliso EM/EM (CID) foram otimizadas para cada analito e juntamente com os pares de MRM monitorados no mtodo esto detalhadas na Tabela 14.

76

___________________________________________________________________________________3. Materiais e Mtodos

Tabela 14 - Transies de MRM monitorados, voltagem de fragmentao e energia de coliso (CID) para cada analito investigado por CLAE/EM-EM.
Voltagem de Analito 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Metilecgonina Benzoilecgonina Tropacocana Cocana Trimetoxicocana Cis-cinamoilcocana Trans-cinamoilcocana Truxilinas Levamisol Cafena Lidocana* Fenacetina Benzocana Diltiazem Hidroxizina fragmentao 101 111 80 138 80 108 108 177 116 96 100 96 230 131 104 1 Transio 200,1 -> 182,0 290,1 -> 168,0 246,1 -> 124,0 304,2 -> 182,0 394,2 -> 195,0 330,2 -> 182,0 330,2 -> 82,0 659,3 -> 182,0 205,1 -> 177,9 195,1 -> 137,9 235,2 -> 86,0 180,1 -> 109,9 166,1 -> 137,8 415,2 -> 177,9 375,2 -> 200,9 CID 13 13 30 17 30 13 13 37 21 17 13 21 10 21 13 2 Transio 200,1 -> 82,0 290,1 -> 105,0 246,1 -> 67,0 304,2 -> 77,0 394,2 -> 182,0 330,2 -> 82,0 330,2 -> 82,0 659,3 -> 131,0 205,1-> 90,9 195,1 -> 110,0 180,1-> 137,9 166,1 -> 119,8 415,2 -> 309,8 375,2-> 165,5 CID 25 29 30 61 30 29 29 50 45 25 13 5 17 41

* A lidocana apresenta praticamente um s on produto em seu espectro de massas de fragmentao, portanto s foi monitorada uma transio para este composto.

77

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

4. RESULTADOS 4.1. Anlises de truxilinas por CG/DCE


As condies cromatogrficas para o mtodo foram descritas detalhadamente no item 3.2.2. A Tabela 15 apresenta os tempos de reteno obtidos e a Figura 22 o cromatograma tpico dos padres internos e dos derivados di-heptafluorobutricos dos diois truxilil e truxinil de cada um dos ismeros das truxilinas, que so os compostos detectados indiretamente aps a reduo e derivatizao das truxilinas, identificados como (3) na Figura 23.

Tabela 15 - Tempos de reteno por CG/DCE dos derivados di-heptafluorobutricos dos diols truxilil e truxinil. Truxilina PI1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PI2 10
a b

tR (min) 21,75 24,91 25,03 25,18 25,39 25,45 25,61 25,84 26,02 26,23 26,45 26,74

Aldrin (PI) Epsilon Delta Beta Peri Neo Epi Alfa Omega Gama Mu (PI) Zeta

a,b

Aldrin foi usado como padro interno do instrumento. PI: padro interno.

78

_________________________________ __________________________________________________________________ ___________________________________________4. Resultados

5 4 6

PI2 10

Figura 22 - Cromatograma tpico dos derivados di-heptafluorobutricos di heptafluorobutricos dos diols truxilil e truxinil por CG/DCE. Picos: mesma numerao utilizada na Tabela 15.

(2)

Truxilina Alfa (1)

(3)

Figura 23 - Reaes de reduo e derivatizao sofridas pelas truxilinas na sua preparao para anlise por CG/DCE.

79

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________4. Resultados

Tabela 16 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos ismeros e respectivos coeficientes de variao (%CV).
reas relativas mdias dos ismeros de truxilinas Concentrao Epsilon 1 2 3 4 5 6 0,213 0,397 0,839 1,346 1,610 2,070 CV (%) 9,55 3,11 1,52 0,78 2,49 1,16 Delta 0,271 0,542 1,216 1,953 2,519 3,118 CV (%) 8,83 4,36 1,95 0,41 2,73 0,64 Beta 0,591 1,187 2,613 4,116 5,338 6,556 CV (%) 9,52 5,59 1,92 0,44 2,96 0,59 Peri 0,029 0,053 0,103 0,164 0,204 0,265 CV (%) 7,20 2,14 0,97 0,94 2,45 0,55 Neo 0,083 0,167 0,353 0,572 0,774 0,949 CV (%) 6,77 2,06 0,85 0,48 2,29 0,33 Epi 0,014 0,026 0,049 0,075 0,091 0,117 CV (%) 8,45 2,79 1,63 0,60 1,82 0,97 Alfa 0,678 1,387 2,993 4,972 6,239 8,048 CV (%) 5,52 2,38 0,87 0,21 1,52 0,27 Omega 0,110 0,201 0,399 0,617 0,743 0,950 CV (%) 6,74 1,09 0,51 0,23 1,66 0,53 Gama 0,101 0,196 0,389 0,635 0,788 1,015 CV (%) 5,00 1,50 0,81 0,50 0,58 0,59 Zeta 0,034 0,064 0,117 0,176 0,230 0,276 CV (%) 0,43 3,86 1,86 0,50 0,98 0,20

80

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

4.1.1. Curvas Analticas As curvas analticas (Figuras 24 a 33) foram obtidas por meio dos dados apresentados na Tabela 16. A equao de regresso linear foi estabelecida pelo mtodo dos mnimos quadrados e empregada na quantificao dos dez ismeros de truxilinas selecionados para anlise. As concentraes utilizadas em cada ponto da curva para cada ismero esto detalhadas na Tabela 10. Nos controles dirios de solues do padro RTI-DEA, a exatido (erro relativo) obtida foi sempre menor que 15% e a preciso (coeficiente de variao) sempre menor que 7%. Deve-se destacar que tais controles foram submetidos ao mesmo procedimento descrito no subitem 3.2.2.a, sendo 3 ou 6 replicatas injetadas por dia, durante 18 dias (n= 90).
2,5 2,0

Epsilon
Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3

rea relativa

1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

y = 0,9663x + 0,0148 R = 0,9949

Concentrao relativa

Figura 24 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero psilon nas concentraes de 0,84 a 8,50 g/mL.
Delta
3,5 3,0 2,5 Replica 1 Replica 2 Replica 3

rea relativa

2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

y = 1,159x - 0,0552 R = 0,9988

Concentrao relativa

Figura 25 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Delta nas concentraes de 1,09 a 11,05 g/mL.

81

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Beta
7,0 6,0 5,0 Replica 1

Replica 2 Replica 3

rea relativa

4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0

y = 1,2655x - 0,0721 R = 0,9990

Concentrao relativa

Figura 26 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Beta nas concentraes de 2,10 a 21,18 g/mL.
Peri
0,3 Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3

rea relativa

0,2

0,1

0,0 0,0 0,1 0,2 0,3

y = 0,6506x + 0,0018 R = 0,9971


0,4 0,5

Concentrao relativa

Figura 27 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Peri nas concentraes de 0,16 a 1,60 g/mL.
Neo

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6

Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3

rea relativa

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

y = 0,7722x - 0,0225 R = 0,9994


1,0 1,2 1,4

Concentrao relativa

Figura 28 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Neo nas concentraes de 0,13 a 1,26 g/mL.

82

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Epi
0,12 0,10 0,08 Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3

rea relativa

0,06 0,04 0,02 0,00 0,0 0,1 0,2

y = 0,5608x + 0,0039 R = 0,9966

Concentrao relativa

Figura 29 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Epi nas concentraes de 0,02 a 0,20 g/mL.

9 8 7 6 rea relativa 5 4 3 2 1 0 0

Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3

Alfa

y = 1,0813x - 0,1837 R = 0,9975 2 4 6 Concentrao relativa 8

Figura 30 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Alfa nas concentraes de 0,75 a 7,54 g/mL.

1,2 1,0 0,8

Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3

Omega

rea relativa

0,6 0,4 0,2 0,0

y = 0,5983x + 0,0247 R = 0,9959 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Concentrao relativa

Figura 31 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Omega nas concentraes de 0,15 a 1,54 g/mL.

83

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Gama
1,2 1,0 0,8 Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3

rea relativa

0,6 0,4 0,2 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

y = 0,8135x - 0,0022 R = 0,9973

Concentrao relativa

Figura 32 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Gama nas concentraes de 0,12 a 1,24 g/mL.
Zeta
0,3 0,3 0,2 Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3

rea relativa

0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,1 0,2 0,3

y = 0,6868x + 0,0093 R = 0,9993


0,4 0,5

Concentrao relativa

Figura 33 - Representao da curva analtica para a determinao do ismero Zeta nas concentraes de 0,04 a 0,39 g/mL.

4.1.2. Limite de deteco e de quantificao Tanto o limite de deteco quanto o limite de quantificao da tcnica de CG/ECD para a anlise de truxilinas foram estimados para os ismeros peri, epi, gama e zeta. Para o primeiro, obtiveram-se valores entre 8 e 19 g/L, enquanto que para o segundo os valores situaram-se entre 39 e 80 g/L. Estas faixas foram consideradas como vlidas para as demais truxilinas. Cabe ressaltar que por este mtodo foram detectados os derivados diheptafluorobutricos dos diois truxilil e truxinil.

84

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

4.1.3. Resultados das anlises das amostras e classificao por origem geogrfica Baseado no trabalho de Moore et al.21, pode-se sugerir a origem geogrfica de amostras de cocana de acordo com o seu teor total de truxilinas. Amostras com teor total de truxilinas menor que 3% so classificadas como de origem boliviana; amostras com teor total entre 3% e 4,9%so classificadas como de origem peruana; e amostras com teor total maior que 4,9% so classificadas como de origem colombiana. Nas Figuras 34 e 35 so apresentadas as origens geogrficas das amostras analisadas baseadas no teor total de truxilinas por CG/DCE, sendo que na Figura 35 as origens esto separadas por forma de apresentao da cocana. Na Tabela 17, esto resumidos os resultados de classificao de origem geogrfica das amostras, separadas por estado de apreenso.

33%

Origem: Bolvia Colmbia

59% 8%

Peru

Figura 34 - Origem geogrfica das amostras, de acordo com o teor total de truxilinas por CG/ECD. (n=160)

60 50 n de amostras 40 30 20 10 0 Bolvia Colmbia Pas de origem Peru


Forma de apresentao:

Base HCl

Figura 35 - Origem geogrfica das amostras analisadas separadas conforme a sua forma de apresentao. (n=160) 85

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Tabela 17 - Origem geogrfica das amostras analisadas por estado de apreenso de acordo com o teor total de truxilinas por CG/ECD. (n=160).
Estado AC AM RO DF MS MT PR SP Pas de origem Bolvia 3 6 6 12 7 9 33 19 Colmbia 0 9 2 0 1 0 0 0 Peru 13 0 12 4 6 7 6 5 Total 16 15 20 16 14 16 39 24

Os teores totais de truxilinas, obtidos por CG/ECD, variaram de 0,28 a 11,89%, com mdia de 2,75% em relao ao teor de cocana. Os resultados detalhados dos teores totais de truxilinas, obtidos pela tcnica de CG/DCE, nas amostras analisadas esto detalhados no Apndice 1 desta dissertao.

4.2. Metodologia de identificao e quantificao de truxilinas por CLAE/TOF-EM


4.2.1. Resultados qualitativos A Figura 36 apresenta o cromatograma reconstrudo da extrao do on (EIC) de m/z 659,3327, on monocarregado das truxilinas, aps injeo da soluo do padro RTI-DEA em metanol. Como se pode notar possvel identificar 9 dos dez ismeros das truxilinas.
7

8 2 1 4 5 6

Figura 36 - Cromatograma reconstrudo (EIC), padro RTI-DEA em metanol, do on de m/z 659,3327, on [M+H] das truxilinas. 86
+

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

A Figura 37 apresenta o espectro de massas de um dos picos das truxilinas identificadas no cromatograma anterior.

Figura 37 - Espectro de massas do pico 3 da Figura 22, no tempo de reteno 10,11 minutos. Destaque para o on [M+H] : 659,3327 e [M+2H] : 330,1706, ambos ons moleculares das truxilinas.
+ 2+

A Figura 38 mostra que o on duplamente carregado das truxilinas possui a mesma massa exata terica do on mono carregado das cinamoilcocanas (m/z 330,1700), porm as truxilinas apresentam o on m/z 330,6721, que est ausente na distribuio isotpica das cinamoilcocanas.
(a)

(b)

Figura 38 - Comparao entre a ampliao dos espectros de massas do on duplamente carregado das truxilinas (a) e o on monocarregado da trans-cinamoilcocana (b). 87

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

A Figura 39 apresenta uma comparao entre os cromatogramas de extrao de ons de m/z 330,1700, que inclui a contribuio dos ons monocarregado das cinamoilcocanas e o duplamente carregado das truxilinas; do on de m/z 330,6716; e do on m/z 659,3327, ambos s presentes nos espectros de massas das truxilinas. A Tabela 18 detalha as distribuies isotpicas obtidas experimentalmente e calculadas dos ons mono e duplamente carregados das truxilinas e do on monocarregado das cinamoilcocanas.
1 2

(a)

(b)

7 3

(c)

6 4 5

Figura 39 - Ampliao dos cromatogramas reconstrudos (EIC), injeo do padro RTI-DEA em metanol: (a) cromatograma do on de m/z 330,1700 (1 e 2: cis e trans-cinamoilcocana); (b) cromatograma do on de m/z 330,6716; (c) cromatograma do on m/z 659,3327 (mesma numerao da Figura 22).

88

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Tabela 18 - Medidas de massas exatas e abundncia isotpica experimentais e calculadas dos ons mono e duplamente carregados das truxilinas e cinamoilcocanas.
Analito on selec. Abundncia % (altura) exp 100,0 39,5 [M+H] Truxilinas (C38H46N2O8)
+

Abundncia % (altura) calc 100,0 42,7 10,5 1,9 0,3 100,0 42,7 10,5 1,9 100 21,3 3,0 0,3

m/z exp 659,3322 660,3363 661,3384 662,3395 663,3462 330,1706 330,6721 331,1727 331,6757 330,1709 331,1740 332,1766 333,1789

m/z calc 659,3327 660,3360 661,3389 662,3417 663,3444 330,1700 330,6716 331,1731 331,6745 330,1700 331,1733 332,1759 333,1785

Erro (ppm) 0,64 -0,47 0,74 3,39 -2,62 -1,87 -1,46 1,13 -3,74 -2,64 -2,12 -2,06 -1,09

9,8 2,2 0,6 100,0

[M+2H]+2

35,8 11,0 1,7

Cinamoilcocana (C19H23NO4)

100 [M+H]+ 23,5 3,3 0,3

Alm dos ons mono e duplamente carregados das truxilinas foi possvel detectar quatro produtos derivados das truxilinas (Tabela 19 e Figura 40) pela metodologia proposta. Tais compostos j haviam sido descritos por Moore et al.21, como sendo produtos da hidrlise das truxilinas. Esses produtos foram detectados ao longo do cromatograma, alguns destes ons coeluem com os ons das truxilinas, outros esto separados, por isso acreditase que alguns deles possam ter origem tambm na fragmentao das truxilinas na fonte de ionizao electrospray.
Tabela 19 - Medidas de massas exatas experimentais e calculadas dos produtos detectados de hidrlise das truxilinas. Analito Produto 1 Produto 2 Produto 3* Produto 4 Frmula C37H44N2O8 C36H42N2O8 C28H31NO6 C27H29NO6 on [M+H] [M+H]
+

m/z exp 645,3173 631,3010 478,2225 464,2071

m/z calc 645,3170 631,3014 478,2224 464,2068

Erro (ppm) -0,28 0,74 -0,14 -0,74

[M+H] [M+H]

* Este composto pode ser observado no espectro de massas da Figura 37.

