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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Tecnologia e Geocincias Departamento de Energia Nuclear

Programa de Ps-Graduao em Tecnologias Energticas e Nucleares PROTEN/UFPE CRCN-NE/CNEN

Neyliane Frassinetti Gonalves dos Santos

ANLISE POR CITOMETRIA DE FLUXO DA EXPRESSO DAS PROTENAS GAMA-H2AX, p21 E CASPASE 3 NA RESPOSTA RADIOINDUZIDA DE LINFCITOS HUMANOS

Recife 2012

ANLISE POR CITOMETRIA DE FLUXO DA EXPRESSO DAS PROTENAS GAMA-H2AX, p21 E CASPASE 3 NA RESPOSTA RADIOINDUZIDA DE LINFCITOS HUMANOS

Neyliane Frassinetti Gonalves dos Santos

ANLISE POR CITOMETRIA DE FLUXO DA EXPRESSO DAS PROTENAS GAMA-H2AX, p21 E CASPASE 3 NA RESPOSTA RADIOINDUZIDA DE LINFCITOS HUMANOS

Tese apresentada ao Programa de PsGraduao em Tecnologias Energticas e Nucleares da Universidade Federal de Pernambuco e Centro Regional de Cincias Nucleares Nordeste da Comisso Nacional de Energia Nuclear, como requisito obteno do ttulo de Doutor em Tecnologias Energticas e Nucleares. rea de concentrao: Dosimetria e Instrumentao Nuclear.

Orientador Co-orientadora

Prof. Dr. Ademir de Jesus Amaral


Departamento de Energia Nuclear UFPE

Profa. Dra. Deborah Ruth Tasat


Universidad Nacional de San Martin (UNSAM Argentina) Universidad de Buenos Aires Argentina (UBA Argentina)

Recife 2012

Catalogao na fonte Bibliotecrio Carlos Moura, CRB-4 / 1502


S237a Santos, Neyliane Frassinetti Gonalves dos. Anlise por citometria de fluxo da expresso das protenas gama-H2AX, p21 e caspase 3 na resposta radioinduzida de linfcitos humanos / Neyliane Frassinetti Gonalves dos Santos. - Recife: O Autor, 2012. 105 folhas, il., tabs. Orientador: Prof. Dr. Ademir de Jesus Amaral. Co-orientadora: Profa. Dra. Deborah Ruth Tasat. Tese (Doutorado) Universidade Federal de Pernambuco. CTG. Programa de Ps-Graduao em Tecnologias Energticas e Nucleares, 2012. Inclui Referncias e Apndice. 1. Radiao ionizante. 2. Protena gama-H2AX. 3. Protena p21. 4. Caspase 3. 5. Citometria de fluxo. I. Amaral, Ademir de Jesus (orientador). II. Tasat, Deborah Ruth (co-orientadora). III. Ttulo. UFPE CDD 612.01448 (21. ed.) BDEN/2012-015

ANLISE POR CITOMETRIA DE FLUXO DA EXPRESSO DAS PROTENAS GAMA-H2AX, p21 E CASPASE 3 NA RESPOSTA RADIOINDUZIDA DE LINFCITOS HUMANOS

Neyliane Frassinetti Gonalves dos Santos

APROVADA EM: 13.09.2012

ORIENTADOR: Prof. Dr. Ademir de Jesus Amaral CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Deborah Ruth Tasat

COMISSO EXAMINADORA:

___________________________________________________________________ Prof. Dr. Ademir de Jesus Amaral DEN/UFPE ___________________________________________________________________ Profa. Dra. Marcela Maria Pereira de Lemos Pinto DEN/UFPE ___________________________________________________________________ Profa. Dra. Maria Elizabeth Cavalcante Chaves CCB/UFPE ___________________________________________________________________ Prof. Dr. Thiago de Salazar e Fernandes DBR/UFPE ___________________________________________________________________ Profa. Dra. Valria Rgo Alves Pereira FIOCRUZ/Depto. Imunologia/UFPE

Visto e permitida a impresso

__________________________________ Coordenador do PROTEN/DEN/UFPE

AGRADECIMENTOS

Ao meu Deus, por confiar em sua filha e me acompanhar em todos os momentos, de glria e dificuldade, me dando a fora que eu nunca posso imaginar que tenho e me apresentando pessoas abenoadas para me acompanharem nessa jornada.

minha me, Neuza, e minha v, Eunice, desde sempre, por comemorarem minhas vitrias como as suas prprias e pelo apoio incondicional quando fraquejei durante estes 4 anos e meio de caminhada. Aos meus irmos talo, Julyanne e Emanuelle, pela crena de que eu seria sempre capaz de conseguir o que desejei e por me darem meus pequenos presentes, Gabriel e Guilherme, os anjinhos da minha vida.

Ao professor Ademir Amaral e doutora Deborah Tasat, por terem acreditado e confiado na possibilidade de meu aprimoramento com a realizao deste doutorado. Pela confiana depositada, pelas possibilidades oferecidas, pelos puxes de orelha, pela orientao que se estende mais do que no trabalho tcnico, mas pela minha vida inteira. Pela amizade construda.

Aos membros das bancas de seminrios, por todas as cruciais contribuies que deram a este trabalho e minha pessoa.

Aos amigos e companheiros de trabalho do Grupo de Radioproteo e Radioecologia Aplicada (GERAR), em especial Marcela Pinto e Rafael Freitas, que mais me aguentaram durante este tempo, me deram apoio, orientao, brao e ombro, e se fizeram meus irmos; Edvane Borges, pelos conselhos e companhia inigualveis; Mariel Cadena, que chegou no meio do caminho mas me teve um companheirismo que valeu e vale por toda a jornada; Mariana Brayner, pela confiana incondicional; Thiago Fernandes, pelo estmulo cientfico que parece inerente sua pessoa.

os amigos Frida, Amlia, Washington, Wiviane, Thatiana, Aluzio, Carolina, Paula, Fernanda, Nandzia e Lia que se fizeram to presentes neste tempo, vibrando junto comigo a cada vitria e dando apoio nos momentos que precisei.

Ao

Laboratrio

de

Metrologia

das

Radiaes

Ionizantes

(LMRI),

pela

disponibilidade do equipamento para irradiao das amostras; aos participantes desta pesquisa, por contriburem voluntariamente na realizao dos estudos e contriburem de forma crucial realizao do estudo e construo do conhecimento.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), pelo apoio financeiro; Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)/ Secretaria de Ciencia y Tecnologia (SeCyT), pelo auxlio realizao de parte do projeto no mbito da pesquisa; Fundao de Amparo Cincia e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE), pelo auxlio financeiro finalizao do doutorado.

A cincia nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez. (George Bernard Shaw)

RESUMO

Os estudos dos efeitos biolgicos radioinduzidos tm progredido com a anlise de diferentes parmetros celulares, e estas pesquisas vm sendo refinadas com o advento recente de novas ferramentas analticas, a exemplo da citometria de fluxo. Nessa perspectiva, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a expresso das protenas gama-H2AX (sinalizao do dano), p21 (bloqueio do ciclo celular) e caspase 3 (apoptose) por citometria de fluxo na resposta radioinduzida de linfcitos humanos. Amostras de sangue perifrico de 10 indivduos saudveis foram divididas em quatro alquotas, das quais uma foi mantida como controle no irradiado, e as demais, irradiadas com doses de 1; 2 e 4 gray (Gy) em fonte de cobalto-60 com taxa de dose mdia de 3,7 Gy/h. As alquotas foram processadas para obteno das clulas mononucleares e marcao das protenas com anticorpos conjugados a fluorocromos, ex vivo e aps cultura in vitro durante 24; 48 e 72 horas, com e sem estmulo com fitohemaglutinina. A expresso protica foi analisada por citometria de fluxo, e mensurada em termos percentuais. Um aumento dose-dependente da expresso radioinduzida da gama-H2AX foi detectado na anlise ex vivo, sendo esta relao perdida nas primeiras 24 horas aps a exposio. Os resultados da p21 no apresentaram correlao com os nveis de dose. Os nveis de expresso da caspase 3 apresentaram-se como evento dose-dependente aps 24 horas, em culturas no estimuladas com fitohemaglutinina. Os resultados contribuem com a identificao de dois potenciais bioindicadores de exposio: a -H2AX, como bioindicador de exposio imediata, e a caspase 3 ativa, para exposies ocorridas h pelo menos 24 horas, sendo vlida at o tempo mximo analisado (72 horas).

Palavras-chave: Radiao ionizante. Protena gama-H2AX. Protena p21. Caspase 3. Citometria de fluxo.

ABSTRACT

Studies of radioinduced biological effects have been evolved with the analysis of different cell parameters, and these researches have been refined with recent advent of new analytical tools, such as flow cytometry. In this context, the aim of this research was to evaluate the expression of gamma-H2AX (damage signaling), p21 (cell cycle blocking) and caspase-3 (apoptosis) proteins by flow cytometry from radioinduced response of human lymphocytes. Peripheral blood samples of 10 healthy subjects were divided into four aliquots, one of which was kept as non-irradiated control and the remaining were irradiated with doses of 1, 2 and 4 gray (Gy) in cobalt-60 source with a mean dose rate of 3.7 Gy/h. Aliquots were processed to reach mononuclear cells and labeling of proteins with fluorochrome-conjugated antibodies, ex vivo and after in vitro culture for 24, 48 and 72 hours, with and without phytohemagglutinin stimulation. The protein expression was analyzed by flow cytometry and measured as percentage. A dose-dependent increase in radioinduced expression of gamma-H2AX was detected for ex vivo condition, and this relation was lost 24 hours after exposure. The results for p21 were not correlated with dose levels. The expression levels for caspase-3 presented as a dose-dependent event after 24 hours, in non-stimulated cell cultures. The results suggested two potential biomarkers of individual exposure to ionizing radiation: -H2AX, as immediate exposure bioindicator, and caspase 3, to investigate exposures within the length of time of 72 hours (maximal time analyzed).

Key-words: Ionizing radiation. Gamma-H2AX protein. p21 protein. Caspase 3. Flow cytometry.

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LISTA DE ILUSTRAES Figura 1 Estrutura bsica do DNA (cido desoxirribonucleico) .......................................... 19 Figura 2 Nveis de compactao do DNA ............................................................................ 20 Figura 3 Relao entre transferncia linear de energia e eficcia biolgica relativa (RBE), mostrando que a RBE mxima quando os eventos de ionizao coincidem com o dimetro do DNA .................................................................................................................................... 22 Figura 4 Principais leses induzidas pela interao da radiao ionizante com o DNA ...... 23 Figura 5 Alvos da quinase ATM, relacionados ao reconhecimento e reparo do dano, bloqueio do ciclo celular e apoptose......................................................................................... 28 Figura 6 Nucleossomo contendo histona H2AX, com sua sequncia serina-glutaminaglutmato-tirosina (SQEY) fosforilada (P) em sua serina.......................................................... 29 Figura 7 Principais mecanismos de regulao e localizao intracelular da protena p53, em condies normais e em resposta irradiao .......................................................................... 32 Figura 8 Fases do ciclo celular (G0, G1, S, G2, M) e principais complexos ciclina/quinases dependentes de ciclina (cdk), com seus respectivos tempos de ao. Tambm so indicadas as posies dos principais pontos de checagem no ciclo .............................................................. 34 Figura 9 Mecanismos de bloqueio do ciclo celular mediado pela protena p21 .................. 36 Figura 10 Representao esquemtica das principais vias de sinalizao da apoptose radioinduzida ............................................................................................................................ 38 Figura 11 Estrutura bsica das procaspases e mecanismo de ativao ................................ 40 Figura 12 Representao esquemtica da imunocitoqumica indireta ................................. 44 Figura 13 Representao esquemtica do sistema primrio de um citmetro de fluxo ....... 45 Figura 14 Separao celular utilizando Ficoll. Em (a), sangue diludo disposto sobre soluo de Ficoll; em (b), disposio dos componentes sanguneos aps centrifugao; em (c) camada de clulas mononucleares do sangue perifrico (PBMCs) resgatada e diluda em soluo salina tamponada com fosfatos (PBS) ......................................................................... 54 Figura 15 Esquema do cultivo celular em placas de 96 poos, para cada tempo de cultura 56 Figura 16 Grfico biparamtrico de densidade para anlise de tamanho e granulosidade (FSCxSSC) ............................................................................................................................... 59 Figura 17 Expresso da histona -H2AX (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, para as anlises ex vivo. Para cada grupo, n = 10. Os colchetes invertidos relacionam estatisticamente os grupos localizados abaixo de suas extremidades....................................... 62

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Figura 18 Valores individuais (n = 10) de expresso da histona -H2AX nos grupos controle e irradiados, para as anlises ex vivo .......................................................................... 63 Figura 19 Expresso da histona -H2AX (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo celular de 24 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10. Os colchetes invertidos relacionam estatisticamente os grupos localizados abaixo de suas extremidades. .................................................................................................................... 64 Figura 20 Expresso da histona -H2AX (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, cultivados durante 48 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10. ....................................................................................................................................... 65 Figura 21 Expresso da histona -H2AX (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo durante 72 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10. ....................................................................................................................................... 66 Figura 22 Expresso da protena p21 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, para as anlises ex vivo. Para cada grupo, n = 10. ............................................................................ 70 Figura 23 Expresso da protena p21 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo durante 24 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10. ...... 71 Figura 24 Expresso da protena p21 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo durante 48 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10. ...... 72 Figura 25 Expresso da protena p21 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo durante 72 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10. ...... 73 Figura 26 Expresso da caspase 3 ativa nas amostras controle e irradiadas, ex vivo ........... 75 Figura 27 Expresso da caspase 3 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, para as clulas cultivadas durante 24 horas. Para cada grupo, n = 10. Os colchetes invertidos relacionam estatisticamente os grupos localizados abaixo de suas extremidades. ................... 76 Figura 28 Expresso da caspase 3 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, para as clulas cultivadas durante 48 horas. Para cada grupo, n = 10. Os colchetes invertidos relacionam estatisticamente os grupos localizados abaixo de suas extremidades. ................... 77 Figura 29 Expresso da caspase 3 nas amostras controle e irradiadas, cultivadas durante 72 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA) ............................................................................. 78 Figura 30 Cmara de Neubauer, com detalhamento das marcaes contidas em cada cmara de contagem e quadrantes (A, B e C) delimitados ................................................................. 103

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LISTA DE TABELAS Tabela 1 Principais caractersticas da imunofluorescncia, citometria de fluxo e Western Blot ............................................................................................................................. 46 Tabela 2 Configurao experimental para a marcao com anticorpos ............................... 58 Tabela 3 Expresso da -H2AX nas anlises ex vivo........................................................... 62 Tabela 4 Expresso da -H2AX para a cultura de 24 horas ................................................. 64 Tabela 5 Expresso da -H2AX para as culturas celulares de 48 horas ............................... 65 Tabela 6 Expresso da -H2AX para as culturas celulares de 72 horas ............................... 66 Tabela 7 Expresso da protena p21 nas anlises ex vivo .................................................... 70 Tabela 8 Expresso da protena p21 aps 24 horas de cultivo ............................................. 71 Tabela 9 Expresso da protena p21 aps 48 horas de cultivo ............................................. 72 Tabela 10 Expresso da protena p21 aps 72 horas de cultivo ........................................... 73 Tabela 11 Expresso da caspase 3, nas anlises ex vivo ...................................................... 75 Tabela 12 Expresso da caspase 3 aps 24 horas de cultivo ................................................ 76 Tabela 13 Expresso da caspase 3 aps 48 horas de cultivo ................................................ 77 Tabela 14 Expresso da caspase 3 aps 72 horas de cultivo ................................................ 79

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AF488 Apaf-1 ATCC ATM ATP ATR Bax Bcl-2 Bcl-xL BD BER bp Brca1 caspase CCS cdk CDKN1A cls. CEP chk Cip1 CNEN CRCN-NE Daxx DDR DEN DISC DNA DNA-PKcs

Alexa Fluor 488 fator de ativao da protease apopttica 1 (apoptotic protease activating factor 1) Coleo de Cultura de Tipos Americana (American Type Culture Collection) ataxia telangiectasia mutada (ataxia telangiectasia mutated) trifosfato de adenosina (adenosine triphosphate) relacionada ATM e Rad3 (ATM- and Rad3-related) protena X associada Bcl-2 (Bcl-2-associated X-protein) linfoma de clulas B 2 (B-cell lymphoma 2) Bcl extra grande (Bcl-extra large) danos s bases (base damage) reparo por exciso de base (base excision repair) pares de base (base pairs) associda predisposio ao cncer de mama 1 (Breast cancer 1, early onset) proteases do aspartato de cistena (cysteinyl aspartate proteinases) Centro de Cincias da Sade quinase dependente de ciclina (cyclin-dependent kinase) inibidor de cdks 1A (cdk inhibitor 1A) clulas Comit de tica em Pesquisa quinase dos pontos de checagem (checkpoint kinases) protena que interage com cdk 1 (CDK- interacting protein 1) Comisso Nacional de Energia Nuclear Centro Regional de Cincias Nucleares do Nordeste protena associada ao domnio de morte (death-domain associated protein) resposta ao dano ao DNA (DNA damage response) Departamento de Energia Nuclear complexo de sinalizao de induo de morte (death-inducing signaling complex) cido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid) subunidade cataltica da protena quinase DNA-dependente (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)

DP DSB

desvio padro quebra na dupla fita de DNA (double strand breaks)

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FancD2

grupo D2 de complementao da anemia de Fanconi (fanconi anemia complementation, group D2)

FADD

protein do domnio de morte ativado pela Fas (Fas-actived death domain protein)

FITC FL FSC HR IAEA

isotiocianato de fluorescena (fluorescein isothiocyanate) fluorescncia disperso frontal (forward scatter) recombinao homloga (homologous recombination) Agncia Internacional de Energia Atmica (International Atomic Energy Agency)

ICL ICRP

ligao cruzada interfitas (interstrand crosslink) Comisso Internacional de Proteo Radiolgica (International Comission of Radiation Protection)

Ig IRIF JNK LAMBDA LC LET LMRI Mdc1

imunoglobulina focos induzidos pela radiao ionizante (ionizing radiation-induced foci) quinase N-terminal c-Jun (Jun N-terminal quinase) Laboratrio de Modelagem e Biodosimetria Aplicada ligaes cruzadas transferncia linear de energia (linear energy transfer) Laboratrio de Metrologia das Radiaes Ionizantes mediador do ponto de checagem 1 do dano ao DNA (Mediator of DNA damage checkpoint 1)

Mdm2 Mre11 MRN Nbs1 NER NHEJ PBMC PBS PE pH PHA

minuto duplo murino 2 (murine doble minute 2) Recombinao meitica 11 (Meiotic recombination 11) Mre11-Rad50-Nbs1 Sndrome da quebra de Nijmegen (Nijmegen breakage syndrome 1) reparo por exciso de nucleotdeo (nucleotide excision repair) unio de extremidades no-homlogas (nonhomologous end joining) clulas mononucleares do sangue perifrico (peripheral blood mononuclear cells) salina tamponada com fosfatos (phosphate-buffered saline) ficoeritrina (phycoerythrin) potencial hidrogeninico fitohemaglutinina (phytohemaglutinin)

