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UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN COORDENAO DE QUMICA CURSO DE BACHARELADO EM QUMICA

SINARA QUELI WELTER

EXTRAO E QUANTIFICAO DE CAFENA EM ENERGTICOS ATRAVS DE CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA E ESPECTROFOTOMETRIA

TRABALHO DE CONCLUSO DE CURSO

PATO BRANCO 2011

SINARA QUELI WELTER

EXTRAO E QUANTIFICAO DE CAFENA EM ENERGTICOS ATRAVS DE CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA E ESPECTROFOTOMETRIA
Trabalho de Concluso de Curso de graduao, apresentado disciplina de Trabalho de Concluso de Curso 2, do Curso Superior de Bacharelado em Qumica, da Universidade Tecnolgica Federal do Paran - UTFPR, como requisito parcial para obteno do ttulo de Bacharel em Qumica. Professora Orientadora: Profa. Dra. Sirlei Dias Teixeira Professor Coorientador: Prof. Dr. Marcio Barreto Rodrigues

PATO BRANCO 2011

minha me Hedi R. Welter, que apoiou e incentivou a realizao deste sonho. memria de meu pai, Arlindo Z. Welter, pelo exemplo de vida. Cleidimar Nardi, pelo carinho e compreenso.

AGRADECIMENTOS Deus. Aos professores Sirlei Dias Teixeira e Marcio Barreto Rodrigues pela dedicao em orientar este trabalho. Universidade Tecnolgica Federal do Paran (UTFPR) Cmpus Pato Branco e Francisco Beltro, e Central de Anlises do Cmpus Pato Branco que disponibilizaram os laboratrios para a realizao das anlises. Aos professores da banca examinadora, Dr. Edimir Andrade Pereira e Dr. Marcio Barreto Rodrigues, pela ateno e contribuio dedicadas a este trabalho. minha famlia, pois sem o seu apoio e incentivo, a realizao deste sonho no seria possvel. Cleidimar Nardi, pelo seu carinho, amor e compreenso.

RESUMO

WELTER, Sinara Q. Extrao e quantificao de cafena em energticos atravs de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia e Espectrofotometria. 2011. 32 f. Trabalho de Concluso de Curso Bacharelado em Qumica, Universidade Tecnolgica Federal do Paran. Pato Branco, 2011. A cafena um alcaloide, um composto contendo nitrognio, que apresenta propriedades bsicas. A cafena um dos principais ingredientes das bebidas energticas, que segundo seus produtores, foram criadas para incrementar a resistncia fsica, aumentar o estado de alerta mental, evitar o sono, entre outros. O presente trabalho relata a extrao e quantificao de cafena em diferentes marcas de energticos encontradas no mercado atravs de dois mtodos: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia e Espectrofotometria. Os resultados de concentrao de cafena no apresentaram diferena significativa quando determinados pelos dois mtodos em questo. Palavras-chave: Cafena. Energticos. CLAE. Espectrofotometria.

ABSTRACT

WELTER, Sinara Q. Extraction and quantification of caffeine in energy drinks by High Performance Liquid Chromatography and Spectrophotometry. 2011. 32 f. Trabalho de Concluso de Curso Bacharelado em Qumica, Universidade Tecnolgica Federal do Paran. Pato Branco, 2011. Caffeine is an alkaloid, a compound containing nitrogen, which has basic properties. Caffeine is oneof the main ingredients of energy drinks, which according to its producers, are designed to increase endurance, increase mental alertness, prevent sleep, among others. This paper describes the extraction and quantification of caffeine in different brands of energy found in the market through two methods: High Performance Liquid Chromatography and Spectrophotometry. The results of caffeine showed no significant difference was determined by two methods in question. Keywords: Caffeine. Energy drink. HPLC. Spectrophotometry.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Frmulas estruturais da xantina e seus derivados .................................... 12 Figura 2 Cromatograma do padro de cafena....................................................... 18 Figura 3 - Cromatograma do padro de cafina a 1,0 ppm em 272 nm .................... 21 Figura 4 - Cromatograma do padro de cafena a 5,0 ppm em 272 nm.................... 21 Figura 5 - Cromatograma do padro de cafena de 10 ppm a 272 nm...................... 22 Figura 6 - Cromatograma do padro de cafena de 25 ppm a 272 nm...................... 22 Figura 8 - Curva padro de cafena obtida atravs de CLAE .................................... 23 Figura 7 - Cromatograma do padro de cafena de 50 ppm a 272 nm...................... 23 Figura 9 - Replicata 1 da anlise do energtico A 10% em CLAE ............................ 24 Figura 10 - Replicata 2 da anlise do energtico A 10% em CLAE .......................... 24 Figura 11 - Replicata 3 da anlise do energtico A 10% em CLAE .......................... 25 Figura 12 - Replicata 1 da anlise do energtico B 10% em CLAE .......................... 25 Figura 13 - Replicata 2 da anlise de energtico B 10% em CLAE .......................... 26 Figura 14 - Replicata 3 da anlise do energtico B 10% em CLAE .......................... 26 Figura 15 - Replicata 1 da anlise do energtico C 10% em CLAE .......................... 27 Figura 16 - Replicata 2 da anlise do energtico C 10% em CLAE .......................... 27 Figura 17 - Replicata 3 da anlise do energtico C 10% em CLAE .......................... 28 Figura 18 - Curva de calibrao obtida atravs de espectrofotmetro ...................... 29 Figura 19 - Pico que representa a cafena no energtico B ...................................... 33 Figura 20 - Pico que representa a substncia interferente ........................................ 34

