MICOLOGIA

CARACTERSTICAS GENERALES
El trmino hongo procede del latn fungus. Estos seres han sido considerados tradicionalmente ms prximos a las plantas que a otros seres vivos debido a su similitud en la composicin qumica y estructura ultramicroscpica, aunque en la actualidad son grupos que se estudian por separado. Los hongos estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, abundando en el suelo, vegetacin, en la materia existente en el agua y en general en cualquier ambiente hmedo. Son en su mayora muy beneficiosos para el hombre, ya que se encargan de destruir la materia orgnica compleja degradndola a formas qumicas simples que pasan a formar parte del suelo, donde finalmente son absorbidas por otras generaciones de plantas, encargndose en gran medida de la fertilidad de la tierra. Gracias a los hongos tambin se pueden obtener ciertos alimentos como los quesos, yogures, pan, bebidas alcohlicas, como la cerveza, vino, etc., as como la produccin de ciertos antibiticos, vitaminas, cido ctrico, etc. Desde un punto de vista clnico, el grupo de hongos ms importante para el hombre va a corresponder a aquellos que crecen como parsitos en ste produciendo infecciones, fundamentalmente de tipo superficial o cutneo, llamadas micosis superficiales y ms excepcionalmente de forma sistmica como micosis profundas. La ciencia que estudia en general los hongos, se denomina Micologa.

GENERALIDADES Y CARACTERSTICAS DE LOS HONGOS

Los hongos son seres vivos cuya estructura celular es de tipo eucariota (eu = verdadero, cario = ncleo), lo que les va a diferenciar de todas las bacterias que son procariotas (pro = primitivo, cario = ncleo). Los hongos son hetertrofos, es decir, necesitan materia orgnica como nutriente. Se pueden comportar como saprfitos; en estos casos su alimento es materia orgnica generalmente muerta, procedente de animales y plantas. Existen otras especies que se pueden comportar como parsitas; en estos casos su alimento procede de huspedes vivos a los que parsita. En general, los hongos se encuentran en la naturaleza formando hifas, que es la forma vegetativa del moho (hiphe = caa). En estos casos, el hongo es pluricelular y al conjunto de hifas se le denomina micelio. Tambin puede encontrarse en forma de levadura; en estos casos, es una nica clula esfrica. Se reproducen de manera natural por medio de esporas aunque existen excepciones. Estas esporas se originan de forma sexual o asexual segn especies. No tienen clorofila y poseen pared celular que contiene quitina y en ocasiones celulosa. Muchos hongos presentan dimorfismo como caracterstica, es decir, pueden existir en la naturaleza en forma de levadura o en forma de moho.

CRECIMIENTO
Como se ha explicado, los hongos pueden crecer en la naturaleza pluricelular-(micelio) y/o unicelularmente (levadura).

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Cuando crece pluricelularmente se suelen llamar mohos u hongos pluricelulares. Aqu se forman estructuras libres, las hifas, que crecen formando un conjunto de ramificaciones entrelazadas llamadas micelios. Dichas hifas crecern por elongacin de sus extremos y por produccin de ramas laterales (crecimiento apical). Este micelio puede ser a su vez areo si el crecimiento del hongo es hacia la superficie y si contiene esporas o clulas reproductoras se denominar micelio reproductor. Si el crecimiento del micelio se realiza hacia el interior de un medio en busca de nutrientes se denominar micelio vegetativo. En general los micelios, sean del tipo que sean, suelen crecer en lquidos o slidos hmedos. Las colonias que forman en su crecimiento son irregulares, algodonosas, filamentosas y secas y, en ciertas ocasiones, pueden estar necrosadas por falta de nutrientes y/u oxigeno. Las hifas que forman un micelio pueden estar divididas por paredes transversales llamadas septos (septum = tabique); de ah el concepto de pluricelular, aunque en algunas ocasiones tal tabicacin no existe. Si el crecimiento es unicelular nos encontramos con las levaduras, que corresponden a clulas eucariotas esfricas u ovales con un dimetro de 3 a 5 micras aproximadamente. Su reproduccin es generalmente por gemacin y crecen en cualquier caso de forma ms lenta que la mayor parte de las bacterias, aunque existen excepciones. Poseen una pared celular rgida que recubre la parte externa de la membrana citoplasmtica y la estructura fundamental de sta es igual en todos los hongos, est formada por polmeros de hexosas y hexosaminas y en muchos casos presenta quitina (N-acetil-glucosamina).

