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PRODUO DE POLIHIDROXIALCANOATOS POR CUPRIAVIDUS NECATOR USANDO CIDO ACRLICO COMO FONTE DE CARBONO

Leandro Finkler

TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAO DOS PROGRAMAS DE PS-GRADUAO DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS

NECESSRIOS PARA A OBTENO DO GRAU DE DOUTOR EM CINCIAS EM ENGENHARIA QUMICA.

Aprovada por: ________________________________________________ Prof. Tito Livio Moitinho Alves, D.Sc.

________________________________________________ Prof. Jos Carlos Costa da Silva Pinto, D.Sc.

________________________________________________ Profa. Denise Maria Guimares Freire, D. Sc.

________________________________________________ Prof. Mrcio Nele de Souza, D.Sc.

________________________________________________ Prof. Marco Di Luccio, D. Sc.

RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL FEVEREIRO DE 2006

FINKLER, LEANDRO Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono [Rio de Janeiro] 2006 IX, 144 p. 29,7 cm (COPPE/UFRJ, D.Sc., Engenharia Qumica, 2006) Tese - Universidade Federal do Rio de Janeiro, COPPE 1. Produo de polihidroxialcanoatos 2. Processo de separao 3. Monitoramento de processo 4. Bioreator coluna de bolhas I. COPPE/UFRJ II. Ttulo ( srie )

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Pedras no caminho? Guardo todas, um dia vou construir um castelo...

Fernando Pessoa

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Dedico sem dvida alguma a meus pais Elio e Isolde que sempre me incentivaram a acreditar nos meus sonhos desde h 16 anos quando sa de casa para estudar e no parei mais, e tambm a meus irmos Cristiano e Francieli que mesmo nos poucos encontros dos ltimos anos sempre nos fizemos famlia.

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AGRADECIMENTOS

Aos professores Tito Livio Moitinho Alves e Jos Carlos Costa da Silva Pinto por supervisionarem os trabalhos.

Ao sempre lembrado e bom velhinho Professor Giulio Massarani que nos nicos 20 minutos de conversa, marcados no relgio, que tivemos, conseguiu me apresentar um pesquisador autntico.

Aos colegas e tcnicos dos diferentes laboratrios do PEQ: LMSCP, LabBio, LSP, LabPol, PAM, NUCAT pelo auxlio nas atividades.

Aos amigos de todas as horas Mrcio Schwaab, Paulo Farinas e Nielson pelo companheirismo na repblica na Ilha do Governador.

Christine Lamenha Luna por disponibilizar o seu tempo, sua alegria, sua pacincia, seus conselhos, sua compreenso e seu afeto.

Aos meus familiares, por acreditarem que chegar aqui no era apenas um sonho de um menino da pequena cidade de Selbach.

Ao CNPq pelo apoio financeiro na forma de bolsa.

Resumo da Tese apresentada COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessrios para a obteno do grau de Doutor em Cincias (D.Sc.)

PRODUO DE POLIHIDROXIALCANOATOS POR CUPRIAVIDUS NECATOR USANDO CIDO ACRLICO COMO FONTE DE CARBONO

Leandro Finkler

Fevereiro/2006

Orientadores: Tito Livio Moitinho Alves Jos Carlos Costa da Silva Pinto

Programa: Engenharia Qumica Neste trabalho foi desenvolvido um processo para produo de

polihidroxialcanoatos a partir de clulas bacterianas de Cupriavidus necator DSM 545 utilizando cido acrlico como nica fonte de carbono. O alto custo de produo de polihidroxialcanoatos exige que certas estratgias de operao no convencionais sejam adotadas. No presente trabalho algumas destas estratgias foram estudadas, tais como: I) monitoramento da produo de biomassa em cultivos em meio complexo (caldo nutriente) atravs do emprego de uma sonda de potencial redox para sinalizar o final da fase de crescimento das clulas; II) concentrao de clulas cultivadas em meio complexo utilizando os agentes floculantes tanino (2800 mg/L) e sulfato de alumnio (800 mg/L), com posterior sedimentao para recuperao do concentrado; III) desenvolvimento de biorreatores no convencionais, como um biorreator tipo coluna de bolhas, assistido por membrana de dilise proposto neste trabalho de forma inovadora. Os resultados obtidos mostram que as clulas consomem cido acrlico a uma taxa de 0,01 g/L.h para crescimento celular e 0,18 g/L.h para manuteno em condio washed cells. O potencial redox pode ser utilizado com eficincia para o monitoramento do crescimento em meio complexo, bem como para determinar a alimentao do biorreator coluna de bolhas. As clulas concentradas a partir da adio de sulfato de alumnio como agente floculante mostraram menor inibio da atividade metablica, quando comparada adio de tanino.

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Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)

PRODUCTION OF POLYHYDROXYALKANOATES FROM CUPRIAVIDUS NECATOR USING ACRYLIC ACID AS CARBON SOURCE

Leandro Finkler

February/2006

Advisors: Tito Livio Moitinho Alves Jos Carlos Costa da Silva Pinto

Department: Chemical Engineering A process for production of polyhydroxyalkanoates by Cupriavidus necator DSM 545 using acrylic acid as the single carbon source was developed. The high costs to produce polyhydroxyalkanoates requires non-conventional production strategies, such as those analyzed in the present work: I) monitoring of the bacterial cells concentration using a redox probe to indicate the end of the growth phase of C. necator cells in broth nutrient medium; II) concentration of bacterial cells produced in complex medium by using the flocculating agents tannin (2800 mg/L) and aluminum sulphate (800 mg/L), with posterior sedimentation to obtain a concentrate of cells; III) development of non-conventional bioreactors, such as a bubble column bioreactor assisted by dialysis membrane, which was originally designed in the present work. The results obtained indicate that C. necator uses acrylic acid at rate 0,01 g/L.h to cellular grow and 0,18 g/L.h to maintaining in washed cells condition. Redox potential can be employed efficiently for monitoring growth of the bacterial cells in complex medium, and to define the feeding time in bubble column bioreactor. Concentrate of bacterial cells obtained through aluminum sulphate addition presented lower inhibition effect on the metabolic activity when compared to tannin addition.

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Partes desta tese foram apresentadas e publicadas em anais de congressos. Este trabalho foi financiado pelo CNPq: FINKLER, L., PINTO, J.C., ALVES, T.L.M., Acrylic acid consumption by Cupriavidus necator DSM 545 using resting cells system, XV Simpsio Nacional de Bioprocessos, 2005, Recife, Brasil. FINKLER, L., PINTO, J.C., ALVES, T.L.M., Use of byproducts of the bean industry for polyhydroxyalkanoates production, 4o Congresso Mercosul de Engenharia Qumica, 2005, Rio de Janeiro, Brasil. FINKLER, L., LUNA, C.L., PINTO, J.C., ALVES, T.L.M., Concentrao de clulas de Ralstonia eutropha DSM 545, Congresso Brasileiro de Sistemas Particulados/ENEMP, 2004, Uberlndia, Brasil. FINKLER, L., PINTO, J.C., ALVES, T.L.M., Utilizao de fontes alternativas de carbono para produo de polihidroxialcanoatos por Ralstonia eutropha DSM 545, Congresso Brasileiro de Engenharia Qumica, 2004, Curitiba, Brasil.

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NDICE GERAL

Captulo 1. Captulo 2. Captulo 3. Captulo 4.

