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Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa.

Dra Cynthia Maria Kyaw UNB)

CRESCIMENTO MICROBIANO Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do nmero de clulas e no ao aumento das dimenses celulares (tamanho da clula). Crescimento Populacional: definido como o aumento do nmero, ou da massa microbiana. A taxa de crescimento a variao no nmero ou massa por unidade de tempo. O tempo de gerao o intervalo de tempo necessrio para que uma clula se duplique. O tempo de gerao varivel para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos at dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de gerao no corresponde a um parmetro absoluto, uma vez que dependente de fatores genticos e nutricionais, indicando o estado fisiolgico da cultura. O tempo de gerao pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela frmula abaixo: N=No.2n, onde N= nmero final de clulas, No= nmero inicial de clulas, n= nmero de geraes. n= log(N) - log(No)/0.301 g = t/n , onde g= tmpo de gerao, t= tempo de crescimento e n= determinado acima. Medidas do crescimento microbiano O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes tcnicas, tais como pelo acompanhamento da variao no nmero ou peso de clulas, por exemplo. Dentre as diferentes tcnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos. Contagem total de clulas: esta metodologia envolve a contagem direta das clulas em um microscpio, utilizando-se cmaras de contagem. A contagem direta uma tcnica rpida, mas tem como principais limitaes a impossibilidade de distino entre clulas vivas e mortas e contagens errneas, devido s pequenas dimenses de algumas clulas, ou pela formao de agregados celulares.

Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Em determinadas situaes, por exemplo quando se requer apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se empregar a contagem proporcional, que corresponde a uma anlise comparativa das culturas com suspenses padro. Como exemplo de uma suspenso padro podemos citar a escala de MacFarland, apresentando assim, graus de turvao distintos. Desta forma, comparando-se a turvao da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se obter uma estimativa do nmero de clulas presentes na amostra.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw UNB)

Contagem de viveis: Procedimento tambm conhecido como contagem em placa, que estima o nmero de clulas viveis (isto , capazes de se reproduzir) em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais so ento inoculadas em meio slido. Aps a incubao dos meios, geralmente por uma noite, o nmero de colnias contado. Como uma colnia normalmente originada a partir de um organismo, o total de colnias que se desenvolvem no meio corresponde ao nmero de clulas viveis presentes na alquota analisada. Esta tcnica deve sempre realizada empregando-se vrias dilues (100 a 104 clulas) das amostras. Esta metodologia amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixos nmeros de clulas e permitindo tambm a contagem de diferentes tipos de microrganismos, pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o crescimento de um determinado tipo ou grupo de organismo) e/ou seletivos e diferenciais (meios que alm de favorecerem o desenvolvimento de um tipo ou grupo de organismo, tambm permite sua distino, a partir de alguma caracterstica fenotpica). Tambm podem ser usadas membranas filtrantes, onde os lquidos so filtrados e as membranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura.

Tcnica de contagem de viveis (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Massa de clulas: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso mido de uma cultura. Este tipo de procedimento realizado quando no necessrio determinar o nmero preciso de microrganismos presentes. Peso seco: Muito utilizado na quantificao de fungos, onde o miclio retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido secagem. Realizam-se ento sucessivas pesagens, at o momento onde no observa-se mais variaes. Este procedimento pode tambm ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou ento secando-o (100 - 150C/16 horas) e depois pesando-o.

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Turbidimetria: quantificao em espectrofotmetro ou colormetro a 660 nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura no interfere com os resultados. Nestes comprimentos, a absoro de luz por componentes celulares corados desprezvel mas, se necessrio, outros comprimentos de onda podem ser usados. Tal metodologia requer a confeco de uma curva padro. Embora a anlise turbidimtrica seja menos sensvel, de rpida e fcil execuo, no destruindo a amostra. Entretanto, no permite a determinao de clulas viveis.

Anlises qumicas: A partir da quantificao de protenas ou de nitrognio, ou por meio da anlise de diferentes atividades metablicas.

Nmero Mais Provvel (NMP): Amplamente utilizado em laboratrios de microbiologia de alimentos ou ambiental, na quantificao de microrganismos em gua, leite e outros produtos. Esta metodologia basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e coliformes fecais, que so microrganismos indicadores de poluio fecal, o que pode ter como consequncia a presena de outros organismos, tais como protozorios e vrus. Esta tcnica foi desenvolvida aps anlises estatsticas complexas.

CURVA DE CRESCIMENTO (CULTURA DESCONTNUA) Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionria e de declnio.

Curva de Crescimento Padro, em um sistema fechado

Lag: perodo varivel, onde ainda no h um aumento significativo da populao. Nesta fase ocorre a sntese de vrias enzimas e/ou outros constituintes celulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no meio. Log ou exponencial: nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de crescimento

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exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo em questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Estacionria: Nesta fase, os nutrientes esto escasseando e os produtos txicos esto tornandose mais abundantes. Nesta etapa no h um crescimento da populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem. Na fase estacionria que so sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambm a esporulao das bactrias. Declnio: A maioria das clulas est em processo de morte, embora outras ainda estejam se dividindo. Crescimento em culturas contnuas: tcnica muito usada nos processos industriais de obteno de produtos microbiolgicos. Nestes casos, tem-se o interesse em manter as clulas em fase log ou estacionria. Utilizam-se fermentadores que permitem um crescimento em equilbrio dinminco.

CONDIES IDEAIS DE CRESCIMENTO O crescimento dos microrganismos grandemente afetado pelas condies fsicas e qumicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em questo. TEMPERATURA: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que h um aumento da temperatura, as reaes qumicas e enzimticas na clula tendem a tornar-se mais rpidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturao de protenas e cidos nuclicos, inviabilizando a sobrevivncia celular. Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas mnima, tima e mxima para cada microrganismo. A temperatura mxima provavelmente reflete os processos de desnaturao mencionados acima.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw UNB)

Temperaturas cardeais dos microrganismos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de temperatura, onde para alguns o timo encontra-se entre 5 e 10C, enquanto para outros de 90 a 100C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo com os timos de temperatura: PSICRFILOS (0 a 20C, timo de 15C), MESFILOS (12 a 45C), TERMFILOS (42 a 68C), e HIPERTERMFILOS (80 a 113C).

Tipos de bactrias em relao temperatura (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

H os microrganismos psicrotolerantes que so aqueles cujo timo encontra-se entre 20 e 40C e que sobrevivem a 0C. So um grupo amplo (bactrias, fungos, algas e protozorios) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw UNB)

Mesfilos: crescem numa faixa de 20 a 40C, com um timo em torno de 37C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente. Termfilos e Hipertermfilos: So encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo ocenico.

TENSO DE HIDROGENIO - pH: Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento de diferentes tipos de microrganismos. Os fungos tendem a ser mais acidfilos que as bactrias (pH <5).

Distribuio de alguns microrgansmos, de acordo com o pH (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

TENSO DE O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que os microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo classificados como AERBIOS, ANAERBIOS FACULTATIVOS, ANAERBIOS ESTRITOS, ANAERBIOS AEROTOLERANTES E MICROAERFILOS. As condies de anaerobiose podem ser conseguidas pelo uso de agentes redutores nos meios de cultura, tais como o tioglicolato de sdio, que reage com o oxignio, formando gua; pela remoo mecnica do oxignio, sendo substitudo por nitrognio e CO2; pelo uso de sistemas comerciais do tipo "GasPak", que gera hidrognio e CO2 com um catalisador de paldio.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw UNB)

Classes de organismos, em relao tenso de oxignio (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

PRESSO OSMTICA

Classes de organismos, em relao salinidade (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)