METABOLISMO
Los hongos son organismos hetertrofos, constituyendo el suelo su hbitat natural. En su mayora son aerobios, donde el oxgeno acta como aceptor final de hidrogeniones. Tambin existen en la naturaleza algunas especies anaerobias facultativas y otras que obtienen su energa de procesos fermentativos al crecer en medios mnimos donde utilizan el nitrgeno en forma de nitratos, nitritos, etc. Otras especies pueden utilizar cualquier fuente de carbono, que es siempre un factor limitante para su desarrollo. La fuente de carbono ms utilizada en su metabolismo suele ser la glucosa u otros componentes ms complejos como el almidn o la celulosa. Tambin pueden necesitar en pequeas cantidades hierro, zinc, cobre, magnesio, fsforo, potasio, etc. Su metabolismo suele desarrollarse a temperaturas que pueden oscilar entre los 0 y los 60 C aunque la temperatura ptima de crecimiento se sita en torno a los 22-30 C. Suelen crecer mejor a concentraciones de acidez relativamente elevadas, aunque pueden encontrarse excepcionalmente en algunos medios alcalinos. El pH ptimo para casi todas las especies se suele situar en torno a 5,5. Necesitan humedad para su desarrollo y pueden obtener agua de la atmsfera y del medio, aunque muchos mohos pueden sobrevivir en ambientes muy deshidratados debido a la presencia de esporas.

REPRODUCCIN
Los hongos pueden reproducirse por medio de ciclos sexuales o asexuales, as como por procesos parasexuales. La estructura responsable de cada uno de estos ciclos es la espora y segn las caractersticas de su formacin hablamos de reproduccin sexual o asexual.

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Reproduccin asexual Consiste en el crecimiento vegetativo de un micelio, producindose divisin nuclear sin verdadera, divisin celular; no hay formacin de gametos y no hay fusin nuclear. Se conocen 3 tipos: esporulacin por germinacin de esporas, gemacin y fragmentacin de hifas.

Micelio

Levaduras

Conidiforo

Esporulacin por germinacin de esporas. La estructura del hongo que produce las esporas asexuales se denomina conidiforo. Estos conidiforos no son ms que hifas especializadas situadas en las zonas apicales de stas y con gran diversificacin en cuanto a forma, color, tamao, tipo de septacin, etc. Tales estructuras especializadas tienen especial importancia para la determinacin taxonmica de cada hongo. Las esporas que all se forman se denominan genricamente conidios. Existen algunos gneros que forman ms de un tipo de conidios o conidias en un mismo talo o hifa. Unas sern ms pequeas o microconidias y otras ms grandes, generalmente pluricelulares, llamadas macroconidias. Las microconidias suelen ser esfricas, ovales, piriformes, etc., y las macroconidias suelen ser alargadas y resultan de la tabicacin transversal de dos o ms clulas. Una vez producidas estas conidias, dichas esporas germinan cuando llegan a un medio adecuado, aumentando de tamao y dando lugar a uno o ms tubos germinales, que se prolongan para formar hifas que originan al crecer y entrelazarse el micelio, dando lugar a una nueva colonia.