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PIKK

protena quinase relacionada fosfoinositdeo 3-quinase (phosphoinositide 3kinase related protein kinase)

pRb PROTEN pS RBE RI RNA ROCK-1 RPMI SAPK SBF SBPC/ML SMC1 SSB SSC TCLE TNF UBA UFPE UNSAM UNSCEAR

protena do retinoblastoma Programa de Ps-Graduao em Tecnologias Energticas e Nucleares fosfatidilserina eficcia biolgica relativa (relative biological effectiveness) radiao ionizante cido ribonucleico (ribonucleic acid) quinase associada Rho 1 (Rho-associated kinase 1) Roswell Park Memorial Institute protena quinase ativada por estresse (stress-activated protein kinase) soro bovino fetal Sociedade Brasileira de Patologia Clnica/Medicina Laboratorial manuteno estrutural de cromossomos 1 (structural maintenance of chromosomes 1) quebra da fita simples (single strand breaks) disperso lateral (side scatter) termo de consentimento livre e esclarecido fator de necrose tumoral (tumoral necrosis factor) Universidad de Buenos Aires Universidade Federal de Pernambuco Universidad Nacional de San Martn Comit Cientfico das Naes Unidas em Efeitos da Energia Atmica (United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation)

WAF1 -H2AX

fragmento 1 ativado pela p53 selvagem (wild-type p53-activated fragment 1) H2AX fosforilada

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LISTA DE SMBOLOS

C C CO2 E eV g g (x g) Gy h Da k n m m L Q S T V v/v

angstrom grau Celsius concentrao gs carbnico glutamato eltronvolt grama fora centrfuga gray hora dalton comprimento de onda quilo nano (prefixo) metro mili (prefixo) litro glutamina serina treonina micro (prefixo) volume volume/volume mdia

tirosina gama

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SUMRIO

1 INTRODUO ................................................................................................................... 17 2 REVISO DA LITERATURA .......................................................................................... 19 2.1 cido desoxirribonucleico (DNA): estrutura e importncia biolgica ........................ 19 2.2 DNA no contexto dos efeitos biolgicos das radiaes ionizantes ................................ 22 2.3 Resposta celular s quebras da dupla fita do DNA (DSBs) .......................................... 26 2.3.1 Localizao do dano ....................................................................................................... 27 2.3.1.1 Histona H2AX .............................................................................................................. 29 2.3.2 Processamento da sinalizao do dano ao DNA ........................................................... 31 2.3.2.1 Bloqueio da progresso do ciclo celular ....................................................................... 33 2.3.2.1.1 Protena p21 .............................................................................................................. 36 2.3.2.2 Apoptose ....................................................................................................................... 38 2.3.2.2.1 Caspase 3................................................................................................................... 41 2.4 Investigao da DDR radioinduzida ............................................................................... 42 2.4.1 Ferramentas de anlise protica .................................................................................... 43 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 48 3.1 Objetivo geral .................................................................................................................... 48 3 .2 Objetivos especficos ........................................................................................................ 48 4 MATERIAIS E MTODOS ............................................................................................... 49 4.1 Perfil do estudo ................................................................................................................. 49 4.2 Aspectos ticos .................................................................................................................. 49 4.3 Seleo dos participantes e casustica ............................................................................. 50 4.4 Obteno do material biolgico ....................................................................................... 51 4.5 Irradiao .......................................................................................................................... 52 4.6 Separao celular .............................................................................................................. 53 4.7 Anlise da viabilidade e ajuste da concentrao celular ............................................... 54 4.8 Cultivo celular ................................................................................................................... 55 4.9 Citometria de fluxo ........................................................................................................... 56 4.9.1 Protocolo de marcao intracelular direta .................................................................... 56 4.9.2 Aquisio dos dados........................................................................................................ 58 4.9.3 Anlise dos dados............................................................................................................ 60 4.10 Anlise estatstica e apresentao dos dados ................................................................ 61 5 RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................................ 62

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5.1 -H2AX .............................................................................................................................. 62 5.1.1 -H2AX resultados ....................................................................................................... 62 5.1.2 -H2AX discusso ........................................................................................................ 67 5.2 Protena p21 ...................................................................................................................... 70 5.2.1 Protena p21 resultados ............................................................................................... 70 5.2.2 Protena p21 discusso ................................................................................................ 73 5.3 Caspase 3 .......................................................................................................................... 74 5.3.1 Caspase 3 - resultados .................................................................................................... 74 5.3.2 Caspase 3 discusso ..................................................................................................... 79 5.4 Potencial das anlises para novas abordagens em prticas humanas e mdicas que empregam radiaes ionizantes ............................................................................................. 81 6 CONCLUSES.................................................................................................................... 86 REFERNCIAS ..................................................................................................................... 87 APNCIDE A Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ...................................... 101 APNCIDE B Questionrio ............................................................................................. 102 APNDICE C Contagem em cmara de Neubauer ....................................................... 103 ANEXO A Parecer do Comit de tica em Pesquisa ..................................................... 105

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1 INTRODUO

Um dos requisitos mais importantes para prticas humanas e mdicas envolvendo radiaes ionizantes a compreenso dos mecanismos que regem os efeitos moleculares, celulares e teciduais induzidos pelas radiaes. Os atuais avanos em radiobiologia visam no s uma melhor compreenso da resposta celular radioinduzida, como tambm o desenvolvimento de abordagens prognsticas, diagnsticas e teraputicas modernas em radioproteo e radio-oncologia (WILLERS; HELD, 2006; CHAUDHRY, 2008; IAEA, 2010).

A base de uma das reas de maior interesse e impacto em radiobiologia consiste na investigao da resposta aos danos radioinduzidos molcula de cido desoxirribonucleico (DNA deoxyribonucleic acid). H um interesse particular na cascata de eventos que sucede as quebras dupla fita de DNA (DSB double strand breaks), uma vez que este tipo de dano considerado o principal mecanismo pelo qual a radiao causa injrias s clulas e tecidos, estando por isso mais relacionado aos efeitos carcinognicos e letais radioinduzidos (RODEMMAN; WOUTERS, 2011; SELZER; HEBAR, 2012).

As DSBs desencadeiam uma resposta celular complexa, que age no intuito de recuperar o DNA e envolvem circuitos de sinalizao do dano, checagem do contedo gentico, reparo e morte celular. Uma ampla gama de molculas e eventos participa desta cascata de sinalizao intracelular e, portanto, pode ser investigada no intuito de caracterizar a resposta celular radioinduzida. Ademais, estes parmetros so podem apresentar potencial como bioindicadores de exposio, efeito ou sensibilidade s RIs (BENNETT; WATERS, 2000; JOUBERT et al., 2011; ROOS; KAINA, 2012).

Alguns ensaios j so bem estabelecidos nesse sentido, a exemplo da avaliao de alteraes citogenticas para estimativa de dose em radioproteo. Clulas como fibroblastos da pele e clulas epiteliais bucais podem ser empregadas nestas anlises; entretanto, os linfcitos tm se destacado como um bom modelo biolgico para anlise dos efeitos biolgicos da radiao, devido a suas caractersticas biolgicas e facilidade de obteno e cultivo em laboratrio (PINTO et al., 2010; IAEA, 2011).

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O crescente desenvolvimento de anlises genmicas e protemicas, associado ao advento de novas tecnologias para estudos in vivo e in vitro, tem agregado novas possibilidades aos estudos em radiobiologia. Os novos ensaios podem fornecer dados teis e aplicveis no s em radioproteo (e.g. acidentes nucleares), como tambm prtica clnica (e.g. radiossensibilidade do tecido normal), em um futuro prximo (NOLAN; YANG, 2007; FERNET; HALL, 2008).

A anlise de protenas apresenta uma relevncia fundamental neste empreendimento. Aps a exposio radiao, uma srie de protenas so hipo ou hiper-reguladas, em diferentes intervalos de tempo. Tais modificaes proteicas podem ser resultado de alteraes gnicas, alteraes ps-traducionais ou mesmo nas vias de sinalizao intra e intercelular (GUIPAUD, BENDERITTER, 2009; RANA et al., 2010).

Uma das ferramentas disponveis para a anlise de protenas a citometria de fluxo, que tem despontado como uma das ferramentas analticas mais versteis no estudo de sistemas biolgicos. Esta tecnologia permite a realizao de anlises rpidas e quantitativas de mltiplos parmetros em um grande nmero de clulas (NOLAN; YANG, 2007; JOUBERT et al., 2011).

Considerando este cenrio, o objetivo geral desta pesquisa foi avaliar a expresso das protenas gama-H2AX, p21 e caspase 3 ativa por citometria de fluxo, usando como modelo biolgico linfcitos perifricos humanos irradiados in vitro. A escolha por estas protenas foi baseada na relevncia de sua ao nos processos de sinalizao dos danos, bloqueio do ciclo celular e apoptose, respectivamente (TRISCIUOGLIO; BIANCHI, 2009; GREENBERG, 2011; WANG et al., 2011).

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2 REVISO DA LITERATURA

2.1 cido desoxirribonucleico (DNA): estrutura e importncia biolgica O cido desoxirribonucleico (DNA deoxyribonucleic acid) uma macromolcula orgnica que se situa principalmente no ncleo celular, mas tambm pode ser encontrado na mitocndria. O DNA constitudo por duas cadeias ou fitas de nucleotdeos, onde cada nucleotdeo formado por um acar desoxirribose, um grupo fosfato e uma base nitrogenada. A dupla fita do DNA se organiza na forma de uma dupla hlice, espiralada em torno de um mesmo eixo, como ilustrado na Figura 1 (WATSON, CRICK, 1953; ELLSWORTH et al., 1997).
Figura 1 Estrutura bsica do DNA (cido desoxirribonucleico)
Base de acar-fosfato
Bases nitrogenadas

Nucleotdeo

Pontes de hidrognio Molcula de fosfato Molcula de acar

Fonte: Disponvel em <http://evolution.berkeley.edu/evolibrary/article/history_22> (adaptado)

Os nucleotdeos se ligam entre si atravs de seus grupamentos fosfato, e a sequncia de desoxirriboses e fosfato forma a base de cada cadeia, que se localiza mais externamente na estrutura da dupla hlice. Na regio interna da molcula encontram-se as bases nitrogenadas, do tipo purina (adenina ou guanina) ou pirimidina (citosina ou timina), cada base ligada a uma unidade desoxirribose. As bases se ligam entre si por pontes de hidrognio, pareadas seguindo o princpio da complementaridade: a adenina se liga timina por meio de duas pontes de

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hidrognio, e a guanina citosina, por trs pontes de hidrognio (WATSON, CRICK, 1953; ELLSWORTH et al., 1997).

A sequncia de DNA organizada linearmente, de forma que, se fosse possvel medi-la, a molcula apresentaria cerca de 2 metros de comprimento. Para que seja possvel acomodar todo o genoma dentro do ncleo celular cujo dimetro em clulas humanas de aproximadamente 10 micrometros (m) a longa fita de DNA complexada a protenas, e a esta unidade bsica de organizao denomina-se cromatina (KINNER et al., 2008; MAESHIMA et al., 2010). Na Figura 2 esto ilustrados os diversos nveis de compactao do DNA na clula.
Figura 2 Nveis de compactao do DNA DNA
nm: nanometro m: micrometro

Nucleossomo

Fibra de 30 nm

Cromossomo mittico

Ncleo

Fonte: Maeshima et al. (2010)

A unidade bsica da cromatina o nucleossomo, que consiste em 147 pares de base (bp base pairs) do DNA enrolados em sentido anti-horrio em 1,7 giros helicoidais em torno de um ncleo proteico, o qual consiste em um octmero formado por dois dmeros de histonas H2A/H2B e dois dmeros de histonas H3/H4. Cada nucleossomo apresenta cerca de 10 nanometros (nm) de dimetro, e a ligao entre duas unidades estruturas nucleossmicas

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feita por uma seo de DNA de comprimento varivel (KINNER et al., 2008; MUNSHI et al., 2009).

Os nveis maiores de condensao da cromatina so mediados por protenas nohistonas e interaes entre nucleossomos adjacentes, que levam formao de fibras de 30 nm de comprimento. As fibras so organizadas em alas, que se aglomeram em espirais de 700 nm, e o nvel de compactao mxima do DNA ocorre durante a mitose (processo de diviso celular), quando o material gentico condensado e duplicado sob a forma de cromossomos (KINNER et al., 2008; MAESHIMA et al., 2010).

A sequncia de bases nitrogenadas que o DNA carrega o que define o cdigo gentico de um organismo. Molculas de RNA (rybonucleic acid) mensageiro so transcritas a partir de uma fita de DNA nuclear, formando uma fita nica. No citoplasma, a sequncia de RNA utilizada pela clula como molde para a produo de aminocidos (traduo). Neste processo, cada trinca de nucleotdeos codifica um aminocido, e a leitura da molcula de RNA inteira leva produo de um polipeptdeo. As protenas so contituintes de estruturas celulares bsicas e atuam em diversas reaes bioqumicas (ELLSWORTH et al., 1997; TSE et al., 2008).

Os altos nveis de compactao da cromatina resolvem o problema de acomodao espacial e organizao do DNA, e geram uma barreira estrutural que controla o acesso de biomolculas que atuam em processos essenciais para o funcionamento da clula (e.g transcrio, replicao, recombinao, reparo), assim como de agentes fsicos (e.g. radiao ionizante, radiao ultravioleta), qumicos (e.g. radicais livres) ou biolgicos (e.g. vrus), derivados ou no do metabolismo celular, que apresentam potencial genotxico (KINNER et al., 2008; HIOM, 2010; LANS et al., 2012).

A exposio ou o acesso descontrolado dos fatores acima citados pode comprometer a expresso gnica e a proliferao celular e, como consequncia, influenciar negativamente a sobrevivncia e sade do indivduo e de seus descendentes. Fica claro, portanto, a importncia biolgica nica da integridade estrutural e gentica do DNA (HIOM, 2010; LANS et al., 2012).

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2.2 DNA no contexto dos efeitos biolgicos das radiaes ionizantes

As radiaes ionizantes (RIs) consistem so formadas a partir da liberao de energia durante a tentativa de estabilizao de tomos instveis, e possuem como propriedade particular a capacidade de gerar espcies eletricamente carregadas (ons) ao interagirem com a matria. Durante esta interao, as RIs depositam sua energia em pacotes (denominados quanta) que vo at centenas de eletronvolts (eV), sendo que 20 eV a energia mnima para produzir um par inico por evento de ionizao (UNSCEAR, 2010; IAEA, 2011; TONNESSEN; POUNDS, 2011).

Se o tomo ionizado pertence a uma molcula que compe um organismo vivo, as alteraes podem envolver componentes celulares bsicos e induzir danos srios ou morte celular, afetando tecidos e rgos, ou mesmo todo o sistema. Membranas, lipdios e protenas podem ser afetados, mas a molcula de DNA considerada o alvo celular crtico para efeitos biolgicos da radiao (BOLUS, 2001; SELZER, HEBAR, 2012).

Sobre os efeitos radioinduzidos, possvel consolidar a importncia biolgica do DNA atravs da anlise do comportamento ilustrado na Figura 3, onde a eficcia de uma radiao em produzir um determinado efeito biolgico (RBE relative biological effectiveness) avaliada em relao quantidade de energia transferida por unidade de comprimento da trajetria dessa radiao (LET linear energy transfer) (HALL; HEI, 2003).
Figura 3 Relao entre transferncia linear de energia e eficcia biolgica relativa (RBE), mostrando que a RBE mxima quando os eventos de ionizao coincidem com o dimetro do DNA
: angstrom keV/: quiloeltronvolts por micrometro LET: transferncia linear de energia RBE: eficcia biolgica relativa

Fonte: Hall e Hei (2003)

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Nesta anlise, possvel observar que a RBE mxima quando a mdia da separao entre os eventos de ionizao coincide com o dimetro da dupla hlice da molcula de DNA (20 angstroms [], que equivale a 2 nm). Como este comportamento observado para uma ampla gama de efeitos biolgicos, confirma-se o papel crtico dos danos ao DNA em termos de efeitos biolgicos radioinduzidos (HILL, 1999; HALL; HEI, 2003).

As radiaes podem causar danos ao DNA atravs de dois mecanismos: os efeitos diretos e indiretos. No efeito direto, a energia da radiao depositada diretamente na molcula de DNA, enquanto no efeito indireto a radiao interage com molculas adjacentes (e.g. gua, protenas), gerando espcies altamente reativas (e.g. radicais livres e espcies reativas de oxignio) que, por sua vez, interagem com o DNA. No efeito indireto, a principal molcula envolvida a molcula de gua, por ser o composto mais abundante na clula 6(BOLUS, 2001; WILLERS; HELD, 2006).

Em decorrncia destes efeitos, diferentes tipos de leses podem ser produzidas na molcula de DNA. Os principais tipos de danos esto ilustrados na Figura 4 e correspondem s quebras em uma das fitas do DNA (quebras fita simples ou SSBs single strand breaks), quebras dupla fita (DSB double strand breaks), danos s bases nitrogenadas e ligaes cruzadas entre as bases de uma fita, ambas as fitas ou DNA e protenas (IAEA, 2011).
Figura 4 Principais leses induzidas pela interao da radiao ionizante com o DNA SSB simples DSB simples DB simples Stio absico SSB complexa

Quebra na fita simples (SSB):

Quebra na fita dupla (DSB):

DSB complexa DB complexo

Dano s bases (DB):

Ligaes cruzadas (LC):

LC intrafita
Fonte: Adaptado de IAEA (2011)

LC interfitas

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Uma simples mudana de base ou a descontinuidade fsica de um gene importante pode ter efeitos catastrficos sade e viabilidade de um organismo. No intuito de anular estas ameaas, as clulas evolucionalmente desenvolveram mecanismos sofisticados que atuam na reverso de danos ao genoma, coletivamente denominados resposta ao dano ao DNA (DDR DNA-damage response) (HIOM, 2010; AZIZ et al., 2012).

A DDR consiste em uma via complexa que abrange os processos que promovem a restaurao da integridade do DNA (os quais sero explorados com detalhes mais adiante). De modo geral, a DDR envolve eventos moleculares que atuam na localizao dos danos, sinalizao, reparo e morte celular, mas os detalhes dessa resposta podem variar de acordo com fatores particulares (e.g. tipo de radiao, dose, localizao do dano na cromatina, tipo celular, fase do ciclo celular em que a clula se encontra) (AZIZ et al., 2012; THOMPSON, 2012).