Introduo .................................................................................... Polihidroxialcanaoatos ................................................................ Cupriavidus necator DSM 545 e o cido acrlico ....................... Estratgias para biodegradao de cido acrlico visando a produo de polihidroxialcanaotos por Cupriavidus necator DSM 545 .......................................................................................

1 8 25

50 69

Captulo 5. Captulo 6.

Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545... Concentrao de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 por floculao/sedimentao ......................................................

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Captulo 7.

Utilizando um bioreator no convencional para cultivo de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 e biodegradao de cido acrlico visando a produo de polihidroxialcanoatos ... 119 138 141

Captulo 8.

Concluses e Sugestes ................................................................ Anexos ..........................................................................................

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CAPTULO 1 Introduo
ndice 1.1. Introduo ......................................................................................................... 1.2. Referncias bibliogrficas ................................................................................. 2 5

CAPTULO 1 Introduo

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

1.1. Introduo A preocupao com a poluio do ambiente vem ganhando cada dia mais importncia, haja vista o crescente aumento da populao mundial e o grande intervalo de tempo necessrio para a degradao dos resduos. Uma alternativa vem sendo desenvolvida como uma tentativa de substituir os polmeros de origem de derivados do petrleo por biopolmeros, cuja vantagem principal est no menor tempo necessrio para biodegradao. Muitos trabalhos so publicados com o objetivo de apresentar solues para minimizar os custos de produo de biopolmeros, em especial daqueles pertencentes classe dos polihidroxialcanoatos (PHAs). Os trabalhos descrevem experincias com diferentes tipos de clulas procariotas (POIRIER et al., 1995), eucariotas (leveduras (BREUER et al., 2002) e plantas (POIRIER, 2002; SNELL e PEOPLES, 2002)). Em alguns, estratgias de cultivo contnuo (KOYAMA e DOI, 1995; PREUSTING et al., 1991) ou descontnuo (KOYAMA e DOI, 1993), com linhagens selvagens, mutantes ou recombinantes (HUISMAN et al., 1992; PRIETO et al., 1999) so estabelecidas para maximizar a produo de massa celular e atingir alta densidade (RYU et al., 1997) no biorreator, a fim de aumentar a produtividade. Em outros, proposta a utilizao de substratos alternativos para utilizao na produo de polihidroxialcanoatos (BRAUNEGG et al., 1998; RUSENDI e SHEPPARD, 1995; MARANGONI et al., 2001). A combinao de substratos pode resultar na biossntese de polihidroxialcanoatos com propriedades distintas, em especial quando as clulas so capazes de sintetizar co-polmeros (DU et al., 2001; MANTZARIS et al., 2001), que melhoram as propriedades do polmero final e facilita a confeco de utenslios em geral. Tambm h a preocupao com a etapa de downstream, como por exemplo a utilizao de agentes floculantes para separao das clulas (RYU et al., 2000; JUNG et al., 2005), permitindo a economia de energia com a centrifugao e a reduo do custo final da produo. Quanto ao destino do produto final, este depende da sua composio e da pureza obtida na etapa de extrao, uma vez que a etapa de extrao pode modificar algumas propriedades do material como a distribuio de massa molar, e no retirar toda a impureza incrustrada ao biopolmero (RAMSAY et al., 1994; CHEN et al., 1999). Dessa forma, a presente tese de doutorado tem como objetivo principal desenvolver um processo que permita a biodegradao de cido acrlico por clulas de

CAPTULO 1 Introduo

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Cupriavidus necator DSM 545, visando a produo de polihidroxialcanoatos. As clulas cultivadas em meio complexo, monitorado pela variao do potencial redox, so concentradas pela adio de um agente floculante e este concentrado utilizado na cmara interna (zona de biorreao) de um biorreator assistido por membrana de dilise construdo no Laboratrio de Bioprocessos. A alimentao de cido acrlico como fonte de carbono realizada atravs da membrana, devido variao do gradiente de concentrao do cido. No Captulo 2 feita uma reviso sobre os polihidroxialcanoatos, enfatizando aqueles produzidos por Cupriavidus necator*, nova nomeao para Ralstonia eutropha (VANDAME e COENYE, 2004). No Captulo 3 so apresentados os resultados referentes aos ensaios de crescimento das clulas em cido acrlico. Tambm so apresentados resultados referentes definio da concentrao de cido acrlico que inibe o crescimento de C. necator e os referentes ao monitoramento do crescimento celular pela variao dos valores da densidade tica e do pH. No Captulo 4 so apresentadas as estratgias para a produo de PHAs por C. necator a partir do cido acrlico. Primeiramente, as clulas de C. necator foram transferidas para um meio de cultura sem a presena de fonte de nitrognio; numa segunda estratgia, a alimentao de cido acrlico foi realizada atravs do controle do pH do meio de cultura durante o cultivo celular; e por ltimo, a massa celular de C. necator foi concentrada e utilizada num sistema washed cells. Tendo sido definido o sistema washed cells para a continuao dos trabalhos, no Captulo 5 apresentado o monitoramento do crescimento de clulas de C. necator em meio complexo, a partir da variao dos valores de potencial redox e da correlao destes valores com a concentrao de massa celular. Alm disso, verificar se a relao entre potencial redox e biomassa verdadeira quando observada em um sistema de microfiltrao utilizando membranas de fibras ocas. A fim de obter o concentrado celular para o sistema washed cells, no Captulo 6 apresentada a etapa de concentrao de clulas de C. necator pelo processo de floculao/sedimentao, tendo sido utilizados os agentes de floculao tanino e sulfato de alumnio. Para cada um dos agentes floculantes, os flocos foram caracterizados quanto densidade, dimetro mdio e distribuio de tamanhos, avaliando-se ainda a capacidade operacional de um sedimentador contnuo a partir de testes de sedimentao

O nome Ralstonia eutropha ser mantido na Reviso Bibliogrfica sendo substitudo por Cupriavidus necator em Materiais e Mtodos, Resultados e Discusso e Concluses.

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em batelada. Alm disso, tambm foi avaliado o efeito dos agentes floculantes sobre a atividade das clulas, quando estas foram inoculadas em meio caldo nutriente. No Captulo 7 apresentado um desenho de um biorreator no convencional assistido por membrana de dilise. Tambm so apresentados os resultados obtidos a partir do uso deste equipamento para crescimento de clulas de C. necator, com alimentao descontnua de caldo nutriente sinalizada pela variao do potencial redox do meio de cultivo, e para suprimento de cido acrlico ao concentrado celular mantido no interior da membrana. As concluses gerais e as sugestes para trabalhos futuros so apresentadas no Captulo 8. Os trabalhos desenvolvidos em cada captulo permitem propor a seqncia de um processo, conforme observado no fluxograma da Figura 1.1.
Hidrolisado Protico ou cido Acrlico Substrato Efluente isento de cido acrlico

S
Monitoramento REDOX

Cupriavidus necator DSM 545

2X

Concentrao Separao

Biocatalisador Caixa Preta

Extrao

Reciclo

PHA

Figura 1.1. Fluxograma para um processo alternativo para biodegradao de cido acrlico e verificao da produo de polihidroxialcanoatos. Na primeira etapa do processo proposto (Figura 1.1), a obteno de massa de clulas de C. necator DSM 545 a partir de meios complexos (hidrolisado protico) tem um forte apelo uma vez que grande a variedade de efluentes industriais que tambm no possuem uma composio qumica definida, mas esto disponveis a preos muito baixos. O crescimento de clulas em meio complexo pode ser monitorado por uma

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sonda que mede a variao do potencial redox do meio de cultivo. Esta forma de monitoramento interessante, pois a sonda barata e a aquisio dos dados simples. A etapa de concentrao de clulas proposta ao processo uma vez que importante, em processos de biodegradao ou de produo de biopolmeros, trabalhar com alta densidade celular para aumentar a produtividade e/ou taxa de biodegradao de um composto xenobitico. Uma maneira de conseguir alta densidade celular a partir de clulas crescidas em meio complexo atravs da adio de agentes floculantes seguida de sedimentao. O concentrado celular pode ser utilizado em um processo de biodegradao em um bioreator coluna de bolhas, cuja parede uma membrana de dilise que permite haver o suprimento de cido acrlico como fonte de carbono a partir da variao do gradiente de concentrao; ou reciclado para obter maior volume de concentrado celular, ou ainda conduzido para extrao do biopolmero.