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Adems de este tipo de esporas, existen otros tipos con diferentes denominaciones, tales como: talosporas, llamadas as por formar parte de la hifa vegetativa artrosporas u odios, que corresponden a clulas cilndricas formadas por fragmentacin de las hifas y conidios. blastosporas, que son yemas mas o menos alargadas y que se originan por la gemacin de una levadura o pseudo-hifa, son, por ejemplo tpicas en la especie Candida albicans Clamidosporas que son esporas redondeadas formadas por una pared gruesa que se ha originado a partir de hifas laterares o terminales. Esporangiosporas, que son esporas que se forman en el interior de unas estructuras que presenten forma de saco (esporangio), situadas en extremos de las hifas o ramas especiales. Gemacin. El principal mecanismo de reproduccin asexual en las levaduras es la gemacin y consiste en la formacin de una gema o yema en cualquier lugar de la clula madre, creciendo hacia fuera y aumentando de tamao a partir de la clula madre. El ncleo de la clula madre se divide y uno de los ncleos resultantes pasar a la clula o yema hija; despus de esto, ambas terminan separndose. Fragmentacin de las hifas. Consiste en fragmentar parte de una colonia e implantar este fragmento en otro nuevo medio. Se ha observado que este mtodo de reproduccin origina un nuevo micelio. Este mecanismo es el utilizado para el cultivo de hongos en laboratorio. Reproduccin sexual Consiste en la reproduccin de esporas previa fusin de dos ncleos haploides sexualmente compatibles. Este proceso se efecta de la siguiente forma: Un ncleo haploide de una clula donante (el macho) penetra en el citoplasma de la clula receptora (la hembra). Esta fase se denomina fase de plasmogamia. Ambos ncleos, cuando se encuentran y fusionan, forman un nuevo ncleo cigoto diploide (fase de cariogamia). Este cigoto, por meiosis, origina 4 ncleos haploides (fase de reproduccin cromatnica).

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Las esporas sexuales se reproducen con menor frecuencia y en menor cantidad que las asexuales y existen distintos tipos que corresponden a: Cigosporas. Son esporas sexuales con cuerpo grande, pared gruesa, formadas por la fusin de los contenidos de dos hifas que se juntan.

Ascosporas. Son esporas sexuales originadas por fusin de dos hifas y posterior fecundacin, originndose este proceso en un saco conocido como asca. Cada asca suele contener un total de 8 esporas. Oosporas. Son esporas formadas por la fusin de 2 gametos dentro de una estructura especfica denominada oogonio.

Basidiosporas. Son esporas sexuales que se forman generalmente de 4 en 4 en la pared terminal de una estructura en forma de clavo llamada basidio. Surgen por la unin de 2 ncleos de una hifa. A este tipo corresponde la formacin de las setas.