89

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

CH3

O C OH H O H H H O O HO H O

O C

H3C
HO H O HO C O O

O C

H3 C

H
H H

C36H42N2O8 [M+H]+: 631,3014

(2)

C27H29NO6 [M+H]+: 464,2068

N H 3CO 2C H O O O H H H

H3C

(4)
HO C

CH3

CO2CH 3 H O H H H O O

N H3CO2C H O H

H3C

C28H31NO6 [M+H]+ : 478,2224

(3)

truxilina
CH3 O C OH H O H H H O O N H3CO2C H O H H H H H

H3C O HO C

O C OH

+
C18H16O 4 [M+H]+ : 296,1049

Ecgonina +

Metanol

(5)

Chemical Formula: C37H44N2O8 [M+H]+: 645,3170

(1)

Figura 40 - Estruturas dos produtos de hidrlise do ismero beta das truxilinas, em amostras de cocana refinadas, de acordo com numerao da Tabela 19.

4.2.2. Otimizao das condies analticas As condies cromatogrficas para o mtodo foram otimizadas e os parmetros cromatogrficos para as condies propostas encontram-se expressos nas Tabelas 20 e 21.

90

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Tabela 20 - Tempo de reteno, reteno relativa, fator de reteno e fator de alargamento dos picos cromatogrficos obtidos para as truxilinas e padro interno (PI). Analito Atropina (PI) Truxilina 1 Truxilina 2 Truxilina 3 Truxilina 4 Truxilina 5 Truxilina 6 Truxilina 7 Truxilina 8 Truxilina 9
a b a

Tempo de ret. (mim) 6,4 8,5 9,1 10,1 11,7 11,9 12,2 13,3 13,9 14,7

Reteno b relativa 1,00 1,31 1,41 1,58 1,81 1,86 1,89 2,08 2,16 2,30

k 6,1 8,4 9,0 10,2 11,9 12,3 12,5 13,8 14,4 15,3

Tf 1,3 1,9 1,4 1,4 0,7 0,8 1,6 1,4 1,7 1,9

A numerao das truxilinas est de acordo com a Figura 22. Tempo de reteno do analito dividido pelo tempo de reteno do padro interno. Tabela 21 - Parmetros cromatogrficos utilizados para avaliar a eficincia na separao dos analitos nas condies cromatogrficas propostas. Analito Atropina (PI) Truxilina 1 Truxilina 2 Truxilina 3 Truxilina 4 Truxilina 5 Truxilina 6 Truxilina 7 Truxilina 8 Truxilina 9 Fator de separao ( ) 1,38 1,07 1,13 1,17 1,03 1,02 1,10 1,04 1,06 Resoluo (Rs) 71,6 9,6 2,4 4,9 6,1 1,0 0,8 4,8 2,0 2,7

4.2.3. Curva Analtica A curva analtica (Figura 41) foi obtida por meio dos dados apresentados na Tabela 22. A equao de regresso linear foi estabelecida pelo mtodo dos mnimos quadrados e foi empregada na quantificao do total de truxilinas nas amostras.

91

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Tabela 22 - reas relativas totais obtidas para a elaborao da curva analtica de truxilinas e respectivos desvio padro (DP) e coeficientes de variao (%CV). Ponto 1 2 3 4 5 6 7 Concentrao (mg/L) 5,76 11,52 23,05 34,57 46,10 57,62 72,02 rea relativa total (mdia) 0,3683 0,9612 2,3038 3,7877 5,2406 6,6815 8,4555 DP 0,0107 0,0260 0,0346 0,0979 0,1501 0,1545 0,0460 CV (%) 2,91 2,70 1,50 2,58 2,86 2,31 0,54

Truxilinas total
9 8 7 rea relativa 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 Concentrao (mg/L) y = 0,1232x - 0,4408 R = 0,9996 60 80 Replicata 1 Replicata 2 Replicata 3

Figura 41 - Representao da curva analtica para a determinao do total de truxilinas nas concentraes de 5,8 a 72,0 mg/L.

4.2.4. Limite de deteco e limite de quantificao Os limites de deteco e de quantificao da tcnica de CLAE/EM proposta para a anlise de truxilinas foram estimados para as truxilinas 3 e 5. Para o primeiro obtiveram-se valores entre 170 e 240 g/L, para o on de quantificao de m/z 659,3327. J para o segundo, obtiveram-se valores entre 330 e 480 g/L, para o on de quantificao de m/z 659,3327. Estas faixas foram consideradas como vlidas para as demais truxilinas.

92

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Para se obterem os limites de deteco e quantificao, as truxilinas 3 e 5 foram consideradas como sendo os ismeros beta e alfa, respectivamente, em virtude de serem os ismeros com maiores teores no padro RTI-DEA. importante frisar que para os demais ismeros no possvel fazer esta inferncia com segurana. 4.2.5. Preciso e exatido intraensaio e interensaio Os coeficientes de variao (preciso) e erros relativos (exatido) obtidos para o mtodo proposto nas anlises de solues com concentraes totais baixa, mdia e alta de truxilinas esto expressas na Tabela 23.
Tabela 23 - Preciso e exatido do mtodo proposto para quantificao de truxilinas, em trs concentraes diferentes. Concentrao Baixa Interdia (n=6) Preciso (CV %) Exatido (Erro relativo %) 4,04 0,69 Intradia (n=18) 4,61 4,26 Concentrao Mdia Interdia (n=6) 4,28 -2,47 Intradia (n=18) 5,92 6,02 Concentrao Alta Interdia (n=6) 2,16 0,76 Intradia (n=18) 6,77 6,72

4.2.6. Resultados das anlises de amostras por CLAE/EM Os resultados detalhados dos teores totais de truxilinas, obtidos pela tcnica proposta, nas amostras analisadas esto detalhados no Apndice 2.

4.3. Anlises de alcaloides e adulterantes por CLAE/TOF-EM


A Tabela 24 apresenta os alcaloides e adulterantes comumente encontrados em amostras de cocana, que puderam ser detectados pelo mtodo de CLAE/TOFEM proposto. Como descrito no item 3.2.2.b, a aquisio de dados foi feita no modo scan, e os cromatogramas com os ons de cada analito foram reconstrudos psanalise. Dessa forma, as corridas monitoraram simultaneamente as truxilinas ou outros alcaloides e os adulterantes. Os cromatogramas (EIC) dos alcaloides e adulterantes identificados esto mostrados nas Figuras 42 e 43, respectivamente.

93

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

x10 6 +ESI EIC(186,1125) Scan Frag=120,0V pq_mix-completo_02set11_61b.d 1 1 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 x10 6 +ESI EIC(200,1281) Scan Frag=120,0V pq_mix-completo_02set11_61b.d 1 2 1,25 1 0,75 0,5 0,25 0 x10 6 +ESI EIC(290,1387) Scan Frag=120,0V pq_mix-completo_02set11_61b.d 3 1,2 1 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 x10 5 +ESI EIC(246,1489) Scan Frag=120,0V pq_mix-completo_02set11_61b.d 1,5 1 1,25 1 0,75 0,5 0,25 0 x10 7 +ESI EIC(304,1543) Scan Frag=120,0V pq_mix-completo_02set11_61b.d 1 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

7 4

Figura 42 - Cromatogramas tpicos reconstrudos (EIC) dos ons [M+H]

dos alcaloides

investigados (padres) em uma mesma injeo. Picos: mesma numerao da Tabela 24.

94

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

10

11

12

13

x10 6 +ESI EIC(180,1019) Scan Frag=120,0V pq_mix-completo_02set11_61b.d 1 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

14

15

x10 5 +ESI EIC(415,1686) Scan Frag=120,0V pq_mix-completo_02set11_61b.d 1 5 4 3 2 1 0

16

17

Figura 43 - Cromatogramas tpicos reconstrudos (EIC) dos ons [M+H] dos adulterantes investigados (padres) em uma mesma injeo. Picos: mesma numerao da Tabela 24. 95

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Tabela 24 - Medidas de massas exatas de padres de alcaloides e adulterantes em soluo de metanol por CLAE/TOF-EM.
Analito 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ecgonina Metilecgonina Benzoilecgonina Tropacocana Cocana Trimetoxicocana Norcocana Cis-cinamoilcocana Trans-cinamoilcocana Procana Levamisol Cafena Lidocana Fenacetina Benzocana Diltiazem Hidroxizina tR (min) 0,9 0,9 7,3 8,0 8,2 9,2 9,6 10,8 12,1 3,2 4,2 6,0 6,1 11,3 11,9 16,4 16,6 Frmula C9H15NO3 C10H17NO3 C16H19NO4 C15H19NO2 C17H21NO4 C20H27NO7 C16H19NO4 C19H23NO4 C19H23NO4 C13H20N2O2 C11H12N2S C8H10N4O2 C14H22N2O C10H13NO2 C9H11NO2 C22H26N2O4S C21H27ClN2O2 on selec. [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H] [M+H]
+ + + + + + + + + + + + + + + + +

m/z exp. 186,1122 200,1278 290,1392 246,1485 304,1552 394,1859 290,1387 330,1706 330,1699 237,1601 205,0796 195,0878 235,1807 180,1021 166,0866 415,1693 375,1838

m/z calc 186,1125 200,1281 290,1387 246,1489 304,1543 394,1860 290,1384 330,1700 330,1700 237,1598 205,0794 195,0877 235,1805 180,1019 166,0863 415,1686 375,1834

Erro (ppm) 1,56 1,77 -1,79 1,60 2,96 0,22 1,06 -1,95 0,35 -1,57 -0,76 -0,56 -0,96 -1,25 -2,10 -1,66 -1,17

4.3.1. Curvas Analticas As concentraes utilizadas em cada ponto para construir as curvas analticas, mostradas nas Figuras 44 a 49, esto detalhadas na Tabela 12. A equao de regresso linear foi estabelecida pelo mtodo dos mnimos quadrados e empregada para verificar a faixa de linearidade dos alcaloides ecgonina, metilecgonina, benzoilecgonina, tropacocana, trimetoxicocana e cis-cinamoilccana, na metodologia proposta. Os dois pontos de maior concentrao relativa mostrados nas Figuras de 43 a 46, e os quatro pontos de maior concentrao relativa mostrados na Figura 48 no foram considerados para determinao das equaes das retas. Tais pontos foram mantidos nas respectivas Figuras apenas para ilustrar as faixas de linearidade dos analitos, e esto excludos das faixas de concentrao informadas nas legendas das Figuras.

96

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Figura 44 - Representao da curva analtica para a determinao de benzoilecgonina nas concentraes de 0,116 a 3,713 mg/L.

Figura 45 - Representao da curva analtica para a determinao de ciscinamoilcocana nas concentraes de 0,858 a 27,462 mg/L.

Figura 46 - Representao da curva analtica para a determinao de ecgonina nas concentraes de 0,252 a 8,063mg/L.

97

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Figura 47 - Representao da curva analtica para a determinao da metilecgonina nas concentraes de 0,161 a 5,167 mg/L.

Figura 48 - Representao da curva analtica para a determinao da trimetoxicocana nas concentraes de 0,026 a 1,316 mg/L.

Figura 49 - Representao da curva analtica para a determinao da tropacocana nas concentraes de 0,016 a 0,249 mg/L.

98

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

4.3.2. Limite de deteco Os limites de deteco estabelecidos para os alcaloides investigados pela tcnica de CLAE/EM proposta esto mostrados na Tabela 25.
Tabela 25 - Limites de deteco estabelecidos para os alcaloides pela metodologia proposta. Alcaloide Benzoilecgonina Cis-cinamoilcocana Trans-cinamoilcocana Ecgonina Metilecgonina Trimetoxicocana Tropacocana Limite de deteco (g/L) 5,8 4,3 4,9 6,3 8,0 2,6 3,9

4.4. Identificao de adulterantes nas amostras


A identificao de adulterantes nas amostras de cocana analisadas foi realizada por CLAE/EM e confirmadas pelos resultados de CG/DIC, na mesma injeo utilizada para a quantificao de cocana. Na Figura 50 pode-se observar a presena de adulterantes no conjunto de amostras analisadas, sendo que pouco mais da metade no apresenta nenhum adulterante, o que no significa que possuam maiores teores de cocana, j que podem apresentar em suas composies diluentes inorgnicos ou acares, por exemplo, que no foram objeto deste trabalho. Os resultados obtidos mostram uma predominncia da fenacetina como principal adulterante, encontrado em 35% das amostras. E esta uma tendncia tambm observada em todas as regies analisadas. Cabe ressaltar que algumas amostras apresentam mais de um adulterante, motivo pelo qual na Figura 50 a soma das porcentagens ser maior que 100%. As Figuras 51 a 54 mostram os mesmos resultados da Figura 49, porm separando as amostras por regio de apreenso e identificando as que contm mais

99

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

de um adulterante. Nessas Figuras, as regies Sudeste e Sul so representadas, respectivamente, por So Paulo e Paran. Os resultados detalhados da presena de adulterantes no conjunto de amostras analisadas esto descritos no Apndice 3 desta dissertao.

60% % de amostras 50% 40% 30% 20% 10% 0% 11% 8% 35%

54%

4%

1%

1%

1%

1%

Adulterante Figura 50 - Presena de adulterantes no total de amostras analisadas. (n=160)

Norte
27%

Fenacetina Cafena

61%

4% 8%

Fenacetina+Cafena Nenhum

Figura 51 - Presena de adulterantes nas amostras provenientes da Regio Norte. (n=51)

100

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Centro-Oeste
26% Fenacetina Levamisol Hidroxizina 57% 11% 4% 2% Misturas com fenacetina Nenhum

Figura 52-Presena de adulterantes nas amostras provenientes da Regio Centro-Oeste. (n=46)

Sudeste
21% 33% Fenacetina Misturas com levamisol Lidocana Cafena Ldocaina+Hidroxizina 4% 4% 8% Figura 53 - Presena de adulterantes nas amostras provenientes da Regio Sudeste. (n=24) 29% Nenhum

Sul
21% Fenacetina Levamisol Cafena 10% 56% 3% 8% 3% Paracetamol Misturas com fenacetina Nenhum

Figura 54 - Presena de adulterantes nas amostras provenientes da Regio Sul. (n=39)

101

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

4.5. Determinao dos teores de cocana nas amostras


Para o conjunto das 160 amostras analisadas foram observadas grandes variaes no teor de cocana (Apndice 3), abrangendo o intervalo de 12,0% at 88,7% de pureza, sendo que o teor mdio global foi de 70,5%. Os teores de cocana foram expressos em porcentagem de cocana na forma de base para todas as amostras independentemente de suas formas de apresentao. Os teores mdios de cocana apresentaram valores prximos entre os estados, variando de 62,4% a 73,3% (Figura 55). As Figuras 56 a 63 mostram a distribuio dos teores de cocana nas amostras por estado. Pode-se constatar que a maioria das amostras (47,5%) apresentou teores entre 70 e 80% de cocana. Observa-se que as amostras provenientes do Paran apresentam os maiores teores de cocana. De fato, aproximadamente metade (46,2%) das amostras provenientes deste estado apresentou alto teor de cocana variando entre 80 e 90% de pureza.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
AC AM RO DF MS MT PR SP

Teor de Cocana (%)

Teor Mdio % Teor Mnimo% Teor Mximo %

Estado Figura 55 - Teores mdio, mnimo e mximo de cocana por estado, nas amostras analisadas.