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Concentraes de cafena encontradas nas diferentes marcas de energticos analisados atravs do mtodo cromatogrfico (CLAE) .......................... 29 Tabela 2 - Valores de absorbncia a 272 nm correspondente ao extrato de cada replicata dos energticos .......................................................................................... 30 Tabela 3 - Concentraes de cafena encontradas nas diferentes marcas de energticos analisados atravs do mtodo espectrofotomtrico ............................... 31 Tabela 4 - Comparao entre as concentraes de cafena quantificadas pelos dois mtodos em estudo e comparao com os dados fornecidos na embalagem do produto ...................................................................................................................... 31

SUMRIO
1 INTRODUO ......................................................................................................... 9 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 10 2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 10 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................... 10 3 REFERENCIAL TERICO..................................................................................... 11 3.1 CAFENA: ORIGEM E DESCRIO ................................................................... 11 3.2 ADMINISTRAO DE CAFENA ........................................................................ 12 3.3 USO DE BEBIDAS ENERGTICAS ................................................................... 13 3.4 LEGISLAO...................................................................................................... 14 3.5 MTODOS DE ANLISE .................................................................................... 14 3.5.1 Cromatografia................................................................................................... 14 3.5.2 Espectrofotometria ........................................................................................... 16 4 MATERIAIS E MTODOS ..................................................................................... 18 4.1 CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE) ............................ 18 4.2 ESPECTROFOTOMETRIA ................................................................................. 19 4.2.1 Extrao ........................................................................................................... 19 4.2.2 Espectrofotometria ........................................................................................... 20 5 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................. 21 CONCLUSO ........................................................................................................... 36 REFERNCIAS ......................................................................................................... 37

1 INTRODUO

A cafena um alcalide de grande uso, sendo consumida pela populao principalmente atravs de chs, caf, bebidas energticas e de frmacos, como antigripais (DE MARIA, MOREIRA, 2007). encontrada naturalmente, em grande quantidade, nas sementes de caf e folhas de ch verde. Esta substncia atinge o Sistema Nervoso Central aumentando a capacidade de alerta e melhorando o desempenho de atividades que exijam vigilncia (DE MARIA, MOREIRA, 2007). Mas em excesso, esta substncia pode causar insnia, nervosismo, palpitao do corao, entre outros sintomas desconfortveis (ALTIMARI, CYRINO, ZUCAS, 2001; BRENELLI, 2003; DE MARIA, MOREIRA, 2007). A cafena um dos principais ingredientes das bebidas energticas, os quais so denominados pela ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria) como composto lquido pronto para consumo, e so fiscalizados, dentre outros fatores, segundo o teor de cafena, o qual no deve ultrapassar 350mg/L (BRASIL, 1998). Este trabalho tem por objetivo a quantificao de cafena de diferentes marcas de energticos, atravs de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia e Espectrofotometria, verificando as quantidades obtidas, comparando os mtodos e os valores relatados no rtulo de cada produto.

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2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Determinar o teor de cafena em diversas marcas de energticos, para posterior comparao entre os mtodos utilizados e com a legislao.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Estudar diferentes mtodos de determinao de cafena em alimentos; Determinar o teor de cafena dos energticos analisados atravs dos mtodos escolhidos; Comparar os resultados encontrados entre os dois mtodos e com os teores de cafena determinados pela ANVISA.