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CLASIFICACION
Los hongos se reproducen por esporas, que son estructuras unicelulares de resistencia que contienen toda la informacin gentica necesaria para el desarrollo completo de un nuevo hongo. Los tipos de esporas, su tamao y el modo de esporulacin son las caractersticas principales para clasificar e identificar a los hongos. Las esporas pueden reproducirse de forma asexual (por simple diferenciacin del micelio) o de forma sexual (por fusin de dos ncleos haploides con formacin de un zigoto sexual). Los hongos forman el reino Fungi. Todos los hongos que producen enfermedades en el hombre son hongos verdaderos o Eumycetes. Los hongos que poseen reproduccin sexual (estado teleomorfo) se denominan hongos perfectos. Los hongos imperfectos son los que no poseen reproduccin sexual o bien se desconoce (estado anamorfo). Las especies patgenas para el hombre se engloban en cuatro clases: Zygomycetes Ascomycetes Basidiomycetes Deuteromycetes La forma de reproduccin sexual mediante zigosporas, ascosporas y basidiosporas es la base de la clasificacin de los hongos perfectos en zigomicetos, ascomicetos y basidiomicetos, respectivamente. Dentro de los deuteromicetos se incluyen todos los hongos en los que se desconoce la reproduccin sexual, as como los estados anamorfos de todos los hongos perfectos. La reproduccin asexual se caracteriza por la formacin de esporangiosporas en los Zygomycetes y de esporas externas o conidiosporas en las otras tres clases. Las esporangiosporas se producen en el interior de una estructura denominada esporangio, por divisin consecutiva; al llegar a la madurez, el esporangio se rompe liberndose las esporas. Las conidias son formas de propagacin de reproduccin asexual que nacen de una clula especializada (clula conidigena), que, a su vez, puede nacer directamente de una hifa vegetativa o de estructuras diferenciadas (conidiforo). Algunos hongos producen conidias grandes y pequeas, llamadas macroconidias y microconidas, es el caso de los hongos dermatofitos, Fusarium, etc. Si las conidias se forman por fragmentacin de la hifa en clulas individuales, se habla de artroconidias o artrosporas (Ej. Coccidioides inmitis, Geotrichum candidum). En las levaduras se produce una protuberancia a partir de una clula madre, que posteriormente se separa. Se llama blastospora o blastoconidia. Por ltimo, existe un tipo particular de conidias, las clamidosporas o clamidoconidias, que son comunes a todos los tipos de hongos; se forman por condensacin del citoplasma y espesamiento de la pared y constituyen formas de reproduccin y resistencia. Habitualmente, la identificacin de los hongos miceliales se realiza basndose en el estudio del estado asexual, ya que el estado sexual suele ser difcil de inducir y observar. Debido a ello, a los hongos perfectos se les asigna con dos nombres, uno para el estado sexual y otro para el asexual. Por ejemplo, Filobasidiella neoformans y Pseudoallescheria boydii son los nombres del estado sexual de los hongos Criptococcus neofomans y Scedosporium apospermum, respectivamente. Mientras no se haya demostrado en el laboratorio que esa cepa se reproduce de forma sexuada, se debe nombrar con el respectivo nombre del estado asexual.

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Clase Ejemplo

Zigomicetos Rhizopus spp

Reproduccin sexual Zigosporas

Tabla Clasificacin de los hongos Ascomicetos Basidiomicetos Estado teleomorfo de la gran Estado teleomorfo de C. mayoria de hongos. Ej. neoformans Aspergillus spp Ascosporas en el interior de Basidiosporas en la extremidad ascas de basidios

Deuteromicetos Hongos imperfectos verdaderos y estado anamorfo de todos los hongos Desconocida

Reproduccin asexual

Esporangiosporas esporangios

dentro

de Esporas externas o conidias

Esporas externas o conidias

Esporas externas o conidias

Morfologa microscpica

Micelio sin tabiques o septos

Micelio con tabiques o son Micelio con tabiques o son Micelio con tabiques o son levalevaduras levaduras duras