Quando os danos no so restaurados, ou so restaurados de forma inadequada, podem haver a formao de mutaes, aberraes e rearranjos cromossmicos, com perda ou transformao da informao gnica, que elevam o risco de desenvolvimento de cncer. No caso de falhas mais graves, pode ocorrer bloqueio irreversvel do ciclo celular, falhas na diviso celular e morte celular, como forma de prevenir a proliferao de clulas danificadas (KHANNA; JACKSON, 2001; GUDKOV; KOMAROVA, 2003; HIOM, 2010).

Nessa perspectiva, a execuo da DDR de singular importncia para a manuteno da integridade genmica, preveno da carcinognese e transmisso de informaes prognie. Tal importncia evidenciada a partir de um grupo numeroso de doenas humanas cuja etiologia consiste em defeitos em um ou mais componentes da DDR, a exemplo da ataxia telangiectasia1, a anemia de Fanconi2 e a microencefalia primria3. Apesar de clinicamente distintas, em geral estas desordens so hereditrias e cursam com defeitos congnitos e

Doena hereditria que afeta sistema nervoso e imune. As anomalias no cerebelo causam o aparecimento de movimentos descoordenados (ataxia). As telangiectasias, dilataes dos capilares, so muito evidentes na pele e nos olhos. 2 Doena gentica caracterizada por alteraes no sistema esqueltico, incidncia aumentada de tumores slidos e leucemias, insuficincia da medula ssea progressiva (anemia aplstica), alteraes renais (rim em ferradura, rim plvico agenesia de ureter) e susceptibilidade celular para agentes que induzem quebras no DNA. 3 Defeito congnito provocado por uma anomalia gentica que provoca um escasso desenvolvimento cerebral, que pode provocar morte.

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predisposio ao cncer (KERZENDORFER; ODRISCOLL, 2009; POLO; JACKSON, 2011).

Os mecanismos de reparo so apontados como a essncia da defesa celular contra leses ao DNA. No existe uma via nica que neutralize todos os tipos de leses radioinduzveis; diversos mecanismos distintos podem ser executados, independentemente ou interativamente, no intuito de remover os danos no DNA (JACKSON; BARTEK, 2009; GIGLIA-MARI et al., 2011; AZIZ et al., 2012).

Leses tais como as SSBs, danos s bases nitrogenadas e ligaes cruzadas no oferecem risco excessivo integridade da cromatina. Alm disso, o reparo livre de erros pode ser realizado atravs de mecanismos mais simples, onde oligonucleotdeos (at 50 bp) so removidos e podem ser resintetizados usando a fita de DNA complementar como modelo fiel. Estes mecanismos consistem no reparo por exciso de nucleotdeos (NER nucleotide excision repair), reparo de exciso de bases (BER base excision repair) e reparo de ligaes cruzadas interfitas (ICL interstrand crosslink) (CICCIA; ELLEDGE, 2010; GIGLIA-MARI et al., 2011).

Em virtude da simplicidade de execuo do reparo livre de erros e do pouco risco estabilidade da cromatina e funo gnica, estes tipos de dano apresentam menor significncia biolgica em termos de morte celular. As DSBs, entretanto, so leses altamente citotxicas. (KINNER et al., 2008; CICCIA; ELLEDGE, 2010).

As DSBs so originadas quando h quebra das ligaes entre os acares de ambas as cadeias do DNA dentro de uma distncia de 10 a 20 bp. Esta quebra gera um risco imediato integridade da cromatina, pois sua estabilidade no consegue ser mantida pelas pontes de hidrognio nem pela estrutura da cromatina (FALK et al., 2010; MAGNANDER; ELMOROTH, 2012).

A descontinuidade fsica gerada pela introduo das DSBs tambm pe em risco a informao gentica codificada, pois como ambas as fitas de DNA so danificadas, o reparo deste tipo de dano intrinsecamente mais laborioso e propenso a erros. Em humanos, as principais vias de reparo de DSBs so a recombinao homloga (HR homologous

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recombination) e a unio de extremidades no-homlogas (NHEJ nonhomologous end joining) (KINNER et al., 2008; GRABARZ et al., 2012).

Na NHEJ, as extremidades quebradas so unidas diretamente, havendo restaurao da integridade da molcula, mas no da informao da sequncia, sendo, portanto, um mecanismo mais propenso a erros. J a HR um mecanismo livre de erros, onde o reparo do dano realizado a partir de um loco recproco presente em uma cromtide4 irm, que possui correspondncia (homologia) extensa sequncia do dano. Como a HR requer a duplicao do contedo gentico, ela ocorre tipicamente em clulas meiticas. Em clulas mitticas, a HR est restrita s fases S e G2 da diviso celular. A NHEJ pode ser executada nas clulas em repouso (quiescentes) e na fase G1 do ciclo celular, sendo considerada o mecanismo primrio de reparo das DSBs (LISBY; ROTHSTEIN, 2009; GIGLIA-MARI et al., 2011).

Frente a este cenrio, possvel destacar as DSBs como o tipo de leso ao DNA com importncia biolgica particular, inclusive em termos de radiobiologia.

2.3 Resposta celular s quebras da dupla fita do DNA (DSBs)

A resposta celular introduo de DSBs envolve circuitos moleculares sofisticados de ativao e sinalizao mobilizados por expresso de genes e modificaes de protenas que atuam na reconstituio da estrutura e informao da molcula de DNA. As leses so detectadas por molculas que reconhecem o dano e liberam sinais bioqumicos para molculas que regem os processos seguintes (KHANNA; JACKSON, 2001; ROOS; KAINA, 2012).

O sinal pode ser processado pelo sistema de reparo, que normalmente est associado a uma inibio da progresso do ciclo celular (para checagem do contedo gentico). A morte celular por apoptose pode ser acoplada a esta via no intuito de evitar ou corrigir um dano potencial; do contrrio, pode haver acmulo de mutaes, formao de aberraes cromossmicas e alteraes na proliferao celular (AZIZ et al., 2012; DAUB, 2012).

Um dos filamentos interligados, formado pela duplicao de um cromossomo

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2.3.1 Localizao do dano

A primeira etapa crtica na resposta celular ao dano dupla fita a percepo destas leses. Esta deteco realizada por sistemas sensores, que consistem no grupo de protenas ou complexos proteicos que so recrutados para o stio do dano no DNA e atuam traduzindo o dano em sinais bioqumicos para as protenas transdutoras. Estas, por sua vez, regulam a atividade dos participantes diretos dos processos de bloqueio do ciclo celular, reparo e morte celular em resposta ao dano (BELLI et al., 2002; ROSS; KAINA, 2012). As protenas quinases relacionadas fosfoinositdeo 3-quinase (PIKK phosphoinositide 3-kinase related protein kinase) so particularmente importantes nesse processo de localizao e sinalizao do dano. A propriedade particular das PIKKs em termos de especificidade de substrato a fosforilao preferencial dos resduos de aminocidos serina (S) ou treonina (T) seguido por uma glutamina (Q) [S/TQ] (SUMMERS et al., 2011; DAUB, 2012).

Os principais membros da famlia de PIKKs so as protenas quinases ataxia telangiectasia mutada (ATM ataxia telangiectasia mutated), ATR (ATM- and Rad3-related) e DNA-dependente (DNA-PKcs DNA-dependent protein kinase catalytic subunit). Destas, a que possui importncia particular na resposta celular radioinduzida a protena quinase ATM (SUMERS et al., 2011; ROSS; KAINA, 2012).

Em condies normais, a ATM encontra-se inativa, na forma de um dmero ou multmero altamente organizado que contm um domnio quinase ligado regio em torno de sua serina 1981. Em resposta irradiao, a ATM ativada por uma rpida autofosforilao desse resduo de aminocido, que leva dissociao dos dmeros e inicia atividade quinase da ATM, que passa a fosforilar uma gama muito ampla de substratos intrinsecamente relacionados com a DDR (BAKKENIST; KASTAN, 2003; MATSUOKA et al., 2007).

Os principais substratos da quinase ATM esto apresentados na Figura 5, posicionados de acordo com sua relao a processos iniciados pela introduo de DSBs, como o reconhecimento e reparo do dano ao DNA, bloqueio do ciclo celular e apoptose, nesta sequncia.

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Figura 5 Alvos da quinase ATM, relacionados ao reconhecimento e reparo do dano, bloqueio do ciclo celular e apoptose Reconhecimento do dano ao DNA/ Reparo Apoptose

Bloqueio do ciclo celular


Fonte: Wilson et al. (2004)

Alguns substratos da ATM atuam na prpria regulao da sinalizao do dano, a exemplo do complexo MRN (Mre11-Rad50-Nbs1), que combina as propriedades de 3 protenas para recrutar mais ATM para o stio do dano. A protena Mre11 (Meiotic recombination 11) apresenta atividade de endo e exonuclease; a Rad50, de ligao ao DNA; e a Nbs1 (Nijmegen breakage syndrome 1), de deslocamento do complexo para o ncleo (MATSUOKA et al., 2007; SRIVASTAVA et al., 2009). Outros substratos compreendem os denominados transdutores, que convertem os sinais da ATM e outras protenas sinalizadoras para os efetores, que atuam diretamente em mecanismos como o bloqueio do ciclo celular, reparo do DNA e apoptose, a exemplo das protenas Brca1 (Breast cancer 1, early onset), quinases dos pontos de checagem (Chk checkpoint kinases) Chk1 e Chk2, e a protena de manuteno estrutural de cromossomos 1 (SMC1 structural maintenance of chromosomes 1). Considerando estes substratos, em particular, fica claro que a resposta celular mediada pela ATM desempenha um papel fundamental na manuteno da integridade do genoma (MATSUOKA et al., 2007; DICKEY et al., 2009; SUZUKI et al., 2011).

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Quando h a localizao da ATM junto a seus substratos, na regio adjacente ao dano, formam-se estruturas microscopicamente visveis na forma de pontos discretos na cromatina, denominados focos induzidos pela radiao ionizante (IRIF ionizing radiationinduced foci). O evento chave na formao destes IRIFs a fosforilao da histona H2AX pela ATM (YAMAUCHI et al., 2008; BELYAEV, 2010).

2.3.1.1 Histona H2AX

A histona H2AX uma variante da histona H2A, e compreende de 2 a 25 % de toda histona H2A que constitui a cromatina. A estrutura da H2AX segue a da maioria das outras histonas, com um domnio central globular flanqueado por caudas N- e C-terminais, mas difere das outras espcies de H2A por apresentar uma pequena sequncia evolutivamente bem conservada de 4 resduos de aminocidos em sua cauda C-terminal, conectada por uma sequncia ligante (FERNANDEZ-CAPETILLO et al., 2004; DICKEY et al., 2009).

Em humanos, os aminocidos contidos na cauda C-terminal so a serina (S), a glutamina (Q), o glutamato (E) e a tirosina (Y), nesta ordem. Em resposta s DSBs radioinduzidas, a H2AX fosforilada rapidamente em sua serina 139 (pS139 phosphatidylserine 139), o que indica a modificao da H2AX por uma PIKK. A forma fosforilada da H2AX referida como gama-H2AX (-H2AX) (ROGAKOU et al., 1998; MATSUOKA et al., 2007; BONNER et al., 2008).

A Figura 6 apresenta um nucleossomo contendo a histona H2AX fosforilada. Na Figura, foi apresentada a sequncia SQEY da H2AX estendida a partir do ncleo proteico e ligada a ele atravs da sequncia ligante, e a fosforilao da protena em seu resduo serina.
Figura 6 Nucleossomo contendo histona H2AX, com sua sequncia serina-glutamina-glutmatotirosina (SQEY) fosforilada (P) em sua serina

Fonte: Adaptado de Bonner et al. (2008)

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A fosforilao da H2AX ocorre rapidamente cerca de segundos aps a introduo de DSBs por interao da radiao, cobrindo no s o stio do dano como grandes regies adjacentes a cada quebra. Um minuto aps o dano, obtm-se cerca de metade da quantidade mxima da -H2AX, que alcanada 9 minutos aps a irradiao e mantida por cerca de 30 minutos aps a exposio (ROGAKOU et al., 1998; BONNER et al., 2008). Durante o tempo em que encontra-se fosforilada, a -H2AX colocalizada com a ATM e seus fatores fosforilados, exercendo diversas funes na DDR. A -H2AX no constitui o sinal primrio requerido redistribuio de complexos de reparo na cromatina danificada essa funo exercida pelas PIKKs, principalmente pela ATM. Entretanto, a H2AX exerce funes secundrias relacionadas concentrao de protenas ativadas pela ATM nas adjacncias das leses do DNA (CELESTE et al., 2003; PODHORECKA et al., 2010). As principais atribuies da -H2AX a este cenrio so:

Acmulo de protenas de sinalizao e reparo nos stios de dano cromatina: a -H2AX interage com protenas fosforiladas pela ATM (e.g. complexo MRN, Mdc1, Brca1) e colocalizadas com ela no stio do dano, relocalizando essas protenas no IRIF (PAULL et al., 2000; FIRSANOV et al., 2011). O Mdc1 (mediator of DNA damage checkpoint 1), por exemplo, pode atuar recrutando e ancorando mais molculas de ATM no local da leso, e pode interagir diretamente com a -H2AX, amplificando o sinal de fosforilao dessa histona (STUCKI; JACKSON, 2006);

Amplificao do sinal e induo de pontos de checagem do ciclo celular induzidos pelo dano ao DNA: a -H2AX contribui ativao de protenas ATMfosforiladas relacionadas ao bloqueio da progresso do ciclo celular e checagem do contedo gentico durante esse bloqueio (checkpoints), como a protena p53 e a Chk2 (KOUNDRIOUKOFF et al., 2004; MATSUOKA et al., 2007; FRAGKOS et al., 2009);

Remodelao da cromatina para prevenir a dissociao de extremidades de quebra, aumentando o processamento das DSBs e a eficincia do reparo: a -

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H2AX auxilia na manuteno da proximidade entre as extremidades quebradas do DNA, atuando como uma ncora, o que aumenta a probabilidade de sucesso e fidelidade do reparo livre de erros (BASSING; ALT, 2004; XIE et al., 2004); Recrutamento de coesinas para promover o reparo por HR: este recrutamento mediado pela -H2AX e tem uma funo importante no reparo por HR por segurar a cromatina danificada prximo sua cromtide irm no-danificada (PODHORECKA et al., 2010; BAUERSCHMIDT et al., 2011).

2.3.2 Processamento da sinalizao do dano ao DNA

O sinal liberado pelo sistema sensor do dano recebido e processado por transdutores, que consistem em molculas que regulam os efetores diretos dos processos de inibio da progresso do ciclo celular, reparo do DNA ou induo da apoptose. O conjunto de transdutores inclui protenas tais como a p53, a Bcra1 e a Chk2 (BELLI et al., 2002; ROSS; KAINA, 2012).

Dentre os participantes desse processo de transduo de sinal, uma ateno particular dada protena p53. Isto porque o sinal para a transcrio dos genes relacionados a processos essenciais manuteno da integridade genmica e celular parte principalmente desta molcula (LI et al., 2011; RINN; HUARTE, 2011). Mesmo outros transdutores, a exemplo da Chk1 e Chk2, podem regular a ao da p53, indicando que o papel central da regulao dos processos subsequentes na DRR exercido por esta protena (TICH et al., 2007; ROSS; KAINA, 2012).

Devido importncia da p53 na mobilizao dos fenmenos importantes manuteno da integridade genmica e celular, atribui-se p53 a condio de guardi do genoma. Esse papel essencial da p53 confirmado pela associao entre mutaes ou delees na p53 com cerca de 50 % de todos os cnceres humanos (MENENDEZ et al., 2006; LI et al., 2011).

A protena p53 um polipeptdeo de 393 aminocidos que consiste em um domnio central, flanqueado por sequncias aminoterminal (N-terminal) e carboxiterminal (C-

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terminal). A atividade da p53 controlada pela regulao de seus nveis, localizao intracelular e funo (basicamente transcricional). A Figura 7 resume os mecanismos principais de tais regulaes, em condies normais e aps estresse radioinduzido (RILEY et al., 2008; BASSETT et al., 2008).
Figura 7 Principais mecanismos de regulao e localizao intracelular da protena p53, em condies normais e em resposta irradiao
Condies normais Aps stress radioativo

Ncleo

Citoplasma

Ncleo

Citoplasma

Ubiquitinao

Coativadores Degradao da p53

Fonte: Adaptado de Gottifredi e Prives (2001)

A regulao da protena p53 realizada principalmente pela protena minuto duplo murino 2 (Mdm2 murine doble minute 2). Em condies normais, a p53 ativa a transcrio da Mdm2 que, aps ser codificada, se liga sequncia N-terminal da p53 e bloqueia sua atividade. Enquanto ainda se encontra no ncleo da clula, a Mdm2 inicia a marcao da p53 com molculas de ubiquitina em sua poro C-terminal, visando o reconhecimento e degradao da molcula por um proteossoma. A ubiquitinao da regio C-terminal pode envolver a sequncia de sinalizao da exportao nuclear, que influencia a translocao do complexo p53-Mdm2 do citoplasma para o ncleo (OKEEFE et al., 2003; BAI; ZHU, 2006; WANG; JIANG, 2012).

J no meio intracitoplasmtico, a Mdm2 completa a degradao da p53, e em consequncia a esta regulao negativa, realizada de forma constante na clula, a vida mdia da p53 curta (6 a 20 minutos). Entretanto, em resposta ao dano radioinduzido, a quinase ATM pode fosforilar direta ou indiretamente (e.g. via Chk2) a protena p53 em sua regio Cterminal, induzindo sua dissociao da Mdm2 (GOTTIFREDI; PRIVES, 2001).

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Com a dissociao da Mdm2, h a estabilizao da sequncia C-terminal de sinalizao da localizao nuclear, que atua na translocao da p53 do citoplasma para o ncleo. Como resultado, a protena se acumula no ncleo celular e sua vida mdia da p53 passa a ser de 1 a 2 horas (CUDDIHY; BRISTOW, 2004; RILEY et al., 2008).

Quando em nveis elevados, a p53 torna-se um fator de transcrio ativo, capaz de ligar-se diretamente, por meio de seu domnio central, a sequncias especficas do DNA, localizadas prximo aos promotores de uma ampla gama de genes efetores. A maioria das mutaes da p53 associadas aos cnceres humanos, inclusive, so detectadas nessa sequncia. A p53 pode tambm se ligar a sequncias no especficas, a exemplo das DSBs, atravs do domnio de tetramerizao, situado em sua poro C-terminal (MENENDEZ et al., 2006; OKOROKOV et al., 2006; BASSETT et al., 2008).

Para otimizar a transcrio, a p53 apresenta um domnio em sua regio N-terminal, o domnio de transativao, onde fatores relacionados maquinaria de transcrio, como os coativadores, podem se ligar protena (BAI; ZHU, 2006; SHAN et al., 2012). No genoma humano, mais de 100 genes j foram identificados como alvos da p53, e essa lista constantemente incrementada (RILEY et al., 2008; PAZ et al., 2011).