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3 REFERENCIAL TERICO

3.1 CAFENA: ORIGEM E DESCRIO

A cafena um alcalide, um composto contendo nitrognio, que apresenta propriedades bsicas (BRENELLI, 2003). Segundo De Maria e Moreira (2007), este alcalide encontrado em grande quantidade nas sementes de caf e nas folhas de ch verde. Esta molcula tambm pode ser encontrada em outros produtos vegetais, como o cacau, o guaran e a erva-mate. Mesmo que uma pequena parcela da populao consuma cafena na forma de frmacos, como os antigripais, grande parte desta substncia ingerida na forma de bebidas (DE MARIA, MOREIRA, 2007). O uso da cafena vem de muitos sculos, e atualmente a droga mais consumida no mundo. A cafena tem sido utilizada desde o perodo paleoltico (ALTIMARI, CYRINO, ZUCAS, 2000, 2001; MELLO, KUNZLER, FARAH, 2007), provavelmente devido aos seus efeitos do Sistema Nervoso Central (SNC) (MELLO, KUNZLER, FARAH, 2007). Quimicamente, a cafena (1,3,7-trimetilxantina) pertence ao grupo das metilxantinas (derivadas da xantina), do qual tambm fazem parte a teofilina, a teobromina, a tena e o guaran (Figura 1) (ALTIMARI, CYRINO, ZUCAS, 2000, 2001). Estes compostos so alcaloides estreitamente relacionados pois todos tem ao farmacolgica sobre o SNC, mas com intensidades diferentes (ALTIMARI, CYRINO, ZUCAS, 2000, 2001).

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Figura 1 - Frmulas estruturais da xantina e seus derivados Fonte: ALTIMARI, CYRINO, ZUCAS, 2001.

3.2 ADMINISTRAO DE CAFENA

Conforme Altimari, Cyrino, Zucas (2000, 2001), a administrao de cafena pode ser feita de diversas formas, mas a mais comum a via oral, devido a sua fcil aplicabilidade. A sua absoro pode atingir todos os tecidos, devido ao fato de que sua distribuio pelo organismo ser feita pela corrente sangunea, posteriormente degradada pelo fgado e excretada pela urina. Embora a maior parte da metabolizao da cafena ocorra no fgado, outros tecidos, incluindo o crebro e os rins, desempenham papel importante no metabolismo deste alcaloide (MELO, 2007). A cafena absorvida de modo rpido e eficiente, principalmente via administrao oral, atravs do trato gastrointestinal, e possui aproximadamente 100% de disponibilidade. Alcana a concentrao mxima na corrente sangunea

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aps 15 a 120 minutos de sua ingesto (ALTIMARI, CYRINO, ZUCAS, 2000, 2001, 2006). Segundo Mello e colaboradores (2007), o uso crnico da cafena geralmente associado habituao e tolerncia. Numa pessoa que no faz uso regular de cafena, esta substncia pode causar um aumento dos nveis de alguns hormnios, como as catecolaminas, a renina e mesmo insulina e o hormnio da paratireoide. Entretanto, estes efeitos no so detectados na pessoa que faz uso regular de cafena, pois seu organismo j est adaptado a essa substncia, no mais havendo estes aumentos. Os principais efeitos colaterais da ingesto de cafena ocorrem no sistema nervoso central e cardiovascular (MELLO, KUNZLER, FARAH, 2007). Os efeitos fisiolgicos principais da cafena nos seres humanos so o efeito estimulante, o efeito diurtico e a dependncia qumica (BRENELLI, 2003). Esta substncia causa o aumento da taxa metablica, o relaxamento da musculatura lisa dos brnquios, do trato gastrintestinal, do trato biliar, e de partes do sistema vascular (BRENELLI, 2003). Gera reduo da fadiga e um aumento da capacidade de alerta, e tambm, melhora no desempenho de atividades que necessitam maior vigilncia (DE MARIA, MOREIRA, 2007).