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MECANISMOS DE PATOGENICIDAD
Las dos principales barreras fisiolgicas para el crecimiento de los hongos en los tejidos humanos son la temperatura y el potencial redox. La mayor parte de los hongos crece de forma ptima a temperaturas ms bajas que las del organismo humano. Por otro lado, la mayor parte de sus sistemas enzimticos actan con mayor eficacia con potenciales redox propios de sustratos muertos, que en el estado relativamente ms reducido de los tejidos metablicamente activos. Adems, el organismo humano posee un sistema muy eficaz de defensas celulares para combatir la implantacin y el desarrollo de los hongos. As pues, la actividad patgena de los hongos depende, sobre todo, de su capacidad para adaptarse a los tejidos y resistir a las defensas celulares. En los hongos patgenos primarios o verdaderos causantes de micosis sistmicas, la capacidad de adaptacin es bastante elevada y se manifiesta por un dimorfismo. As, cuando Histoplasma, Blastomyces o Paracoccidioides invaden el organismo humano, forman levaduras gemantes y Coccidioides forma una esfrula endosporulada. En estado parasitario, el metabolismo fngico aumenta y se ven facilitadas determinadas vas metablicas; el resultado es un microorganismo que crece y se multiplica con mucha mayor rapidez que en su estado natural a temperaturas ms bajas. Estas formas parasitarias son ms susceptibles a la fagocitosis y destruccin por los macrfagos. Esta es la razn por la que muchas de estas infecciones cursan de forma subclnica y se resuelven de manera espontnea; la blastomicosis es la nica excepcin a esta regla. El otro grupo de hongos causantes de micosis sistmicas, mucho menos virulentas, las llamadas oportunistas (Cryptococcus, Aspergillus, etc.), requieren la mayor parte de las ocasiones un defecto de las defensas del husped para poder establecerse en el interior del organismo humano; no presentan dimorfismo trmico, aunque son tolerantes respecto a la temperatura. Las cepas aisladas de infecciones humanas son metablicamente ms activas a 370C y en el potencial redox de los tejidos, que cuando son aisladas del suelo. En los hongos causantes de micosis subcutneas tambin existe una amplia gama de adaptabilidad. Son microorganismos poco virulentos que, para producir un cuadro de infeccin, tienen que introducirse de forma mecnica en los tejidos (implantacin traumtica); Sporothrix, el ms virulento de este grupo, presenta tambin un dimorfismo trmico, transformndose en levadura cuando invade los tejidos del husped. En los agentes de la cromomicosis y micetomas, la fase de adaptacin requiere mucho tiempo; en el primer caso, la forma parasitaria es la clula esclertica que se divide por planos, y en los micetomas se forman microcolonias filamentosas en los tejidos. El grado de inmunidad natural del organismo humano frente a las infecciones fngicas es considerable. El establecimiento de una micosis depende de la exposicin a un inculo suficiente y del grado de resistencia del husped. En este sentido, existen dos grandes grupos de infecciones fngicas sistmicas perfectamente delimitadas. En el primero (patgenos primarios o verdaderos), la infeccin ocurre en individuos de una determinada rea endmica que inhalan un nmero suficiente de conidias. La mayor parte de estas infecciones son asintomticas o se resuelven con rapidez. Esto suele ir seguido de una resistencia especfica a la reinfeccin y en muy pocos casos se llega a la infeccin grave. En las infecciones sistmicas producidas por hongos oportunistas, el establecimiento de la enfermedad depende enteramente de la baja resistencia del husped y, si el paciente se recupera de una infeccin de este tipo, no suele apreciarse una resistencia especfica frente a la misma.

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Los anticuerpos humorales desempean un papel muy poco importante en la defensa frente a las infecciones fngicas. Las defensas celulares parecen ser las nicas eficaces frente a estas infecciones. En pacientes con defectos en los linfocitos B, las micosis son infrecuentes en contraste con la elevada frecuencia de infecciones bacterianas. La importancia de la inmunidad celular se pone tambin de manifiesto en los diferentes tipos de reacciones histopatolgicas de las micosis; en general, los hongos patgenos en un husped normal inducen reacciones pigenas, seguidas por una reaccin granulomatosa, y la respuesta producida como consecuencia de una invasin por hongos oportunistas es necrtica o supurativa.

AISLAMIENTO Y EXAMEN DE HONGOS: DIAGNOSTICO MICOLOGICO

Examen directo
El diagnstico micolgico a partir de muestras clnicas se realiza mediante examen directo de las mismas o, de forma indirecta, tras su cultivo. El examen directo en fresco se lleva a cabo realizando una suspensin del producto patolgico con unas gotas de KOH al 10-30 % , lo que facilita la disolucin de otras clulas y fibras. En muestras de lquido cefalorraquideo y suero, puede ser interesante realizar una prueba de tinta china si hay sospecha de infeccin criptoccica. Sobre el fondo oscuro de la tinta se observar la gran cpsula de C. neoformans. La tincin de Gram permite ver las levaduras como clulas gram positivas de gran tamao, pero la coloracin de los hongos es ms homognea cuando se utiliza el azul de metileno o Giemsa . Si se usa la tincin de blanco de calco flor, los hongos se observarn de color verde fluorescente a microscopio de fluorescencia. En cortes histolgicos, la tcnica de PAS-Gridley colorea intensamente los polisacridos de la pared de los hongos, al igual que las tcnicas argnticas como la plata -metenamina de Grocott-Gomori. El examen histopatolgico resulta de gran ayuda cuando el patgeno se trata de un hongo oportunista, ya que con frecuencia resulta difcil su valoracin en el medio de cultivo.