102

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Acre
12

n de amostras

10 8 6 4 2 0 <50 50-60 60-70 70-80 80-90

Teor de cocana (%)


Figura 56 Distribuio dos teores de cocana das amostras do Acre.

Amazonas
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 <50 50-60 60-70 70-80 80-90

n de amostras

Teor de cocana (%)


Figura 57 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Amazonas.

Rondnia
8 7 6 5 4 3 2 1 0 <50 50-60 60-70 70-80 80-90

n de amostras

Teor de cocana (%)


Figura 58- Distribuio dos teores de cocana das amostras de Rondnia.

103

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Distrito Federal
12

n de amostras

10 8 6 4 2 0 <50 50-60 60-70 70-80 80-90

Teor de cocana (%)


Figura 59 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Distrito Federal.

Mato Grosso
12

n de amostras

10 8 6 4 2 0 <50 50-60 60-70 70-80 80-90

Teor de cocana (%)


Figura 60 - Distribuio dos teores de cocana das amostras de Mato Grosso.

Mato Grosso do Sul


8 7 6 5 4 3 2 1 0 <50 50-60 60-70 70-80 80-90

n de amostras

Teor de cocana (%)


Figura 61 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Mato Grosso do Sul.

104

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Paran
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 <50 50-60 60-70 70-80 80-90

n de amostras

Teor de cocana (%)


Figura 62 - Distribuio dos teores de cocana das amostras do Paran.

So Paulo
14

n de amostras

12 10 8 6 4 2 0 <50 50-60 60-70 70-80 80-90

Teor de cocana (%)


Figura 63 - Distribuio dos teores de cocana das amostras de So Paulo.

4.6. Determinao dos teores de cis e trans-cinamoilcocana e grau de oxidao das amostras.
Conforme discutido no item 1.7 o teor total de cinamoilcocanas em uma amostra indica o grau de oxidao que ela sofreu durante o processo de refino. De acordo com a classificao sugerida por Casale60, as amostras foram classificadas de acordo com o seu grau de oxidao a partir de seus teores de cinamoilcocanas (relativos ao teor de cocana). Amostras contendo menos do que 2% de cinamoilcocanas so consideradas altamente oxidadas, amostras contendo entre 2% e 6% so consideradas medianamente oxidadas, e amostras contendo mais de 6% so consideradas levemente oxidadas ou no sofreram nenhuma oxidao.

105

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

A partir desta classificao os resultados demonstram que a minoria das amostras sofreu alta oxidao (Figura 64) e tambm que a maioria das amostras de cocana na forma de base sofreu baixa oxidao ou no foram oxidadas (Figura 65). Por outro lado, as amostras na forma de cloridrato (Figura 66), em sua maioria sofreram mdia ou alta oxidao. Na Figura 67 est detalhada a distribuio das amostras por estado considerando o grau de oxidao das mesmas.
Nacional
15%

43%

Grau de Oxidao: Alto Mdio Baixo

43%

Figura 64 - Grau de oxidao de todas as amostras analisadas.

Nacional - Cocana Base


9% Grau de oxidao: 24% Alto Mdio Baixo 67%

Figura 65 - Grau de oxidao de amostras de cocana na forma de base.

106

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Nacional - Cloridrato de cocana


2%

25%

Grau de oxidao: Alto Mdio Baixo

73%

Figura 66 - Grau de oxidao em amostras de cocana na forma de sal cloridrato.

25 20 15 10 5 0 AC AM RO DF MS MT PR SP Estado Figura 67 - Grau de oxidao: alto, mdio, e baixo das amostras analisadas por estado.
Grau de Oxidao: Alto Mdio Baixo

alcaloides e adulterantes investigados. Com exceo da lidocana, em todos os compostos foi possvel monitorar duas transies MRM. Cabe ressaltar que, as transies inscritas nos cabealhos de cada cromatograma so exatamente as transies que apresentam a maior intensidade.

n de amostras

4.7. Anlises de alcaloides e adulterantes por CLAE/EM-EM (Triplo quadrupolo)


As Figuras 68 e 69 apresentam os cromatogramas das transies MRM dos

107

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

Figura 68 - Cromatogramas das duas transies MRM de cada um dos alcaloides investigados (padres) em uma mesma injeo. Picos: mesma numerao da Tabela 14. 108

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

x10 5 +ESI MRM Frag=104,0V CID@13,0 (375,2000 -> 200,9000) pequi_diluentes_DMRM_1b.d 3,20 1 3 1 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 Counts vs. Acquisition Time (min) 6,5 7 7,5 8 8,5 9

(15)

9,5

Figura 69 - Cromatogramas das duas transies MRM de cada um dos adulterantes investigados (padres) em uma mesma injeo. Picos: mesma numerao da Tabela 14. 109

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

Nas Figuras de 70 a 72 so apresentados espectros de massas de fragmentao, em experimentos de EM/EM, dos ons de m/z 330,0, em diferentes tempos de reteno e do on m/z 659,0, em diferentes energias de coliso.
(a)

(b)

(c)

Figura 70 - Espectros de massas de fragmentao (EM/EM) do on de m/z 330,0, no tempo de reteno da cis-cinamoilcocana, em trs energias de coliso (CID): (a) CID = 5, (b) CID = 10 e (c) CID = 20.

(a)

(b)

(c)

Figura 71 - Espectros de massas de fragmentao (EM/EM) do on de m/z 330,0, no tempo de reteno de um dos ismeros da truxilina, em trs energias de coliso (CID): (a) CID = 5, (b) CID = 10 e (c) CID = 20.

110

___________________________________________________________________________________________4. Resultados

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Figura 72 - Espectros de massas de fragmentao (EM/EM) do on de m/z 659,0, no tempo de


reteno de um dos ismeros da truxilina, em cinco energias de coliso (CID): (a) CID = 10, (b) CID = 20, (c) CID = 30, (d) CID = 40, e (e) CID = 50.

111

___________________________________________________________________________________________5. Discusso

5. DISCUSSO 5.1. Introduo


Como j foi descrito anteriormente, este trabalho tem como principal objetivo apresentar uma nova metodologia analtica que possibilite a anlise de truxilinas por CLAE/EM. Para complementar este desenvolvimento, optou-se por tentar, com a mesma metodologia, detectar os principais adulterantes e alcaloides encontrados em amostras de cocana simultaneamente. A relevncia deste trabalho reside no fato de que, conforme mostrado na Introduo, ainda no existe no Brasil qualquer informao sobre os perfis de truxilinas em amostras de cocana. At mesmo as informaes de teor de cocana e grau de oxidao das amostras no so rotineiramente estabelecidas e publicadas no pas. Dessa forma, necessrio que a Polcia Federal tenha a sua disposio um laboratrio forense que seja capaz de desenvolver metodologias apropriadas e criteriosamente validadas para que os resultados emitidos sejam inequvocos e incontestveis, contribuindo para o estabelecimento do perfil qumico da cocana apreendida no pas, do qual este trabalho parte integrante.

5.2. Desenvolvimento da metodologia proposta e anlise de truxilinas


Os coeficientes de variao obtidos para as curvas de calibrao dos ismeros das truxilinas por CG/DCE foram satisfatrios, pois apresentaram excelente linearidade dentro do intervalo dinmico da curva analtica, com valores de coeficientes de regresso linear sempre superiores a 0,99 para todos os ismeros. O mtodo proposto de quantificao de truxilinas por CLAE/EM tambm apresentou excelente linearidade dentro do intervalo dinmico da curva analtica, com valor do coeficiente de regresso linear superior a 0,999. Foi proposto por Anastassiades et al.91, em 2003, uma metodologia inovadora para extrao e preparo de amostras de resduos de pesticidas denominado QuEChERS (do ingls, Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), que foi traduzido para o portugus, segundo Prestes et al.92, como rpido, fcil, econmico, efetivo, robusto e seguro. Com desenvolvimento do trabalho de 2003, os autores
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___________________________________________________________________________________________5. Discusso

buscavam um novo mtodo de extrao simultnea de mltiplos resduos de pesticidas, para depois serem analisados por alguma anlise cromatogrfica. Os parmetros sugeridos por Anastassiades para um mtodo rpido, fcil, econmico, efetivo, robusto e seguro podem servir para avaliar qualquer nova metodologia analtica. Desta forma, esta abordagem ser utilizada para comparar a nova metodologia de anlise de truxilinas por CLAE/EM, desenvolvida nesta dissertao, com aquela publicada na literatura por CG/DCE21. No que tange rapidez, o mtodo de CLAE/EM proposto mais vantajoso que o de CG/DCE, pois mais rpido tanto na preparao de amostras quanto no tempo de anlise nos cromatgrafos. A preparao (reduo e derivatizao) de 20 amostras, pelo mtodo CG/DCE, leva 6 horas (sem considerar a etapa de pesagem das amostras, que comum aos dois mtodos), resultando em um tempo estimado de 18 minutos por amostra. Somados aos 38 minutos de anlise no CG/ECD, gastase quase 1 hora de anlise por amostra. J na nova metodologia proposta o tempo de preparao da amostra bastante reduzido, j que, desconsiderando a pesagem, basta se adicionar 10 mL de soluo de padro interno e transferir para o vial. Com isso, a anlise de CLAE/EM dura praticamente 23 minutos por amostra, que corresponde ao tempo de anlise no cromatgrafo. Uma possvel melhoria para a metodologia de CLAE/EM proposta seria a utilizao de um equipamento de UHPLC acoplado ao espectrmetro de massas, que poderia diminuir o tempo de anlise para menos de 10 minutos, mantendo ou melhorando a resoluo de picos do mtodo proposto. Quanto facilidade, o mtodo de CG/DCE muito mais trabalhoso do que a nova metodologia proposta. Como j discutido, a preparao de amostras no mtodo de CG/DCE envolve etapas de reduo e derivatizao, o que exige um laborioso procedimento de bancada, no qual as possibilidades de erros por parte do analista so significativamente ampliadas. J no caso do mtodo de CLAE/EM, por tratar-se de uma preparao direta, o trabalho do analista simplificado. Analisando somente a preparao de amostra, no quesito economia o novo mtodo proposto cerca de 7 vezes mais barato que o mtodo de CG/ECD. Para tal estimativa foram contabilizados os custos dos reagentes mais caros, em que no caso do mtodo por CG/DCE - HFBA, LiAlH4, mu-truxinato, aldrin, isooctano e ter
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etlico >99% - o custo de cerca de R$ 7,00 por amostra. No caso da preparao de amostras pelo mtodo de CLAE/EM - metanol, seringa descartvel e filtro para amostras (aproximadamente 20% das amostras precisaram ser filtradas) - o custo de R$ 1,00 por amostrav. Alm disso, outro fato que torna o mtodo de CG/ECD menos vantajoso economicamente o custo por analista/hora. Enquanto no mtodo de CLAE/EM o analista gasta menos de 10 minutos na preparao de 20 amostras, no mtodo de CG/ECD ele gastaria 6 horas. Os teores totais de truxilinas obtidos pela metodologia de CLAE/EM proposta foram notadamente diferentes dos obtidos pelo mtodo de referncia por CG/DCE. Os resultados podem ser observados nos Apndices 1 e 2. Sem dvida, esta a grande desvantagem apresentada pelo mtodo proposto, o que inviabiliza sua utilizao em uma rotina de anlise de truxilinas, nesta fase de desenvolvimento em que se encontra. Considerando efetividade como sendo a capacidade de um mtodo de gerar resultados confiveis e responder ao que ele se prope de maneira eficiente, podese concluir que o mtodo proposto no logrou o xito esperado neste quesito. Algumas hipteses podem ser propostas para tentar explicar a diferena de teores obtida pelos dois mtodos. Porm, antes de apresent-las importante discutir os resultados obtidos nas anlises realizadas nas solues do padro de truxilinas RTI-DEA. Nos experimentos planejados para a verificao da confiabilidade do mtodo, diversos parmetros foram avaliados durante o desenvolvimento proposto. A exatido, a preciso, a linearidade e os parmetros cromatogrficos, como fator de reteno, fator de alargamento, fator de separao e resoluo foram avaliados e os valores obtidos se mostraram adequados ao exigido para uma nova metodologia analtica. Portanto, as diferenas observadas nos teores de truxilinas na amostras analisadas por CLAE/EM no foram observadas nos padres durante o desenvolvimento da metodologia.

Preos consultados no site www.aldrich.com em 29/10/2011.

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Ao invs de se calcular o erro relativo para avaliar a exatido de um mtodo, pode-se efetuar o clculo da recuperao, que definido como sendo a razo percentual entre a concentrao experimental e a concentrao real (ou entre a concentrao encontrada e a terica). Segundo pshtein93, para a determinao quantitativa de impurezas de at 1%, a recuperao no pode ficar fora da faixa de 90 a 110%. No caso das avaliaes de exatido realizadas por CLAE/EM, na quantificao das truxilinas, esta faixa variou de 97,5 a 106,7%, incluindo as concentraes baixa, mdia e alta. J em relao preciso inter e intra-ensaio, pshtein93 sugere coeficientes de variao menores ou iguais a 10% para impurezas variando entre 0,1 a 1%. No nosso caso, os coeficientes de variao obtidos para o mtodo variaram entre 0,5 a 6,8%, incluindo todas as concentraes analisadas na curva de calibrao e nos ensaios inter e intra-dia, conforme pode ser observado nas Tabelas 22 e 23. Sugere-se que o fator de reteno (k) deve ser maior que 2, segundo o CDER/FDA88, ou seja, que os picos estejam bem resolvidos em relao aos compostos no retidos na coluna. Neste sentido, os picos de todos os ismeros das truxilinas e o padro interno (atropina) analisados pelo mtodo proposto apresentaram valores maiores que 2. De acordo com a referncia 92, recomenda-se que o Tf (fator de alargamento) seja maior ou igual a 2, e, segundo pshtein93 valores fora da faixa de 0,75 e 2,5 devem ser evitados. Valores de Tf menores que 1 significam que o pico apresenta uma assimetria frontal, enquanto valores maiores que 1 implicam que o pico apresenta uma assimetria final (cauda). Na metodologia proposta, apenas o pico da truxilina 4 ficou fora desta faixa. A resoluo (Rs) entre um pico de interesse e o pico mais prximo (por exemplo, interferentes, produtos de degradao, padres internos), para fins quantitativos, deve ser maior do que 1, segundo Lurie87 ou 2, segundo o CDER/FDA88. No mtodo proposto, com exceo das truxilinas 5 e 6, foi possvel obter uma resoluo maior que 2 entre cada uma das truxilinas e o padro interno escolhido. Considerando o critrio mais tolerante, apenas a truxilina 6 no foi resolvida adequadamente.