3.3 USO DE BEBIDAS ENERGTICAS

Segundo Ballistreri e Corradi-Webster (2008), h no mercado bebidas denominadas energticas, que segundo seus produtores, foram criadas para incrementar a resistncia fsica, aumentar o estado de alerta mental, proporcionar sensao de bem estar, evitar o sono, estimular o metabolismo e ajudar a eliminar substncias nocivas ao corpo. Os principais ingredientes da maioria destas bebidas so: taurina, cafena, guaran, ginseng, glucuronolactona e vitaminas. Algumas possuem minerais, inositol e carnitina, entre outras substncias. As pessoas tm acesso livre a estas bebidas em vrios lugares, como em danceterias, clubes, bares, academias, centros esportivos, etc., onde so vendidas separadamente ou junto com bebidas alcolicas (BALLISTRERI, CORRADIWEBSTER, 2008). O principal intuito das bebidas energticas estimular o crebro

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para que este entre em estado de alerta, at pouco tempo atrs eram utilizados para se obter um aumento da capacidade mental, devido ao cansao (ZENI, 2009). Ballistreri e Corradi-Webster (2008) afirmam que, uma questo que surge a utilizao de energticos juntamente com bebidas alcolicas, principalmente entre os jovens, j que, com a mistura e a melhora do sabor, maiores quantidades de lcool estariam sendo consumidas. De acordo com um estudo feito pela Universidade Federal de So Paulo (Unifesp), o energtico mascara o gosto do lcool, o que incentiva uma maior ingesto de bebidas alcolicas e promove uma falsa sensao de bem estar, o que faz a pessoa se sentir mais ligada e muitas vezes se considerando capaz de dirigir (ZENI, 2009).

3.4 LEGISLAO

Segundo BRASIL (1998), em compostos lquidos pronto para consumo (energticos), permitida a adio de cafena como ingrediente no limite mximo de 350 mg/L. obrigatrio informar no rtulo do produto o teor de cafena, quando presente. O composto lquido pronto para consumo, objeto deste Regulamento, deve indicar obrigatoriamente, a seguinte advertncia em destaque e negrito: "Idosos e portadores de enfermidades: consultar o mdico antes de consumir este produto" (BRASIL, 1998).

3.5 MTODOS DE ANLISE

3.5.1 Cromatografia

Segundo Holler (2009) e colaboradores, a cromatografia um mtodo de separao muito eficiente que se aplica a muitos ramos da cincia. Compreende um grupo diversificado e importante de mtodos que permitem a separao e

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identificao de componentes muito semelhantes entre si (HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009). Em toda anlise cromatogrfica, a amostra transportada por uma fase mvel, que pode ser um gs ou um lquido (em outras palavras, o solvente que se move atravs da coluna). Essa fase mvel forada a passar por uma fase estacionria imiscvel e fixa, no interior de uma coluna ou sobre uma superfcie slida. a distribuio dos solutos entre as fases mvel e estacionria que provoca a separao dos compostos, pois as duas fases so escolhidas de modo que os componentes da amostra distribuam-se entre as fases mvel e estacionaria em graus distintos (HARRIS, 2008; HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009). Segundo Holler e colaboradores (2009), os compostos que so retidos mais fortemente na fase estacionria movem-se mais lentamente pela coluna. Em contrapartida, os compostos que interagem mais fracamente com a fase estacionria movem-se mais rapidamente. Em funo dessas velocidades de migrao diferentes os componentes da amostra so separados em bandas ou zonas discretas, que podem ser analisadas tanto qualitativamente como quantitativamente.

3.5.1.1 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Segundo Cienfuegos e Vaitsman (2000) a cromatografia lquida aquela em que a fase mvel liquida. A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia, do ingls, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), utiliza pequenas colunas cheias de materiais especialmente preparados, capazes de proporcionar separaes muito eficientes; e fase mvel submetida a altas presses para forar sua passagem pela coluna (CIENFUEGOS, VAITSMAN, 2000; HARRIS, 2008). O dispositivo para CLAE consiste, basicamente, em um sistema de distribuio de solvente, uma vlvula de injeo de amostra, uma coluna de alta presso, um detector e um computador para controlar o sistema e apresentar os resultados (HARRIS, 2008). Conforme o mesmo autor, os resultados podem ser observados atravs de cromatogramas que so grficos que mostram a resposta do detector em funo do tempo de eluio (passagem do lquido pela coluna cromatogrfica). Um dos parmetros utilizados nos clculos deste trabalho o tempo de reteno, que o

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tempo necessrio, a partir da injeo da mistura na coluna, para que cada componente alcance o detector. A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia tem como vantagem a rapidez de anlise, alta eficincia, reprodutibilidade e sensibilidade, mas possui algumas limitaes como o alto custo de equipamento, a necessidade de operador experiente e solventes de alta pureza (CIENFUEGOS, VAITSMAN, 2000).