Medios de cultivo
Los hongos, como las bacterias, crecen en medios de cultivo artificiales y, en general, son poco exigentes desde el punto de vista nutritivo. Por ello, el aislamiento de los hongos es relativamente fcil, pero su identificacin y la determinacin de su significado clnico es mucho ms difcil. El medio de cultivo ms utilizado en micologia es el Sabouraud pH 5,6; esta acidez dificulta el desarrollo bacteriano. Aunque no necesariamente todos los hongos crecen mejor en este medio, su utilizacin est consagrada por el uso. De hecho, la mayor parte de las descripciones de hongos patgenos se basan en el aspecto que tienen sobre este medio de cultivo. El medio de Sabouraud suele hacerse selectivo por adicin de antibacterianos, como el cloranfenicol, o antifngicos como la cicloheximida (actidiona); esta ltima inhibe de forma selectiva la mayor parte de los hongos saprfitos y no tiene accin, en general, sobre los hongos patgenos (existen excepciones como Cryptococcus neoformans). Por otro lado, la mayor parte de los medios de cultivo de uso habitual en bacteriologa tambin permiten el desarrollo de los hongos causantes de micosis humanas. En micologa, los medios de cultivo se incuban en aerobiosis, y la temperatura ptima de incubacin es 25-30C para los hongos causantes de infecciones superficiales y 35C para los causantes de micosis sistmicas.

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Las levaduras dan lugar a colonias similares a las bacterianas, macroscpicamente visibles a las 24-48 h. Algunos hongos filamentosos se desarrollan en los cultivos en 3-5 das, pero otros requieren varias semanas de incubacin; macroscpicamente se presentan como colonias centrfugas, con filamentos entrelazados ms o menos largos como una costra compacta recubierta por filamentos cortos. En el caso de los hongos dimrficos patgenos primarios, existen medios de cultivo que ayudan a obtener in vitro la fase parasitaria levaduriforme (medios con sangre o huevo incubados a 35-37C).

Identificacin
Los hongos se identifican, en primer lugar, por la morfologa macroscpica de sus colonias, el color, la textura, la velocidad de crecimiento, etc., pero sobre todo por la morfologa microscpica del cultivo esporulado (forma, tamao, situacin, mecanismo de reproduccin y el tipo de esporas asexuales). Para la observacin con microscopia ptica de los hongos filamentosos, el colorante ms empleado es el azul de algodn. Algunos hongos degenerados por el parasitismo no esporulan, lo que hace muy difcil o imposible su identificacin. Las levaduras se identifican por el estudio de la morfologa que presentan cuando crecen en medios pobres (Corn Meal Tween Agar, Rice Tween Agar) y por pruebas bioqumicas: asimilacin y fermentacin de carbohidratos. La asimilacin (auxonograma y zimogama) consiste en el crecimiento de la levadura utilizando un nico compuesto como fuente de carbono o nitrgeno. La fermentacin implica la acidificacin del medio con produccin de gas. Para la identificacin de Candida albicans se usa una prueba rpida de produccin de tubos germinales en suero (prueba de filamentacin. Algunas especies de levaduras requieren pruebas concretas: hidrlisis de la urea y esculina. Por el contrario, la deteccin de antgenos fngicos en muestras clnicas parece ms prometedora. De hecho, la aglutinacin de partculas de ltex para detectar el antgeno capsular de C. neoformans en suero y liquido cefalorraquideo es de gran utilidad. No obstante, las tcnicas diagnsticas en micologa ofrecen en conjunto unos resultados muy por debajo de lo deseable, y continuamente se investigan nuevos mtodos de cultivo y de deteccin de componentes celulares que permitan un diagnstico ms rpido y certero. En este sentido, las tcnicas de diagnstico basadas en la ampliacin de ADN fngico a partir de muestras normalmente estriles pueden ser de utilidad en un futuro. La identificacin de los mohos se lleva a cabo en base a sus caractersticas morfolgicas y de cultivo; as pues, es necesario utilizar mtodos de cultivo y de anlisis que eviten en lo posible el deterioro de las estructuras reproductoras. Hay que tener en cuenta, adems, que la frmula del medio en el que ha crecido un moho tiene una influencia importante en el aspecto de las colonias y en el desarrollo de las estructuras areas reproductoras, clamidosporas, esclerocios, etc. Se recomienda, por tanto, que cuando se est realizando la identificacin de un moho se le cultive en varios medios diferentes. Como ya se indic anteriormente, estos medios pueden ser agar malta, agar Czapek-Dox, agar patata glucosa, agar patata zanahoria glucosa, agar levadura sal de Davis, etc. Para determinar las caractersticas coloniales y de cultivo en medios slidos, se siembra el centro de una placa con esporas (tomadas de la superficie de una colonia con ayuda de un asa de alambre) o con una pequea porcin de agar que contenga micelio de una colonia del moho. Las caractersticas morfolgicas pueden, a veces, determinarse por las preparaciones en fresco a partir de cultivos en placa. Sin embargo, con mucha frecuencia ocurre que las estructuras reproductoras quedan seriamente deterioradas al hacer estas preparaciones, desligndose la maPgina 10 de 21