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Em virtude das consideraes acima, ou seja, da dificuldade em se obter uma boa resoluo e uma boa simetria (fator de alargamento) para os picos da truxilinas 4, 5 e 6, o que gera dificuldades em se conseguir uma integrao reprodutiva no software de anlise de dados, optou-se por integrar estes picos de forma conjunta, considerando-os como uma rea nica. Aps a discusso destes resultados, deve-se retornar proposio de explicaes para as diferenas observadas nas anlises de truxilinas nas amostras pelas duas tcnicas. Em metodologias instrumentais as medies podem ser alteradas porque os reagentes, a matriz da amostra ou outros componentes alteram a sensibilidade do detector que mede o analito de interesse ou porque estes compostos afetam diretamente sua resposta, por meio da saturao do detector, por exemplo. Alm disso, os efeitos de erros constantes (interferncias) e erros proporcionais (efeito de matriz) podem ocorrer simultaneamente. Como as diferenas de exatido foram observadas apenas nas amostras analisadas e no nas anlises das solues padres RTI-DEA, esse fato indica que os erros encontrados apontam para um efeito de matriz nas amostras. importante ressaltar que o padro utilizado neste trabalho (RTI-DEA), no um padro analtico puro e sim um padro de controle que apresenta a composio similar a uma amostra de cocana, porm as amostras apreendidas apresentam composio muito variada, no que diz respeito aos teores de alcaloides e da presena de adulterantes e diluentes. Segundo Kaufmann94, muitas vezes, um espectrmetro de massas para CLAE no responde com a mesma a intensidade se uma concentrao idntica de analito est presente em uma soluo de padro puro ou em uma amostra. Tal comportamento geralmente relacionado eficincia da ionizao, que pode ser afetada por outros compostos presentes na matriz, mas no na soluo padro pura. No caso deste trabalho, isto se relaciona aos interferentes que no esto presentes no padro RTI-DEA utilizado. Dependendo dos analitos monitorados e dos compostos interferentes da matriz, pode ser observada supresso ou ganho de sinal. Tais efeitos tm sido relatados, em diversos graus, para todos os tipos de fontes de ionizao.
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Ainda segundo Kauffmann, acredita-se que a supresso do sinal na fonte electrospray pode ocorrer se ons de um analito no conseguem se desvencilhar das gotas de fase mvel, que esto secando, em virtude de alguns efeitos fsicos e/ou qumicos. Isto pode envolver a presena de alguns compostos da matriz, que podem ocupar predominantemente a superfcie das gotculas, portanto dificultando a sada dos ons do analito. A formao de adutos (por exemplo, sdio, amnio, cloreto), que so frequentemente observados no electrospray, afeta a quantificao por meio da produo de picos de massa adicionais s custas da intensidade dos ons moleculares [M+H]+. A razo de [M+H]+ e [M+Na]+ pode ser afetada pela concentrao de sdio de uma amostra particular, que dificultar a quantificao. Em alguns casos, os ons do analito podem at perder sua carga, como causado pela reao com um ligante presente na matriz que seja capaz de formar complexos. Da forma similar, com o que ocorre com a formao de adutos, pode-se sugerir que a competio na formao de ons mono e duplamente carregados de truxilinas na fonte electrospray pode variar de amostra para amostra dependendo de sua composio qumica. E uma diminuio ou aumento da ionizao do on monocarregado, que foi o on escolhido para quantificao, alteraria os teores de truxilinas obtidos. Se tal fenmeno tambm ocorre nas solues de padro utilizadas, ele poderia ser constante e no ser observado em virtude disso, j que o efeito de matriz do padro seria o mesmo para todos os ensaios feitos com ele (construo da curva de calibrao, controles, etc.). A supresso do sinal ou a sua melhoria pode ser eficientemente reduzida por um bom processo de clean up (procedimentos antes da injeo no CLAE/EM) ou pela separao cromatogrfica do analito dos compostos supressores da matriz. Uma fonte de ionizao alternativa, como APCI pode ser testada se estas abordagens falharem. Em muitos casos, a supresso de sinal ou o seu aumento pode ser reduzida, mas no eliminada. Tais situaes requerem o uso de tcnicas de calibrao adequadas, como a produo de solues de calibrao em matriz branca (livre do analito questionado) em vez de padres em solvente puro. Porm, a utilizao de uma matriz nica livre de truxilinas praticamente impossvel neste caso, pois como mostrado anteriormente, as amostras de cocana
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so matrizes de composio extremamente variada. Assim impossvel definir uma matriz branca universal, que possua todos os efeitos matriz, cada amostra pode ter seu prprio efeito matriz. Para reas em que a composio da matriz relativamente constante, como em toxicologia forense, pode-se determinar a supresso, que pode ser definida como a razo da rea do pico de um determinado analito na matriz e a rea do mesmo pico, na mesma concentrao, em solvente puro. Como mostrado por Ferrer e Thurman95 o analisador de massas tipo TOF o que possui o menor intervalo dinmico, o que no impossibilita sua utilizao em mtodos quantitativos. Kaufmann94 discute uma srie de aspectos de um analisador de massas tipo TOF, e ressalta que funes de calibrao, tanto do TOF quanto de um quadrupolo, podem ser perfeitamente lineares, enquanto algumas outras podem ser melhores se tratadas com uma equao quadrtica. Alm disso, o desvio da linearidade no um problema com os softwares modernos. Entretanto, problemas com a linearidade no afetaram a curva de calibrao das truxilinas, mas podem ser interessantes para tentar enquadrar os dois pontos mais concentrados das curvas de calibrao da maioria dos alcaloides, que ficaram fora da faixa de linearidade. A linearidade das medidas de TOF limitada por causa da maneira como os ons so detectados. A deteco exata do tempo de voo de um on muito desafiadora do ponto de vista da engenharia do equipamento. Os tubos de voo relativamente curtos dos instrumentos disponveis no mercado exigem medies muito precisas e de alta velocidade. A cadeia de gravao a partir do detector para o amplificador e o armazenamento de dados tem de ser extremamente rpida. Mesmo um grupo de ons idnticos chegar ao detector como uma banda minimamente espalhada, causada por alguma variao da energia de transio inicial e por imperfeies durante a acelerao dos ons. Um problema quantitativo e qualitativo pode ser observado se dois ons chegarem dentro de um intervalo de tempo mais curto do que aquele em que o detector pode se "recuperar" a partir do choque do primeiro on. O detector s vai registrar o tempo do primeiro on. Com isso, o segundo on no ser detectado nem o tempo de voo conhecido.
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Consequentemente, o tempo mdio de voo tendencioso, j que apenas os primeiros ons a atingir o detector esto disponveis para o clculo da mdia de tempo de voo e as respectivas massas exatas tambm resultaro em medies erradas. E exatamente este tipo de fenmeno que ocorre na saturao do TOF. Uma outra alternativa para a soluo deste problema seria implementar um mtodo de adio-padro, que consiste na adio de quantidades exatas e conhecida dos analitos em estudo s solues de amostras a fim de preparas os pontos da curva analtica. Este mtodo vai requerer maior quantidade de padro e, normalmente, maior tempo de execuo. Por outro lado, todas as amostras preparadas estaro submetidas s mesmas condies de matriz, minimizando ao mximo interferncias desta natureza na anlise. Alm disso, pode-se testar trabalhar com amostras mais diludas, para evitar a saturao do detector, as desvantagens seriam o maior consumo de solventes ou tempo, em se tratando de diluies sucessivas, e seria necessrio reduzir o limite de deteco das truxilinas. Pode-se observar na curva de calibrao da tropacocana (Figura 49), o que aparentemente um efeito claro de saturao do TOF ou supresso da ionizao na fonte electrospray ou de ambos. At o quinto ponto da curva, a tropacocana apresenta um comportamento linear. Porm a partir do sexto ponto, ela perde completamente este comportamento. O problema que a tropacocana tem um tempo de reteno muito prximo ao da cocana. A partir do momento em que a tropacocana aumenta de concentrao, a cocana tambm aumenta (o padro RTIDEA tem 83,4% de cocana) e estes analitos passam a ter uma coeluio parcial, principalmente em virtude do alargamento do pico da cocana. E a partir deste ponto que o comportamento da tropacocana se torna problemtico. As alternativas so a melhoria da separao cromatgrafica dos analitos ou retirada da cocana em uma etapa pr CLAE/EM. As limitaes produzidas por concentraes fora do intervalo dinmico do TOF poderiam ser resolvidas com a utilizao de funes de calibrao no-lineares. Entretanto, o problema principal est associado com os deslocamentos nas medidas de massa exata que so observadas quando o detector atinge essa saturao.

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Outra diferena fundamental entre as tcnicas proposta e de referncia que na preparao das amostras no mtodo de anlise de truxilinas por CG/DCE a cocana eliminada durante a etapa de reduo. Seus grupos steres so reduzidos a alcois e so extrados pela fase aquosa. Isto minimiza os possveis efeitos de matriz (normalmente a cocana o principal componente das amostras) que poderiam influenciar na separao e deteco dos analitos. No mtodo proposto, como j discutido, no existe etapa prvia de limpeza da amostra, para eliminar a cocana e outros possveis interferentes. A Orientao publicada pelo Inmetro89 apresenta robustez como traduo de robustness, parmetro bastante comum na validao de mtodos analticos, com a seguinte definio: A robustez de um mtodo de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta face a pequenas variaes. Um mtodo diz-se robusto se revelar praticamente insensvel a pequenas variaes que possam ocorrer quando esse est sendo executado. Esta definio a mesma apresentada no guia93 do Center of Drug Evaluation and Research (CDER) Food and Drug Administration (FDA) para robustness. Por isso, como definio de rugged, apresentado por Anastassiades91, ser utilizado o conceito de ruggedness, que mais amplo e engloba a preciso intermediria, a reprodutibilidade e o de robustness de um mtodo. Portanto, infere-se que a robustez de um mtodo analtico o grau de reprodutibilidade dos resultados obtidos pelas anlises das mesmas amostras sob uma variedade de condies, tais como diferentes laboratrios, diferentes analistas, em condies ambientais e operacionais, que podem variar, mas que se mantenham dentro dos parmetros estabelecidos pelo mtodo. Interpretando desta maneira, a ruggedness uma das ltimas etapas para a validao de um mtodo, e, portanto no foi executada neste trabalho em virtude das diferenas obtidas nas anlises de truxilinas totais pelos dois mtodos. No apropriado prosseguir com o processo de validao, antes de se descobrirem as causas deste problema. Finalmente, comparando a segurana dos mtodos proposto e de referncia, mais uma vez as etapas de reduo e derivatizao so determinantes nesta comparao, pois os reagentes utilizados so extremamente txicos. Com especial
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destaque para o aldrin, que um composto organoclorado com ao agrotxica, proibido no pas desde 1985, dado sua alta toxicidade para sade humana e periculosidade para o meio ambiente. Alm disso, o HFBA e o LiAlH4 tambm so txicos para a sade humana, e podem causar severas queimaduras na pele. Alm destes reagentes, no mtodo de referncia so manipulados solventes inflamveis como ter etlico, clorofrmio e isooctano e soluo de cido sulfrico. Cabe ressaltar, ainda, que o LiAlH4 em contato com gua pode ser extremamente perigoso, em razo da possibilidade de exploso. No mtodo proposto, por outro lado, os fatores de risco segurana so significativamente menores, pois existe somente a manipulao de metanol e atropina, como reagentes txicos. Boa parte da discusso acima menciona a utilizao do padro RTI-DEA como nica alternativa para a quantificao de truxilinas, sendo que ele funcionou satisfatoriamente nas anlises de truxilinas por CG/ECD. No mercado, no existem padres analticos disponveis de nenhum dos ismeros das truxilinas. Neste sentido, o trabalho desenvolvido nesta dissertao s foi possvel em virtude de uma doao desse padro de cocana RTI-DEA, que contm teores especificados dos ismeros das truxilinas, pelo Special Testing & Research Laboratory do Drug Enforcement Administration (DEA). Porm, este padro se trata de uma mistura de diversos alcaloides. A falta de um padro analitico das truxilinas, ou de ao menos algum de seus ismeros, impossibilitou uma srie de testes e otimizaes no espectrmetro de massas, como por exemplo testes de supresso de ons das truxilinas com os alcaloides que coeluem parcialmente com as mesmas, como o caso da trans-cinamoilcocana. Seria possvel estabelecer, com isso, o intervalo dinmico mais confivel das truxilinas neste mtodo, sem a presena de interferentes. Uma alternativa vivel a esta limitao seria purificar as truxilinas a partir de amostras de cocana, tentando isol-las para servir de padro, como foi realizado por Lurie et al20,50. Contudo, alm de fugir do escopo proposto neste trabalho, o tempo no seria suficiente para a implementao deste mtodo de purificao. Os limites de deteco obtidos por Moore et al21 na metodologia de CG/ECD foram de 4 a 8 vezes mais baixos que os obtidos durante os ensaios realizados, com a mesma metodologia, no desenvolvimento dessa dissertao. provvel que essa
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distino seja explicada pelas diferenas nos instrumentos utilizados. Por exemplo, durante os exames, foi utilizado um injetor tipo PTV, enquanto no artigo de Moore e colaboradores utilizou-se um injetor tradicional tipo split/splitless. Outras hipteses podem ser levantadas como diferentes modelos do detector ECD. Comparando-se os limites de deteco e quantificao obtidos

experimentalmente, pelo mtodo de CG/DCE, nas condies e equipamento testados, e na nova metodologia proposta por CLAE/EM, o limite de deteco da tcnica de CG/DCE cerca de 12 a 20 vezes menor e o de quantificao cerca de 8 vezes menor do que por CLAE/EM. Como j foi discutido, a determinao de truxilinas por CG/DCE envolve a derivatizao prvia com anidrido heptafluorobutrico (HFBA), os derivados formados apresentam dois grupos heptafluorobutricos (HFB) o que gera uma grande resposta no detector por captura de eltrons, que um detector muito sensvel para compostos halogenados. Alm disso, parte dessa diferena pode ser explicada pela prpria resposta das truxilinas na tcnica de CLAE/EM. Para os demais alcaloides tropnicos de coca, que tm estruturas semelhantes s das truxilinas, foram obtidos limites de deteco bem menores que os das mesmas, entre 2,6 e 8,0 g/L, de 60 a 80 vezes menores, no mesmo equipamento e mtodo. Nos ensaios qualitativos por CLAE/EM j era perceptvel esta diferena nos limites de deteco dos demais alcaloides em relao s truxilinas. provvel que as truxilinas sofram fragmentao e/ou no ionizem to bem na fonte de ionizao electrospray. Elas formam mais espcies do on duplamente carregado (m/z 330,1700) em detrimento do on mono carregado (659,3327), que foi o on utilizado na determinao do LD e LQ, por se tratar do on exclusivamente formado na ionizao das truxilinas. Parte da diferena nas abundncias dos ons mono e duplamente carregados foi minimizada pelo aumento da energia de fragmentao no equipamento, que permitiu um aumento no sinal do on mono carregado em relao ao on duplamente carregado. Infelizmente, pela indisponibilidade de padres puros de truxilinas, o comportamento das truxilinas na fonte electrospray no pode ser completamente elucidado.