3.5.2 Espectrofotometria

Segundo Vinad e Vinad (2005), os mtodos espectroscpicos de anlise tm como caracterstica comum a interao da radiao eletromagntica com a matria. Existe uma relao de proporcionalidade entre a quantidade de radiao absorvida por uma espcie qumica e a concentrao dessa espcie. Essa relao que permite a quantificao nas amostras. Quando a radiao eletromagntica atravessa uma amostra, certas frequncias podem ser seletivamente removidas por absoro, um processo pelo qual a energia eletromagntica transferida para os tomos, ons ou molculas que compe a amostra (HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009). Cienfuegos e Vaitsman (2000) afirmam que a relao existente entre a luz transmitida e a luz incidente (pela amostra), chama-se transmitncia (T) e o valor mximo que pode ser transmitido 100%. Segundo Holler (2009) e colaboradores, a absorbncia a frao da radiao que absorvida pela amostra e definida pela equao: A = - log T Para uma radiao monocromtica (apenas um comprimento de onda), a absorbncia diretamente proporcional ao caminho b, percorrido pela radiao atravs do meio, e concentrao c da espcie absorvente (HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009). Essas relaes so dadas pela Lei de Beer: A = a.b.c

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onde a uma constante chamada de absortividade molar, caracterstica de cada substncia e em cada comprimento de onda (HARRIS, 2008; HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009). A espectrofotometria UV-Vis (ultravioleta-visvel) um dos mtodos analticos mais usados nas determinaes analticas em diversas reas. A regio ultravioleta do espectro geralmente considerada na faixa de 200 a 400 nm, e a regio do visvel entre 400 a 800 nm (VINAD, VINAD, 2005). Para avaliar a regio espectral correta, deve-se elaborar o espectro de absoro, que consiste em relacionar as absorbncias em funo dos respectivos comprimentos de onda. Atravs do espectro de absoro possvel determinar o comprimento de onda em que o analito absorve melhor a radiao; o espectro de absoro caracterstico de cada espcie qumica e pode ser traduzido como a impresso digital desse composto (VINAD, VINAD, 2005).

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4 MATERIAIS E MTODOS

O presente trabalho foi realizado utilizando duas tcnicas para a quantificao de cafena (cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e espectrofotometria) em 03 (trs) marcas de energticos. As anlises foram realizadas em triplicata.

4.1 CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE)

Inicialmente, utilizou-se um cromatograma de cafena (fornecido pelo laboratrio), onde pode-se identificar qual o comprimento de onda (max.) em que a cafena tem a sua melhor absoro e o tempo de reteno da cafena indicado no canto superior direito da Figura 2.

Figura 2 Cromatograma do padro de cafena Fonte: Central de Anlises da UTFPR Campus Pato Branco.

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Em seguida, foram feitas solues padro de cafena em gua ultrapura (obtida por filtrao membranar) de concentraes 1,0 ppm, 5,0 ppm, 10 ppm, 25 ppm e 50 ppm. Estas solues foram analisadas no CLAE por um tempo de 15 minutos a 272 nm, e pode-se obter uma curva padro e a equao da reta, que indicam a relao entre a concentrao de cafena e a rea do pico no cromatograma. Para a determinao da concentrao de cafena nas bebidas energticas, estas foram homogeneizadas e transferidas para bquer de 250 mL e submetidas a ultrassom por 5 minutos para a eliminao do gs carbnico. Em seguida, foram diludos a 10% e analisados no CLAE em triplicata.