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yora de las esporas. Si a causa de esto no se puede realizar la identificacin, debern prepararse cultivos en portaobjetos. Existen dos mtodos de cultivo en portaobjetos que pueden utilizarse. Cultivo en bloque de agar sobre portaobjetos. En una placa de Petri se depositan 10 ml de medio y se deja solidificar. Se esteriliza una placa de Petri que contenga en la base un disco de papel de filtro, sobre el cual se coloca una varilla de vidrio en forma de U que lleve dos portaobjetos limpios. Una vez realizada la esterilizacin, se aaden unos ml de solucin estril de glicerina al 20 % al papel de filtro, con el fin de evitar que el cultivo que se encuentra en el portaobjetos se seque durante la incubacin. Del medio solidificado se cortan aspticamente varios bloques de 1 cm2, montndolos sobre los portaobjetos. Se siembran las cuatro superficies cortadas de cada bloque con el moho que se va a estudiar y se coloca sobre cada bloque un cubreobjetos esterilizado. Los cultivos se incuban en las placas de Petri, con las tapas colocadas. Los portaobjetos pueden sacarse de vez en cuando con el fin de examinar el cultivo al microscopio, con el objetivo de poco aumento o de gran aumento; los cubreobjetos contribuyen a evitar que se produzca contaminacin en esos momentos. Una vez que se observa un desarrollo satisfactorio del moho se pueden hacer preparados en fresco, ya que el moho tiende a adherirse al cubreobjetos y al portaobjetos. Con mucho cuidado se quitan los cubreobjetos de los bloques de agar, colocndolos en portaobjetos limpios, con lactofenol, lactofenol azul algodn o lactofenol cido pcrico. Adems de esto se pueden quitar los bloques de agar de los portaobjetos en que se encontraban, examinando estos portaobjetos con colorante y cubreobjetos limpios. Mtodo de cultivo en portaobjetos de Johnson (Johnson, 1946). Se esteriliza una placa de Petri que contenga papel de filtro, una varilla de cristal y portaobjetos, y se aade glicerol estril al 20 % de la forma indicada anteriormente. Se colocan aspticamente dos lneas, estrechas y paralelas, de vaspar estril, a unos 2 cm de distancia, a lo ancho del portaobjetos. En el centro, entre las dos lneas de vaspar, se coloca el inculo del hongo y se tapa con un cubreobjetos que se coloca sobre las lneas de vaspar (fig. a). Con ayuda de una pipeta Pasteur estril, se vierte una cantidad de medio fundido estril (enfriado a 55C) entre el portaobjetos y el cubreobjetos hasta que la lnea de medio llegue al inculo (fig. b). Se consigue as una lnea de cultivo para el hongo. Finalmente, se sella el borde del cubreobjetos por el lado del medio para evitar que ste se seque (fig. c). El cuarto lado del cubreobjetos se deja abierto. Se incuba el cultivo sobre el portaobjetos dentro de una placa de Petri tapada. El cultivo puede examinarse al microscopio cada cierto tiempo y, cuando sea necesario, puede examinarse una preparacin en fresco y teida del cubreobjetos. Para quitar el cubreobjetos se corta
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el cierre de vaspar que se encuentra en el borde del portaobjetos y se empuja cuidadosamente el cubreobjetos con ayuda de otro portaobjetos (fig. d). Se cortan las lneas de Vaspar que hay a cada lado y se corta con cuidado el agar, dejando el cultivo de bongos sobre el cubreobjetos. Este se monta en un portaobjetos y se tie con uno de los colorantes a base de lactofenol.