Os principais alvos da transcrio iniciada pela p53 radioinduzida consistem em genes relacionados regulao negativa da progresso do ciclo celular, ao reparo de DSBs e apoptose (JEN; SHEUNG, 2005; RASHI-ELKELES et al., 2011).

2.3.2.1 Bloqueio da progresso do ciclo celular

O ciclo celular definido como a sequncia de eventos pelos quais uma clula replica seus componentes e os divide em partes iguais entre duas clulas-filhas idnticas. Esta sequncia envolve cinco fases distintas (TYSON; NOVAK, 2008; IWAMOTO et al., 2012): G0 (G gap, intervalo; fase de latncia ou quiescncia): fase em que a maquinaria de diviso celular encontra-se parcialmente inativa. Clulas diferenciadas e que no se dividem em geral so encontradas em repouso (em G0);

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G1: fase onde h o aumento da sntese de protenas, enzimas e de outras molculas, com acmulo de reservas. Clulas recm-geradas apresentam-se em G1, e clulas de diviso lenta permanecem nesta fase a maior parte de sua vida;

S (sntese): fase em que a clula duplica seu genoma e produz duas cpias de cada cromossomo;

G2: fase em que a integridade do genoma monitorada e a clula continua crescendo, preparando-se para a mitose;

M (mitose): fase em que os cromossomos duplicados alcanam sua condensao mxima, migram para polos opostos da clula e so segregados para duas clulas filhas, onde cada uma contm uma cpia completa do genoma da clula original (REYNOLDS, SCHECKER, 1995; FAVAUDON, 2000).

A progresso do ciclo celular depende essencialmente da ativao e inibio sequncial de diferentes quinases dependentes de ciclinas (cdk cyclin-dependent kinase). A atividade das cdks depende principalmente da ligao de sua ciclina associada (cuja disponibilidade controlada por fatores de transcrio) e da inativao dos dmeros de ciclina-cdk por inibidores de cdk (TYSON; NOVAK, 2008; IWAMOTO et al., 2012). Na Figura 8 possvel observar as fases do ciclo celular e os principais complexos ciclina-cdk que atuam em tais fases, com seus tempos aproximados de atividade.
Figura 8 Fases do ciclo celular (G0, G1, S, G2, M) e principais complexos ciclina/quinases dependentes de ciclina (cdk), com seus respectivos tempos de ao. Tambm so indicadas as posies dos principais pontos de checagem no ciclo
Ponto de checagem

clula quiescente, em repouso

Ciclina E cdk 2 Ciclina D Ciclina A cdk 4,6 cdk 2 Ciclina B,A cdk 1 Ponto de checagem

Ponto de checagem Fonte: Adaptado de Reynolds e Schecker (1995)

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No sentido de transmitir fielmente seu genoma para a prognie, as clulas desenvolveram mecanismos complexos de sobrevivncia celular, executados durante o ciclo celular, denominados pontos de checagem (Figura 10). Estes mecanismos consistem em vias de sinalizao da qual participam diversos genes e protenas que coordenam a progresso do ciclo celular, inibindo-o at que o problema seja resolvido, e podem acoplar vias de reparo do DNA e de morte celular (TYSON; NOVAK, 2008; IWAMOTO et al., 2012).

Os principais pontos de checagem envolvem o bloqueio da fase G1, diminuio da velocidade da fase S e bloqueio da fase G2. Considerando os eventos que ocorrem durante as fases G1, S e G2, fica claro que os pontos de checagem foram desenvolvidos pelas clulas a fim de prevenir a entrada em S com o DNA danificado (G1), evitar a perpetuao do dano durante a duplicao do DNA (S) e prevenir a segregao de cromossomos alterados que ocorre durante a mitose (G2) (BELLI et al., 2002; LUKAS et al., 2004).

Os pontos de checagem, portanto, ocorrem no intuito de monitorar o DNA e neutralizar possveis danos, de forma a garantir a transmisso fiel da informao gentica. Em decorrncia da importncia da execuo dos pontos de checagem manuteno da integridade genmica, esses mecanismos foram acoplados DDR radioinduzida (FEI; EL-DEIRY, 2003; PAWLIK; KEYOMARSI, 2004).

Os pontos de checagem induzidos pela cascata de sinalizao regulada pela ATM em resposta irradiao envolvem reguladores diferentes em cada fase. O bloqueio em G1 mediado pela p53, Mdm2 and Chk2; em S, pelo Nbs1, Brca1 e FancD2 (fanconi anemia complementation group D2); e em G2/M, pelo Bcra1 e hRad17. Destes processos, o mecanismo melhor caracterizado da resposta celular radioinduzida aquele mediado pela p53 e seus reguladores (Mdm2 e Chk2), que corresponde ao ponto de checagem que ocorre mediante o bloqueio do ciclo celular na fase G1. Alteraes no ponto de checagem em G1 podem ser suficientes para induzir um estado neoplsico (FAVAUDON, 2000; BAKKENIST; KASTAN, 2003; BRANZEI; FOIANI, 2008).

A ativao do ponto de checagem em G1 mediado pela p53 radioinduzida envolve principalmente a interao da protena p53 e o gene p21, que codifica um inibidor de cdks (CDKN1A cdk inhibitor 1A). A protena codificada por este gene, denominada p21 (devido a seu peso molecular de 21 quiloDaltons [kDa]), WAF1 (wild-type p53-activated fragment 1)

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ou CIP1 (cdk interaction protein 1), o regulador chave dos eventos que regem o bloqueio em G1 (GARTEL; TYNER, 2002; BARTEK; LUKAS, 2007).

2.3.2.1.1 Protena p21

O complexo ciclina-cdk que regula a passagem da fase G1 para a fase S do ciclo celular aquele formado entre a ciclina E e a cdk2. A expresso da ciclina E iniciada em G1, prximo ao momento do ponto de checagem e mxima na juno G1-S (FAVAUDON, 2000).

O processo de bloqueio em G1 regulado pela p21 encontra-se ilustrado resumidamente na Figura 9.


Figura 9 Mecanismos de bloqueio do ciclo celular mediado pela protena p21

P cyE cdk2

fase S
pRb E2F

p53 p21 P

X
Fonte: O autor

fase S

Quando a cdk2 se complexa sua ciclina associada, a ciclina E, ela sofre uma mudana estrutural que aumenta a acessibilidade do cofator trifosfato de adenina (ATP adenosine triphosphate), que se encontra em seu stio de ligao. Desta forma, a cdk2 torna-se uma unidade ativa e passa a fosforilar a protena do retinoblastoma (pRb), causando modificaes estruturais nesta protena que estimulam sua dissociao do fator de transcrio E2F (REYNOLDS, SCHECKER, 1995; MORRIS et al., 2000).

Em sua forma livre, o fator E2F participa da transcrio dos genes que regulam a disponibilidade da ciclina E, assim como de fatores requeridos para a fase S. Esse o

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mecanismo bsico atravs do qual o complexo ciclina E-cdk2 promove a progresso da fase G1 para a fase S do ciclo (REYNOLDS, SCHECKER, 1995; MORRIS et al., 2000).

A protena p21 um potente inibidor de cdks e atua ligando-se aos heterodmeros formados entre a cdk2 e a ciclina E, inibindo a atividade da cdk2, em seu complexo com a ciclina E, na fosforilao da pRb. Sem sua fosforilao, a pRb no sofre as alteraes conformacionais que permitem sua dissociao do fator E2F e, consequentemente, a atividade deste fator. Assim, h o bloqueio na produo de ciclina E, e outros fatores necessrios passagem fase S no so transcritos, o que resulta no bloqueio do ciclo celular em G1 (DONOVAN; SINGERLAND, 2000; ZHAO et al., 2012).

A execuo dos pontos de checagem mediante bloqueio do ciclo celular fornece tempo para a execuo de mecanismos de reparo dos danos radioinduzidos ao DNA. O sucesso do reparo influenciado por diversos fatores (e.g. complexidade da leso, eficincia da maquinaria de reparo, disponibilidade de tempo para o reparo), de modo que as clulas podem: (i) ter o dano completamente restaurado e continuar funcionando normalmente; (ii) ter o dano mal reparado ou no reparado, gerando mutao ou aberrao cromossmicas; (iii) sofrer morte celular, iniciada no intuito de eliminar as unidades (clulas) com danos (GUDKOV; KOMAROVA, 2003; LUKAS et al., 2004).

As alteraes cromossmicas produzidas nas clulas podem ter carter estvel (e.g. translocaes, inverses) e conseguir passar pela seleo negativa inicial, mas induzindo a carcinognese, manifestada pelo indivduo ou em suas geraes seguintes. Alteraes transitrias e instveis (e.g. dicntricos, microncleos) perturbam a estabilidade genmica de forma imediata, sinalizando para a execuo de diversos mecanismos que definem o destino celular (FAVAUDON, 2000; VERHEIJ, BARTELINK, 2000; GUDKOV; KOMAROVA, 2003).

A catstrofe mittica (inativao celular durante a mitose) e a senescncia (bloqueio permanente do ciclo celular) so alguns mecanismos de prenunciao da eliminao celular, como a apoptose e a necrose (VITALE et al., 2011; GALLUZZI et al., 2012). A exposio radiao pode induzir a morte celular por apoptose ou necrose, mas a necrose em geral associada exposio a altas doses. Nesse cenrio, a apoptose considerada o principal

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mecanismo envolvido na morte celular radioinduzida (VERHEIJ, BARTELINK, 2000; ELMORE, 2007; ERIKSSON; STIGBRAND, 2010).

2.3.2.2 Apoptose

As principais vias de apoptose radioinduzida esto apresentadas na Figura 10. Os principais mecanismos envolvem a regulao, mediada pela p53 radioinduzida, das vias intrnseca e extrnseca. A via intrnseca corresponde sinalizao intracelular para a apoptose produzida por eventos iniciados na mitocndria, enquanto que a via extrnseca envolve receptores transmembrana na mediao da transmisso do sinal de morte, iniciado na superfcie celular para as vias de sinalizao intracelular (VERHEIJ, BARTELINK, 2000; ELMORE, 2007).
Figura 10 Representao esquemtica das principais vias de sinalizao da apoptose radioinduzida

ceramida

Daxx MEKK SAPK/JNK

RI

Bid truncado

Citocromo c

Apoptossomo

Substratos apoptticos

Fonte: Adaptado de Hengatner (2000)

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A regulao da apoptose mediada pela p53 envolve principalmente a ativao de membros da famlia do Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), como a protena pr-apopttica Bax (Bcl2-associated X protein). A translocao da Bax para a mitocndria induz variaes na membrana interna da mitocndria (agindo de forma contrria s protenas Bcl2 e a Bcl-xL [Bcl-extra large]). e liberao do citocromo c, um pr-apopttico, para o citosol. Alm dos mecanismos p53-mediados, outros estmulos radioinduzidos, como a fosforilao direta da Bax pela ATM e espcies reativas do oxignio, podem provocar a liberao de fatores de ativao pela mitocndria (VERHEIJ, BARTELINK, 2000; CHOWDHURY et al., 2008).

No citosol, o citocromo c se liga e ativa a Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1), que por sua vez se liga procaspase iniciadora 9 e promove sua ativao. O complexo formado pelo citocromo c, Apaf-1 e procaspase 9 denominado apoptossomo (VERHEIJ, BARTELINK, 2000; KURANAGA, 2012)

Outro mecanismo de induo da apoptose via p53-radioinduzida a hiper-regulao da interao entre o ligante (CD95L) e o receptor CD95. O CD95 um receptor expresso constitutivamente, e faz parte da superfamlia de receptores do fator de necrose tumoral (TNF tumoral necrosis factor). Aps a ligao da CD96L-CD95, h a associao sequencial da molcula adaptadora FADD (Fas-activated death domain protein) com a procaspase 8, formando o complexo de sinalizao da induo de morte (DISC death-inducing signaling complex). A oligomerizao da procaspase 8 resulta em sua ativao e subsequente clivagem da protena pro-apopttica Bid (VERHEIJ, BARTELINK, 2000; PETER et al., 2007).

Um terceiro mecanismo envolve a ativao radioinduzida da via SAPK/JNK (Stressactivated protein kinase/Jun N-terminal kinase) mediada por sinais derivados da membrana, como a ceramida, e a Daxx (death-domain associated protein) regulada pela CD95; a SAPK/JNK atua na induo da apoptose regulando, dentre outros alvos, a p53 e caspases executoras (VERHEIJ, BARTELINK, 2000; KUWABARA et al., 2003).

Os reguladores centrais da apoptose consistem no grupo de proteases denominadas caspases (cysteinyl aspartate proteinases), que atuam clivando seus substratos nos resduos de aminocido aspartato. As caspases participam da cascata de eventos coordenados e altamente complexos que ligam o estmulo inicial de morte celular execuo das alteraes

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bioqumicas que culminam nas caractersticas morfolgicas e estruturais da apoptose (KUMAR, 2007; KURANAGA, 2012).

As caspases so expressas constitucionalmente na forma de precursores inativos (pr-enzimas ou zimgenos), denominados procaspases, formados por um pr-domnio Nterminal (contendo sequncias que interagem com molculas ativadoras), uma subunidade grande (contendo um stio ativo), e uma subunidade pequena C-terminal. O pr-domnio separado da subunidade grande por um stio de clivagem contendo um resduo (aminocido) de aspartato, e as subunidades grande e pequena so ligadas por um ou dois stios de clivagem do aspartato (ZIMMERMMANN et al., 2001; CHOWDHURY et al., 2008).

A Figura 11 apresenta esta estrutura bsica das procaspases, e simplifica seu mecanismo de ativao.
Figura 11 Estrutura bsica das procaspases e mecanismo de ativao
Pr-domnio Subunidade grande Subunidade pequena

Asp Procaspase 1 clivagem

2 clivagem

Associao entre duas molculas precursoras

Caspase ativa

Fonte: O autor

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A cascata de ativao das caspases comea com a interao das molculas ativadoras com as procaspases. Estas interaes so mediadas pela sequncia contida no pr-domnio Nterminal, de forma que as caspases que contm esta sequncia N-terminal longa e possuem o domnio efetor de morte ou o domnio de recrutamento de caspases, esto implicadas no incio da cascata de ativao das caspases (ZIMMERMMANN et al., 2001; CHOWDHURY et al., 2008).

As caspases que apresentam esta caracterstica so denominadas iniciadoras e compreendem as caspases 2, 8, 9 e 10. Estas caspases atuam regulando as caspases que contm um pr-domnio pequeno (20 a 30 aminocidos), que compreendem s caspases 3, 6 e 7. Para a via radioinduzida, as caspases iniciadoras importantes so a 8 e 9, e entre as caspases executoras, a caspase 3 (ZIMMERMMANN et al., 2001; CHOWDHURY et al., 2008). A presena dos resduos aspartato nos denominados stios de clivagem para maturao permite que as caspases possam se autoativar ou ser ativadas por outras caspases. Para ativao, as caspases passam por duas clivagens proteolticas, onde a primeira separa a cadeia em subunidades grande e pequena, e a segunda remove o pr-domnio N-terminal. Ao final, a caspase ativa consiste em um heterotetrmero, composto de dois heterodmeros (uma subunidade grande e uma pequena) derivado de duas molculas precursoras

(ZIMMERMMANN et al., 2001; KUMAR, 2007).

Esta cascata proteoltica, na qual uma caspase ativa outra, amplifica a via de sinalizao apopttica, em um processo que parece ser irreversvel na conduo morte celular. O ponto de convergncia entre as vias intrnseca e extrnseca consiste na caspase 3, que ativada por qualquer caspase iniciadora e, uma vez considerada a mais importante das caspases executoras, consiste em um alvo importante na investigao da apoptose radioinduzida (VERHEIJ; BARTELINK, 2000; PORTER, 2006; ELMORE, 2007).

2.3.2.2.1 Caspase 3

As caspases 3, 6 e 7 so as caspases classificadas como executoras. A caspase 3, entretanto, a caspase mais prevalente na clula; e apesar de ser auxiliada pelas caspases 6 e 7, a caspase 3 considerada a principal responsvel pela maioria dos efeitos apoptticos (PORTER; JNICK, 1999; ZIMERMMANN et al., 2001).

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Durante a apoptose, a caspase 3 ativa apresenta-se como um heterotetrmero de subunidades de 17 e 12 kDa que atua clivando centenas de substratos proteicos celulares presentes no citoplasma e no ncleo, destruindo ou modificando a funo desses substratos. Alguns substratos da caspase 3 so a gelsolina (um protena de ligao da actina), a ROCK-1 (rho-associated kinase 1, que quando ativada regula o rearranjo do citoesqueleto), e a endonuclease CAD (que em sua forma livre degrada o DNA cromossmico e causa condensao da cromatina) (PORTER, 2006; ELMORE, 2007; KURANAGA, 2012).

Como resultado destes processos bioqumicos, as clulas apoptticas passam a apresentar alteraes morfolgicas que caracterizam a ocorrncia deste evento de morte. As principais caractersticas so o arredondamento da clula, a reduo do volume celular (picnose), a condensao da cromatina (picnose nuclear), a fragmentao nuclear (cariorrxis), pouca ou nenhuma modificao estrutural de organelas citoplasmticas e a formao de vesculas na membrana plasmtica (GALLUZZI et al., 2007; KROEMER et al., 2009).

Ao final do processo apopttico, so formados pequenos corpos arredondados contendo organelas citoplasmticas intactas e/ou fragmentos do ncleo, completamente envolvidos por pores da membrana plasmtica. In vivo, estas unidades denominadas corpos apoptticos so reconhecidas atravs de ligantes na membrana por clulas fagocticas (e.g. macrfagos), que fazem a ingesto e digesto dessas estruturas sem reao inflamatria associada (GALLUZZI et al., 2007; KROEMER et al., 2009).

2.4 Investigao da DDR radioinduzida

A resposta s DSBs tem se consolidado como uma das reas de maior interesse e impacto em radiobiologia, uma vez que os efeitos deletrios e transformadores deste tipo de dano tm sido diretamente relacionados aos efeitos citotxicos e mutagnicos das radiaes. Desta forma, o estudo das bases moleculares da resposta celular radioinduzida associada introduo de DSBs consistem, atualmente, em um dos requisitos mais importantes para o desenvolvimento de novas abordagens prognsticas, diagnsticas e teraputicas em prticas humanas e mdicas envolvendo radiaes ionizantes (CHAUDHRY, 2008; RODEMMAN; WOUTERS, 2011).

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A investigao da resposta celular radioinduzida pode ser feita com base em uma infinidade de parmetros, a exemplo de alteraes na cromatina, a expresso de genes relevantes no DNA, RNA ou nveis de protenas. Alguns ensaios e modelos biolgicos j so bem estabelecidos, a exemplo da avaliao de alteraes citogenticas para fins de radioproteo. Entretanto, os atuais avanos cientficos e o advento de novas tecnologias tm agregado novas possibilidades em termos de ferramentas e parmetros celulares a serem analisados (WEST et al., 2005; PINTO et al., 2010).