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Apesar de os limites de deteco e quantificao obtidos para as truxilinas por CLAE/EM serem mais altos que os obtidos por CG/ECD, eles so suficientes para analisar os teores de truxilinas normalmente encontrados em amostras de cocana. No incio do desenvolvimento desta metodologia objetivou-se estabelecer uma tcnica para deteco e quantificao de truxilinas, porm com os ensaios qualitativos extremamente promissores buscou-se estabelecer condies experimentais e instrumentais que permitissem a deteco simultnea de todos os analitos. Por exemplo, a voltagem de fragmentao do CLAE/EM que gera o maior sinal para do on m/z 659,3327 das truxilinas de cerca de 250 V, porm essa energia muito alta para a maioria dos outros analitos investigados, que se fragmentam acentuadamente, diminuindo radicalmente seus sinais, por isso optouse por uma energia menos alta de 200 V, que tambm apresenta um bom sinal do on m/z 659,3327. Como perspectiva futura, seria interessante testar faixas de voltagem de fragmentao diferentes durante a anlise, objetivando selecionar as melhores voltagens de fragmentao para cada analito, dependendo de seu tempo de reteno. A ressalva estaria na velocidade com que o equipamento estabiliza o sinal a cada nova voltagem selecionada. Talvez o uso de faixas fixas de alguns minutos para grupos de analitos ao invs de estabelecer faixas para cada analito fosse a alternativa mais indicada. importante ressaltar que um grande esforo foi despendido na otimizao das condies cromatogrficas durante o desenvolvimento do mtodo proposto. O objetivo foi resolver da melhor forma possvel os dez ismeros das truxilinas. Grande parte do trabalho experimental desta dissertao foi gasto neste desenvolvimento. Dezenas de condies foram testadas, combinando-se os parmetros descritos no subitem 3.2.2.c, incluindo testes com quatro colunas cromatogrficas diferentes. As colunas que possuem partculas de 3,5 m apresentaram resoluo sensivelmente melhor que as colunas de 5 m. Alm disso, a troca do eluente orgnico acetonitrila/0,1% cido frmico por metanol tambm gerou uma significativa melhora na resoluo. O metanol tem sido uma opo eficaz para substituir a acetonitrila nos ltimos anos, quando ocorreu um

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desabastecimento de acetonitrila no mercado, gerando um aumento em seus preos. S foi possvel identificar os nove ismeros mostrados aps a utilizao das colunas com partculas de 3,5 m e metanol como eluente orgnico. Acredita-se que a dcima truxilina no observada nos cromatogramas esteja coeluindo com algum dos picos dos demais ismeros das truxilinas. Como todos os ismeros possuem o on molecular com a mesma massa exata torna-se impossvel, com o detector de massas utilizado, identificar em que ponto ocorre esta coeluio. Mesmo nos testes de fragmentao das truxilinas por CLAE/EM-EM no foi possvel observar diferenas entre os espectros de massas (EM-EM) das truxilinas. Os espectros de massas dos diferentes picos cromatogrficos do on m/z 659,00 apresentaram os mesmos ons produto, com intensidades similares. Nas medidas de massa molecular exata dos ons [M+H]+, por CLAE/EM, os erros obtidos foram menores que 2,5 ppm. As medidas foram realizadas em uma soluo-padro, com todos os analitos. Os erros aceitveis para confirmao de massa molecular devem ser menores do que 5 ppm77. Analisando os espectros de massas dos ons de m/z 330,1700 ([M+2H]2+) e 659,3327 ([M+H]+), no equipamento de CLAE/TOF-EM, com ionizao electrospray, observou-se que o on de 330,1700, apesar de ter o mesmo m/z do on monocarregado das cinamoilcocanas, tambm formado como on duplamente carregado das truxilinas. Este fato comprovado primeiramente pela presena do on de m/z 330,6716 em sua distribuio isotpica. ons duplamente carregados apresentam distribuio isotpica diferente (Figura 38) dos monocarregados. Alm disso, a sobreposio praticamente perfeita dos cromatogramas reconstrudos dos ons de m/z 330,6716 e 659,3327 das truxilinas. Observou-se que o cromatograma do on de m/z 330,6716 apresenta pequena contribuio do on monocarregado das cinamoilcocanas. No tempo de reteno da cis-cinamoilcocana, aparece um pequeno pico no cromatograma reconstrudo do on 330,6716, no observado no cromatograma do on de m/z 659,3327, e no tempo de reteno da trans-cinamoilcocana, o pico da truxilina 6 proporcionalmente maior no cromatograma do on de m/z 330,6716 que no

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cromatograma do on de m/z 659,3327. Em virtude destes resultados, o on de m/z 659,3327 foi o on escolhido para quantificao das truxilinas. Os experimentos de CLAE/EM-EM tambm confirmaram a formao de um on duplamente carregado das truxilinas, por meio da ionizao electrospray. Nos experimentos de EM/EM de fragmentao de ons precursores, o on de m/z 330,0 foi fragmentado. Nos tempos de reteno das cinamoilcocanas, os espectros de massas de EM/EM obtidos no apresentaram nenhum on produto maior que 330,0. J nos tempos de reteno da truxilinas, os espectros de massas de EM/EM do mesmo on apresentaram o on de m/z 478, que um dos ons produto da fragmentao do on monocarregado das truxilinas (m/z 659,0). Outro fato importante a se destacar que os espectros de massas de fragmentao EM/EM dos ons de m/z 330,0, nos tempos de reteno das cinamoilcocanas e das truxilinas, e do on de m/z 659,0 das truxilinas, apresentam os mesmos ons produto. Isto indica claramente que so compostos com estruturas bastante similares, o que exatamente o caso, j que as truxilinas so formadas pela fotodimerizao das cinamoilcocanas. Moore et al.21 descreveram a deteco de produtos de hidrlise das truxilinas por CLAE/EM-EM em amostras de cocana. Tais produtos tambm foram observados neste estudo por CLAE/EM e CLAE/EM-EM, principalmente os produtos 1 e 3, conforme numerao da Figura 40. Alm das massas exatas obtidas por CLAE/EM serem as esperadas (Tabela 19), a confirmao de que estes ons se referem a estes produtos foi feita pela fragmentao EM-EM destes ons. Seus espectros de massas de fragmentao apresentam os mesmos ons produtos obtidos na fragmentao dos ons das truxilinas, sugerindo estruturas semelhantes. O on com m/z 478,2, alm de ser a massa do produto 3 de hidrlise das truxilinas, tambm um dos ons produtos da fragmentao EM-EM dos ons das truxilinas (Figura 71). Este resultado somado ao fato dos cromatogramas reconstrudos dos ons de m/z 478,2 e 659,3 terem apresentando alguns picos coeluindo, sugere que parte dos ons de m/z 478,2 pode ser resultado da fragmentao dos ons das truxilinas ainda na fonte de ionizao electrospray. Porm, tal fato s poderia ser confirmado com a anlise de um padro de truxilinas puro por CLAE/EM ou CLAE/EM-EM.
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Os teores totais de truxilinas foram estabelecidos pela tcnica de CG/ECD, j que os teores obtidos por CLAE/EM no foram confiveis, conforme discusso anterior. Os resultados obtidos para origem geogrfica foram coerentes, para a maioria das amostras, com os estados com os quais estes pases fazem fronteira e com as informaes de inteligncia/investigao policial fornecidas pela CGPRE/DCOR/DPF (Coordenao-Geral de Polcia de Preveno e Represso a Entorpecentes/Diretoria de Combate ao Crime Organizado). Segundo as anlises de truxilinas totais, nenhuma amostra de origem colombiana foi apreendida em So Paulo e Paran, e somente uma foi apreendida no Centro-Oeste. A maioria das amostras de origem colombiana foi apreendida no estado do Amazonas, estado que faz fronteira com a Colmbia. A maioria das amostras aprendidas no Paran (85%), em So Paulo (79%), Distrito Federal (75%) e Mato Grosso (56%) so de origem boliviana, o que est em conformidade com as informaes investigativas da CGPRE/DCOR/DPF. Todas as amostras apreendidas no estado do Acre so de origem peruana (80%) ou boliviana (20%), o que perfeitamente coerente, uma vez que so pases com os quais o Acre possui fronteira. Cabe ressaltar que, apesar dos resultados promissores, no possvel estabelecer inequivocamente a origem geogrfica de amostras de cocana somente com a anlise de truxilinas. Como discutido anteriormente, necessrio um conjunto de tcnicas instrumentais para esta concluso. Moore et al.21 estabeleceram uma faixa de 0,22 a 12,3% de variao no teor total de truxilinas, nas amostras investigadas por eles, em 1996. Esta faixa muito prxima obtida neste trabalho, que foi de 0,28 a 11,9%. Pode-se evidenciar mais uma caracterstica interessante: quase todas as amostras na forma de sal cloridrato so de origem boliviana (95%) enquanto todas as amostras supostamente oriundas da Colmbia e a grande parte das oriundas do Peru esto na forma de base livre (94%). Isto revela um padro de produo/consumo que se torna uma caracterstica importante dentro dos critrios de identificao de origem geogrfica de apreenso.

126

___________________________________________________________________________________________5. Discusso

Aparentemente as propores entre os teores de cada um dos ismeros das truxilinas nas amostras analisadas visualmente muito similar observada nas anlises de Moore et al.21, sendo os ismeros alfa e beta os mais abundantes. Uma futura anlise destes resultados por quimiometria poder estabelecer correlaes mais efetivas, comparando-se os teores de cada um dos ismeros, tentando agrup-los por semelhanas entre as propores relativas de cada ismero. Como no era objetivo deste trabalho quantificar os outros alcaloides minoritrios, o mtodo proposto com enfoque para estes analitos no foi validado e nem comparado com outra tcnica de referncia. Portanto os dados de quantificao obtidos para estes alcaloides simultaneamente ao das truxilinas, a partir de suas curvas de calibrao, no sero includos nesta dissertao. O objetivo principal foi o desenvolvimento de um mtodo qualitativo, simultneo quantificao das truxilinas. Porm, com as determinaes do intervalo dinmico e do limite de deteco destes alcaloides nas condies do mtodo proposto. No mtodo de quantificao por CLAE/EM obteve-se a faixa de linearidade de aproximadamente duas ordens de magnitude e foi obtido um coeficiente de regresso linear maior que 0,99 para todos os alcaloides, exceto para a ciscinamoilcocana. A quantificao das cinamoilcocanas provavelmente no ser mantida no mtodo, em etapas futuras, pois, por serem alcaloides com concentraes relativamente altas, elas estariam fora do intervalo dinmico de um analisador de massas tipo TOF. No foi possvel planejar a construo das curvas de calibrao, de acordo com os valores tipicamente esperados para cada alcaloide na literatura. Como j discutido para as truxilinas, o padro disponvel para a construo das curvas era o padro RTI-DEA, que possui concentraes variadas de cada um dos analitos. Se for necessrio testar um ponto mais concentrado de um dos analitos todos os outros aumentam de concentrao tambm, principalmente a cocana, que o componente majoritrio deste padro.

127

___________________________________________________________________________________________5. Discusso

5.3. Determinao do teor de cocana nas amostras


Alguns autores31 sugeriram relaes entre o teor de cocana e o tamanho da apreenso de cocana em pases europeus. Barrio30 faz a separao entre cocana de rua (amostras com menos de 5 g e destinadas ao usurio) e grandes lotes ou lotes em condies de trfico (grandes quantidades para trfico internacional e interestadual). Observa-se que, de forma geral, na Europa a pureza da cocana aumenta com o aumento do volume da apreenso. Porm, Almeida25 no conseguiu estabelecer essa relao em amostras brasileiras. Essa relao intuitiva, j que durante a cadeia de distribuio da cocana a tendncia que a amostra tenha tido sua massa aumentada com substncias (adulterantes e diluentes) mais baratas para aumentar a lucratividade dos traficantes. Desta forma como as pequenas apreenses so efetuadas com usurios, a tendncia que este material j esteja bastante diludo ou adulterado (comumente chamado de batizado) com baixo teor de cocana ao contrrio das grandes apreenses. As amostras selecionadas para anlise neste trabalho so oriundas de apreenses acima de 5 kg, isto buscou-se eliminar amostras de baixa pureza, muito diludas ou adulteradas, j que nestes casos os teores de alcaloides tambm esto reduzidos. Amostras no batizadas mantm a composio constante desde a sua produo, facilitando a determinao da sua origem geogrfica. Apesar das poucas publicaes com este tipo de informao, principalmente no Brasil, pode-se comparar com o trabalho de Almeida, em que o teor mdio de cocana obtido foi de 28,8%, bem inferior ao o teor mdio das amostras analisadas nesse trabalho, que foi de 70,5% (teor mdio de 62,4% a 73,3% por estado). A maioria das amostras apresentou teores entre 70 e 80% de cocana. Acredita-se, portanto, que a seleo de amostras maiores que 5 kg para anlise tenha sido efetiva na obteno de amostras menos adulteradas ou diludas. No foi possvel estabelecer nenhuma diferenciao evidente entre os teores de cocana nas amostras apreendidas em diferentes estados ou por regio. Os estados apresentaram faixas similares de teores mdios e mximos. Da mesma forma, no foi possvel constatar nenhuma relao entre forma de apresentao e

128

___________________________________________________________________________________________5. Discusso

teor de cocana. As amostras de cocanas na forma de base apresentaram teor mdio de 69,8% e na forma de sal cloridrato de 71,5%.