4.2 ESPECTROFOTOMETRIA

4.2.1 Extrao

O mtodo espectrofotomtrico utilizado para a extrao de cafena foi adaptado de Alves e Bragagnolo (2002). Dissolveu-se, num erlenmeyer, 5 g de xido de magnsio no energtico a ser analisado (frasco de aproximadamente 250 mL). Em seguida, aqueceu-se a mistura em chapa de aquecimento e agitao constante, por 45 minutos. Aps o resfriamento, filtrou-se a mistura para um funil de separao, atravs de um funil de vidro com papel filtro, adicionou-se este 4 mL de cido sulfrico 10% e o sistema foi homogeneizado. Extraiu-se a cafena com 20 mL de clorofrmio, agitando vigorosamente o sistema, deixando a fase clorofrmica separar e transferindo-a para outro funil de separao. Esta extrao foi repetida 5 vezes, sempre transferindo a fase clorofrmica para o mesmo funil de separao. Na fase de clorofrmio, foi adicionado 5 mL de hidrxido de potssio a 1%, agitou-se a mistura por 1 minuto e deixou-se separar as fases. A fase clorofrmica foi filtrada, atravs de um funil de vidro com algodo, para um balo volumtrico de 100 mL e completou-se o volume com clorofrmio. O extrato foi guardado em geladeira at ser analisado no espectrofotmetro.

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4.2.2 Espectrofotometria

Preparou-se 5 solues padro de cafena em clorofrmio, em bales volumtricos de 50 mL com as seguintes concentraes: 4,64 ppm, 9,28 ppm, 13,92 ppm, 18,56 ppm e 23,2 ppm. Calibrou-se o espectrofotmetro com um branco de clorofrmio e construiu-se a curva de calibrao 272 nm (max. da cafena), da absorbncia em funo da concentrao dos padres. Fizeram-se as leituras das amostras, tambm contra um branco de clorofrmio, e foi calculada a concentrao de cafena atravs da equao da reta encontrada na curva de calibrao.

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5 RESULTADOS E DISCUSSO

Os padres de cafena de 1,0 ppm, 5,0 ppm, 10 ppm, 25 ppm e 50 ppm foram analisados no CLAE por 15 minutos no comprimento de onda de 272 nm (max. da cafena). Nas Figuras 3, 4, 5, 6, 7 so apresentados os cromatogramas dos respectivos padres de cafena.

Figura 3 - Cromatograma do padro de cafina a 1,0 ppm em 272 nm Fonte: Prpria.

Figura 4 - Cromatograma do padro de cafena a 5,0 ppm em 272 nm Fonte: Prpria.

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Figura 5 - Cromatograma do padro de cafena de 10 ppm a 272 nm Fonte: Prpria.

Figura 6 - Cromatograma do padro de cafena de 25 ppm a 272 nm Fonte: Prpria.

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Figura 7 - Cromatograma do padro de cafena de 50 ppm a 272 nm Fonte: Prpria.

Atravs dos cromatogramas acima pode-se verificar que o tempo de reteno da cafena de aproximadamente 3,1 minutos, e que quanto maior a concentrao de cafena, maior ser a rea do pico, ou seja, maior a intensidade do sinal. A partir dos relatrios de cada soluo padro gerados por CLAE, pode-se obter os valores exatos da rea do pico, e com esses dados pode-se construir uma curva padro de cafena (Figura 8) na qual se apresentam a rea do pico do cromatograma em funo da concentrao de cafena.

Figura 8 - Curva padro de cafena obtida atravs de CLAE Fonte: Prpria.

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Em seguida, analisaram-se os energticos A, B e C no CLAE por 10 minutos, em triplicata, no comprimento de onda de 272 nm (max. da cafena). Nas figuras abaixo, so apresentados os cromatogramas dos respectivos energticos.

Figura 9 - Replicata 1 da anlise do energtico A 10% em CLAE Fonte: Prpria.

Figura 10 - Replicata 2 da anlise do energtico A 10% em CLAE Fonte: Prpria.

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Figura 11 - Replicata 3 da anlise do energtico A 10% em CLAE Fonte: Prpria.

Figura 12 - Replicata 1 da anlise do energtico B 10% em CLAE Fonte: Prpria.

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Figura 13 - Replicata 2 da anlise de energtico B 10% em CLAE Fonte: Prpria.

Figura 14 - Replicata 3 da anlise do energtico B 10% em CLAE Fonte: Prpria.

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Figura 15 - Replicata 1 da anlise do energtico C 10% em CLAE Fonte: Prpria.

Figura 16 - Replicata 2 da anlise do energtico C 10% em CLAE Fonte: Prpria.

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Figura 17 - Replicata 3 da anlise do energtico C 10% em CLAE Fonte: Prpria.