1.2. Referncias bibliogrficas BRAUNEGG, G., LEFEBVRE, G., GENSER, K, 1998, Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: physiological and engineering aspects, Journal of Biotechnology, v. 65, pp. 127-161. BREUER, U., TERENTIEV, Y., KUNZE, G., BABEL, W., 2002, Yeast as producer of polyhydroxyalkanoates: genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae, Macromolecular Bioscience, v. 2, pp. 380-386. CHEN, Y., CHIEN, J., YU, C., DU, G. LUN, S., 1999, Recovery of poly-3hydroxybutyrate from Alcaligenes eutrophus by surfactant-chelate aqueous system, Process Biochemistry, v. 34, pp. 153-157. DU, G.C., CHEN, J., YU, J., LUN, S., 2001, Feeding strategy of propionic acid for production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) with Ralstonia eutropha, Biochemical Engineering Journal, v. 8, pp. 103-110. HUISMAN, G.W., WONINK, E., de KONING, G., PREUSTING, H., WITHOLT, B., 1992, Synthesis of poly(3-hydroxyalkanoates) by mutant and recombinant Pseudomonas strains, Applied Microbiology and Biotechnology, v. 38, pp. 1-5. JUNG, I.L., PHYO, K.H., KIM, K.C., PARK, H.K., KIM, I.G., 2005, Spontaneous liberation of intracellular polyhydroxybutyrate granules in Escherichia coli, Research in Microbiology, v. 156, pp. 865-873.

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KOYAMA, N., DOI, Y., 1993, Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate) from various carbon sources by batch-fed cultures of Alcaligenes eutrophus, Journal of Environmental Polymer Degradation, v. 3, pp. 235-240. KOYAMA, N., DOI, Y., 1995, Continuous production of poly(3-hydroxybutyrate-co3-hydroxyvalerate) by Alcaligenes eutrophus, Biotechnolgy Letters, v. 17, pp. 281-284. MANTZARIS, N.V., KELLEY, A.S., SRIENC, F., 2001, Optimal carbon source switching strategy for the production of PHA copolymers, AIChE Jounal, v. 47, pp. 727-743. MARANGONI, C., FURIGO Jr., A., ARAGO, G.M.F., 2001, The influence of substrate source on the growth of Ralstonia eutropha, aiming at the production of polyhydroxyalkanoate, Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 18, pp. 175-180. POIRIER, Y., NAWRATH, C., SOMERVILLE, C., 1995, Production of polyhydroxyalkanoates a family of biodegradable plastics and elastomers in bacteria and plants, Biotechnology, v. 13, p. 142-150. POIRIER, Y., 2002, Polyhydroxyalkanate synthesis in plants as a tool for biotechnology and basic studies of lipid metabolism, Prog. Lipid. Res., v. 41, pp. 131-155. PREUSTING, H., KINGMA, J., WITHOLT, B., 1991, Physiology and polyester formation of Pseudomonas oleovorans in continuous two-liquid phase culture, Enzyme Microbiology Technology, v. 13, pp. 770-780. PRIETO, M.A., KELLERHALS, M.B., BOZZATO, G.B., RADNOVIC, B., WOTHOLT, KESSLER, B., 1999, Engineering of stable recombinant bacteria for production of chiral medium-chain-length poly-3-hydroxyalkanoates, Applied and Environmental Microbiology, v. 65, pp. 3265-3271. RAMSAY, J.A.; BERGER, E., VOYER, R., CHAVARIE, C., RAMSAY, B.A., 1994, Extraction of poly-3-hydroxybutyrate using chlorinated solvents, Biotechnology Techniques, v. 8, pp. 589-594. RUSENDI, D., SHEPPARD, J.D., 1995, Hydrolysis of potato processing waste for the production of poly--hydroxybutyrate, Bioresource Technology, v. 54, pp. 191196.

CAPTULO 1 Introduo

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RYU, H.W., HAHN, S.K., CHANG, Y.K., CHANG, H.N., 1997, Production of poly(3-hydroxybutyrate) by high cell density fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with phosphate limitation, Biotechnology and Bioengineering, v. 55, pp. 28-32. RYU, H.W., CHO, K.S., LEE, E.G., CHANG, Y.K., 2000, Recovery of poly(3hydroxybutyrate) from coagulated Ralstonia eutropha using a chemical digestion method, Biotechnology Progress, v. 16, pp. 676-679. SNELL, K.D., PEOPLES, O.P., 2002, Polyhydroxyalkanoate polymers and their production in transgenic plants, Metabolic Engineering, v. 4, pp. 29-40. VANDAME, P., COENYE, T., 2004, Taxonomy of the genus Cupriavidus: a tale of lost and found, International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, v 54, pp. 2285-2289.

CAPTULO 2 Polihidroxialcanoatos
ndice 2.1. Conceito ......................................................................................................... 2.2. Microrganismos produtores de polihidroxialcanoatos ................................... 2.2.1. Organismos recombinantes produtores de polihidroxialcanoatos ............... 2.2.1.1. Bactrias ................................................................................................... 2.2.1.2. Plantas ...................................................................................................... 2.3. Bioqumica das reaes .................................................................................. 2.4. Vias de biossntese de polihidroxialcanoatos ................................................. 2.5. Extrao dos polihidroxialcanoatos ............................................................... 2.6. Propriedades dos polihidroxialcanoatos ......................................................... 2.7. Aplicaes dos polihidroxialcanoatos ............................................................ 2.8. Biodegradao de polihidroxialcanoatos ....................................................... 2.9. Dificuldades encontradas na produo de polihidroxialcanoatos .................. 2.10. Referncias bibliogrficas ............................................................................ 9 9 10 10 10 11 12 13 13 18 18 19 20

CAPTULO 2 Polihidroxialcanoatos

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

2.1. Conceito Os polihidroxialcanoatos (PHAs) so materiais de reserva de energia e carbono (BYROM, 1987) acumulados como incluses de polisteres insolveis (hidrofbicos) no citoplasma (DAWES e RIBBONS, 1962). Uma ampla variedade de microrganismos acumula PHAs para realizao de snteses metablicas e crescimento (STEINBCHEL e FCHTENBUSCH, 1998). Isto ocorre quando h condies desfavorveis de crescimento (DU et al., 2001a) na presena de excesso de carbono (STEINBCHEL e FCHTENBUSCH, 1998, DU et al., 2001b). A condio desfavorvel ao crescimento gerada pela exausto de algum nutriente, tal como nitrognio, fsforo, enxofre, oxignio (LINKO et al., 1993, KIM et al., 1994, LEE et al., 1996b, STEINBCHEL e FCHTENBUSCH, 1998), magnsio (LEE et al., 1996b, LEE e CHOI, 1999), potssio ou ferro (LEE et al., 1996b, KESSLER e WITHOLT, 2001). Os PHAs so constituintes intracelulares produzidos a partir de vrios hidroxialcanoatos, podendo corresponder a 90% do massa celular (MADISON e HUISMAN, 1999, TSUGE, 2002, REDDY et al., 2003).