5.4. Determinao da presena de adulterantes nas amostras


Em relao presena de adulterantes nas amostras analisadas, pode-se observar que 46% do total de amostras estavam adulteradas, sendo que em So Paulo esta porcentagem ficou em 33% e nas demais regies variou de 56 a 61%. Almeida25 observou, em 2003, em amostras apreendidas no pas, um ndice de adulterao de 54%, pouco superior ao detectado neste trabalho, talvez pelo fato de as amostras selecionadas e analisadas serem de grandes apreenses. O principal adulterante encontrado (35%) em todos os estados foi a fenacetina, como tambm foi observado por Brunt35, na Holanda em 2009. A mesma caracterstica tambm foi ressaltada por Almeida25, 2003, em amostras do estado do Amazonas, em que a fenacetina era o principal frmaco adulterante, presente em 40,7% das amostras deste estado. J nas amostras do Rio Grande do Sul o principal adulterante encontrado foi a lidocana, que neste trabalho no foi detectada nas regies Norte e Centro-Oeste e estava presente em apenas 4% das amostras dos estados do Paran e So Paulo. Esta tendncia de queda na presena de lidocana em amostras de cocana tambm foi observada por Barrio30, na Espanha. Outra caracterstica importante observada nas amostras analisadas foi a presena de levamisol em 11% delas. Em nenhuma publicao anterior sobre amostras apreendidas no pas havia sido descrita a deteco deste frmaco, somente em publicaes sobre apreenses de cocana em outros pases, como foi discutido na Introduo. No foi detectado nenhum frmaco diferente dos comumente descritos em publicaes anteriores, exceto o paracetamol, que foi detectado em apenas uma amostra, que aparentemente se trata de um caso isolado. Trabalhos futuros com maior quantidade de amostras e quantificao dos adulterantes devero ser executados para confirmar estas tendncias de adulterao com frmacos.

129

___________________________________________________________________________________________5. Discusso

5.5. Determinao do grau de oxidao das amostras


Analisando os teores de cis e trans-cinamoilcocana e relacionando os mesmos com o grau de oxidao sofrido pelas amostras, conforme classificao mostrada anteriormente pode-se estabelecer algumas caractersticas importantes. Apenas 15% das amostras passaram por processos muito oxidativos. Porm, quando as amostras so separadas por forma de apresentao, observa-se que as amostras de cloridrato de cocana tendem a ser mais oxidadas que as amostras de cocana na forma de base, que podem no ter passado por nenhum processo oxidativo, como foi discutido nos processos de refino apresentados na Introduo. Ainda em relao ao grau de oxidao, no foi observada nenhuma tendncia regional clara, j que no Acre, Rondnia e Mato Grosso a maioria das amostras era baixamente oxidada, enquanto as amostras do Amazonas, Distrito Federal, Paran e So Paulo sofreram majoritariamente uma oxidao mediana.

5.6. Anlises por CLAE/EM-EM


Como o equipamento de CLAE/EM-EM (Triplo quadrupolo) utilizado neste trabalho foi uma verso demo em nosso laboratrio, a metodologia proposta foi desenvolvida somente no equipamento de CLAE/EM. O mtodo de CLAE/EM-EM testado apresentou bons resultados na deteco de todos os compostos analisados objetos dos estudos. A principal vantagem da tcnica de CLAE/EM-EM reside no fato do tempo de anlise ser de apenas 9 minutos, enquanto que no mtodo de CLAE/EM testado, o tempo de anlise foi de 23 min. Tal fato se deve s diferenas existentes entre os equipamentos de CLAE utilizados, pois o equipamento de CLAE/EM-EM estava acoplado a um UHPLC, que permite o uso de colunas com dimenses menores e com partculas de 1,8 m, que conseguem manter a resoluo dos picos em tempos de anlise significativamente menores. Alm disso, como discutido anteriormente com o equipamento de CLAE/EMEM foi possvel realizar experimentos de fragmentao EM/EM dos ons das truxilinas.

130

__________________________________________________________________________________________ 6. Concluses

6. CONCLUSES
Os resultados das anlises de 160 amostras de cocana apreendidas em 8 estados brasileiros foram apresentados. Determinaram-se o teor de truxilinas, de cocana, e de cis e trans-cinamoilcocana, alm da presena de adulterantes. No mtodo de quantificao de truxilinas por CG/DCE os teores obtidos variaram entre 0,28-11,89% (m/m relativo cocana), faixa muito prxima estabelecida em publicaes anteriores. No mtodo de quantificao de truxilinas por CLAE/EM obteve-se um coeficiente de regresso linear maior que 0,999 e uma excelente separao cromatgrafica, que resolveu nove dos dez ismeros das truxilinas. Os resultados obtidos por experimentos de CLAE/EM-EM foram comparveis aos resultados obtidos por CLAE/EM e demonstrou-se que os experimentos de MRM so uma abordagem analtica promissora para a identificao e quantificao rotineiras de alcaloides de cocana e adulterantes. Foi possvel comprovar a formao do on duplamente carregado na ionizao por electrospray das truxilinas, bem como estabelecer o seu perfil de fragmentao em equipamentos do tipo EM/EM, resultados que ainda no foram publicados na literatura. Em virtude das vantagens (rpido, fcil, econmico, efetivo, robusto e seguro) e potencialidades do mtodo de CLAE/EM proposto, esforos continuaro sendo dedicados para a correo dos erros encontrados, para que enfim seja possvel valid-lo e utiliz-lo como uma metodologia na rotina de anlises para o estabelecimento do perfil qumico de amostras de cocana apreendidas pela Polcia Federal. Os experimentos futuros que devem ser testados para superar os problemas encontrados com a metodologia proposta so: mtodo de adio-padro, insero de uma etapa de pr-tratamento, melhorias na separao cromatogrfica, e novos parmetros na deteco por TOF.

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137

APNDICE 01

RESULTADOS DAS ANLISES QUANTITATIVAS DE TRUXILINAS POR CG-ECD (% m/m relativo cocana)

138

Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 AC1 AC2 AC3 AC4 AC5 AC6 AC7 AC8 AC9 AC10 AC11 AC12 AC13 AC14 AC15 AC16 AM1 AM2 AM3 AM4 AM5 AM6 AM7 AM8 AM9 AM10 AM11 AM12

Estado AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM

Forma Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base HCl HCl Base HCl Base Base Base

Classificao. Origem Peru Peru Bolvia Peru Bolvia Peru Peru Peru Peru Peru Peru Bolvia Peru Peru Peru Peru Colmbia Colmbia Colmbia Colmbia Colmbia Bolvia Bolvia Colmbia Bolvia Colmbia Colmbia Colmbia

Total de truxilinas (%) 4,057 3,093 0,546 3,022 2,737 3,702 3,596 3,676 3,235 3,476 3,506 2,694 3,555 3,325 3,479 4,153 7,887 6,045 11,735 6,516 11,885 0,451 0,428 6,019 0,779 7,648 10,260 7,234

psilon (%) 0,409 0,321 0,033 0,294 0,232 0,370 0,348 0,356 0,318 0,346 0,343 0,211 0,328 0,319 0,322 0,424 0,817 0,649 1,287 3,503 1,413 0,019 0,015 0,598 0,072 0,769 1,082 0,807

delta (%) 0,467 0,355 0,091 0,312 0,253 0,415 0,418 0,427 0,358 0,392 0,382 0,232 0,362 0,379 0,408 0,466 1,057 0,903 1,715 3,845 1,655 0,064 0,064 0,830 0,111 0,789 1,265 0,816

beta (%) 0,973 0,696 0,139 0,687 0,640 0,874 0,902 0,811 0,756 0,828 0,856 0,661 0,856 0,746 0,840 1,002 1,816 1,386 3,068 8,436 3,322 0,134 0,136 1,337 0,228 1,921 2,763 1,793

peri (%) 0,050 0,041 0,014 0,048 0,033 0,047 0,053 0,059 0,053 0,045 0,044 0,034 0,040 0,043 0,041 0,062 0,119 0,077 0,198 0,560 0,209 0,008 0,008 0,078 0,028 0,135 0,155 0,109

neo (%) 0,209 0,158 0,040 0,157 0,147 0,196 0,183 0,203 0,165 0,182 0,181 0,146 0,187 0,168 0,185 0,208 0,379 0,313 0,543 1,819 0,527 0,034 0,033 0,350 0,045 0,358 0,470 0,338

epi (%) 0,038 0,029 0,007 0,030 0,026 0,030 0,029 0,034 0,029 0,029 0,030 0,021 0,029 0,033 0,031 0,044 0,078 0,058 0,138 0,404 0,130 0,005 0,005 0,062 0,013 0,081 0,109 0,068

alfa (%) 1,317 1,023 0,182 1,034 0,977 1,216 1,164 1,214 1,091 1,142 1,166 0,962 1,209 1,133 1,163 1,337 2,370 1,780 3,125 9,633 3,081 0,158 0,144 1,946 0,214 2,360 2,904 2,205

mega (%) 0,306 0,258 0,017 0,245 0,219 0,291 0,259 0,310 0,245 0,266 0,263 0,216 0,281 0,280 0,252 0,318 0,724 0,506 0,877 3,057 0,828 0,011 0,008 0,406 0,032 0,681 0,827 0,607

gama (%) 0,217 0,159 0,016 0,161 0,163 0,200 0,180 0,199 0,167 0,183 0,180 0,162 0,201 0,162 0,176 0,216 0,374 0,254 0,522 1,829 0,494 0,014 0,011 0,309 0,027 0,397 0,475 0,362

zeta (%) 0,073 0,053 0,007 0,055 0,049 0,063 0,060 0,062 0,054 0,062 0,061 0,048 0,063 0,062 0,061 0,076 0,153 0,119 0,263 0,679 0,226 0,004 0,004 0,104 0,009 0,157 0,213 0,128

139

Amostra 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 AM13 AM14 AM15 DF1 DF2 DF3 DF4 DF5 DF6 DF7 DF8 DF9 DF10 DF11 DF12 DF13 DF14 DF15 DF16 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9

Estado AM AM AM DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF MS MS MS MS MS MS MS MS MS

Forma HCl HCl HCl Base Base Base Base Base Base HCl HCl HCl HCl HCl HCl HCl Base Base Base HCl Base Base Base HCl Base Base Base Base

Classificao. Origem Bolvia Bolvia Bolvia Peru Bolvia Bolvia Peru Peru Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Peru Bolvia Bolvia Bolvia Colmbia Peru Peru Bolvia Peru Peru Bolvia Bolvia

Total de truxilinas (%) 0,799 0,626 0,442 3,080 2,520 2,707 4,508 4,639 2,962 0,488 0,453 1,675 1,804 1,438 1,389 0,572 3,068 2,538 2,527 0,728 5,413 3,339 4,619 1,025 4,005 3,897 2,406 2,241

psilon (%) 0,058 0,030 0,013 0,277 0,227 0,229 0,458 0,497 0,261 0,020 0,016 0,116 0,129 0,087 0,083 0,028 0,295 0,207 0,186 0,046 0,007 0,350 0,501 0,082 0,399 0,330 0,209 0,158

delta (%) 0,095 0,076 0,055 0,413 0,333 0,342 0,585 0,638 0,435 0,061 0,058 0,244 0,258 0,210 0,196 0,068 0,383 0,381 0,281 0,100 0,864 0,437 0,579 0,118 0,492 0,597 0,362 0,287

beta (%) 0,260 0,213 0,145 0,763 0,510 0,590 1,242 1,282 0,719 0,152 0,137 0,378 0,407 0,382 0,371 0,205 0,843 0,594 0,535 0,232 1,664 0,902 1,149 0,339 0,935 0,981 0,565 0,476

peri (%) 0,023 0,014 0,006 0,042 0,040 0,032 0,057 0,066 0,038 0,006 0,007 0,030 0,032 0,024 0,024 0,010 0,040 0,032 0,036 0,010 0,120 0,064 0,066 0,025 0,063 0,064 0,035 0,032

neo (%) 0,046 0,040 0,033 0,167 0,113 0,172 0,217 0,205 0,168 0,034 0,033 0,130 0,136 0,108 0,104 0,036 0,139 0,152 0,169 0,044 0,259 0,141 0,218 0,055 0,224 0,225 0,144 0,157

epi (%) 0,013 0,009 0,005 0,033 0,212 0,032 0,042 0,045 0,038 0,006 0,006 0,017 0,019 0,015 0,014 0,008 0,034 0,035 0,026 0,007 0,056 0,032 0,043 0,014 0,031 0,042 0,028 0,021

alfa (%) 0,232 0,198 0,156 1,002 0,763 0,943 1,316 1,336 0,953 0,172 0,165 0,563 0,608 0,472 0,458 0,175 0,938 0,856 0,935 0,222 1,734 0,999 1,439 0,284 1,294 1,215 0,782 0,838

mega (%) 0,031 0,020 0,011 0,178 0,150 0,171 0,296 0,286 0,154 0,015 0,012 0,079 0,085 0,055 0,056 0,019 0,207 0,115 0,161 0,031 0,357 0,211 0,328 0,054 0,293 0,195 0,121 0,113

gama (%) 0,031 0,020 0,014 0,146 0,105 0,147 0,189 0,196 0,138 0,016 0,014 0,084 0,095 0,061 0,060 0,018 0,132 0,118 0,153 0,025 0,242 0,139 0,214 0,038 0,210 0,172 0,114 0,123

zeta (%) 0,009 0,006 0,004 0,059 0,067 0,049 0,105 0,089 0,059 0,005 0,005 0,033 0,035 0,023 0,023 0,006 0,058 0,049 0,046 0,011 0,111 0,064 0,084 0,016 0,065 0,076 0,045 0,036

140

Amostra 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 MS10 MS11 MS12 MS13 MS14 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 MT11 MT12 MT13 MT14 MT15 MT16 PRF1 PRF2 PRF3 PRF4 PRF5 PRF6 PRF7

Estado MS MS MS MS MS MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT PR PR PR PR PR PR PR

Forma Base Base HCl Base Base HCl Base Base Base Base Base Base Base Base HCl HCl Base Base Base Base Base HCl HCl HCl HCl HCl HCl HCl

Classificao. Origem Bolvia Bolvia Peru Bolvia Peru Bolvia Bolvia Peru Bolvia Peru Bolvia Bolvia Peru Peru Bolvia Bolvia Bolvia Peru Peru Peru Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia

Total de truxilinas (%) 2,824 2,280 3,404 2,669 3,732 2,528 2,699 3,048 2,807 3,709 2,260 1,637 3,343 4,524 0,775 0,617 2,511 3,840 3,919 3,991 1,798 0,715 0,906 0,974 0,617 0,502 2,832 0,943

psilon (%) 0,219 0,166 0,357 0,226 0,351 0,184 0,187 0,240 0,213 0,358 0,154 0,218 0,376 0,439 0,036 0,027 0,170 0,397 0,403 0,395 0,137 0,035 0,052 0,047 0,026 0,014 0,265 0,091

delta (%) 0,502 0,299 0,436 0,421 0,402 0,408 0,364 0,469 0,449 0,389 0,376 0,251 0,430 0,438 0,068 0,064 0,385 0,516 0,519 0,550 0,317 0,088 0,102 0,095 0,076 0,051 0,307 0,123

beta (%) 0,608 0,496 0,793 0,643 0,892 0,615 0,570 0,740 0,685 0,914 0,496 0,315 0,893 1,039 0,330 0,247 0,568 1,070 1,098 1,152 0,403 0,245 0,332 0,442 0,211 0,171 0,740 0,196

peri (%) 0,043 0,031 0,054 0,031 0,045 0,034 0,030 0,038 0,040 0,047 0,029 0,028 0,037 0,054 0,015 0,011 0,025 0,062 0,067 0,063 0,005 0,006 0,016 0,019 0,013 0,005 0,044 0,020

neo (%) 0,177 0,156 0,154 0,156 0,194 0,186 0,214 0,207 0,191 0,191 0,179 0,097 0,186 0,223 0,039 0,034 0,198 0,165 0,169 0,179 0,113 0,048 0,051 0,046 0,040 0,029 0,146 0,057

epi (%) 0,033 0,022 0,054 0,047 0,033 0,027 0,026 0,032 0,033 0,027 0,025 0,053 0,099 0,042 0,009 0,006 0,025 0,040 0,044 0,042 0,039 0,012 0,009 0,012 0,007 0,004 0,029 0,012

alfa (%) 0,953 0,833 1,108 0,865 1,257 0,795 0,978 0,989 0,894 1,229 0,771 0,455 0,957 1,569 0,212 0,182 0,862 1,142 1,160 1,151 0,612 0,222 0,258 0,241 0,201 0,191 0,896 0,326

mega (%) 0,121 0,117 0,238 0,116 0,292 0,108 0,129 0,125 0,119 0,292 0,087 0,125 0,168 0,388 0,033 0,020 0,109 0,218 0,224 0,221 0,065 0,027 0,042 0,035 0,020 0,019 0,214 0,060

gama (%) 0,113 0,122 0,147 0,115 0,198 0,118 0,148 0,145 0,129 0,196 0,105 0,060 0,125 0,256 0,026 0,019 0,122 0,156 0,161 0,158 0,074 0,026 0,031 0,028 0,017 0,015 0,138 0,044

zeta (%) 0,055 0,038 0,063 0,049 0,068 0,053 0,053 0,062 0,055 0,067 0,038 0,036 0,071 0,078 0,008 0,006 0,048 0,073 0,075 0,079 0,033 0,007 0,012 0,011 0,007 0,005 0,054 0,015

141

Amostra 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 PRF8 PRF9 PRF10 PRF11 PRF12 PRF13 PRF14 PRF15 PRF16 PRF17 PRF18 PRF19 PRF20 PRF21 PRF22 PRF23 PR1 PR2 PR3 PR4 PR5 PR6 PR7 PR8 PR9 PR10 PR11 PR12

Estado PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR

Forma HCl HCl HCl HCl Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base HCl HCl Base HCl Base HCl Base HCl HCl Base HCl HCl Base

Classificao. Origem Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Peru Peru Peru Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Peru Bolvia Bolvia Bolvia Peru

Total de truxilinas (%) 0,475 0,610 0,476 0,463 2,541 1,871 1,926 3,130 2,674 2,956 2,874 3,289 2,905 2,846 3,136 0,734 0,290 2,578 2,324 1,469 0,280 2,099 0,697 0,634 2,954 0,638 0,618 2,757

psilon (%) 0,013 0,043 0,014 0,004 0,033 0,172 0,186 0,265 0,211 0,209 0,231 0,257 0,245 0,224 0,262 0,026 0,009 0,189 0,172 0,064 0,010 0,147 0,031 0,025 0,260 0,028 0,023 0,182

delta (%) 0,047 0,090 0,056 0,055 0,349 0,313 0,318 0,380 0,354 0,467 0,412 0,516 0,327 0,333 0,421 0,108 0,044 0,388 0,375 0,216 0,044 0,353 0,102 0,107 0,398 0,108 0,107 0,437

beta (%) 0,163 0,160 0,154 0,157 0,747 0,419 0,436 0,690 0,598 0,678 0,666 0,722 0,581 0,573 0,725 0,155 0,070 0,621 0,555 0,487 0,073 0,509 0,258 0,195 0,583 0,199 0,196 0,676

peri (%) 0,005 0,016 0,007 0,001 0,017 0,020 0,021 0,039 0,039 0,045 0,041 0,047 0,042 0,040 0,049 0,005 0,001 0,036 0,032 0,029 0,001 0,033 0,012 0,014 0,048 0,012 0,012 0,039

neo (%) 0,029 0,040 0,032 0,033 0,191 0,106 0,114 0,205 0,179 0,204 0,185 0,220 0,187 0,188 0,202 0,059 0,025 0,188 0,163 0,111 0,024 0,152 0,048 0,054 0,178 0,053 0,055 0,198

epi (%) 0,003 0,009 0,005 0,003 0,017 0,021 0,020 0,033 0,027 0,026 0,030 0,028 0,031 0,029 0,031 0,005 0,001 0,030 0,024 0,017 0,002 0,026 0,008 0,006 0,027 0,007 0,006 0,037

alfa (%) 0,178 0,200 0,175 0,186 1,055 0,629 0,619 1,084 0,931 1,028 0,964 1,150 1,064 1,054 1,042 0,310 0,128 0,835 0,751 0,455 0,115 0,649 0,198 0,195 1,073 0,193 0,190 0,880

mega (%) 0,017 0,024 0,014 0,010 0,050 0,093 0,100 0,204 0,145 0,124 0,164 0,135 0,202 0,188 0,189 0,030 0,004 0,108 0,103 0,032 0,001 0,095 0,014 0,011 0,184 0,011 0,008 0,124

gama (%) 0,016 0,019 0,015 0,010 0,066 0,070 0,079 0,171 0,140 0,129 0,134 0,156 0,174 0,168 0,158 0,030 0,007 0,129 0,106 0,044 0,007 0,092 0,019 0,020 0,157 0,019 0,017 0,125

zeta (%) 0,005 0,008 0,005 0,003 0,017 0,030 0,033 0,059 0,048 0,047 0,047 0,057 0,053 0,049 0,057 0,007 0,001 0,054 0,044 0,015 0,002 0,043 0,007 0,006 0,046 0,007 0,006 0,057

142

Amostra 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 PR13 PR14 PR15 PR16 RO1 RO2 RO3 RO4 RO5 RO6 RO7 RO8 RO9 RO10 RO11 RO12 RO13 RO14 RO15 RO16 RO17 RO18 RO19 RO20 SP1 SP2 SP3 SP4

Estado PR PR PR PR RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO SP SP SP SP

Forma Base HCl HCl Base Base Base HCl Base Base HCl Base Base Base Base Base Base Base Base Base HCl Base Base Base Base HCl HCl Base Base

Classificao. Origem Bolvia Bolvia Peru Bolvia Peru Bolvia Bolvia Peru Peru Bolvia Bolvia Peru Peru Peru Peru Colmbia Peru Colmbia Bolvia Bolvia Peru Peru Peru Peru Bolvia Bolvia Peru Peru

Total de truxilinas (%) 4,527 3,713 3,097 1,939 3,447 2,247 0,587 4,500 3,886 2,415 2,930 3,638 3,643 3,886 4,287 5,094 3,273 6,003 2,838 2,678 4,529 3,982 3,104 4,308 0,514 0,917 3,472 3,898

psilon (%) 0,335 0,371 0,311 0,131 0,384 0,221 0,013 0,401 0,296 0,158 0,264 0,346 0,347 0,311 0,343 0,428 0,277 0,524 0,261 0,198 0,464 0,415 0,295 0,417 0,016 0,060 0,291 0,358

delta (%) 0,634 0,512 0,413 0,305 0,526 0,316 0,070 0,702 0,367 0,342 0,511 0,492 0,496 0,479 0,510 0,653 0,438 0,709 0,282 0,330 0,586 0,539 0,333 0,418 0,068 0,106 0,444 0,499

beta (%) 0,935 1,135 0,955 0,432 0,915 0,562 0,229 1,060 0,674 0,543 0,669 0,902 0,876 0,883 0,990 1,108 0,661 1,352 0,643 0,722 1,204 1,108 0,714 0,978 0,181 0,252 0,750 0,969

peri (%) 0,069 0,069 0,060 0,024 0,045 0,035 0,007 0,070 0,042 0,031 0,049 0,059 0,048 0,059 0,069 0,073 0,051 0,090 0,045 0,041 0,078 0,060 0,040 0,053 0,006 0,014 0,046 0,062

neo (%) 0,340 0,160 0,128 0,149 0,136 0,114 0,039 0,274 0,176 0,180 0,161 0,186 0,189 0,240 0,266 0,306 0,203 0,346 0,153 0,168 0,197 0,179 0,164 0,218 0,038 0,066 0,220 0,190

epi (%) 0,049 0,042 0,038 0,018 0,069 0,024 0,005 0,004 0,033 0,022 0,061 0,051 0,049 0,059 0,041 0,044 0,030 0,054 0,021 0,025 0,220 0,044 0,032 0,035 0,005 0,011 0,037 0,132

alfa (%) 1,592 1,007 0,852 0,667 0,957 0,681 0,189 1,498 1,047 0,876 0,927 1,100 1,119 1,378 1,537 1,843 1,211 2,135 0,977 0,889 1,251 1,147 1,048 1,497 0,171 0,299 1,224 1,161

mega (%) 0,238 0,207 0,166 0,083 0,189 0,153 0,013 0,211 0,247 0,127 0,120 0,242 0,249 0,209 0,232 0,305 0,195 0,380 0,234 0,163 0,262 0,242 0,248 0,373 0,010 0,048 0,215 0,246

gama (%) 0,250 0,137 0,114 0,094 0,132 0,097 0,017 0,212 0,164 0,105 0,117 0,141 0,144 0,207 0,233 0,256 0,156 0,314 0,171 0,107 0,186 0,169 0,173 0,247 0,016 0,047 0,187 0,172

zeta (%) 0,086 0,073 0,060 0,036 0,093 0,044 0,004 0,070 0,053 0,031 0,052 0,118 0,127 0,060 0,066 0,078 0,051 0,100 0,051 0,036 0,082 0,080 0,057 0,071 0,004 0,015 0,060 0,107

143

Amostra 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 SP5 SP6 SP7 SP8 SP9 SP10 SP11 SP12 SP13 SP14 SP15 SP16 SP17 SP18 SP19 SP20 SP21 SP22 SP23 SP24

Estado SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP

Forma Base HCl Base HCl HCl HCl HCl HCl HCl Base HCl HCl Base HCl Base Base Base HCl HCl HCl

Classificao. Origem Bolvia Bolvia Peru Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Peru Bolvia Bolvia Peru Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia Bolvia

Total de truxilinas (%) 2,990 0,460 3,655 0,489 2,090 2,220 0,422 0,813 1,998 3,157 0,744 1,136 3,285 0,879 2,322 2,642 0,792 0,542 0,563 0,478

psilon (%) 0,234 0,021 0,348 0,013 0,156 0,168 0,012 0,036 0,159 0,294 0,050 0,087 0,295 0,050 0,163 0,218 0,045 0,024 0,021 0,021

delta (%) 0,365 0,062 0,410 0,062 0,301 0,325 0,062 0,114 0,301 0,487 0,115 0,145 0,458 0,118 0,390 0,413 0,111 0,073 0,071 0,074

beta (%) 0,565 0,131 0,870 0,118 0,467 0,526 0,111 0,266 0,457 0,767 0,210 0,315 0,757 0,275 0,563 0,623 0,257 0,159 0,178 0,151

peri (%) 0,045 0,007 0,042 0,010 0,031 0,043 0,004 0,014 0,026 0,040 0,016 0,022 0,047 0,014 0,036 0,040 0,014 0,008 0,008 0,009

neo (%) 0,214 0,034 0,190 0,038 0,137 0,161 0,034 0,063 0,135 0,173 0,055 0,075 0,202 0,058 0,168 0,162 0,057 0,041 0,042 0,037

epi (%) 0,031 0,005 0,030 0,005 0,020 0,025 0,004 0,009 0,022 0,047 0,011 0,014 0,049 0,010 0,029 0,032 0,010 0,006 0,006 0,006

alfa (%) 1,117 0,163 1,230 0,200 0,740 0,713 0,167 0,249 0,667 0,986 0,229 0,351 1,038 0,275 0,718 0,855 0,236 0,186 0,195 0,153

mega (%) 0,181 0,015 0,280 0,018 0,099 0,104 0,013 0,023 0,091 0,155 0,023 0,057 0,191 0,041 0,105 0,122 0,022 0,018 0,016 0,010

gama (%) 0,185 0,018 0,195 0,020 0,102 0,108 0,012 0,029 0,100 0,144 0,026 0,053 0,179 0,029 0,102 0,126 0,029 0,019 0,022 0,014

zeta (%) 0,054 0,005 0,060 0,005 0,035 0,046 0,002 0,010 0,039 0,064 0,009 0,017 0,068 0,009 0,047 0,052 0,010 0,006 0,005 0,003

144

APNDICE 02

RESULTADOS DAS ANLISES QUANTITATIVAS DE TRUXILINAS POR CLAE/EM (% m/m relativo cocana)

145

Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 AC1 AC2 AC3 AC4 AC5 AC6 AC7 AC8 AC9 AC10 AC11 AC12 AC13 AC14 AC15 AC16 AM1 AM2 AM3 AM4

Estado AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AM AM AM AM

Forma Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base

Total de truxilinas (%) 16,204 13,000 3,138 1,196 8,955 9,091 7,636 1,046 7,398 11,899 8,484 8,337 8,744 1,349 9,335 10,610 1,213 2,674 5,909 2,557 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Amostra AM5 AM6 AM7 AM8 AM9 AM10 AM11 AM12 AM13 AM14 AM15 DF1 DF2 DF3 DF4 DF5 DF6 DF7 DF8 DF9

Estado AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM DF DF DF DF DF DF DF DF DF

Forma Base HCl HCl Base HCl Base Base Base HCl HCl HCl Base Base Base Base Base Base HCl HCl HCl

Total de truxilinas (%) 36,074 1,112 1,268 3,549 0,766 23,940 10,003 10,688 1,869 0,898 1,722 11,260 3,749 5,008 14,773 17,936 17,706 1,079 1,048 3,652

146

Amostra 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 DF10 DF11 DF12 DF13 DF14 DF15 DF16 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 MS10 MS11 MS12 MS13

Estado DF DF DF DF DF DF DF MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS

Forma HCl HCl HCl HCl Base Base Base HCl Base Base Base HCl Base Base Base Base Base Base HCl Base

Total de truxilinas (%) 4,032 5,938 5,548 1,537 4,301 20,329 12,008 0,609 1,763 2,644 9,920 1,315 1,019 3,592 12,444 7,887 3,692 7,220 1,383 13,341 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

Amostra MS14 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 MT11 MT12 MT13 MT14 MT15 MT16 PRF1 PRF2 PRF3

Estado MS MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT PR PR PR

Forma Base HCl Base Base Base Base Base Base Base Base HCl HCl Base Base Base Base Base HCl HCl HCl

Total de truxilinas (%) 3,923 5,885 10,190 16,393 12,412 13,375 9,415 3,192 13,007 18,206 2,191 1,877 1,278 16,342 17,343 16,212 8,534 1,037 1,151 2,032

147

Amostra 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 PRF4 PRF5 PRF6 PRF7 PRF8 PRF9 PRF10 PRF11 PRF12 PRF13 PRF14 PRF15 PRF16 PRF17 PRF18 PRF19 PRF20 PRF21 PRF22 PRF23

Estado PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR

Forma HCl HCl HCl HCl HCl HCl HCl HCl Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base HCl