Nos cromatogramas apresentados pode-se observar claramente o pico que representa a cafena presente nas amostras, no tempo de reteno aproximado de 3,1 minutos. As concentraes de cafena presentes nos energticos A, B e C, foram calculadas utilizando a equao da reta da curva padro de cafena (Figura 8), y = 0,8348x + 1,1869, na qual y representa a rea do pico e x representa a concentrao de cafena. Os valores de rea do pico de cada replicata dos energticos utilizados nos clculos foram retirados dos relatrios gerados pelo cromatgrafo. Na Tabela 1 so apresentados os resultados das anlises com CLAE, cujos dados foram submetidos a anlise de varincia e teste de Tukey tendo sido obtido uma diferena mnima significativa () de 40,2179 que aplicada as mdias de concentrao de cafena obtidas pelo mtodo cromatogrfico geraram os coeficientes de diferenciao conforme notao indicada na Tabela 1. De uma forma geral, segundo o teste de Tukey as concentraes de cafena nos produtos analisados diferiram significativamente entre si tendo o energtico A e C apresentado a maior e a menor concentrao de cafena respectivamente.

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Tabela 1 - Concentraes de cafena encontradas nas diferentes marcas de energticos analisados atravs do mtodo cromatogrfico (CLAE) Concentrao de cafena (mg/L) Energtico A B Replicata 1 280,46 337,96 Replicata 2 290,05 376,30 Replicata 3 296,04 354,73 Mdia 288,85 356,33
b a

Desvio padro 7,85 19,22

C 153,49 189,42 184,63 175,84 19,50 Mdias seguidas de letras iguais no diferem significativamente entre si ao nvel de 5% de probabilidade. Fonte: Prpria.

Com relao ao mtodo espectrofotomtrico, foram realizadas as extraes da cafena nos trs energticos em triplicata. Os extratos foram obtidos em bales volumtricos de 100 mL e completados os seus volumes com clorofrmio. Para a determinao da concentrao de cafena nos extratos foi construda uma curva de calibrao (Figura 18) com cinco padres de diferentes concentraes de cafena e medindo suas respectivas absorbncias em espectrofotmetro a 272 nm (max. da cafena).

Figura 18 - Curva de calibrao obtida atravs de espectrofotmetro Fonte: Prpria.

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Em seguida, foram feitas as leituras dos extratos de cafena dos energticos A, B e C em espectrofotmetro no mesmo comprimento de onda. Na Tabela 2 so mostrados os valores de absorbncia de cada extrato.

Tabela 2 - Valores de absorbncia a 272 nm correspondente ao extrato de cada replicata dos energticos Energtico A A A B B B C C C Fonte: Prpria. Replicata 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Absorbncia a 272 nm 0,25 0,241 0,233 0,183 0,184 0,186 0,072 0,07 0,068

As concentraes de cafena nos energticos analisados foram determinadas atravs da equao da reta da curva de calibrao de cafena (Figura 18), y = 0,0485x 0,1115, na qual y representa a absorbncia e x a concentrao de cafena em mg/L. Na Tabela 3, so apresentados os resultados para as concentraes de cafena nos energticos atravs do mtodo espectrofotomtrico. Os dados foram submetidos anlise de varincia e teste de Tukey tendo sido obtido uma diferena mnima significativa () de 10,5607 que aplicada as mdias geraram os coeficientes de diferenciao conforme notao indicada. De uma forma geral, segundo o teste de Tukey as concentraes de cafena nos produtos analisados diferiram significativamente entre si tendo o energtico A e C apresentado a maior e a menor concentrao de cafena, respectivamente.

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Tabela 3 - Concentraes de cafena encontradas nas diferentes marcas de energticos analisados atravs do mtodo espectrofotomtrico Conc. de cafena (mg/L) Energticos A B Replicata 1 298,14 242,89 Replicata 2 290,72 243,71 Replicata 3 284,12 245,36 Mdia 290,99 243,98
b a

Desvio padro 7,01 1,25

C 145,52 143,93 142,35 143,93 1,58 Mdias seguidas de letras iguais no diferem significativamente entre si ao nvel de 5% de probabilidade. Fonte: Prpria

Atravs da Tabela 4, pode se observar que, em comparao aos dois mtodos de quantificao de cafena em energticos, apenas para o energtico A o mtodo espectrofotomtrico apresentou um valor maior de cafena, para B e C o mtodo CLAE se sobressaiu apresentando resultados mais satisfatrios. Observando os resultados encontrados, pode-se concluir que nos energticos B e C, a concentrao de cafena encontrada excede o valor prescrito no rtulo do produto, e que para o energtico A, este valor se encontra a baixo do prescrito. Aps aplicao do mesmo tratamento estatstico antes mencionado (analise de varincia seguido do teste de Tukey) foram obtidas as diferenciaes indicadas na Tabela 4. Segundo estes resultados possvel inferir que o mtodo de referncia (CLAE) e o mtodo em estudo (espectrofotomtrico) concordam entre si para a anlise do analito para o caso dos energticos A e C e discordam apenas para o caso do energtico B