As tendncias apontam as protenas como um parmetro celular interessante na investigao da DDR radioinduzida. A eliminao de DSBs envolve a organizao espaotemporal de um nmero vasto de protenas, cuja atividade cataltica depende de modificaes ps-traducionais que so revertidas quando o reparo completado. O recrutamento de numerosas protenas para o stio do dano, a redundncia funcional e as vias alternativas garantem que o reparo das DSBs seja extremamente eficiente, tanto quantitativa quanto qualitativamente (WEST et al., 2005; CICCIA; ELLEDGE, 2010; THOMPSON, 2012).

Nesse contexto, as protenas podem ser utilizadas na investigao da exposio radiao, uma vez que suas modificaes podem refletir alteraes gnicas ou pstraducionais. Em termos de investigao propriamente dita, as amostras podem ser obtidas por mtodos de coleta no-invasivos ou semi-invasivos, para abordagens em larga escala ou ensaios monoparamtricos (com uma nica protena), empregando-se tcnicas de imunodeteco, principalmente (DAINIAK et al., 2005; WEST et al., 2005; GUIPAUD, BENDERITTER, 2009).

2.4.1 Ferramentas de anlise protica

A caracterstica comum das tcnicas de imunodeteco o emprego de anticorpos que reconhecem especificamente um determinado antgeno apresentado na clula. As principais tcnicas de imunodeteco so a imunocitoqumica (ICQ), o Western Bloting (WB) e, mais recentemente, a citometria de fluxo, e cada tcnica apresenta caractersticas, vantagens e limitaes particulares (CAVALCANTI JNIOR et al., 2003).

As tcnicas em ICQ utilizam frequentemente clulas fixadas em lminas e submetidas marcao indireta. Nesse tipo de marcao, as clulas so incubadas

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primeiramente com um anticorpo primrio, o qual reconhece o antgeno celular neste caso, a protena a partir da frao varivel de sua imunoglobulina (Ig). Em seguida, as clulas so incubadas com um anticorpo secundrio, que reconhece a frao constante da Ig do anticorpo primrio. O anticorpo secundrio geralmente conjugado a uma enzima reveladora ou a um fluorocromo (imunofluorescncia); a enzima reveladora, ao ser incubada com seu substrato, permite a deteco colorimtrica associada positividade atravs de uma anlise por microscopia tica, enquanto o fluorocromo pode ser excitado com um laser e a emisso de fluorescncia o parmetro associado positividade (CAVALCANTI JNIOR et al., 2003; HOFFMAN, 2008).

A Figura 12 ilustra esquematicamente os princpios da ICQ indireta.


Figura 12 Representao esquemtica da imunocitoqumica indireta

Ac secundrio Ac primrio

Clula

Antgeno celular

Fonte: O autor

O WB alia a tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida com a ICQ. As protenas contidas em uma mistura so separadas de acordo com sua massa atravs da eletroforese em gel de poliacrilamida, e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. O substrato absorvente contendo a rplica exata da matriz do gel incubado com um anticorpo primrio e, em seguida, com um anticorpo secundrio, sendo em seguida revelado por mtodos enzimticos, de emisso de luz ou radiao. A presena de bandas corresponde positividade ao antgeno em questo (CAVALCANTI JNIOR et al., 2003; KURIEN, SCOFIELD, 2006).

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Na citometria de fluxo, clulas em suspenso so marcadas com anticorpos conjugados diretamente a fluorocromos, que so analisadas no equipamento citmetro de fluxo. Nesse equipamento, as clulas so conduzidas atravs de um fluxo de lquido isotnico de modo a serem interceptadas individualmente por um feixe de laser (MCCOY JR., 2002; CHO et al., 2010). A luz do laser espalhada frontal (FSC forward scatter) e lateralmente pela clula (SSC side scatter) e pode ser absorvida pelos fluorocromos, resultando na emisso de fluorescncia (FL) por parte destas molculas (BROWN; WITTWER, 2000; MCCOY JR., 2002).

Os sinais de disperso e fluorescncia so coletados por um conjunto de lentes, espelhos e filtros ticos e direcionados para tubos fotomultiplicadores, onde cada fluorescncia amplificada e convertida em sinais eletrnicos. A informao final digitalizada e visualizada em grficos (HERZENBERG et al., 2006; LUGLI et al., 2010).

A Figura 13 apresenta a representao esquemtica do sistema primrio dos citmetros de fluxo.


Figura 13 Representao esquemtica do sistema primrio de um citmetro de fluxo
Filtros ticos Sistema eletrnico e computacional

Sistema de fluxo

Detectores Lentes coletoras Fonte do laser

Fonte: Adaptado de <http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html>

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Os parmetros de FSC e SCC so proporcionais ao tamanho e complexidade da clula, respectivamente, permitindo a distino de diferentes populaes celulares. Os parmetros de FL permitem a anlise da reao antgeno-anticorpo, ou mesmo da fluorescncia diretamente associada a uma molcula, a exemplo do iodeto de propdio (BROWN; WITTWER, 2000; MCCOY JR., 2002).

A Tabela 1 apresenta as principais caractersticas da ICQ, WB e citometria de fluxo.


Tabela 1 Principais caractersticas da imunocitoqumica, citometria de fluxo e Western Blot Parmetros Mtodo Tempo de realizao Tcnica N de amostras Reao imunolgica Localizao da protena na clula Quantificao gnica Correlao expressomorfologia celular Correlao expresso-fenmeno celular N de clulas avaliadas Anlise dos dados Preciso Reprodutibilidade Sensibilidade Especificidade Resoluo Imunocitoqumica Altenativo/ complementar Horas Manual Reduzido Direto/Indireto Sim No Sim Sim 102-103 Positivo/Negativo Subjetividade Baixa Baixa Baixa Baixa Western Blot Padro Dias Manual Reduzido Indireto No Sim No No 105-106 Positivo/Negativo Objetividade Baixa Alta Alta Alta Citometria de fluxo Padro Minutos Semi-automatizada Elevado Direto No Sim Sim Sim 105-106 Multiparamtrica Objetividade Alta Alta Alta Alta

Fonte: McCoy Jr. (2002), Cavalcanti Jnior et al. (2003), Bonner et al. (2008) e Fritschy (2008)

Analisando-se as propriedades listadas na Tabela 1, fica claro que a tecnologia da citometria de fluxo agrega vantagens nicas em relao aos outros mtodos que podem ser empregados na anlise de protenas. Este mtodo alia praticidade, rapidez e preciso, alm de permitir a anlise e quantificao de vrias protenas a partir de uma nica amostra (CAVALCANTI JNIOR et al., 2003; NOLAN; YANG, 2007).

interessante, portanto, investigar o emprego da citometria de fluxo na avaliao da resposta ao dano radioinduzido. A anlise realizada no presente trabalho visou empregar esta feramenta para a anlise de trs protenas, relevantes regulao do processo de DDR em nveis diferentes: a -H2AX, essencial na localizao da leso (GREENBER, 2011); a p21,

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que atua no bloqueio do ciclo celular em G1 (WANG et al., 2011); e a caspase 3, executora da apoptose (TRISCCIUOGLIO; BIANCHI, 2009).

Como modelo biolgico, foram escolhidas as clulas mononucleares do sangue perifrico, que consiste predominantemente de linfcitos. Alguns ensaios de anlise da DDR radioinduzida j so bem estabelecidos com linfcitos humanos perifricos, a exemplo da anlise de aberraes cromossmicas instveis. Outras propostas empregando este mesmo modelo biolgico apresentam grande potencial na compreenso da resposta celular radioinduzida e como mtodos in vitro de estimao da dose ou de radiossensibilidade individual, empregando anlises genticas ou de protenas (CAVALCANTI et al., 2008; SCHNARR et al., 2007; PINTO et al., 2010; IAEA, 2011).

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3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar a expresso das protenas gama-H2AX, p21 e caspase 3 por citometria de fluxo em linfcitos perifricos humanos irradiados in vitro.

3 .2 Objetivos especficos Analisar a expresso das protenas gama-H2AX, p21 e caspase 3 aps exposio a diferentes doses de radiao, tempos ps-exposio e condies de cultura (estmulo com fitohemaglutinina); Avaliar a melhor condio de ensaio para anlise das protenas de interesse; Avaliar o potencial das protenas analisadas como bioindicadores de exposio radiao ionizante.

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4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 Perfil do estudo

O estudo prospectivo e experimental envolveu 10 indivduos, voluntrios, adultos e sadios. Amostras de sangue perifrico foram coletadas destes indivduos e submetidas irradiao in vitro, em fonte de cobalto-60, com doses de 1; 2 e 4 grays (Gy), sendo mantido um controle no irradiado. As clulas mononucleares foram isoladas e analisadas ex vivo e aps cultivo durante 24, 48 e 72 horas, com e sem estmulo proliferativo com fitohemaglutinina. As clulas foram marcadas com anticorpos anti-gama H2AX, anti-p21 e anti-caspase 3 ativa, conjugados a fluorocromos, e as expresses das protenas foram analisadas por citometria de fluxo, mensurada em termos percentuais., focando na populao linfocitria.

4.2 Aspectos ticos

Por se tratar de um estudo conduzido em modelo humano, o projeto desta pesquisa foi submetido ao Comit de tica em Pesquisa envolvendo Seres Humanos do Centro de Cincias da Sade da Universidade Federal de Pernambuco (CEP/CCS/UFPE). O presente estudo faz parte do macroprojeto intitulado Estudo de bioindicadores moleculares na determinao da radiosensibilidade individual, aprovado sob nmero de processo 297/09 (ANEXO A).

Apenas indivduos adultos e no vulnerveis foram includos na pesquisa. Seguindo as orientaes do CEP, os candidatos foram orientados de forma clara sobre a proposta do estudo e, mediante concordncia com os procedimentos a serem realizados, assinaram voluntariamente o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) (APNDICE A). Mediante a assinatura do TCLE, os indivduos oficializaram sua incluso no estudo, autorizando a coleta do material biolgico e facultando o uso das informaes biolgicas para fins cientficos (incluindo sua publicao). Os dados pessoais fornecidos foram mantidos sob confidencialidade.

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4.3 Seleo dos participantes e casustica

No momento em que foram orientados sobre a proposta do estudo, os voluntrios preencheram um questionrio (ver APNDICE B) onde forneceram informaes sobre dados pessoais, hbitos (lcool, fumo), histria clnica (doenas comuns5, neoplasias malignas, uso de medicamentos) e exposio ocupacional, mdica ou ambiental a produtos de elevada toxicidade (e.g. agrotxicos, quimioterpicos) ou radiaes ionizantes.

Com base nas informaes prestadas, foram includos no estudo indivduos:

Relatando ausncia de sintomas indicativos de doena, com ou sem diagnstico mdico, principalmente de neoplasias (BOYLE; LEVIN, 2008) e agentes infecciosos (PAGANO et al., 2004), principalmente virais (DAYARAM; MARRIOTT, 2008; MCLAUGHLIN-DRUBIN; MUNGER, 2008), que podem alterar a integridade genmica e processos de proliferao, diferenciao e morte celular;

Que no se encontravam sob tratamento medicamentoso, tendo em vista que algumas classes de antibiticos e quimioterpicos apresentam efeito

radioprotetor ou radiossensibilizador, influenciando at mesmo o processo de reparo de danos radioinduzidos (WARDMAN, 2007; KIM et al., 2009; MAH et al., 2011);

Que no tivessem ingerido bebida alcolica em at 24 horas antes da coleta. Segundo estudos de Monobe e colaboradores (MONOBE; ANDO, 2002; MONOBE et al., 2004), para este tempo, a cerveja possui efeito radioprotetor. Na ausncia de informaes sobre outras classes de bebidas alcolicas, optou-se por desconsiderar a ingesto de qualquer tipo de bebida, alm da cerveja;

Que estivessem a pelo menos 3 meses sem realizar quaisquer procedimentos diagnstico ou teraputico envolvendo radiaes ionizantes, para evitar interferncias da radioexposio nos resultados. Este perodo corresponde ao

Causadas por vrus, bactrias, protozorios

51

tempo de vida mdio estimado para eliminao de alteraes cromossmicas instveis em linfcitos, para exposies envolvendo as doses utilizadas na presente pesquisa (RAMALHO et al., 1995; PINTO et al., 2010).

Os critrios de excluso do estudo foram:

Necessidade do indivduo de retirar seu consentimento, por quaisquer motivos e a qualquer tempo, at a concluso do trabalho;

Ocorrncia de problemas logsticos ou materiais que impossibilitassem o desenrolar do experimento;

Negativa do voluntrio em fornecer novamente seu material biolgico quando da inviabilidade da amostra ou ocorrncia dos problemas acima.

Aplicando-se os critrios de incluso e excluso, o estudo foi conduzido com 10 indivduos, com idades entre 19 e 44 anos (mdia: 28,8 anos), sendo 6 mulheres e 4 homens.

4.4 Obteno do material biolgico

A coleta do material biolgico foi realizada no Laboratrio de Modelagem e Biodosimetria Aplicada do Departamento de Energia Nuclear da UFPE (LAMBDA DEN/UFPE).

Cada voluntrio forneceu uma amostra de sangue perifrico venoso, coletada seguindo as recomendaes da Sociedade Brasileira de Patologia Clnica/Medicina Laboratorial (SBPC/ML, 2010). A amostra foi obtida atravs de puno venosa no brao, utilizando sistema a vcuo estril, com adaptador, agulha de 22G x 1 (BD) e tubo a vcuo de 9 mL contendo heparina sdica (Vacuette, Greiner BioOne). Foi coletado um total de 36 mL (quatro tubos de 9 mL), distribudos em uma alquota de 18 mL e 3 alquotas de 6 mL, onde estas ltimas foram destinadas irradiao.

A escolha pela heparina deve-se ao fato deste anticoagulante ser o mais recomendado nas anlises de linfcitos por citometria de fluxo a partir de amostras processadas

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imediatamente e submetidas ao procedimento de separao celular (neste caso, minimiza a contaminao da camada de clulas mononucleares com clulas vermelhas e granulcitos) (CARTER et al., 1992; NICHOLSON et al., 1993).

As alquotas foram identificadas com as iniciais do voluntrio e imediatamente encaminhadas para o local da irradiao. O transporte foi feito temperatura ambiente, em recipiente de isopor, onde as amostras foram protegidas de choque e vazamentos (SBPC/ML, 2010).

4.5 Irradiao

A irradiao das amostras foi realizada no Laboratrio de Metrologia das Radiaes Ionizantes (LMRI DEN/UFPE), em irradiador gama com fonte de cobalto-60 (Radionics Laboratory, USA) com taxa de dose mdia para as irradiaes de 3,7 Gy/hora.

Uma alquota no foi irradiada, para servir como controle negativo para a condio de exposio radiao. As demais alquotas foram posicionadas, uma por vez, no centro da cmara de irradiao do equipamento, e irradiadas com doses de 1; 2 e 4 Gy.

A escolha destas doses foi baseada em outros trabalhos realizados no LAMBDA envolvendo a anlise de protenas em resposta irradiao (CAVALCANTI et al., 2003; CAVALCANTI et al., 2011; SILVA; 2011). Trata-se de doses de relevncia teraputica, em que 2 Gy consiste na dose padro em protocolos convencionais de radioterapia (fracionamento), e as doses de 1 e 4 Gy (que consistem em e 2x a dose padro), em variaes deste regime, administradas no intuito de preservar os tecidos normais ou superar a repopulao tumoral, respectivamente (BERNIER et al., 2004; MARCU, 2010).

Aps a irradiao, o conjunto de amostras foi imediatamente encaminhado de volta ao LAMBDA, onde foram iniciados os procedimentos de separao celular, cultivo de linfcitos, marcao e anlise das protenas por citometria de fluxo. Esta manipulao imediata garante a minimizao de alteraes nos linfcitos em termos de viabilidade e resposta blastognica fitohemaglutinina (KAPLAN et al., 1982).

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4.6 Separao celular

Os linfcitos foram isolados a partir das amostras de sangue perifrico humano atravs da separao celular por gradiente de densidade com Ficoll. O Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) uma soluo aquosa de densidade de 1,077 g/mL que permite a purificao de linfcitos com alta taxa de rendimento e viabilidade6 atravs de um procedimento simples e rpido de centrifugao.

Seguindo as recomendaes do fabricante do Ficoll, o sangue foi diludo em soluo salina tamponada com fosfato (PBS phosphate-buffered saline, pH 7,2-7,4), na proporo 1:1 (v/v). Em tubos plsticos de polipropileno para centrifugao, com fundo cnico e capacidade para 15 mL, o sangue diludo foi depositado pelas paredes do tubo, vagarosamente, sobre uma fase de Ficoll, na proporo 3:1, evitando-se mistura. Os tubos foram ento centrifugados a 400 x g durante 35 minutos, temperatura ambiente.

Aps a centrifugao, os componentes sanguneos foram separados de acordo com sua densidade e em relao ao Ficoll. Nessa separao, as clulas mononucleares do sangue perifrico (PBMCs peripheral blood mononuclear cells), que compreendem os linfcitos e moncitos, formam uma fina camada que se dispe na interface entre o Ficoll e o plasma.

A camada de PBMCs foi resgatada com uso de pipeta Pasteur e transferida para outro tubo de centrifugao. Para remoo de resduos de Ficoll e plasma (que contaminam a suspenso com granulcitos e excesso de plaquetas, respectivamente), as clulas foram ressuspensas em PBS, a uma proporo PBS: amostra de 3:1. A Figura 14 ilustra a disposio sangue-ficoll antes (a) e aps (b) a centrifugao, e com a separao das PBMCs, diludas em PBS (c) para realizao de lavagens.

Obtm-se uma preparao com: 90 % de viabilidade; 95 5 % de clulas mononucleares; 60 20 % dos linfcitos contidos na amostra original; 3 2 % de granulcitos; 5 2 % de eritrcitos e < 0,5 % das plaquetas contidas na amostra original

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Figura 14 Separao celular utilizando Ficoll. Em (a), sangue diludo disposto sobre soluo de Ficoll; em (b), disposio dos componentes sanguneos aps centrifugao; em (c) camada de clulas mononucleares do sangue perifrico (PBMCs) resgatada e diluda em soluo salina tamponada com fosfatos (PBS)

(a)

(b)

(c)

Sangue

Plasma PBMCs Ficoll

PBMCs + PBS

Ficoll Eritrcitos e granulcitos

Fonte: O autor

Aps adio do PBS, a amostra foi ressuspendida vrias vezes com o auxlio da pipeta, e os tubos foram centrifugados a 250 x g por 10 minutos. Aps descarte do sobrenadante, o precipitado foi desfeito sob agitao, e este procedimento de lavagem foi repetido mais uma vez.