Serologia
En las infecciones fngicas, las tcnicas serolgicas suelen ser de menor utilidad que en las infecciones bacterianas o vricas. Los antgenos fngicos comerciales permiten la deteccin de anticuerpos frente a hongos patgenos primarios, pero en el caso de las micosis oportunistas resulta difcil distinguir las infecciones de las colonizaciones no invasivas.

ANTIFUNGICOS
Para el tratamiento de las micosis se dispone de un nmero reducido de frmacos. La anfotericina B es un antifngico polinico que, como todos los del grupo, posee un amplio anillo cerrado con un sistema de dobles enlaces conjugados. Este antifngico, aislado en 1955 de una bacteria del gnero Streptomyces del suelo venezolano, es el compuesto ms eficaz y ms utilizado en el tratamiento de las micosis sistmicas. El frmaco se une a la membrana celular del hongo (esteroles), aumentando su permeabilidad. Los hongos son ms sensibles a la anfotericina B que a otros polienos, por su mayor afinidad y avidez para unirse al ergosterol, que es el principal esterol de las membranas fngicas. Con excepcin de algunos hongos dematiceos, Scedosporium y algunos zigomicetos, el resto de los hongos que producen enfermedad en el hombre son sensibles a la anfotericina B. Su gran inconveniente son los efectos txicos, que pueden ser muy graves. La 5-fluorocitosina es un antifngico sinttico, una pirimidina fluorada, que se absorbe por va oral y es eficaz en el tratamiento de unas pocas micosis, en particular las producidas por determinadas levaduras. Acta inhibiendo la sntesis de cidos nucleicos. En la actualidad se utiliza casi exclusivamente en algunas infecciones causadas por Candida o Cryptococcus y algunos hongos dematiceos responsables de cromomicosis. No suele dar buen resultado cuando se utiliza sola. El desarrollo de resistencia a la 5-fluorocitosina durante el tratamiento (resistencia adquirida) hace necesaria su asociacin con la anfotericina B. Los derivados azlicos (miconazol, clotrimazol, ketoconazol, fluconazol, itraconazol) tienen una estructura comn y un amplio espectro de actividad antimicrobiana. El efecto fungisttico primario de los azoles se debe a la inhibicin de la sntesis de los esteroles de la membrana celular. La existencia de un metabolismo activo es indispensable para que los derivados azlicos ejerzan su actividad antifngica; por el contrario, la anfotericina B acta sobre componentes preformados de la membrana. Al igual que ocurre con la 5-fluorocitosina, algunos constituyentes de los medios de cultivo interfieren la actividad de los azoles; este hecho, junto con su carcter fungisttico, dificulta considerablemente la estandarizacin de los Estudios in Vitro de estos frmacos. Actualmente se tiende a utilizar para esta prueba medios sintticos de composicin definida, pero, aun as, todava no se ha alcanzado con los antifngicos la correlacin clnica alcanzada con los antibiticos.

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