Tabela 4 - Comparao entre as concentraes de cafena quantificadas pelos dois mtodos em estudo e comparao com os dados fornecidos na embalagem do produto Mdia das concentraes de cafena (mg/L) Energticos A B Espectrofotmetro 290,9933 243,9867
aA bA aA

CLAE 288,8500 356,3300


aA bB aA

Rtulo do energtico 320 320

C 143,9333 175,8467 146,15 Letras minsculas seguidas de letras iguais nas colunas e letras maisculas seguidas de letras iguais nas linhas no diferem significativamente entre si ao nvel de 5% de probabilidade. Fonte: Prpria.

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O teste de Tukey aplicado aos resultados apresentados na tabela 4, mostra que para os energticos A e C, as concentraes de cafena determinada pelos dois mtodos de anlise, no diferem significativamente entre si ao nvel de 5% de probabilidade. O mesmo foi observado por Alves e Bragagnolo (2002), quando da quantificao de cafena por espectrofotometria e cromatografia em amostras de chs. J para o energtico B pode-se observar diferena nos resultados entre os dois mtodos, isso se deve ao fato de que, nos cromatogramas do energtico B, nas replicatas 2 e 3, pode se observar a interferncia de outra substncia que possui um tempo de reteno muito prximo ao da cafena ocasionando uma sobreposio entre dois picos. Nas Figuras 19 e 20 pode-se observar o pico de cafena e do suposto alcaloide, respectivamente. Pode-se confirmar que o pico apresentado no tempo de reteno de 3,1 minutos o da cafena, pois este indica uma substncia que possui um max. de 272 nm caracterstico da cafena. O pico que se apresenta sobreposto ao da cafena, representa uma substncia que possui um max. de 226 nm, dentro da faixa de absoro de compostos aromticos.

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Figura 19 - Pico que representa a cafena no energtico B Fonte: Prpria.

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Figura 20 - Pico que representa a substncia interferente Fonte: Prpria.

Esse fato indica a provvel presena de outro alcaloide na composio do energtico B e justifica a diferena nos resultados encontrados nos dois mtodos para o energtico em questo, pois para o mtodo espectrofotomtrico foi necessrio um procedimento de extrao da cafena, e durante esta etapa, alm da cafena, pode ter sido extrado outra substncia que, mesmo utilizando um comprimento de onda mximo para a absoro de radiao pela cafena, pode ter interferido no valor da absorbncia e consequentemente no valor da concentrao de cafena. Portanto, considerando a boa aproximao dos resultados dos dois mtodos para os energticos A e C, e a justificvel diferena para o energtico B, pode-se afirmar que o mtodo espectrofotomtrico tambm pode ser utilizado como um mtodo alternativo de quantificao de cafena em laboratrios que no tem equipamentos mais sofisticados. Mas este mtodo possui uma seletividade limitada,

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pois outras metilxantinas ou outras substncias aromticas podem influenciar no resultado final, o que tambm foi observado por Alves e Bragagnolo (2002), quando da quantificao de cafena por espectrofotometria e cromatografia em amostras de chs.

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CONCLUSO

Atravs deste estudo pode-se concluir que os resultados apresentados para a concentrao de cafena nos energticos analisados indicaram grande aproximao entre os resultados do mtodo espectrofotomtrico e o cromatogrfico, mesmo com a justificvel diferena para uma das amostras. Portanto, o mtodo espectrofotomtrico apresenta-se como um mtodo alternativo de quantificao de cafena em laboratrios de ensino e pesquisa que ainda no possuem um mtodo padro, mas apresenta uma baixa seletividade com relao a CLAE, pois outras substncias aromticas podem interferir nos resultados de quantificao do alcaloide estudado. Ao analisarmos os valores detectados em relao legislao, que prev a adio de cafena como ingrediente no limite mximo de 350 mg/L, verificamos que apenas uma amostra de energtico (B), est ligeiramente acima do valor permitido (356,33 mg/L).

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REFERNCIAS

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