2.2. Microrganismos produtores de polihidroxialcanoatos Atualmente existem pelo menos 75 gneros diferentes de microrganismos j conhecidos produtores de poli3-hidroxibutiratos P(3HB) (MADISON e HUISMAN, 1999, REDDY, 2003). Ralstonia eutropha (atualmente denominada Cupriavidus necator (VANDAME e COENYE, 2004)) o organismo mais usado para a sua produo porque cresce facilmente e acumula grande quantidade de biopolmero (acima de 80 % do peso seco). A fisiologia e a bioqumica das reaes para sntese de P(3HB) so bem compreendidas para diferentes microrganismos (KIM et al., 1994). A bactria Ralstonia eutropha possui uma nica enzima PHA sintase, que incorpora hidroxialcanoatos (HAs) de comprimento de cadeia curta (3 a 5 tomos de carbono). Pseudomonas oleovorans possui duas isoformas de PHA sintases, que incorporam preferencialmente compostos alifticos insaturados e substitutos de 3HA de comprimento de cadeia mdio (6 a 14 tomos de carbono). A PHA sintase de Thiocapsa pfennigii apresenta a mais diversificada faixa de substratos que podem ser transformados em PHA, ou seja, menor especificidade, dentre as PHA sintases investigadas (STEINBCHEL e VALENTIN, 1995).

CAPTULO 2 Polihidroxialcanoatos

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

Vrios outros microrganismos como Bacillus megaterium, Azotobacter beijerincki, Rhizobium, Nocardia, Pseudomonas putida, Alcaligenes latus, sintetizam PHAs (KALIA et al., 2000, REDDY, 2003). Os microrganismos que tambm acumulam P(3HB) em alguma quantidade so dos gneros: Actinomycetes, Azospirilum, Bacillus, Beijerinckia, Chlorogloea, Chromatium, Derxia, Ferrobacillus, Noscardia,

Hyphomicrobium,

Lampropaedia,

Methylobacterium,

Micrococcus,

Rhizobium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Sphaerotilus, Spirillum, Streptomyces, Vibrio e Zoogloea (BYROM, 1987) alm das linhagens selvagens de cianobactrias, como Synechococcus sp MA19 (TSUGE, 2002). O operon associado biossntese de P(3HB), contendo os genes codificadores de P(3HB) sintase, -cetotiolase e acetoacetil-CoA redutase de R. eutropha, tm sido clonado em vrios procariotos, eucariotos e plantas, resultando em acmulo de P(3HB) (QI et al., 1998). Essa uma linha de investigao que vem sendo utilizada para permitir a produo de P(3HB) em quantidades e condies mais favorveis que as normalmente encontradas na natureza.

2.2.1. Organismos recombinantes produtores de polihidroxialcanoatos 2.2.1.1. Bactrias Duas estratgias de manipulao gentica podem ser consideradas para o desenvolvimento de linhagens bacterianas produtoras de PHA a partir de fontes de carbono mais baratas (LEE, 1996b): I. genes para utilizao do substrato podem ser introduzidos na clula produtora de PHA; II. genes da biossntese de PHA podem ser introduzidos em clulas no produtoras de PHA que podem utilizar substratos baratos. Os genes responsveis pela biossntese de P(3HB) em R. eutropha H16 j foram clonados e expressos em E. coli, resultando em um valor expressivo de 89 g/L de P(3HB) em um cultivo em batelada alimentada com controle de pH (KIM et al., 1994).

2.2.1.2. Plantas POIRIER et al. (1995) conseguiram sintetizar PHAs em plantas Arabidopsis transgnicas expressando genes de bactrias produtoras de PHA. O acmulo de P(3HB) em folhas variou de 20 g/g a 100 g/g, que representam valores muito inferiores aos

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CAPTULO 2 Polihidroxialcanoatos

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

da concentrao de reservas de lipdeos, que atingem 20 a 40% do peso seco. Se forem alcanados percentuais de acmulo iguais aos apresentados para os lipdeos em plantas isso poder ser uma alternativa para a reduo do custo de produo, tornando o P(3HB) um produto competitivo com os produtos plsticos derivados do petrleo.

2.3. Bioqumica das reaes A composio do PHA resultante depende muito do substrato usado (BRANDL et al., 1988, HUISMAN et al., 1989). O tipo de reao mais simples a converso de uma molcula de HA, fornecida como fonte de carbono s clulas, por uma tioquinase ou uma transferase-CoA em um tioster HA-CoA correspondente (STEINBCHEL e VALENTIN, 1995), com posterior incorporao cadeia de PHA.

Figura 2.1. Diagrama esquemtico de reaes em uma clula bacteriana (REDDY et al., 2003).

Os organismos unicelulares apresentam diferentes reaes qumicas para funes metablicas distintas. Na Figura 2.1 esto representadas trs classes de reaes, mais especificamente reaes associadas gerao de energia (Classa I), biossntese (Classe II) e polimerizao (Classe III). Essa mesma diviso das reaes pode ser analisada em relao biossntese de PHA. Na Figura 2.2 est representada a rede metablica de R. eutropha, podendo ser identificadas as etapas apresentadas na Figura 1 na gerao de energia na forma de ATP pelo conjunto de reaes r25, na biossntese de aminocidos (glutamato) pela Reao 21 e na reao de polimerizao pela Reao 28.

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G-6-P: glicose-6- fosfato; F-6-P: fructose-6-fosfato; GAP: gliceraldeido-3-fosfato; R5P: ribose-5-fosfato; PEP: fosfoenolpiruvato; PYR: piruvato; OAA: oxaloacetato; MAL: malato; SUC: succinato; SUCCoA: succinil-CoA; KG: -cetoglutarato; IsoCit: isocitrato; Glut: glutamato; Glum: cido glutmico; AcCoA: acetil-CoA; L-(-)HBCoA: L-(-)-hidroxibutiril-CoA; AcAcCoA: acetoacetil-CoA; D-(-)HB-CoA: D-(-)- hidroxibutiril-CoA;;PHB: polihidroxibutirato; ATP: adenosina tri fosfato; ADP: adenosina di fosfato; NAD: nicotinamida adenina dinucleotdeo oxidada; NADH: nicotinamida adenina dinucleotdeo reduzida; NADP+: nicotinamida adenina
P

dinucleotdeo fosfato oxidada; NADPH: nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato reduzida; CO2: dixido de carbono

Figura 2.2. Rede metablica de Ralstonia eutropha (LEE et al.,1995).

2.4. Vias de biossntese de polihidroxialcanoatos. Muitas bactrias conseguem converter acetil-CoA a D-(-)-3-hidroxibutiril-CoA, pela via do acetoacetil-CoA, dando origem ao poli-3-hidroxibutirato (Figura 2., reao 28) (ANDERSON e DAWES, 1990, STEINBCHEL e VALENTIN, 1995). A via biossinttica de P(3HB) consiste de trs reaes enzimticas catalisadas por trs enzimas diferentes (Figura 2.3). A primeira reao consiste da condensao de duas molculas de acetil-Coenzima A (acetil-CoA) em acetoacetil-CoA pela cetotiolase. A segunda reao a reduo de acetoacetil-CoA a (R)-3-hidroxibutirilCoA por uma acetoacetil-CoA desidrogenase NADPH dependente. Finalmente, os monmeros (R)-3-hidroxibutiril-CoA so polimerizados pela P(3HB) polimerase (HUISMAN et al., 1989).

