Prctica N 7: Observacin de ribosomas.

Introduccin.

Los ribosomas son responsables del aspecto granuloso del citoplasma de las clulas. Es el orgnulo ms abundante. En la clula eucariota, las subunidades que forman los ribosomas se sintetizan en el nuclolo. Una vez formados, estas subunidades atraviesan los poros nucleares y son funcionales solo en el citoplasma cuando se unen las dos subunidades a una molcula de ARN. Los ribosomas son mquinas para la traduccin. En el microscopio, los ribosomas se ven como granos oscuro. Estn formados qumicamente por varias protenas asociadas a ARN ribosmico procedente del nuclolo. Pueden encontrarse libres en el citoplasma o adheridos a las membranas del retculo endoplasmtico. Unas protenas (riboforinas) sirven de nexo entre ambas estructuras. Su estructura es sencilla: dos subunidades (una mayor u otra menor) de diferente coeficiente de sedimentacin. Su funcin consiste nicamente en ser el orgnulo lector del ARN mensajero, con rdenes de ensamblar los aminocidos que formarn la protena. Son orgnulos sintetizadores de protenas.

Procedimiento.

Se mezclaron unas gotas de sangre con azul de metileno nuevo en un tubo de 13x100. Se mantuvo en la mano durante 5 minutos para que precipitaran algunos ribosomas con el calor corporal; despus se transfiri la mezcla a un porta objetos en el cual se coloc una gota de aceite de inmersin para que se observara mejor en el microscopio.

Resultados.

Despus de realizar todo el procedimiento, anteriormente descrito, se procedi a observar la muestra (seca con inmersin en aceite; sin cubreobjetos) con objetivo de 100 X. Se observaron "circulitos" (reticulocitos) pequeos de un color verduzco, y algunos otros (seis aproximadamente) de color azul, tendiendo al prpura. He aqu la imagen con nuestros resultados:

Discusin de resultados.

Nuestros resultados, tendrn punto de comparacin con el blog "Enfermera en Hematologa y Hematoterapia" De acuerdo a dicho sitio, se puede definir a los reticulocitos, como eritrocitos inmaduros, contienen remanentes de cido ribonucleico ribosmico (ARN) que estuvo presente en grandes cantidades en el citoplasma de los precursores nucleados de los que proceden, precipitan en forma de filamentos o grnulos que son visibles al microscopio ptico debido a que los ribosomas tienen la capacidad de reaccionar con ciertos colorantes bsicos como el azul B. El azul de cresilo brillante o el nuevo azul de metileno. Los reticulocitos ms jvenes son los que presentan una capacidad precipitable ms grande y los ms maduros, solo se observan unos cuantos puntos o algunas hebras cortas. Este recuento permite estudiar la capacidad hematopoytica de la mdula sea. Nuestras observaciones Blog

Cuestionario.

1.- Describa las diferencias en estructura de los ribosomas: a) en clulas procariticas. b) en clulas eucariticas.

Distinguimos dos tipos de ribosomas atendiendo a su coeficiente de sedimentacin. Ribosomas 70 S y Ribosomas 80 S. Los ribosomas 70 S son tpicos de PROCARIOTAS, y de cloroplastos y mitocondrias. Los ribosomas 80 S son tpicos de las clulas EUCARIOTAS. Los ribosomas estn formados por dos subunidades de tamao desigual y distinto coeficiente de sedimentacin; Una es la subunidad mayor y la otra es la subunidad menor. Los ribosomas 70 S tienen una subunidad mayor con un coeficiente de sedimentacin de 50 S y una menor de 30 S. Los ribosomas 80 S tienen la subunidad mayor con coeficiente 60 S y la otra 40 S. La unin de ambas subunidades se realiza en presencia de una concentracin 0,001 M de iones Mg, si esta concentracin disminuye se producira la separacin de las dos subunidades, es por lo tanto un proceso reversible. Si la concentracin molar de los iones magnesio aumenta hasta 10 veces, se produce la unin de dos ribosomas para dar lugar a los dmeros. El dmero de los ribosomas 70 S tiene un coeficiente de 100 S, mientras que en el dmero de los ribosomas 80 S, el coeficiente de sedimentacin sera de 120. La ultraestructura del ribosoma es muy compleja, est formado por RNA ribosmico y protenas. Hay diferentes tipos de ARN ribosmico teniendo en cuenta el coeficiente de sedimentacin. Si realizamos una extraccin con fenol de dos subunidades de un R 70 S, se separan por un lado las protenas, y por otro un RNA ribosmico con un coeficiente de sedimentacin 23 S y con el 30 S, aparecen protenas y ARN ribosmico 16 S.

2.- Esquema de un ribosoma durante la sntesis de protena.

3.- Por qu los ribosomas fijan colorantes bsicos? El azul de metileno (color azul), es un colorante bsico, en las clulas se une a sustancias cidas que se tien de color azul. Los 2 componentes ms importantes que siendo cidos poseen esta cualidad metacromtica, son el DNA y los mucopolisacridos cidos (glicosaminoglicanos), esta la razn por lo que la cromatina y las estructuras que poseen mucopolisacridos se tien de color rojo a violeta. Si las molculas de azul de metileno se fijan a estructuras cidas cuyos sitios de unin para el colorante no se encuentran ordenadas (tpicamente ribosomas) dichas sustancias se tien de color azul (no metacromtico). Cuando los ribosomas terminan su maduracin salen al citoplasma en donde se lleva a cabo la sntesis proteca. Si los ribosomas son abundantes producen basofilia citoplasmtica, pues aunque cada uno de ellos no se observa con el microscopio de luz, cuando estn presentes en gran cantidad fijan colorantes bsicos como azul de metileno.