Em seguida, as clulas foram ressuspendidas em 1 mL de meio suplementado, que corresponde ao meio de cultura RPMI-16407 contendo hepes (tampo orgnico), 300 mg/mL de L-glutamina (aminocido nutriente), 50 mg/L de sulfato de gentamicina e 2 mg/L de anfotericina B (antibiticos) (Cultilab), suplementado com 10 % de soro bovino fetal (SBF) estril e inativado (Cultilab). O meio de cultura RPMI-1640 promove um crescimento mais rpido das culturas de linfcitos, e a suplementao a 10 % garante a boa viabilidade destas culturas, inclusive sob condies de estmulo com mitgenos (MOORE et al., 1967; IAEA, 2011).

4.7 Anlise da viabilidade e ajuste da concentrao celular

Para determinar a viabilidade celular antes do emprego das clulas, foi realizado o ensaio com o corante vital azul de trypan. Trata-se de um mtodo de avaliao rpido e

RPMI: acrnimo de Roswell Park Memorial Institute, instituio onde Moore et al. (1967) desenvolveram este meio de cultura

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simples, no qual clulas que perderam a integridade da membrana (no-viveis) so coradas com o azul de trypan, enquanto as clulas viveis no so coradas, apresentando apenas um anel refrativo em torno de si. As clulas viveis e no-viveis so contadas manualmente em hemocitmetro, utilizando um microscpio tico (LONGO-SORBELLO et al., 2006; JURII; BUMBAIREVI, 2008).

Em um eppendorf contendo 90 L de soluo de azul de trypan a 0,4 % (Sigma), foram acrescentados 10 L da suspenso celular. Aps homogeneizao, cerca de 10 L da mistura foram depositados na cmara de contagem de um hemocitmetro tipo cmara de Neubauer. As lminas foram analisadas por microscopia tica de campo claro, sendo contabilizados os linfcitos viveis e no-viveis situados nos quadrantes maiores, localizados nas extremidades da grade da cmara (para maiores detalhes, ver APNDICE C).

Os valores obtidos nas contagens foram utilizados nas estimativas da viabilidade celular e da concentrao celular, cujas frmulas esto detalhadas no APNDICE C. As amostras foram consideradas adequadas para o experimento quando a viabilidade foi igual ou maior que 95 %, e a concentrao da suspenso celular foi ajustada para um valor final de 2 x 106 clulas/mL (frmula para ajuste tambm consta no APNDICE C).

A expresso de protenas foi analisada ex vivo e aps cultivo celular durante os tempos de 24, 48 e 72 horas. Para as anlises ex vivo, a suspenso celular foi processada diretamente para citometria de fluxo (ver procedimentos a partir de 4.9 Citometria de fluxo). Para os demais tempos, as clulas foram submetidas a cultivo celular, totalmente realizado em condies estreis (reagentes e materiais estreis ou descartveis, manipulados em cabine de fluxo laminar).

4.8 Cultivo celular

As suspenses celulares foram cultivadas em placas de cultura de fundo chato contendo 96 poos (TPP). Como a capacidade das clulas removerem o dano ao DNA pode estar relacionada com a atividade proliferativa (MAYERA et al., 2002), foram avaliadas clulas quiescentes e em diviso, induzida atravs do estmulo com fitohemaglutinina (PHA phytohemaglutinnin).

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Para cada tempo, foi utilizada uma placa, dispondo as clulas e reagentes de acordo com o esquema ilustrado na Figura 15.
Figura 15 Esquema do cultivo celular em placas de 96 poos, para cada tempo de cultura 1 A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Fonte: O autor 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H

Sem PHA Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Com PHA Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

PHA: fitohemaglutinina

Em cada poo, foram depositados 100 L da suspenso final ajustada (2 x 105 clulas) mais 100 L de meio RPMI suplementado, com ou sem fitohemaglutinina (PHA) a 20 g/mL (concentrao final: 10 g/mL). Em ensaio com timidina triciada realizado em pesquisas prvias no LAMBDA, verificou-se que esta concentrao de PHA tima para a proliferao e no txica para os linfcitos.

As placas foram incubadas durante 24, 48 e 72 horas a 37 C sob atmosfera umidificada, a 5 % de CO2. Tal temperatura requerida para crescimento timo de culturas linfocitrias, e tal concentrao de CO2, manuteno do pH do meio (IAEA, 2011; ATCC, 2012).

4.9 Citometria de fluxo

4.9.1 Protocolo de marcao intracelular direta

As suspenses celulares (ex vivo ou in vitro) foram transferidas para tubos de ensaio apropriados para citometria de fluxo8, onde em cada tubo foram reunidas 6 x 105 clulas (para as placas, foram reunidos 3 poos). Cada tubo foi identificado com as iniciais do indivduo,

Tubos plsticos de poliestireno, de fundo redondo

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tempo de cultura, condio de estmulo (PHA), dose de radiao e anticorpos a serem recebidos.

Para a marcao das protenas intracelulares em questo, foram utilizados anticorpos conjugados diretamente a fluorocromos. O protocolo de marcao adotado foi aquele recomendado pelo fabricante da caspase-3 (BD). Em experimentos prvios, o protocolo mostrou-se adequado tambm para marcao das demais protenas a serem analisadas (p21 e -H2AX).

As clulas foram centrifugadas a 300 x g durante 5 minutos. Aps a centrifugao, o sobrenadante foi descartado e o precipitado, desfeito sob agitao. Para eliminar qualquer resduo do meio de cultura, as clulas foram lavadas duas vezes com PBS. Em cada lavagem, foram acrescentados 2 mL de PBS gelado (4 C) por tubo e as clulas foram centrifugadas a 300 x g por 5 minutos, descartando-se o sobrenadante e em seguida desfazendo-se o pellet por agitao.

A marcao intracelular requer a permeabilizao da membrana celular, mas para que os antgenos-alvo permaneam dentro da clula, necessria uma fixao prvia. As clulas foram ressuspensas em 300 L9 de soluo tampo contendo paraformaldedo a 4 % e saponina a 0,1 % (Cytofix/Cytoperm, BD), sendo incubadas durante 20 minutos em gelo. Para remover esta soluo, as clulas foram centrifugadas a 400 x g durante 5 minutos, descartando-se o sobrenadante.

Para retirar o excesso deste fixador/permeabilizante e permeabilizar a membrana celular, o pellet foi desfeito e as clulas foram lavadas com tampo de permeabilizao e lavagem 1X (Perm/Wash, BD), uma soluo que contm um agente permeabilizante (saponina) e um inibidor de marcaes inespecficas (SBF). Foram realizadas duas lavagens, nas quais as clulas receberam 300 L9 deste tampo e, aps homogeneizao, os tubos foram centrifugados a 400 x g durante 5 minutos, com descarte do sobrenadante.

Como a permeabilizao mediada pela saponina um processo reversvel, as clulas precisam ser mantidas na presena de saponina durante a colorao intracelular. Para isso, o

Para uma concentrao de 1 x 106 cls./500 L

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pellet celular foi ressuspendido em 100 L do mesmo tampo de permeabilizao e lavagem 1X e os anticorpos monoclonais foram adicionados.

A configurao experimental para a marcao encontra-se detalhada na Tabela 2.

Tabela 2 Configurao experimental para a marcao com anticorpos

Tubo 1 2 3 4 5

Anticorpo 1 Anticorpo 2 Volume/teste10 Controles (apenas clulas no-irradiadas) CD4-FITC* CD8-PE* 5 l/ 5 l $ IgG1-AF488 IgG1-PE* 5 l/ 6 l IgG-PE* 5 l Protenas (clulas no irradiadas e irradiadas com 1, 2 e 4 Gy) Anti-H2AX (pS139)-AF488* Anti-p21 (WAF1)-PE# 5 L/ 6 L Anti-caspase 3 ativa-PE* 12 L

AF488: Alexa Fluor 488; FITC (fluorescein isothiocyanate): isotiocianato de fluorescena; Gy: gray; IgG: imunoglobulina G; PE (phycoerythrin): ficoeritrina; pS: fosfatidilserina; WAF1 (Wild-type p53-activated Fragment): fragmento 1 ativado pela p53 selvagem; l: microlitros Fabricantes: *BD; $Invitrogen; #FK Biotec Fonte: O autor

Aps a adio dos anticorpos, as clulas foram incubadas por 30 minutos temperatura ambiente, ao abrigo da luz. O excesso de anticorpos foi retirado atravs de uma lavagem com 1 mL do tampo de permeabilizao e lavagem, com centrifugao a 400 x g por 5 minutos e descarte do sobrenadante. O pellet final foi ressuspenso em 500 L deste mesmo tampo.

As clulas foram mantidas em geladeira (4 C) e ao abrigo da luz at sua leitura em citmetro de fluxo, realizada em at 48 horas (mximo) aps a finalizao da marcao.

4.9.2 Aquisio dos dados

As leituras das amostras foram realizadas em citmetro de fluxo modelo Gallios (Beckman Coulter), pertencente ao LAMBDA (DEN/UFPE), utilizando o software Gallios (Beckman Coulter).

10

Seguindo recomendaes do fabricante para a quantidade de clulas a ser marcada

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A aquisio foi realizada utilizando o laser argnio do citmetro, que emite luz com comprimento de onda () de 488 nm (azul), que excita os fluorocromos utilizados neste ensaio (AF488 = FITC: excitao/emisso = 495 nm/519 nm; PE: excitao/emisso = 566 nm/576 nm). Na leitura de cada amostra (tubo), foram adquiridos 50.000 eventos (clulas).

O tubo 1 (cls. controle, CD4-FITC/CD8-PE) foi utilizado no ajuste dos detectores de voltagem e ganho dos sinais de disperso do laser (FSC e SCC) e de fluorescncia (FL1 e FL2), antes da leitura das amostras de anlise.

Um grfico biparamtrico, do tipo densidade de pontos, foi utilizado para visualizao da populao celular de interesse. Os parmetros de FSC e SSC foram dispostos respectivamente nos eixos x e y do grfico, em escala linear, e os eventos foram analisados em termos de tamanho e complexidade celular.

Ajustes foram realizados para o devido posicionamento das populaes celulares de acordo com suas caractersticas. Em seguida, os restos celulares (debris) foram eliminados da anlise atravs do ajuste do discriminador (limiar eletrnico). Os eventos correspondentes aos linfcitos foram delimitados atravs do recurso grfico das gates" (janelas). Para a quantificao das clulas, um resumo estatstico dos eventos apresentados foi obtido.

A Figura 16 apresenta um exemplo de grfico FSCxSSC correspondente aquisio de uma amostra analisada ex vivo, aps os devidos ajustes, assim como seus dados estatsticos.
Figura 16 Grfico biparamtrico de densidade para anlise de tamanho e granulosidade (FSCxSSC)

Fonte: O autor

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A partir das clulas apresentadas no grfico FSC x SSC e contidas no interior da gate, foram realizados os ajustes e anlises das fluorescncias, adquiridas em escala logartmica. O ajuste prvio dos detectores de fluorescncias foi realizado a partir do tubo 1, utilizando grficos bidimensionais FL1 x FL2. A anlise da intensidade de fluorescncia dos anticorpos de interesse (-H2AX, p21 e caspase 3 ativa) foi realizada em grficos monoparamtricos (histograma). Nos histogramas, cada fluorescncia foi visualizada no eixo x em relao ao nmero de clulas no eixo y.

O tubo 1 foi marcado com anticorpos que reconheciam subpopulaes distintas (linfcitos CD4 e CD8) presentes na populao a ser analisada (delimitada na gate), permitindo a deteco da positividade das fluorescncias FL1 e FL2 sem sobreposio (dupla marcao), uma vez que os linfcitos ou so CD4 (FITC) ou so CD8 (PE). As configuraes do detector FL1 foram ajustadas com FITC, devido s suas similaridades em termos de excitao/emisso com a AF488 (que marca um dos anticorpos de interesse).

A princpio, foi realizado o devido posicionamento dos eventos nos canais negativos e positivos de cada fluorescncia. Em seguida, foram realizados ajustes na compensao11, uma vez que os espectros de emisso de FL1 e FL2 se sobrepem.

Uma vez ajustados todos os parmetros, foi procedida a leitura dos tubos contendo os controles isotpicos, seguidas das leituras do tubo marcado com as protenas s quais correspondem (ou seja, tubo 2 - tubo 4; tubo 3 - tubo 5).

4.9.3 Anlise dos dados

A anlise dos dados foi realizada tambm no citmetro de fluxo Gallios, pertencente ao LAMBDA. O Kaluza (verso 1.0, Beckman Coulter) foi o software empregado nas anlises.

Os resultados de positividade da fluorescncia (e, portanto, ao anticorpo de interesse) foram expressos em valores percentuais. Os valores de expresso isotipos correspondem s ligaes inespecficas e foram subtrados dos valores de expresso das protenas.
11

Processo que corrige a sobreposio da emisso de uma fluorescncia para o detector projetado para coletar a emisso de outra fluorescncia

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4.10 Anlise estatstica e apresentao dos dados

Para a anlise estatstica, foi utilizado o programa Biostat (verso 5.3, Instituto Miramau). Foi realizada uma estatstica descritiva dos dados, analisando-se os valores de expresso da protena, para cada dose, em termos de mdia dos 10 indivduos analisados.

As diferenas entre as mdias foram analisadas atravs da anlise da varincia (ANOVA) one-way e, sendo as varincias desiguais, foi aplicado o teste t de Student. Para interpretao da verdade cientfica, diferenas estatisticamente significantes foram aceitas para valores de p de significncia iguais ou menores que 0,05 (p 0,05).

Os valores indicados nos grficos, para cada dose, apresentam a mdia ( ) e seus respectivos desvios padro (DP).

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5 RESULTADOS E DISCUSSO 5.1 -H2AX 5.1.1 -H2AX resultados

A Figura 17 mostra a expresso da histona H2AX fosforilada em amostras controle e irradiadas, processadas imediatamente aps a irradiao (anlises ex vivo).
Figura 17 Expresso da histona -H2AX (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, para as anlises ex vivo. Para cada grupo, n = 10. Os colchetes invertidos relacionam estatisticamente os grupos localizados abaixo de suas extremidades. *** *** *** **** ****
* p 0,05 ** p 0,01 *** p 0,001 **** p 0,0001

****

A Tabela 3 apresenta os valores a que se referem os dados ilustrados na Figura 17 sobre expresso da -H2AX nas anlises ex vivo:
Tabela 3 Expresso da -H2AX nas anlises ex vivo

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) DP 5,52 9,35 49,57 28,18 72,94 19,03 86,55 12,94

Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

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A anlise estatstica dos dados da anlise ex vivo revelou o aumento significante da expresso da -H2AX nos grupos irradiados em relao ao grupo controle, para todas as doses avaliadas 1; 2 e 4 Gy (p < 0,0001). Entre as doses, foi identificada diferena significante (p < 0,001) entre o grupo irradiado com 1 Gy em relao s doses de 2 e 4 Gy, e entre os grupos irradiados com 2 e 4 Gy (p < 0,05).

Analisando-se os valores dos desvios padro, possvel inferir sobre uma variao heterognea das amostras em relao mdia dos grupos. No grfico ilustrado na Figura 18, possvel visualizar esta variao interindividual na magnitude da expresso radioinduzida entre os indivduos; contudo, em todos os casos a expresso da -H2AX aumenta de nveis basais (que variaram de 0 a 24,09 %) para nveis elevados (variando de 63,65 a 98,26 %) com o incremento da dose.
Figura 18 Valores individuais (n = 10) de expresso da histona -H2AX nos grupos controle e irradiados, para as anlises ex vivo

A Figura 19 ilustra os grficos da expresso da -H2AX nas clulas cultivadas durante 24 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA).

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Figura 19 Expresso da histona -H2AX (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo celular de 24 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10. Os colchetes invertido relaciona estatisticamente os grupos localizados abaixo de suas extremidades.

24 horas, PHA-

24 horas, PHA+

* *

* p 0,05. significante

Os valores da expresso mdia da histona -H2AX para as amostras cultivadas durante 24 horas aps a irradiao foram os seguintes:
Tabela 4 Expresso da -H2AX para a cultura de 24 horas

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 10,83 10,82 8,53 8,31 9,8 5,69 8,62 5,58 16,15 10,41 10,60 8,38 23,16 11,67 13,79 11,46

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

Para as clulas cultivadas durante 24 horas sem estmulo com PHA, diferenas significantes (p < 0,05) foram mantidas entre os grupos controle e irradiados com 4 Gy, e entre os grupos irradiados com 1 e 4 Gy. Nas clulas cultivadas em presena de PHA, no foram observadas diferenas significantes.

Comparando-se os grupos irradiados das anlises ex vivo e aps cultura de 24 horas, foi possvel observar uma reduo significante (p < 0,001) dos nveis mdios de expresso da

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-H2AX, para todas as doses analisadas, em ambas as condies experimentais (com e sem PHA). A Figura 20 ilustra os resultados da expresso da -H2AX para o tempo de cultivo de 48 horas.
Figura 20 Expresso da histona -H2AX (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, cultivados durante 48 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10.

48 horas, PHA-

48 horas, PHA+

* p 0,05. significante

Os valores mdios de expresso da -H2AX para as amostras cultivadas durante 48 horas aps a irradiao so apresentados na Tabela 5.
Tabela 5 Expresso da -H2AX para as culturas celulares de 48 horas

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 8,28 6,04 12,71 8,64 11,91 3,61 13,45 8,52 15,09 4,54 14,65 8,64 14,76 6,13 16,9 9,52

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

Para esse tempo, diferenas significantes (p < 0,05) foram observadas apenas nas amostras cultivadas sem estmulo, entre os grupos controle e irradiados com 2 e 4 Gy. Sob

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ao da PHA, mantendo o comportamento observado aps 24 horas, no foram observadas diferenas estatisticamente significantes entre os grupos. A Figura 21 ilustra os resultados da expresso mdia da -H2AX nas amostras cultivadas durante 72 horas.
Figura 21 Expresso da histona -H2AX (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo durante 72 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10.

72 horas, PHA-

72 horas, PHA+

* p 0,05. significante

Os valores mdios de expresso da -H2AX para os grupos graficamente apresentados acima so apresentados na Tabela 6.
Tabela 6 Expresso da -H2AX para as culturas celulares de 72 horas

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 8,66 7,9 21,08 13,28 11,36 9,53 23,83 14,49 11,46 7,7 26,32 14,33 10,01 7,51 26,2 14,13

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

Para o tempo de 72 horas, as diferenas estatisticamente significantes detectadas entre alguns grupos, para os tempos de 24 horas e 48 horas, no foram mais observveis nos cultivos sem PHA. Mantendo o comportamento das amostras estimuladas com PHA durante

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os tempos menores de cultivo, para 72 horas tambm no foram observadas diferenas na expresso radioinduzida da -H2AX entre os grupos. Para o tempo de 72 horas, o estmulo com PHA altera os nveis de -H2AX, tanto para o grupo controle quanto para os grupos irradiados. Comparando-se os experimentos cultivados sem PHA em relao aos cultivados com este estmulo com o mitgeno, foi observado um aumento significante (p < 0,05) da expresso basal da -H2AX, para todas as doses analisadas. 5.1.2 -H2AX discusso

Os dados do presente trabalho mostram que, para anlises realizadas ex vivo, possvel detectar um aumento da expresso da -H2AX induzido pela exposio radiao, em um comportamento dose-dependente (quanto maior a dose, maior a expresso da H2AX). A anlise das amostras irradiados em relao ao seu prprio controle revela uma tendncia no aumento da expresso da -H2AX com o incremento da dose, para todos os indivduos analisados.