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-cetotiolase

Acetoacetil CoA redutase

PHB polimerase

Acetil CoA

Acetoacetil CoA

Poli 3-OH butiril CoA

Poli 3-OH butirato

Figura 2.3. Via e enzimas envolvidas na biossntese de P(3HB) (REDDY et al., 2003).

2.5. Extrao dos polihidroxialcanoatos A extrao do biopolmero pode ser realizada de diferentes maneiras: utilizando solventes como clorofrmio, cloreto de metileno, carbonato de propileno, dicloroetano (RAMSAY et al., 1994); utilizando uma soluo aquosa de surfactante e quelato, respectivamente, betana e EDTA disdio (TSUGE, 2002); fazendo-se extrao com hipoclorito de sdio (BERGER et al., 1989, JIN et al., 1999, RIBEIRA et al., 2001) ou hipoclorito de sdio junto com clorofrmio (HAHN, 1993, HAHN, 1994); realizando-se a digesto enzimtica (LEE, 1996). A fase de extrao tambm uma fase crtica do processo, por causa do longo tempo de extrao e da possvel degradao do material polimrico.

2.6. Propriedades dos polihidroxialcanoatos O poli-3-hidroxibutirato (P(3HB)), tipo de PHA encontrado mais comumente na natureza, foi descoberto como um composto de estocagem em Bacillus megaterium em 1926 (LEMOIGNE, 1926, STEINBCHEL e VALENTIN, 1995, FULLER, 1999). Em 1932, o P(3HB) foi o primeiro polihidroxialcanoato (PHA) identificado quimicamente a partir de depsitos granulares no citoplasma de uma ampla gama de bactrias. (RAMOS-COMERZANA e MONTEOLIVA-SNCHEZ, 2000). Os PHAs produzidos por bactrias so termoplsticos completamente degradveis (MIGUEL et al., 1997) que normalmente apresentam alta massa molar, so altamente cristalinos, so oticamente ativos e isotticos, apresentam caractersticas piezoeltricas e so insolveis em gua. Por causa do conjunto particular de propriedades, so potenciais substitutos do polipropileno em vrias aplicaes (MADISON e HUISMAN, 1999).

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Como todos os polisteres, os polisteres bacterianos tambm so resistentes gua e podem ser processados por injeo e por moldagem com sopro. Contudo, em funo da alta cristalinidade, os PHAs no so flexveis o suficiente para formar filmes mas tendem a ser quebradios, o que compromete sua propriedade de barreira ao vapor dgua. Estas limitaes podem ser contornadas pelo melhoramento das formulaes de misturas com outros polmeros e/ou aditivos (HNGGI, 1995). Mais de 100 diferentes unidades monomricas j foram identificadas como constituintes dos PHAs armazenados por microrganismos. As unidades de repetio apresentam a estrutura geral apresentada na Figura 2.4, em que a substituio do radical R caracteriza um novo polmero ou copolmero. Os monmeros de hidroxialcanoatos que formam o PHA podem ser divididos em duas classes: hidroxialcanoatos de comprimento de cadeia curta, compreendendo os monmeros de 3 a 5 carbonos; e hidroxialcanoatos de cadeia mdia, compreendendo os monmeros de 6 a 14 carbonos (TSUGE, 2002). A massa molar dos PHAs varia tipicamente de 50.000 a 1.000.000 Da, conforme o organismo produtor do PHA e as condies de produo (REDDY et al., 2003). Quando as unidades fundamentais de repetio no PHA apresentam comprimento de cadeia na faixa de C6-C16, os PHAs so mais flexveis e considerados como termoelastmeros e borrachas. Esses PHAs tm uma faixa de aplicao diferenciada daqueles obtidos de monmeros de cadeia curta (GROSS et al., 1989; PREUSTING et al., 1990). Contudo, a maioria dos microrganismos sintetiza ambos os tipos de PHA, sendo que os PHAs de tamanho de cadeia curta contm primariamente unidades de 3HB, enquanto os PHAs com unidades monomricas de tamanho de cadeia mdio contm principalmente o 3-hidroxioctanoato (3HO) e 3-hidroxidecanoato (3HD) (ANDERSON e DAWES, 1990; STEINBCHEL, 1991; STEINBCHEL e SCHLEGEL, 1991; LEE, 1996).

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H O C R (CH2)n C O 100-30.000
n=1 R = hidrognio R = metil R = etil R = propil R = pentil R = nonil R = hidrognio R = metil R = hidrognio R = metil R = hexil Poli (3-hidroxipropionato) Poli (3-hidroxibutirato) Poli (3-hidroxivalerato) Poli (3-hidroxihexanoato) Poli (3-hidroxioctanoato) Poli (3-hidroxidodecanoato) Poli (4-hidroxibutirato) Poli (4-hidroxivalerato) Poli (5-hidroxivalerato) Poli (5-hidroxihexanoato) Poli (6-hidroxidodecanoato)

n=2

n=3

n=4

Figura 2.4. Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos (LEE, 1996).

A composio dos comonmeros de PHA depende principalmente da fonte de carbono, das condies de cultivo e da rota metablica que levam formao do PHA (EGGINK et al., 1992, STEINBCHEL e VALENTIN, 1995). Dentre os diferentes hidroxialcanoatos (HAs) detectados na biossntese de PHA esto (STEINBCHEL e VALENTIN, 1995): I. 3-HA compreendidos entre os cidos 3-hidroxipropinico e 3-

hidroxihexadecanico; II. cidos 3-hidroxialcenicos insaturados, com uma ou duas ligaes duplas no grupo R-pendente dos constituintes nos polisteres; III. 3-HA apresentando radical R ramificado; IV. 3-HA apresentando radical R funcionalizado; V. 4-HA, 5-HA, 6-HA; VI. HA com radical R na posio alfa ou com ligaes duplas entre carbonos que influenciam no esqueleto do polister.