4.- Describa los compartimientos celulares donde podemos encontrar ribosomas. El citoplasma consiste en una estructura celular cuya apariencia es viscosa. Se encuentra localizada dentro de la membrana plasmtica, pero fuera del ncleo de la clula. Hasta el 85% del citoplasma est conformado por agua, protenas, lpidos, carbohidratos, ARN, sales minerales y otros productos del metabolismo. Entre los orgnulos localizados en el citoplasma podemos citar:

1. Ribosomas: Intervienen en la sntesis de protena. 2. Retculo endoplasmtico rugoso: Intervienen en la sntesis de protena. 3. Retculo endoplasmtico liso: Intervienen en la sntesis de hormonas, transporte de sustancias, entre otras. 4. Mitocondrias: Intervienen en la respiracin celular. 5. Lisosomas: Intervienen en la digestin celular. 6. Complejo de Golgi. 7. Vacuolas. 8. Cloroplasto: Intervienen en la fotosntesis 5.- Esquematice el procedimiento para la separacin y purificacin de Ribosomas de la clula. Fraccionamiento diferencial, para aislar al organelo en forma relativamente pura, se procede a lo siguiente: 1. Extraccin.

Es necesario utilizar condiciones poco agresivas, para evitar la prdida de la actividad biolgica (temperatura de entre 0 y 4 C y materiales mantenidos en hielo, usar soluciones acuosas a pH fisiolgico) estas condiciones evitan que enzimas digestivas como proteasas y nucleasas, se liberen al romper las membranas celulares o se pierda la actividad enzimtica. Una solucin usada frecuentemente es STKM (sucrosa, tris, kalium y magnesium).

2. Homogeneizacin.

Es necesario un homogeneizador que consiste en un agitador que se introduce en un recipiente de dimensiones adecuadas que contiene el rgano picado finamente en la solucin tampn. La rotacin controlada del agitador ejerce una fuerza mecnica en las clulas y las rompe, liberando, sus constituyentes en la solucin de sacarosa, esta suspensin se conoce como homogenato. La toma de muestras para verificar al microscopio si las clulas fueron rotas es una prctica usual. Como al romperse las membranas celulares, tambin se liberan las proteasas de los comportamientos sub-celulares, se hace necesario incluir inhibidores de proteasas y remover rpidamente las protenas para garantizar que la protena se conserve intacta.

Centrifugacin diferencial

Utiliza una serie de tres pasos de centrifugacin diferencial, con velocidades sucesivamente mayores, y cada uno produce un sedimento y un sobrenadante, el sobrenadante de cada paso es centrifugado en el siguiente. Este procedimiento proporciona tres sedimentos que son las fracciones nucleares, mitocondriales y microsmica. Ninguna de las fracciones est compuesta de organelos absolutamente puros, sin embargo se ha establecido que existen algunas enzimas u otro compuesto qumico caracterstico de cada una de las tres fracciones, pudiendo servir como marcadores.

Purificacin. La fraccin que nos interesa debe ser en principio separada, para posteriormente proceder a aislar y purificar la biomolcula contenida en la misma. Estos mtodos normalmente se combinan para lograr la forma pura de las biomolculas, es decir, sin contaminacin de otras.

En el caso de la purificacin de ribosomas, se utiliza el mtodo de cromatografa de cistena con un cargo Sulfolink resina. Esta aplicacin sencilla y rpida reduce significativamente co-purificacin de las actividades proteolticas y nucleolticas, produciendo altos rendimientos de los ribosomas intactos, levadura muy bioqumicamente activas. La simplicidad del mtodo, y la pureza mejorada y la actividad de los ribosomas cromatogrficas representan un avance tcnico importante para el estudio de los ribosomas eucariticos.

Conclusiones.

Se logr la observacin de los reticulocitos. Las observaciones se lograron gracias al colorante azul de metileno nuevo para hacerlos visibles en el microscopio, y se us como medio el aceite de inmersin con el objetivo de 100 X.

Bibliografas.

Apuntes [http://apuntes.infonotas.com/pages/biologia/la-celula/el-citoplasma.php] Comunidades de divulgacin cientfico tcnica [http://www.elergonomista.com/biologia/ribosomas.htm] Enfermera en Hematologa y Hematoterapia [http://enfhematologiayhematoterapia.blogspot.mx/2011/04/laanemia.html] Web del profesor [http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO%201%20INTRODUCCION% 2006-04.pdf]

Biblioteca Digital ILCE [http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen1/ciencia2/18/html/sec_13.html] Jove General [http://www.jove.com/video/3214/purificacin-por-cromatografa-de-ribosomas-de-levadura-de-granactividad?language=Spanish] Elergonomista [http://www.elergonomista.com/patologia/mad.html]