Os dados indicam, portanto, que a anlise de expresso da forma fosforilada da H2AX poderia ser empregue na investigao de exposies a altas doses de radiao, pelo menos para o intervalo de dose aqui analisado (de 1 a 4 Gy). Hamasaki e colaboradores (2007), analisando a expresso da -H2AX em linfcitos por citometria de fluxo, 6 horas aps irradiao com 4 Gy de radiao X, tambm detectaram um aumento da expresso da H2AX com o aumento da dose recebida, confirmando o comportamento dose-dependente da protena em questo. Em experimentos de deteco da -H2AX em linfcitos por imunofluorescncia, Vilasov e colaboradores (2008) tambm detectaram este comportamento de aumento radioinduzido de expresso da -H2AX aps a exposio faixa de dose de 0,5 a 5 Gy de radiao gama; ou seja, numa faixa de dose aproximada empregue no presente trabalho. Entretanto, Belyaev (2010) refere que focos da -H2AX j foram detectados por imunofluorescncia em linfcitos, mesmo aps exposio a poucos miligrays de radiao. Em conjunto, os dados indicam que a deteco da expresso da -H2AX permite identificar

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presena ou no de exposio radiao, a baixa e altas doses, e permitiria a diferenciao entre doses. Sobre o fator tempo, considerando os dados aqui observados para as anlises ex vivo e aps 24 horas de cultivo, possvel sugerir que a fosforilao da histona H2AX induzida de forma dose-dependente imediatamente aps a irradiao, e que esta fosforilao mantida por algumas horas aps o evento. Contudo, essa fosforilao decai de forma expressiva nas primeiras 24 horas, comportamento que se manteve para os tempos de 48 e 72 horas. Os dados da presente pesquisa sugerem, portanto, que a -H2AX poderia ser utilizada como bioindicador de exposio radiao, para anlises imediatas. A deteco da -H2AX tem sido apontada como de aplicabilidade para avaliao e quantificao dos danos ao DNA (KINNER et al., 2008; DICKEY et al., 2009).

No cenrio dos mtodos disponveis para este fim, a deteco da histona fosforilada, notadamente por meio de tcnicas de imunofluorescncia, consideravelmente mais sensvel, eficiente e reprodutvel em comparao a mtodos clssicos e de amplo emprego como a eletroforese em gel bidimensional e o teste do cometa12 (ISMAIL et al., 2007). Nesse contexto, a citometria de fluxo vem a acrescentar benefcios s anlises, em termos de rapidez e objetividade de anlise, e processamento de um grande nmero de amostras em curto intervalo de tempo. Aps 24 horas, os dados indicam que a -H2AX seria til como biomarcador de exposio apenas para doses elevadas, iguais ou talvez maiores que 4 Gy, o que foi observado tambm para o tempo de 48 horas, mas no mais para 72 horas. A cintica observada parece refletir a funo biolgica da -H2AX: a expresso inicial da -H2AX parece refletir a quantidade de danos ao DNA. A fosforilao da H2AX ocorre logo aps a introduo de quebras radioinduzidas na dupla fita do DNA e parece ser mantida de 30 minutos a algumas horas aps a exposio, sendo eliminada j nas primeiras 24 horas (ROGAKOU et al., 1998; FIRSANOV et al., 2012). Aps sua atuao, a protena desfosforilada, principalmente pela ao de fosfatases (CHOWDHURY et a., 2005; DOUGLAS et al., 2010).
12

Mtodo de anlise de leses no DNA que se baseia na migrao de fragmentos de DNA em microeletroforese formando uma cauda, e a imagem resultante tem a aparncia de um cometa.

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Sobre a influncia da PHA, foi possvel notar tambm que j nas primeiras 24 horas, os nveis de expresso da -H2AX so reduzidos, e a relao entre a expresso da forma fosforilada da histona H2AX e a exposio radiao foi perdida. Esse comportamento foi observado para todos os tempos de cultura analisados. Ademais, para o tempo de 72 horas, a PHA eleva tambm os nveis mdios de -H2AX, tanto nas amostras no-irradiadas quanto nas irradiadas.

Hamasaki e colaboradores (2007) tambm identificaram que, aps cultivo de 24 horas com estmulo da PHA, a relao entre a exposio radiao e a expresso da -H2AX era perdida. Alguns autores tm realizado anlises a fim de desvendar a participao da H2AX em outros eventos, vinculados, neste caso, aos eventos de proliferao e diviso celular.

Ichijima e colaboradores (2005) e McManus e Hendzel (2005) identificaram o evento de fosforilao da histona H2AX em clulas humanas, alm de um evento responsivo ao dano ao DNA, tambm como um evento dependente do ciclo celular, sem qualquer dano induzido quela molcula; neste caso, a fosforilao da H2AX poderia contribuir manuteno da integridade genmica.

Alm disso, Tanaka e colaboradores (2007) afirmam que a fosforilao da histona H2AX constitutiva fortemente amplificada durante o estmulo de linfcitos com mitgenos. Os linfcitos em G0 possuem metabolismo oxidativo mnimo, e um aumento na atividade transcricional e traducional, do nmero de mitocndrias e a induo da replicao do DNA que ocorrem durante o seu estmulo com mitgenos aumenta o metabolismo oxidativo e, consequentemente, a gerao de espcies reativas de oxignio, que aumentam o dano a DNA, responsvel pelo envelhecimento e senescncia celular. Em conjunto, os dados da presente pesquisa sugerem a -H2AX como um potencial biomarcador de exposio, e a sua anlise, como um ensaio aplicvel na investigao de exposies radiao, imediatamente aps o evento ocorrido. Estas anlises devem ser realizadas em clulas no expostas fitohemaglutinina e sua aplicabilidade se restringe a investigaes imediatas, uma vez que j nas primeiras 24 horas aps a exposio, possvel identificar a exposio somente para doses em torno de 4 Gy, e aps 72 horas essa relao completamente perdida.

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5.2 Protena p21 5.2.1 Protena p21 resultados

A Figura 22 ilustra os grficos da expresso da protena p21 nas amostras sem cultivo (ex vivo, 0 horas).
Figura 22 Expresso da protena p21 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, para as anlises ex vivo. Para cada grupo, n = 10.

Os valores da expresso mdia (%) ( DP) da protena p21, para a condio experimental acima ilustrada, esto apresentados na Tabela 7, abaixo.
Tabela 7 Expresso da protena p21 nas anlises ex vivo

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) ( DP) 2,13 2,12 2,05 1,65 1,75 1,33 1,87 1,43

Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

A anlise estatstica dos dados no indica diferena entre os grupos controle e irradiados.

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A Figura 23 ilustra os grficos da expresso da protena p21 nas amostras cultivadas durante 24 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA).
Figura 23 Expresso da protena p21 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo durante 24 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10.

24 horas, PHA-

24 horas, PHA+

Os valores da expresso mdia (%) ( DP) da protena p21, para as clulas cultivadas durante 24 horas, so apresentados na Tabela 8.
Tabela 8 Expresso da protena p21 aps 24 horas de cultivo

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 3,33 3,15 5,33 3,63 2,53 2,60 5,61 3,57 2,20 2,09 5,14 2,82 2,30 1,86 5,80 3,91

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

A anlise estatstica dos dados no indica diferena na expresso da p21 entre os grupos controle e irradiados, para ambas as condies experimentais (com e sem PHA). Nas amostras irradiadas e cultivadas sob influncia da PHA, os nveis mdios de expresso dessa protena apresentaram um aumento significante (p < 0,01) em relao s amostras analisadas ex vivo.

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A Figura 24 ilustra os grficos da expresso da protena p21 nas cultivadas durante 48 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA).
Figura 24 Expresso da protena p21 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo durante 48 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10.

48 horas, PHA-

48 horas, PHA+

Os valores da expresso mdia (%) ( DP) da protena p21, para as amostras cultivadas por 48 horas, so apresentados na Tabela 9.
Tabela 9 Expresso da protena p21 aps 48 horas de cultivo

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 3,80 4,31 6,67 5,74 2,59 1,05 6,37 5,78 3,44 1,47 6,06 4,41 7,46 9,40 7,17 5,89

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

Os nveis mdios da expresso da p21 foram similares entre as amostras estimuladas e no estimuladas. Comparando-se os grupos controle e irradiados, no foram detectadas diferenas estatisticamente significantes entre eles, para ambas as condies experimentais (com e sem estmulo com PHA).

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A Figura 25 ilustra os grficos da expresso da protena p21 nas cultivadas durante 72 horas.
Figura 25 Expresso da protena p21 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, aps cultivo durante 72 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA). Para cada grupo, n = 10.

72 horas, PHA-

72 horas, PHA+

Os valores da expresso mdia (%) ( DP) da protena p21, para as amostras cultivadas por 72 horas, so apresentados na Tabela 10.
Tabela 10 Expresso da protena p21 aps 72 horas de cultivo

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 4,39 3,69 6,71 6,97 4,06 3,01 6,74 6,22 4,31 2,69 6,81 5,31 5,18 4,08 10,14 7,41

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

Os dados para o tempo de 72 horas foram similares queles obtidos para o tempo de 48 horas e, de maneira semelhante, no foram detectadas diferenas estatisticamente significantes entre os nveis da protena p21 entre os grupos controle e irradiados. 5.2.2 Protena p21 discusso

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Apesar de os dados da literatura indicarem um aumento radioinduzido da expresso da protena p21 em clulas irradiadas (KOIKE et al., 2011; WIESE et al., 2012), na presente pesquisa este comportamento no foi apresentado. Vilasov e colaboradores (2008) identificaram um aumento radioinduzido da p21 em linfcitos quiescentes, aps 24 horas (permanecendo durante 48 e 72 horas), e proliferantes, aps 4 horas (permanecendo durante 24, 48 e 72 horas).

Cavalcanti e colaboradores (2005), em anlise da protena p53 radioinduzida para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas, identificaram o tempo de 72 horas como o melhor tempo de deteco da p53 e sua relao com a dose de radiao. Os dados do presente trabalho indicam que a expresso radioinduzida da p53 neste tempo est mais relacionada execuo da apoptose (dado confirmado com a dinmica da expresso da caspase 3, explicitada no item 5.3), j que os nveis de expresso da p21 no apresentaram relao com nenhum dos tempos de anlise. possvel que a atuao da p21 j tenha ocorrido para o menor tempo analisado (24 horas), tendo as clulas sido conduzidas j apoptose. Seria interessante, portanto, a anlise da p21 em intervalos de tempo entre 0 e 24 horas, para analisar esta observao.

Uma vez que no se percebeu o comportamento biolgico esperado, importante considerar que o anticorpo utilizado na presente pesquisa, de difcil obteno comercial, no apresenta mesma sensibilidade que os anticorpos utilizados nas pesquisas que realizam anlises por Western blotting e imunofluorescncia, com anticorpos facilmente obtidos e de boa sensibilidade.

5.3 Caspase 3

5.3.1 Caspase 3 - resultados

A Figura 26 ilustra os grficos da expresso da caspase 3 ativa nas anlises ex vivo.

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Figura 26 Expresso da caspase 3 ativa nas amostras controle e irradiadas, ex vivo

Os valores da expresso mdia (%) ( DP) da caspase 3, ilustrados no grfico acima, so apresentador na Tabela 11.
Tabela 11 Expresso da caspase 3, nas anlises ex vivo

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) ( DP) 1,12 0,74 0,98 0,81 1,34 1,04 0,97 0,93

Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

A anlise estatstica destes resultados confirmou a impresso clara de que, para o tempo de 0 horas, os nveis de expresso da caspase 3 ativa no foram alterados.

A Figura 27 ilustra os grficos da expresso da caspase 3 para o tempo de cultivo de 24 horas, nas amostras cultivadas com e sem fitohemaglutinina (PHA).

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Figura 27 Expresso da caspase 3 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, para as clulas cultivadas durante 24 horas. Para cada grupo, n = 10. Os colchetes invertidos relacionam estatisticamente os grupos localizados abaixo de suas extremidades.

24 horas, PHA-

24 horas, PHA+

*** * *** ***

* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001

Os valores da expresso mdia (%) ( DP) da caspase 3, para o tempo de 24 horas de cultivo so apresentados na Tabela 12:
Tabela 12 Expresso da caspase 3 aps 24 horas de cultivo

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 4,90 2,82 13,66 11,64 10,63 3,84 17,23 15,33 16,91 6,48 17,44 13,33 24,09 8,16 19,28 14,67

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

Nas amostras incubadas durante 24 horas, um aumento estatisticamente significantes dos nveis mdios de expresso da caspase 3 com a exposio radiao foi observado para as amostras cultivadas sem PHA, mas no para as amostras estimuladas. Para as clulas quiescentes, foi possvel diferenciar as amostras controle daquelas irradiadas com 1 Gy (p < 0,05), 2 Gy (p < 0,001) e 4 Gy (p < 0,001), assim como diferenciar os grupos irradiados de

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acordo com a dose (p < 0,05 para: 1 Gy versus 2 Gy; 2 Gy versus 4 Gy. p < 0,001 para 1 Gy versus 4 Gy).

Os nveis de caspase 3 aumentaram significativamente (p < 0,01) para as amostras incubadas com PHA em relao s anlises ex vivo, para todas as doses analisadas. Em relao s amostras incubadas sem PHA, um aumento significante (p < 0,05) foi detectado apenas para as amostras controle.

A Figura 28 ilustra os grficos da expresso da caspase 3 ativa nas amostras cultivadas durante 48 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA).
Figura 28 Expresso da caspase 3 (mdia 1 DP) nos grupos controle e irradiados, para as clulas cultivadas durante 48 horas. Para cada grupo, n = 10. Os colchetes invertidos relacionam estatisticamente os grupos localizados abaixo de suas extremidades.

48 horas, PHA-

48 horas, PHA+

* *** * ***

* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001

Os valores da expresso mdia (%) ( DP) da caspase 3 ativa, para as amostras cultivadas por 48 horas so ilustrados na Tabela 13.
Tabela 13 Expresso da caspase 3 aps 48 horas de cultivo

Dose Controle

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 10,17 9,83 23,61 14,44

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1 Gy 2 Gy 4 Gy

23,67 12,09 31,63 12,75 35,53 13,81

23,50 11,87 28,33 14,76 29,53 14,91

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

Para as amostras no estimuladas, a diferenciao entre amostras controle e irradiadas continuou sendo possvel, para todas as doses analisadas (p < 0,05 para 1 Gy, e p < 0,001 para 2 e 4 Gy). Contudo, a diferenciao entre as doses s foi mantida para a comparao entre os grupos irradiados com 1 e 4 Gy (p < 0,05).

Nas amostras estimuladas, assim como para o tempo de 24 horas, no foi possvel detectar diferenas entre os grupos controle e irradiados.

A Figura 29 ilustra os grficos da expresso da caspase 3 nas clulas cultivadas durante 72 horas.
Figura 29 Expresso da caspase 3 nas amostras controle e irradiadas, cultivadas durante 72 horas, com e sem fitohemaglutinina (PHA)

72 horas, PHA-

72 horas, PHA+

***

* p 0,05; *** p 0,001

Os valores da expresso mdia (%) ( DP) da caspase 3 ativa, para as amostras cultivadas por 72 horas, esto apresentados na Tabela 14.

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Tabela 13 Expresso da caspase 3 aps 72 horas de cultivo

Dose Controle 1 Gy 2 Gy 4 Gy

Expresso (%) Condio de cultura Sem PHA ( DP) Com PHA ( DP) 7,21 2,92 38,35 19,85 21,36 12,34 41,66 20,46 25,06 14,01 46,68 20,75 27,45 16,65 42,73 22,07

PHA: fitohemaglutinina; Gy: Gray; : mdia; DP: desvio padro

A anlise estatstica das amostras cultivadas em presena de PHA por 72 horas confirma e complementa os comportamentos observados para os tempos de 24 e 48 horas. O estmulo com PHA elevou os nveis mdios de expresso da caspase 3 ativa nas clulas noirradiadas, e como para os demais tempos, no foi observada diferena estatisticamente significante entre os grupos controle e irradiados, nem entre os grupos irradiados.

Na anlise das amostras no estimuladas, foi possvel observar diferenas estatisticamente significantes entre o grupo controle e as amostras irradiadas, para todas as doses empregadas (p < 0,05 para 1 e 2 Gy, e p < 0,001, para a dose de 4 Gy). Entretanto, no foi possvel diferenciar os grupos irradiados de acordo com a dose recebida, uma vez que os valores das mdias foram aproximados. 5.3.2 Caspase 3 discusso

Os dados da anlise ex vivo no mostraram expresso da caspase 3 induzida pela radiao. Entretanto, os dados para o tempo de 24 horas de cultivo, sem fitohemaglutinina, revelaram um comportamento dose-dependente de expresso desta caspase, o que indica que a apoptose um requer tempo para que o dano seja interpretado pela clula e execute seus mecanismos de deciso do destino celular; dessa forma, que os fenmenos bioqumicos (como a expresso de caspases) e morfolgicos que caracterizam este evento no so induzidos imediatamente introduo do dano.

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Vokurkov e colaboradores (2006) obtiveram resultados semelhantes. Analisando linfcitos quiescentes expostos a 7 Gy de radiao, a apoptose no foi detectada mesmo 6 horas aps a irradiao. A exposio de resduos da fosfatidilserina na poro externa da membrana plasmtica um evento associado execuo da apoptose e, no estudo liderado por Vokurkov, essa exposio foi detectada somente 16 horas aps a irradiao. Na presente pesquisa, o menor tempo de cultivo avaliado aps a irradiao foi de 24 horas, de forma que a deteco de uma caspase ativa j seria possvel.

O estmulo com PHA por si s eleva os nveis de caspase 3 ativa nas clulas, o que indica, em diferentes tempos, que a anlise da apoptose em clulas estimuladas no adequado. O aumento da caspase 3 ativa por ao da PHA reduz a sensibilidade de deteco dos eventos apoptticos relacionados exposio radiao propriamente dita. Vilasov e colaboradores (2008) tambm detectaram um aumento da apoptose (neste caso, detectada atravs da expresso da anexina V) nas clulas estimuladas com PHA em comparao a clulas no estimuladas.

A deteco da expresso da caspase 3 em linfcitos estimulados pela fitohemaglutinina principalmente do tipo T pode ser decorrente da ativao desta caspase pela caspase 8, a qual est diretamente relacionada com a proliferao deste tipo de linfcito (FALK et al., 2004; GALLUZZI et al., 2008).