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O P(3HB) o polister termoplstico biodegradvel mais conhecido, encontrando aplicaes similares s de alguns plsticos derivados da indstria petroqumica como, por exemplo, o polipropileno. O P(3HB) um material altamente cristalino e duro, quebradio e tem qualidades elsticas muito pobres. Os copolmeros so mais dcteis, mais fceis de moldar e mais resistentes, quando comparados com o homopolmero P(3HB). O P(3HB) isolado de R. eutropha apresenta 55-70% de cristalinidade, enquanto que no interior das clulas as molculas de P(3HB) so essencialmente amorfas e existem como incluses insolveis em gua. As misturas de P(3HB) com outros polmeros biodegradveis, tais como polilactatos e poli(caprolactona), contornam os problemas de rigidez e fragilidade excessivas do P(3HB), possibilitando seu uso (KIM et al., 1994, TSUGE, 2002). O peso molecular mdio de P(3HB) produzido por bactria de linhagem selvagem est geralmente na faixa de 1x104 a 3x106 Da, com ndice de polidisperso aproximadamente igual a 2,0. A temperatura de transio vtrea (Tg) e a temperatura de fuso (Tm) do homopolmero P(3HB) so iguais, respectivamente, a 4 oC e 177 oC (TSUGE, 2002). As clulas recombinantes de E. coli podem produzir P(3HB) com massa molar ponderal mdia (Mw) muito grande, 3 a 20x106 Da, quando o pH mantido na faixa de 6,0 a 6,5, isso potencializa sua utilizao na manufatura de filmes (TSUGE, 2002). Outra forma de melhorar as propriedades fsicas de P(3HB) a incorporao de diferentes unidades de HA na seqncia polimrica, para formar copolmeros. A formao dos copolmeros dependente das vias de biossntese do PHA e das fontes de carbono usadas (TSUGE, 2002). A composio monomrica dos PHAs pode ser controlada em bactrias recombinantes que possuem uma combinao de PHA sintases substrato especficas e adequadas quantidades de enzima(s)/monmero. Por exemplo, a Ralstonia eutropha produz P(3HB) homopolimrico a partir de glicose. Contudo, a expresso funcional do gene phaG para gerar monmeros (R)-3-HA com comprimento de cadeia mdio (C8-C12) em Ralstonia eutropha metabolicamente engenheirada (contendo o gene pha C1ps que codifica) resulta na sntese de um novo tipo de copolmero P(3HB-co-3HA) a partir de acar (MATSUMOTO et al., 2001). Algumas propriedades dos biopolmeros P(3HB), P(4HB) e copolmeros P(3HBco-3HV) so apresentadas na Tabela 1.

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Tabela 2.1. Propriedades dos polmeros (LEE, 1996).


P(3HB-co-3HV) Ponto de Fuso ( C) 3% mol de HV 9% mol de HV 14% mol de HV 20% mol de HV 25% mol de HV P(3HB) P(4HB) Polipropileno Poliestireno 170 162 150 145 137 179 53 170 110
0

Rigidez (GPA) 2,9 1,9 1,5 1,2 0,7 3,5 149 1,7 3,1

Resistncia Presso (MPa) 38 37 35 32 30 40 104 34,5 50

Resistncia ao Impacto (J/m) 60 95 120 200 400 50 --45 21

Algumas dessas propriedades so comparadas com as propriedades do polipropileno (PP) na Tabela 2. Observa-se que a introduo de hidroxivalerato (HV) na cadeia polimrica provoca enorme impacto sobre as propriedades finais do material, o que pode justificar o uso do co-monmero para ajuste de grades. Em particular, observa-se que a introduo de cerca de 10% de HV resulta em um material muito parecido com o polipropileno. Tabela 2.2. Principais caractersticas dos polmeros poli-3-hidroxibutirato,

polihidroxioctanoato e polipropileno (GOMES e NETTO, 1997)


Caracterstica Ponto de Fuso Tg Densidade Cristalinidade Permeabilidade ao oxignio
3

P(3HB) 180 C 5 0C 1.18 1.25 g/cm3 70% 45 (cm /m /atm/dia)


2 0

PHO 61 C - 35 0C 1.02 g/cm3 25% --3 0

PP 176 0C - 10 0C 0.905 g/cm3 70% 1700 (cm /m2/atm/dia)

Transmisso de vapor Mdulo de Young Tenso de Cisalhamento Resistncia ruptura Peso molecular

60-70 (g/cm2/dia) 3500MPa 40Mpa 5% 1-8.10-5 8MPa 9MPa 380% --1700MPa 38MPa 400% 2.2-7.10-5

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2.7. Aplicaes dos polihidroxialcanoatos Uma das aplicaes mais comuns dos PHAs a produo de embalagens e frascos para diferentes produtos, sobretudo cosmticos. Por causa de suas propriedades, o P(3HB) e copolmeros como P(3HB-co-3HV) tm sido tambm utilizados para a produo de frascos para o transporte de lquidos, gases e vapores (MIGUEL et al., 1997). No Brasil a Plasvale juntamente com a PHB Industrial tem iniciado estudos de produo de potes com tampa a partir de PHB (BUCCI, 2003). Essas aplicaes normalmente requerem alta rigidez e alto brilho, sendo que as caractersticas ecologicamente corretas do P(3HB), como biodegradabilidade e obteno a partir de recursos renovveis, conferem ao produto embalado um diferencial mercadolgico importante. Os PHAs tambm podem ser usados para a preparao de microcpsulas ou nanocpsulas para aplicaes mdicas e farmacolgicas. Isto permite que o princpio ativo seja liberado lentamente, prolongando sua ao (OGAWA, 1997). Uma aplicao muito interessante dos PHAs seu emprego em engenharia tissular, para a fabricao de prteses e outros componentes mdicos, em concordncia com suas propriedades biocompatveis (WILLIAMS et al., 1999). Para estes tipos de aplicao, cinco propriedades so requeridas: biocompatibilidade, manuteno do crescimento celular, capacidade de organizar as clulas na forma prevista e desejada ao redor da prtese, permitir o desenvolvimento tissular e no gerar produtos txicos durante a degradao (RAMOS-COMERZANA e MONTEOLIVA-SNCHEZ, 2000).

2.8. Biodegradao dos polihidroxialcanoatos Uma importante caracterstica dos PHAs a sua biodegradabilidade. Na natureza, vrios microrganismos podem degradar PHAs pelo uso de PHA hidrolases e PHA depolimerases. As atividades destas enzimas podem variar e dependem da composio do polmero, sua forma fsica (amorfa ou cristalina), das dimenses das amostras e das condies ambientais. O tempo de degradao do produto formado por P(3HB) da ordem de poucos meses quando submetidos digesto anaerbica (Figura 2.5), a anos quando lanados gua do mar (MADISON e HUISMAN, 1999).

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Figura 2.5. Embalagens de P(3HB-co-3HV) degradada em lodo ativado aerbico durante 0, 2, 4, 6, 8 e 10 semanas (MADISON e HUISMAN, 1999).

A biodegradao dos polmeros ocorre por dois mecanismos distintos, dependendo da natureza do polmero e do ambiente. O primeiro a hidrlise bitica ou abitica, seguida por bioassimilao (hidrobiodegradao). Esse o processo primrio envolvido na biodegradao das heterocadeias polimricas (tais como celulose, amido e polisteres alifticos), dos quais polmeros de cido ltico (PLA) e

polihidroxialcanoatos (PHAs) so tpicos. O segundo a peroxidao, seguida por bioassimilao de produtos de baixa massa molar (oxo-biodegradao). Esse processo aplicado usualmente cadeia de carbono dos polmeros (SCOTT, 2000).

2.9. Dificuldades encontradas na produo de polihidroxialcanoatos A principal dificuldade da produo de PHAs est em reduzir o seu custo, que muito alto, quando comparado ao dos plsticos sintticos no biodegradveis (KIM et al., 1994). Os baixos custos de produo de plsticos petroqumicos explicam os hbitos de consumo e o desenvolvimento generalizado de produtos de convenincia, que tm exigido maiores reas para a disposio de resduos/rejeitos (HNGGI, 1995). O grande custo com aterros poderia ser amenizado com o emprego de biopolmeros. Produtos que no exigem um tempo de prateleira muito grande e que tendem a ser misturados com o material residual orgnico poderiam ser produzidos com biopolmeros, reduzindo o impacto sobre os aterros (HNGGI, 1995).