Total de truxilinas (%) 1,512 0,941 4,470 2,248 1,617 1,313 0,853 0,683 2,684 6,135 5,970 11,769 9,051 16,220 1,097 13,796 10,087 8,437 10,928 1,340 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120

Amostra PR1 PR2 PR3 PR4 PR5 PR6 PR7 PR8 PR9 PR10 PR11 PR12 PR13 PR14 PR15 PR16 RO1 RO2 RO3 RO4

Estado PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR RO RO RO RO

Forma HCl Base HCl Base HCl Base HCl HCl Base HCl HCl Base Base HCl HCl Base Base Base HCl Base

Total de truxilinas (%) 0,540 16,681 9,470 4,934 2,094 13,471 2,562 2,814 5,505 2,559 2,601 15,595 13,419 10,610 5,327 18,639 11,997 8,789 1,350 19,058

148

Amostra 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 RO5 RO6 RO7 RO8 RO9 RO10 RO11 RO12 RO13 RO14 RO15 RO16 RO17 RO18 RO19 RO20 SP1 SP2 SP3 SP4

Estado RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO SP SP SP SP

Forma Base HCl Base Base Base Base Base Base Base Base Base HCl Base Base Base Base HCl HCl Base Base

Total de truxilinas (%) 26,974 1,819 12,704 12,817 13,613 19,042 13,970 7,253 13,958 33,995 6,647 3,230 2,006 10,476 1,065 6,800 0,973 4,364 7,230 12,186 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160

Amostra SP5 SP6 SP7 SP8 SP9 SP10 SP11 SP12 SP13 SP14 SP15 SP16 SP17 SP18 SP19 SP20 SP21 SP22 SP23 SP24

Estado SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP

Forma Base HCl Base HCl HCl HCl HCl HCl HCl Base HCl HCl Base HCl Base Base Base HCl HCl HCl

Total de truxilinas (%) 7,891 0,788 4,344 1,518 7,477 13,143 0,821 2,896 3,206 15,829 2,259 3,863 14,152 2,124 1,803 16,208 3,739 1,666 2,117 1,006

149

APNDICE 03

RESULTADOS DA DETERMINAO DOS TEORES DE COCANA, CIS E TRANS-CINAMOILCOCANA POR CG/DIC; E PRESENA DE ADULTERANTES POR CG/DIC E CLAE/EM (% de cis e trans-cinamoilcocana expressos em m/m relativo cocana)

150

Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 AC1 AC2 AC3 AC4 AC5 AC6 AC7 AC8 AC9 AC10 AC11 AC12 AC13 AC14 AC15 AC16 AM1 AM2 AM3 AM4 AM5 AM6 AM7 AM8 AM9 AM10 AM11 AM12

Estado AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM

Forma Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base HCl HCl Base HCl Base Base Base

Teor de Cocana (%) 82,640 77,992 76,759 73,193 76,286 75,991 71,756 60,937 66,563 79,569 73,477 85,005 73,215 73,626 55,624 70,993 41,143 42,861 52,124 19,298 70,206 78,409 75,067 70,921 77,624 40,807 56,860 71,828

Cis-cinamoil cocana (%) 7,652 7,308 2,034 1,164 5,099 6,903 3,792 0,581 4,439 5,413 5,360 4,803 4,899 1,608 7,384 4,930 0,612 1,650 1,333 0,000 6,652 1,052 1,096 1,369 0,947 5,798 0,118 3,141

Trans-cinamoil cocana (%) 5,546 5,422 1,352 0,613 2,914 4,593 3,010 0,272 3,183 3,441 3,739 2,475 2,975 0,621 4,906 3,330 0,207 0,747 1,065 0,000 5,256 0,957 0,964 0,594 0,710 6,107 0,348 1,935

Total de Grau de cinamoilcocana Oxidao (%) 13,20 12,73 3,39 1,78 8,01 11,50 6,80 0,85 7,62 8,85 9,10 7,28 7,87 2,23 12,29 8,26 0,82 2,40 2,40 0,00 11,91 2,01 2,06 1,96 1,66 11,90 0,47 5,08 Baixo Baixo Mdio Alto Baixo Baixo Baixo Alto Baixo Baixo Baixo Baixo Baixo Mdio Baixo Baixo Alto Mdio Mdio Alto Baixo Mdio Mdio Alto Alto Baixo Alto Mdio

BEN -

FEN SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM

CAF SIM SIM SIM SIM -

LEV -

LID -

PRO -

HID -

DIL -

PAR -

151

Amostra 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 AM13 AM14 AM15 DF1 DF2 DF3 DF4 DF5 DF6 DF7 DF8 DF9 DF10 DF11 DF12 DF13 DF14 DF15 DF16 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9

Estado AM AM AM DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF DF MS MS MS MS MS MS MS MS MS

Forma HCl HCl HCl Base Base Base Base Base Base HCl HCl HCl HCl HCl HCl HCl Base Base Base HCl Base Base Base HCl Base Base Base Base

Teor de Cocana (%) 79,622 79,401 79,390 76,515 59,990 71,988 71,341 77,631 76,634 81,371 83,055 72,259 75,104 61,838 66,227 79,916 72,626 71,185 74,029 71,999 46,757 78,189 74,793 76,419 55,700 59,434 82,585 77,928

Cis-cinamoil cocana (%) 1,377 1,178 1,218 0,000 2,547 3,030 6,627 7,073 5,312 1,485 1,489 0,100 0,122 1,255 1,357 0,990 0,096 6,636 3,426 0,658 1,818 1,636 3,788 1,548 0,610 1,923 6,452 3,798

Trans-cinamoil cocana (%) 1,160 1,033 1,470 0,271 1,889 1,677 4,881 4,501 3,625 1,371 1,326 0,185 0,252 1,753 1,738 0,987 0,205 6,749 3,139 0,853 2,201 0,785 2,988 0,971 0,293 0,791 3,870 1,939

Total de Grau de cinamoilcocana Oxidao (%) 2,54 2,21 2,69 0,27 4,44 4,71 11,51 11,57 8,94 2,86 2,82 0,29 0,37 3,01 3,10 1,98 0,30 13,38 6,56 1,51 4,02 2,42 6,78 2,52 0,90 2,71 10,32 5,74 Mdio Mdio Mdio Alto Mdio Mdio Baixo Baixo Baixo Mdio Mdio Alto Alto Mdio Mdio Alto Alto Baixo Baixo Alto Mdio Mdio Baixo Mdio Alto Mdio Baixo Mdio

BEN -

FEN SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM

CAF SIM SIM SIM -

LEV SIM SIM SIM SIM SIM SIM -

LID -

PRO -

HID SIM -

DIL -

PAR -

152

Amostra 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 MS10 MS11 MS12 MS13 MS14 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 MT11 MT12 MT13 MT14 MT15 MT16 PRF1 PRF2 PRF3 PRF4 PRF5 PRF6 PRF7

Estado MS MS MS MS MS MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT PR PR PR PR PR PR PR

Forma Base Base HCl Base Base HCl Base Base Base Base Base Base Base Base HCl HCl Base Base Base Base Base HCl HCl HCl HCl HCl HCl HCl

Teor de Cocana (%) 39,660 73,589 42,859 73,895 69,186 73,486 75,804 70,957 76,625 78,125 44,730 78,619 69,465 81,734 77,904 78,632 52,449 64,198 72,867 70,910 66,294 82,045 76,245 83,470 85,725 85,032 68,669 86,396

Cis-cinamoil cocana (%) 3,376 3,833 2,438 6,118 1,919 0,000 4,026 5,275 4,855 4,884 4,892 1,495 7,166 6,439 1,578 1,580 3,979 6,212 6,467 6,446 4,426 1,084 1,146 1,138 1,633 1,195 0,149 1,663

Trans-cinamoil cocana (%) 2,945 2,061 3,766 5,279 1,366 2,146 3,584 3,867 3,256 3,864 4,650 1,099 6,433 5,096 1,893 2,252 4,143 4,718 4,939 4,896 3,133 1,379 1,415 1,326 1,453 1,356 0,948 0,918

Total de Grau de cinamoilcocana Oxidao (%) 6,32 5,89 6,20 11,40 3,29 2,15 7,61 9,14 8,11 8,75 9,54 2,59 13,60 11,53 3,47 3,83 8,12 10,93 11,41 11,34 7,56 2,46 2,56 2,46 3,09 2,55 1,10 2,58 Baixo Mdio Baixo Baixo Mdio Mdio Baixo Baixo Baixo Baixo Baixo Mdio Baixo Baixo Mdio Mdio Baixo Baixo Baixo Baixo Baixo Mdio Mdio Mdio Mdio Mdio Alto Mdio

BEN -

FEN SIM SIM SIM SIM -

CAF SIM -

LEV SIM SIM -

LID -

PRO -

HID -

DIL -

PAR -

153

Amostra 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 PRF8 PRF9 PRF10 PRF11 PRF12 PRF13 PRF14 PRF15 PRF16 PRF17 PRF18 PRF19 PRF20 PRF21 PRF22 PRF23 PR1 PR2 PR3 PR4 PR5 PR6 PR7 PR8 PR9 PR10 PR11 PR12

Estado PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR PR

Forma HCl HCl HCl HCl Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base Base HCl HCl Base HCl Base HCl Base HCl HCl Base HCl HCl Base

Teor de Cocana (%) 86,690 87,488 87,021 67,578 12,043 76,682 75,756 82,377 85,242 42,625 46,382 50,536 81,641 78,119 78,323 57,505 76,792 77,632 66,176 34,310 86,643 76,853 85,195 80,932 73,181 84,263 84,313 51,000

Cis-cinamoil cocana (%) 1,463 0,809 1,284 0,975 0,000 5,327 5,437 4,475 2,340 1,225 1,434 3,938 5,179 3,970 4,460 1,661 0,718 6,296 0,302 1,274 4,932 1,520 1,380 1,405 3,592 1,468 1,403 7,104

Trans-cinamoil cocana (%) 0,929 0,616 1,276 1,253 0,000 4,879 4,759 2,837 2,434 2,102 2,242 3,140 3,312 2,540 3,097 0,930 0,952 4,569 3,285 1,038 2,500 1,425 1,507 1,362 2,842 1,572 1,430 5,233

Total de Grau de cinamoilcocana Oxidao (%) 2,39 1,43 2,56 2,23 0,00 10,21 10,20 7,31 4,77 3,33 3,68 7,08 8,49 6,51 7,56 2,59 1,67 10,87 3,59 2,31 7,43 2,94 2,89 2,77 6,43 3,04 2,83 12,34 Mdio Alto Mdio Mdio Alto Baixo Baixo Baixo Mdio Mdio Mdio Baixo Baixo Baixo Baixo Mdio Alto Baixo Mdio Mdio Baixo Mdio Mdio Mdio Baixo Mdio Mdio Baixo

BEN SIM -

FEN SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM

CAF SIM -

LEV SIM SIM SIM -

LID SIM -

PRO -

HID -

DIL -

PAR SIM -

154

Amostra 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 PR13 PR14 PR15 PR16 RO1 RO2 RO3 RO4 RO5 RO6 RO7 RO8 RO9 RO10 RO11 RO12 RO13 RO14 RO15 RO16 RO17 RO18 RO19 RO20 SP1 SP2 SP3 SP4

Estado PR PR PR PR RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO SP SP SP SP

Forma Base HCl HCl Base Base Base HCl Base Base HCl Base Base Base Base Base Base Base Base Base HCl Base Base Base Base HCl HCl Base Base

Teor de Cocana (%) 40,840 84,115 84,306 55,137 75,061 88,659 81,615 75,977 73,327 22,820 67,709 64,426 63,102 69,498 67,709 67,569 76,878 71,274 82,394 19,676 65,550 88,387 79,280 76,976 76,996 85,055 56,791 66,144

Cis-cinamoil cocana (%) 5,813 0,000 0,280 7,353 4,600 5,236 1,353 5,267 1,714 1,258 5,442 6,693 6,986 7,874 5,442 3,482 5,241 8,933 3,896 1,311 1,431 4,676 1,942 2,727 1,036 0,482 5,240 4,557

Trans-cinamoil cocana (%) 5,218 0,350 0,553 5,503 3,327 3,177 1,505 2,682 0,702 2,226 3,045 5,006 5,329 6,215 3,045 2,683 5,785 8,218 1,901 1,138 0,805 2,280 0,816 1,549 1,621 0,596 4,309 2,986

Total de Grau de cinamoilcocana Oxidao (%) 11,03 0,35 0,83 12,86 7,93 8,41 2,86 7,95 2,42 3,48 8,49 11,70 12,31 14,09 8,49 6,17 11,03 17,15 5,80 2,45 2,24 6,96 2,76 4,28 2,66 1,08 9,55 7,54 Baixo Alto Alto Baixo Baixo Baixo Mdio Baixo Mdio Mdio Baixo Baixo Baixo Baixo Baixo Baixo Baixo Baixo Mdio Mdio Mdio Baixo Mdio Mdio Mdio Alto Baixo Baixo

BEN SIM -

FEN SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM

CAF SIM SIM SIM

LEV SIM -

LID SIM -

PRO -

HID -

DIL SIM -

PAR -

155

Amostra 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 SP5 SP6 SP7 SP8 SP9 SP10 SP11 SP12 SP13 SP14 SP15 SP16 SP17 SP18 SP19 SP20 SP21 SP22 SP23 SP24

Estado SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP SP

Forma Base HCl Base HCl HCl HCl HCl HCl HCl Base HCl HCl Base HCl Base Base Base HCl HCl HCl

Teor de Cocana (%) 74,745 84,266 59,997 79,326 73,501 69,146 81,677 79,589 76,772 71,717 73,918 77,204 56,952 58,249 69,479 69,718 71,886 77,895 77,068 86,815

Cis-cinamoil cocana (%) 4,743 1,153 4,625 2,250 0,502 0,000 0,900 1,617 0,617 5,940 1,069 1,495 5,612 1,068 0,763 5,485 1,504 1,220 1,296 0,915

Trans-cinamoil cocana (%) 2,880 1,398 4,217 0,969 0,433 2,349 0,812 1,612 1,643 4,625 1,031 1,504 3,210 1,133 0,750 3,328 1,416 0,992 1,129 1,161

Total de Grau de cinamoilcocana Oxidao (%) 7,62 2,55 8,84 3,22 0,93 2,35 1,71 3,23 2,26 10,57 2,10 3,00 8,82 2,20 1,51 8,81 2,92 2,21 2,43 2,08 Baixo Mdio Baixo Mdio Alto Mdio Alto Mdio Mdio Baixo Mdio Mdio Baixo Mdio Alto Baixo Mdio Mdio Mdio Mdio

BEN -

FEN SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM -

CAF -

LEV SIM SIM SIM SIM SIM SIM -

LID SIM SIM SIM SIM

PRO -

HID SIM

DIL -

PAR -

Nota: BEN (Benzocana), FEN (Fenacetina), CAF (Cafena), LEV (Levamisol), LID (Lidocana), PRO (Procana), HID (Hidroxizina), Diltiazem (DIL) e Paracetamol (PAR).

156