Os dados para o tempo de 48 horas indicam que a anlise dos nveis de expresso da caspase 3 ativa ainda permite diferenciar situaes de exposio e no exposio, e diferenciar apenas entre a menor e maior dose do intervalo investigado neste trabalho (1 Gy e 4 Gy). Estes dados confirmam o observado por Belyaev (2010), que refere que a apoptose induzida pela radiao gama em linfcitos humanos em G0 satura a doses acima de 2 Gy. Para o tempo de 72 horas, a diferenciao no presente trabalho foi possvel apenas entre o grupo controle em relao aos irradiados.

Considerando o cenrio construdo, a caspase 3 ativa tambm apresenta potencial para investigao de exposio de dose. Diferente do que foi observado para a -H2AX onde o momento ideal de investigao foi o tempo imediatamente aps a exposio, a caspase 3 ativa comea a apresentar sua relao de dose-dependncia 24 horas aps a exposio, de

81

forma que poderia ser investigada de modo complementar anlise da -H2AX, considerando a escala de tempo ps-irradiao.

Em conjunto, os resultados indicam que a caspase 3 ativa pode ser uma ferramenta para anlise da morte celular induzida pela exposio radiao, sendo de 24 horas o tempo mnimo requerido para anlise deste e de outros eventos associados apoptose. Os resultados apontam tambm a utilidade da caspase 3 ativa na avaliao de exposio e dose recebida, para o tempo de 24 horas aps a possvel irradiao, e indicao de exposio, para tempos maiores (48 e 72 horas). Todas as anlises so indicadas em culturas sem estmulo com PHA

5.4 Potencial das anlises para novas abordagens em prticas humanas e mdicas que empregam radiaes ionizantes

O conhecimento da radiobiologia do tecido normal um pr-requisito importante s prticas mdicas e radioproteo. As organizaes que estabelecem as principais recomendaes que visam proteger o homem contra os danos das RIs, a exemplo da ICRP (International Commission on Radiological Protection), tm se esforado na reviso e avaliao das bases biolgicas destas prticas de radioproteo, de forma que os atuais protocolos e normas podem ser modificados (IAEA, 2010).

Para as prticas mdicas, um quesito importante so os efeitos citotxicos precoces e tardios associados irradiao dos tecidos sadios. Cerca de 20 % dos pacientes submetidos radioterapia (RT) desenvolvem reaes adversas envolvendo o tecido normal (e.g. fibrose, dermatite, mucosite, dano vascular), sendo que em cerca de 5 %, estas reaes so exacerbadas (AWWAD, 2005; BARNETT et al., 2009).

Atualmente, no possvel identificar quais indivduos correspondem a esta parcela hipersensvel aos efeitos prejudiciais das RIs, e na tentativa de se controlar os riscos prospectivamente, esta frao altamente sensvel radiao (5 %) considerada no clculo da dose a ser prescrita a todos os pacientes (BENOTMANE, 2004; AWWAD, 2005).

Apesar do nmero crescente de fatores e interaes que vm sendo descobertos, ainda no foram identificados os determinantes genticos ou moleculares dessa radiossensibilidade do tecido normal. A identificao de diferentes graus de

82

radiossensibilidade possibilitaria ganhos nas taxas teraputicas atravs da individualizao do tratamento. O risco de complicaes radioinduzidas poderia ser minimizado em pacientes hipersensveis por reduo de doses (ou substituio por outra modalidade teraputica). Para pacientes normais ou resistentes, o incremento gradativo da dose a nveis maiores, tanto quanto tolerveis, aumentaria as chances de cura (TWARDELLA; CHANG-CLAUDE, 2002; AWWAD, 2005).

Devido grande complexidade da resposta radioinduzida, determinar apenas um componente-chave como potencial candidato para o desenvolvimento de ensaios preditivos pode no ser a melhor opo. Talvez o melhor caminho para desvendar a radiossensibilidade seria combinar mais de um parmetro de anlise, fornecendo uma informao mais complexa do que acontece nos tecidos normais de determinado paciente em resposta irradiao.

O aumento da compreenso dos eventos biolgicos desencadeados pela exposio do homem s RIs pode ter reflexos positivos para estes campos. Novos bioindicadores moleculares podem ser identificados no processo, e, dos ensaios realizados no presente trabalho, os resultados mais importante correspondem aos ensaios de anlise dos nveis de expresso das protenas -H2AX e caspase 3 ativa. Os resultados obtidos para as anlises ex vivo (manipulao da amostra logo aps a irradiao), para anlise da -H2AX, e mnimo de 24 horas (alm de 48 e 72 horas), para anlise da caspase 3 sugerem a aplicabilidade deste ensaio na anlise dos eventos radioinduzidos, e podem servir de base para o estabelecimento de curvas dose-efeito, que podem ser obtidas com a utilizao de mtodos matemticos (CHAPPELL et al., 2010). Ensaios j vm sendo realizados para relacionar a expresso da -H2AX exposio radiao ionizante; contudo, a grande maioria deles utiliza a tcnica da imunofluorescncia para a identificao dos focos IRIF em clulas fixadas a lminas. As principais dificuldades desta tcnica consistem no elevado tempo (horas a dias) consumido para sua realizao e na subjetividade na contagem e determinao da intensidade dos focos IRIFs, que dependem da interpretao do operador (ZWICKER et al., 2011). Os dados sobre a expresso da -H2AX sugerem esta protena como um potencial biomarcador de exposio s RIs. Esta anlise seria til apenas avaliao imediata da exposio, uma vez que a correlao entre a expresso da -H2AX e diferentes doses de

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radiao s foi possvel para as anlises ex vivo, e aps 24 horas no foram obtidas diferenas significantes. Nesse contexto, o ensaio com a -H2AX disponibiliza uma ferramenta de triagem rpida e eficaz em casos de emergncias radiolgicas, fornecendo resultados no mesmo dia da exposio.

Nesse sentido, alguns pesquisadores tm dedicado tempo e esforo no melhoramento das tcnicas de imunofluorescncia. Visando tornar a tcnica menos trabalhosa, mais rpida e objetiva, as aes mais relevantes consistem no desenvolvimento de plataformas automatizadas para deteco da luminescncia (AVONDOGLIO et al., 2009; TURNER et al., 2011; VALENTE et al., 2011) e otimizao das anlises atravs de mtodos computacionais (BCKER; ILIAKIS, 2006).

Considerando o ensaio realizado neste trabalho, sugere-se o emprego de um ensaio de anlise das protenas de maior relevncia (-H2AX e caspase 3) baseado em citometria de fluxo, o que traria um benefcio extra s aplicaes prticas.

Para os ensaios em biodosimetria, vrias amostras podem ser processadas por vez, sendo analisado um grande nmero de clulas em questo de minutos, com resultados mais objetivos e rpidos. Nesse sentido, os dados sobre possvel exposio poderiam ser fornecidos no mesmo dia da coleta da amostra. Alm disso, a citometria de fluxo uma tecnologia difundida para vrios centros de pesquisa, assim como laboratrios de centros mdicos, e, portanto, no requer o desenvolvimento de novas tecnologias, reduzindo os gastos para aquisio de novos equipamentos.

O emprego dos linfcitos como modelo biolgico tambm agrega vantagens que so cruciais aplicabilidade do presente ensaio na prtica clnica, onde dados confiveis devem ser fornecidos de forma rpida (AWWAD, 2005). Os linfcitos so clulas que apresentam elevada radiossensibilidade e possuem boa representao quantitativa em sangue perifrico, podendo ser obtidos facilmente por meio de uma puno venosa (um procedimento minimamente invasivo, corriqueiro em prticas laboratoriais). Alm disso, so de fcil manuteno e manipulao em laboratrio, consistindo em uma alternativa promissora aos fibroblastos outro tipo celular bastante investigado em ensaios de radiossensibilidade para ensaios de abrangncia clnica (BARBER et al., 2000). Os experimentos realizados no

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presente trabalho confirmam esta sensibilidade dos linfcitos s RIs e sua adequao s prticas laboratoriais de investigao deste evento.

O ganho de tempo agregado por este ensaio, proposto para avaliaes em acidentes radiolgicos, essencial para o contexto dessas situaes, onde o tempo um fator chave para os procedimentos de cuidado aos indivduos expostos. A aplicao da -H2AX como preditor de radiossensibilidade tem sido avaliada em pesquisas laboratoriais, assim como na prtica clnica. Para aplicaes em prticas mdicas, o ensaio imediato de deteco da H2AX radioinduzida poderia ser usado no monitoramento dos nveis de danos causados ao paciente em seu tecido normal e possivelmente indicar a sensibilidade de tecidos normais e tumorais, como sugerido por Belyaev (2010) e Zwicker e colaboradores (2011). Ensaios com diferentes linhagens de camundongos mostraram que a cintica da -H2AX mensurada em vrios rgos idntica cintica obtida em linfcitos do sangue perifrico; assim, os dados obtidos a partir dos linfcitos sanguneos poderiam fornecer informaes valiosas sobre a radiossensibilidade de diferentes rgos e tecidos (BELYAEV, 2010).

Em pesquisas laboratoriais, Bhogal e colaboradores (2010) realizaram um estudo com linhagens de camundongos sensveis e resistentes aos efeitos da radiao, e os resultados obtidos sugerem que a anlise de focos residuais da -H2AX poderia ser empregada na predio da radiossensibilidade. Goodarsi e Jeego (2011) defendem que de fato a deteco da -H2AX poderia ser utilizada como ferramenta de avaliao dessa radiossensibilidade.

Banth e colaboradores (2004) e Taneja e colaboradores (2004) foram alguns dos pesquisadores que realizaram pesquisas laboratoriais com linhagens de clulas cancerosas, e identificaram relaes entre o tipo de linhagem e a perda da -H2AX. Os pesquisadores associaram estas diferenas radiossensibilidade intrnseca, prpria de cada linhagem, e Taneja e colaboradores sugerem que a -H2AX pode, inclusive, ser utilizada no desenvolvimento de frmacos que aumentem a morte de clulas radiorresistentes.

Seguindo uma tendncia contrria, Yoshikawa e colaboradores (2009) encontraram resultados no to promissores, e sugerem que no h correlao entre os focos da -H2AX e radiossensibilidade de clulas tumorais. Nesse sentido, mais investigaes precisam ser

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realizadas, no intuito de esclarecer se a -H2AX pode ser utilizada como parmetro de anlise da radiossensibilidade de tecidos normais e tumorais.

Sobre a mensurao dos nveis de apoptose em linfcitos, esta anlise tem sido sugerida como mtodo de estimao da dose in vitro aps exposio acidental RI, e na identificao de indivduos radiossensveis (que tendem a apresentar uma menor apoptose radioinduzida) (VERJEIH; BARTELINK, 2000; SCHNARR et al., 2007; PINAR et al., 2010).

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6 CONCLUSES A expresso da protena -H2AX proporcional ao aumento da dose de radiao. A melhor correlao foi observada para anlises ex vivo, sugerindo seu potencial como biomarcador imediato de exposio s RIs, onde o emprego da citometria de fluxo agrega ganho de tempo s anlises; Os nveis mdios de expresso da p21 no apresentaram correlao de dosedependncia, para todos os tempos e condies avaliados; Os nveis de expresso da caspase 3 apresentaram aumentaram em resposta ao incremento de dose. As correlaes foram possveis apenas nas amostras cultivadas, para todos os tempos analisados, sugerindo um potencial da caspase 3 como bioindicador de exposio ocorridas h no mnimo 24 horas. Estas observaes foram obtidas em culturas sem estmulo com fitohemaglutinina.

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APNCIDE A Termo de Consentimento Livre e Esclarecido


DADOS DE IDENTIFICAO Ttulo do projeto: Estudo de bioindicadores moleculares na determinao da radiossensibilidade individual Pesquisador Responsvel: Prof. Dr. Ademir de Jesus Amaral Instituio a que pertence: Departamento de Energia Nuclear Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof. Luiz Freire, 1000, Cidade Universitria, CEP: 50740-540, Recife-PE Telefones para contato: (81) 2126-7985 / (81) 8888-3142 E-mail: amaral@ufpe.br Nome do voluntrio: _________________________________________________________ Data de nascimento: ___ / ___ / ______ Idade: ____ anos R.G.: _________________ Responsvel legal (quando for o caso): ___________________________________________ R.G. Responsvel legal: _________________________ O (A) Sr. (a) est sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa Estudo de bioindicadores moleculares na determinao da radiossensibilidade individual, de responsabilidade do pesquisador Ademir de Jesus Amaral. JUSTIFICATIVA. Pacientes que so tratados com radioterapia podem apresentar reaes adversas nos tecidos normais, e estas reaes so mais severas em algumas pessoas que em outras. As pesquisas em radiossensibilidade (sensibilidade radiao) individual buscam entender melhor como a clula normal responde ao dano causado pela radiao, para tentar sugerir testes laboratoriais que sejam realizados antes do comeo do tratamento e que identifiquem os diferentes graus de radiossensibilidade. Isto possibilitaria individualizar o tratamento e melhorar a qualidade de vida dos pacientes submetidos radioterapia. OBJETIVOS E METODOLOGIA DA PESQUISA. O objetivo desta pesquisa avaliar parmetros celulares relacionados resposta das clulas ao dano da radiao, para identificar diferenas na radiossensibilidade individual. Para isto, 40 mL de sangue sero coletados de uma veia do brao utilizando sistema a vcuo (que torna a coleta mais rpida e menos traumtica) e irradiadas com diferentes doses de radiao. A partir destas amostras sero separados os linfcitos (tipo de clula presente no sangue) e a anlise dos parmetros celulares ser realizada por citometria de fluxo. RISCOS E BENEFCIOS Riscos: Durante o procedimento de coleta, o voluntrio poder se sentir desconfortvel na regio de insero da agulha. Hematomas podem aparecer depois. Problemas durante o processamento das amostras podem impossibilitar a concluso da investigao. Devido ao treinamento do profissional de coleta e ao suporte para o bom andamento do estudo, a ocorrncia destas circunstncias mnima, mas no pode ser descartada; Benefcios: As pesquisas em radiossensibilidade individual permitem que se compreendam melhor as conseqncias da irradiao das clulas normais, podendo-se sugerir ou mesmo identificar parmetros que possam ser empregados em testes de identificao dos graus de radiossensibilidade. Conseqentemente, o tratamento poderia ser feito de maneira a aplicar a dose que permita controlar o tumor com menos reaes adversas associadas. Os participantes sero informados do resultado final do estudo, assim como da sua caracterstica individual. PRIVACIDADE E CONFIDENCIALIDADE. A sua participao como voluntrio nesta pesquisa livre e desimpedida; portanto, caso sinta necessidade, o (a) sr.(a) pode retirar o seu consentimento a qualquer tempo. Quaisquer dados pessoais e informaes obtidas sero confidenciais e restritas. CONSENTIMENTO Eu, __________________________________________, RG n _____________________ declaro ter sido informado e concordo em participar, como voluntrio, do projeto de pesquisa acima descrito. Recife, _____ de ____________ de _________.

_________________________________________________________ Assinatura do paciente ou responsvel legal _________________________________________________________ Nome e Assinatura do pesquisador responsvel _________________________________________________________ Assinatura da 1 Testemunha Nome: ___________________________ RG: _____________

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_________________________________________________________ Assinatura da 2 Testemunha Nome: ___________________________ RG: _____________

APNCIDE B Questionrio

Nome completo: _______________________________________________________________ Data de nascimento: ____/____/_______ Sexo: E-mail: ______________________________________ Telefone: (___) ______.______ Fumante? -fumante: H quanto tempo deixou?_______________ Quantos cigarros/dia? ______________ H quanto tempo?_________________ Quantos cigarros/dia? ______________ Bebe? ______ Quando bebeu pela ltima vez? ___________________ Quanto?: ______________________ Esteve doente recentemente? Quando? ___________________________ O que teve? ___________________________ Que medicao tomou? ___________________ Quando parou a medicao? ___________________ Fez radiografia recentemente? _______________________________ Usa medicamentos regularmente? ______ Dose: _______________________________ J teve algum tipo de neoplasia maligna (cncer, leucemia, linfoma)? Quando? ___________________________ O que teve? ___________________________ Que tratamento realizou? ________________________________________________________ Obteve cura? ________________________ H quanto tempo? __________________________ J realizou transfuso sangunea? Sim. Quando? _____________________________________________ Foi submetido a radioterapia ou exame de medicina nuclear? No; ________ O que teve? _____________ Obteve cura? ________________________ H quanto tempo? __________________________ Contato com produtos txicos (ex.: agrotxicos, veneno ou produtos qumicos fortes)? e tipo? _________________________ Com que frequncia? _______________________ H quanto tempo: ______________________ Usa equipamento de proteo? Se usa equipamento de proteo, de que tipo ? _______________________________________ Trabalha ou trabalhou exposto a radiaes ionizantes? Profisso: ____________________ Tipo de radiao e horas/dia de trabalho? _____________ Usa equipamentos de proteo? _______________________________ Mais informaes: ________________________________________________________________

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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

APNDICE C Contagem em cmara de Neubauer

A cmara de Neubauer uma lmina de vidro espesso com duas cmaras de contagem (Figura 30, em vermelho), cada uma contendo marcaes em quadrantes com medidas conhecidas, como visualizado na Figura 30.
Figura 30 Cmara de Neubauer, com detalhamento das marcaes contidas em cada cmara de contagem e quadrantes (A, B e C) delimitados

A B A

B C B

A B A

Os lados das cmaras so mais elevados (Figura 30, em azul) para adaptar uma lamnula de vidro especfica para cmara de Neubauer, a qual permite a formao de uma lmina de exatamente 0,1 milmetros (mm) acima da superfcie da cmara. Cada cmara de contagem tem uma superfcie espelhada onde esto delimitados 9 quadrantes de contagem (Figura 30, no detalhe, com A, B e C), com rea de 0,1 mm2 cada um. Desta forma, o volume padronizado da cada quadrante de 0,1 mm3 (= 0,1 mm2 x 0,1 mm), que corresponde a 10-4 mL (= 0,0001 mL = 0,1 mm3).

A escolha dos quadrantes a serem utilizados na contagem baseada no tamanho da clula a ser visualizada. Para o caso dos linfcitos, que so clulas grandes, so utilizados os quadrantes maiores (Figura 30, em A). Os valores obtidos na contagem podem ser utilizados na estimativa da viabilidade celular e da concentrao celular na suspenso.

Para o clculo de viabilidade celular, utiliza-se a seguinte frmula:

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Para o clculo de concentrao celular, a frmula a que segue:

Para as condies da contagem para linfcitos realizadas na presente pesquisa, onde so contabilizados 4 quadrantes a partir de uma amostra diluda 1:10, a frmula final do clculo de concentrao celular foi a seguinte:

Sabendo-se que a concentrao celular da suspenso utilizada nas culturas foi de 2 x 106 clulas/mL, foram realizados ajustes do volume final com base na seguinte equao:

Onde C1 corresponde concentrao calculada na equao anterior; V1, ao volume inicial (1 mL); e C2, a 2 x 106 cls/mL.

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ANEXO A Parecer do Comit de tica em Pesquisa

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