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Devido origem microbiolgica, PHAs podem conter protena residual, agentes surfactantes residuais e elevados nveis de endotoxina. As protenas estranhas, presentes no PHA, podem ocasionar processos alrgicos. A presena de endotoxinas constitui um dos principais problemas dos fabricantes, pois bactrias gram-negativas normalmente so empregadas para a produo de PHAs (LEE et al., 1999). HNGGI (1995) afirma que os polisteres bacterianos precisam atender as seguintes exigncias para serem aceitos em larga escala: I. atender a um mercado especfico de aplicao; II. possuir sistemas eficientes de compostagem instalados em reas urbanas; III. possuir qualidade e desempenho de processamento compatveis com os plsticos petroqumicos atuais; IV. satisfazer os requerimentos para o registro como embalagens de alimentos; V. possuir um preo competitivo. A viabilidade econmica da produo de P(3HB) determinada pela eficincia e velocidade de crescimento, formao do produto e contedo intracelular do biopolmero. Dessa forma, para melhorar a viabilidade econmica e reduzir o preo do produto preciso maximizar a converso de carbono e a produtividade em todo o processo (ACKERMANN e BABEL, 1998), encontrando fontes alternativas de carbono (LINKO et al., 1993).

2.10. Referncias bibliogrficas ACKERMANN, J.U., BABEL, W., 1998, Approaches to increase the economy of the PHB production, Polymer Degradation and Stability, v. 59, pp. 183-186. ANDERSON, A.J.; DAWES, E.A., 1990, Occurrence, metabolism, metabolic role and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates, Microbiology Reviews, v. 54, p. 450-472, 1990. BERGER, E., RAMSAY, B.A., RAMSAY, J.A., CHAVARIE, C., BRAUNEGG, G., 1989, PHB recovery by hypochlorite digestion of non-PHB biomass, Biotechnology Techniques, v. 3, pp. 227-232. BRANDL, H.; GROSS, R.A.; LENZ, R.W.; FULLER, R.C., 1988, Pseudomonas oleovorans as a source of poly-(-hydroxyalkanoates) for potential applications as biodegradable polyesters, Applied and Environmental Microbiology, v. 54, n. 8, p. 1977-1982.

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CAPTULO 2 Polihidroxialcanoatos

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RAMSAY, J.A.; BERGER, E., VOYER, R., CHAVARIE, C., RAMSAY, B.A., 1994, Extraction of poly-3-hydroxybutyrate using chlorinated solvents, Biotechnology Techniques, v. 8, pp. 589-594. REDDY, C.S.K.; RASHMI, R.G.; KALIA, V.C., 2003, Polyhydroxyalkanoates: an overview, Bioresource Technology, v. 87, pp. 137-146. RIBEIRA, R. G., MNTEOLIA-SANCHEZ, M., RAMOS-CORMENZANA, A., 2001, Production of polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas putida KT2442 horboring pSK2665 in wastewater from oive oil mills (alpechn), Electronic Journal of Biotechnology, v. 4, pp.1-4. SCOTT, G., 2000, Green Polymers, Polymer Degradation and Stability, v. 68, p. 1-7. STEINBCHEL, A., 1991, Polyhydroxyalkanoic acids. In: Byrom, D. (Ed), Biomaterials: Novel Materials from Biological Sources, New York, NY, Stockton Press. STEINBCHEL, A., HUSTEDE, E., LIEBERGESELL, M., PIEPER, U., TIMM, A., VALENTIN, H., 1992, Molecular basis for biosynthesis and accumulation of polyhydroxyalkanoic acid in bacteria, FEMS Microbiology Reviews, v. 103, pp. 217-230. STEINBCHEL, A.; FCHTENBUSCH, B., 1998, Bacterial and other biological systems for polyester production, Trends in Biotechnology, v. 16, p. 419-427. STEINBCHEL, A., SCHLEGEL, H.G., 1991, Physiology and molecular genetics of poly(-hydroxy-alkanoic acid) synthesis in Alcaligenes eutrophus. Molecular Micorbiology, v. 5, pp. 535-542. STEINBCHEL, A.; VALENTIN, H.E., 1995, Diversity of bacterial

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CAPTULO 3 Cupriavidus necator DSM 545 e o cido acrlico


ndice 3.1. Introduo ....................................................................................................... 3.2. Fontes alternativas de carbono ....................................................................... 3.2.1. cido acrlico .............................................................................................. 3.2.1.1. Vias de degradao de xenobiticos ........................................................ 3.2.1.2. Efeito da concentrao do cido acrlico .................................................. 3.2.1.3. Anlise do cido acrlico .......................................................................... 3.2.1.4. Microrganismos degradadores de cido acrlico ...................................... 3.3. Experimental .................................................................................................. 3.3.1. Microrganismo ............................................................................................ 3.3.2. Meios de Cultura ......................................................................................... 3.3.3. Condies de Cultivo .................................................................................. 3.3.4. Procedimentos Analticos ............................................................................ 3.3.4.1. pH ............................................................................................................. 3.3.4.2. Anlise de cido acrlico .......................................................................... 2.3.4.3. Anlise da concentrao celular ............................................................... 3.3.4.3.1. Espectrofotometria ................................................................................ 3.3.4.3.2. Gravimetria ............................................................................................ 3.3.4.4. Anlise da concentrao de poli-3-hidroxialcanoatos (PHAs) ................ 3.4. Resultados e Discusso .................................................................................. 3.4.1. Adaptao simultnea ................................................................................. 3.4.2. Definio da concentrao de substrato ...................................................... 3.4.3. Monitoramento do crescimento celular ....................................................... 3.4.4. Avaliao do consumo de cido acrlico com vistas produo de P(3HB) .................................................................................................................. 3.5. Concluses ..................................................................................................... 3.6. Referncias Bibliogrficas ............................................................................. 43 44 45 26 26 27 29 30 31 31 33 33 33 33 35 35 35 36 36 37 37 38 38 40 42

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3.1. Introduo O custo da produo de PHAs ainda muito alto quando comparado ao dos plsticos sintticos no biodegradveis (KIM et al., 1994). Para melhorar a viabilidade econmica e reduzir o preo do produto preciso maximizar a converso de carbono e a produtividade em todo o processo (ACKERMANN e BABEL, 1998). Isso pode ser feito, por exemplo, encontrando fontes alternativas de carbono (LINKO et al., 1993).

3.2. Fontes alternativas de carbono Acares tais como glicose e sacarose so as fontes de carbono mais comuns usadas para produo de PHA porque podem ser obtidas a preos relativamente baixos (TSUGE, 2002). Embora haja esta preferncia, os PHAs podem ser produzidos a partir de uma ampla variedade de substratos, tais como fontes renovveis (amido, celulose, triacilglicerdeos), fsseis (metano, leo mineral, lignita), subprodutos de outros processos (melao, soro de queijo, glicerol), produtos qumicos (cido propinico, cido 4-hidroxibutrico) e dixido de carbono. Contudo, a engenharia metablica est sendo intensivamente explorada para introduzir novas vias metablicas e aumentar a diversidade de substratos utilizveis, a fim de aumentar tanto a produtividade da sntese como a produo de novos PHAs (REDDY et al., 2003). R. eutropha conhecida por acumular altos nveis de P(3HB) a partir de frutose sob condies de restrio de crescimento (LINKO, 1993). Porm, esse microrganismo metaboliza ainda outras fontes de acares, cidos orgnicos, leos vegetais e dixido de carbono, convertendo essas fontes de carbono a PHA em at 80% de peso seco celular (TSUGE, 2002). Ouras fontes de carbono acumuladas por R. eutropha esto apresentadas na Tabela 3.1. BYROM (1987) observou que concentraes de 0,1% (w/w) de cido propinico no meio j provoca a inibio da produo de PHA por R. eutropha. Por outro lado, RAMSAY et al. (1990) observaram que o crescimento de R. eutropha e produo do polmero so inibidos por concentraes de 0,3% ou mais de cido propinico.

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Tabela 3.1. Substratos normalmente assimilados por R. eutropha. Substrato Glicose e cido propinico Xilose, cido fumrico e cido itacnico cido butrico cido ltico cido pentanico Referncia HOLMES et al., 1985 LINKO et al., 1993 DOI et al., 1988 BRAUNEGG et al., 1978 RAMSAY et al., 1990

A bactria R. eutropha pode usar CO2 inorgnico como fonte de carbono (TANAKA et al., 1995). Isso est de acordo com as observaes de HUGES e RICHARDSON (1984), que mostraram que a concentrao de CO2 no ar de alimentao afeta fortemente a biossntese de P(3HB). Clulas recombinantes de E. coli podem utilizar vrias fontes de carbono (incluindo glicose, sacarose, lactose e xilose) presentes em fontes baratas desses substratos, como melao, soro de queijo e hidrolisado de celulose, para produzir PHAs (LEE et al., 1995). Os cidos graxos volteis (AGV), obtidos pela digesto anaerbia, so tambm precursores para formao de PHA. Fontes de AGV incluem resduos municipais (KALIA e JOSHI, 1995), banana (KALIA et al., 2000), gros deteriorados, casca de ervilha, bagao de ma e efluente de indstria de leo de palma (KALIA et al., 1992). Os resduos agrcolas e da indstria de alimentos podem ser utilizados como fontes baratas de carbono e nitrognio. Entre as fontes de carbono esto a xilose, o segundo acar mais abundante nesses resduos, o cido ltico e o cido actico (TSUGE et al., 1999, TSUGE et al., 2001) obtidos de fermentaes anaerbias, alm dos cidos graxos presentes em plantas produtoras de leo (YAMANE, 1992).

3.2.1. cido acrlico O cido acrlico um lquido incolor, com um odor creo irritante temperatura e presso ambiente. A concentrao para o cido acrlico ser sentido difundido no ar baixa, aproximadamente 0,20-3,14 mg/m3. miscvel em gua e na maioria dos solventes orgnicos. Polimeriza facilmente quanto exposto ao calor, luz e metais, sendo necessria a adio de um inibidor de polimerizao nos produtos comerciais. 27

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A produo mundial de cido acrlico em 1994 foi estimada em aproximadamente 2 milhes de toneladas. usado primariamente como um iniciador na produo de steres acrlicos e como um monmero para cido poliacrlico e sais. Tambm usado como um co-monmero, associado acrilamida para a sntese de polmeros que sero usados como floculantes, ao etileno para sntese de resinas polimricas de troca inica e a steres metlicos para sntese de polmeros. O cido acrlico amplamente usado na indstria qumica, sendo uma importante matria-prima para produo de resinas adesivas, selantes, fibras sintticas e detergentes. Tambm um monmero utilizado para produo de enorme variedade de polmeros na indstria de tintas, de cobertura, de fibras e de adesivos (FREDERICK e REYNOLDS, 1989). No ambiente, o cido acrlico pode produzir efeitos mutagnicos, carcinognicos e txicos sobre os organismos vivos (IGNATOV et al., 1997), exibindo alta toxicidade para microrganismos tais como bactrias, leveduras e fungos (TAKAMIZAWA et al., 1993). Embora corrosivo quando puro e irritante em solues concentradas, o cido acrlico foi avaliado negativamente para carcinogenicidade da pele e mutagenicidade (DePASS et al., 1984, LIJINSKY e ANDREWS, 1980). O cido acrlico pode aparecer como poluente na forma de polmero de seus sais, como por exemplo o poliacrilato de sdio (PSA), que uma macromolcula sinttica preparada pela polimerizao radicalar de acrilato de sdio ou do cido acrlico. Em gua um polinion de cadeia longa devido aos seus muitos grupos carboxilas. PSAs lineares so higroscpicos e solveis em gua, sendo usados por isso como agentes dispersantes, quelantes e floculantes (IWAHASHI et al., 2003). O cido acrlico tambm aparece como um produto da clivagem do dimetilsulfonilpropionato (DMSP), sendo que diferentes microrganismos realizam tal reao. Entre os microrganismos aerbios podem ser citados Pseudomonas doudoroffi, Alcaligenes sp. linhagem M3A (DE SOUZA e YOCH, 1995), linhagem MD14-50 (DIAZ et al., 1992) e linhagem ML-D (DIAZ e TAYLOR, 1996), e Fusarium lateritium (BACIC e YOCH, 1998). Em 1962, WAGNER e STADTMAN demonstraram a clivagem anaerbia de DMSP por Clostridium propionicum. Recentemente, mostrou-se que uma linhagem de Desulfovibrio acrylicus isolada apresenta a capacidade de reduzir sulfato e acrilato, alm de clivar rapidamente DMSP. Contudo, a clula no fermenta o acrilato produzido da reao de clivagem, utilizando-o como aceptor de eltrons (VAN DER MAAREL et al., 1996).

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O cido acrlico ocorre naturalmente em algas marinhas e tambm tem sido encontrado no fluido do rmen de ovelhas e no rum obtido pela fermentao do suco de cana de acar pela ao de Micrococci spp. Ainda, pode ser formado pela hidrlise de acrilamida de resduos industriais no solo, especialmente sob condies aerbias. Industrialmente, o cido acrlico foi primeiramente sintetizado a partir da hidrlise de etileno de cianoidrina em cido sulfrico (KIRK-OTHMER, 1984). Atualmente produzido a partir da oxidao do vapor de propileno a acrolena, a qual ento oxidada a 300oC na presena do catalisador vandio-molibdnio a cido acrlico (NLM, 1989). WHANGER e MATRONE (1967) estudaram a produo de propionato a partir de acrilato, utilizando clulas microbianas presentes no rmen de carneiros. Observaram que o acrilato consumido antes de que seja produzida uma aprecivel quantidade de propionato. Tambm verificaram que a deficincia de enxofre diminui ou inibe completamente a via do acrilato para converso de lactato a propionato, causando acmulo de lactato no rmen. 3.2.1.1. Vias de degradao de xenobiticos O acrilato um intermedirio de algumas vias de degradao de xenobiticos, como estireno e acrilonitrila (Figura 3.1) por Pseudomonas chlororaphis K22 e B23 (KEGG, 2004). Alguns microrganismos, como Megasphaera elsdenii, Clostridium propionicum e Prevotella ruminicola apresentam a via do acrilato ou via de reduo direta. O acrilato convertido a propionato, sendo necessrio o aporte do equivalente redutor flavoprotena, na forma reduzida, para transferncia de eltrons (CALDWELL, 1995). O processo de degradao do cido acrlico no foi ainda estudado suficientemente, mas sabe-se que o cido ltico um intermedirio da via metablica de consumo de cido acrlico (IGNATOV et al., 1997).

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Via de degradao do estireno


Estireno

Via de degradao da acrilonitrila


Acrilonitrila

Acrilato

Acrilato

Lactato

Lactato

Metabolismo do Piruvato

Metabolismo do Piruvato

Acetil-CoA

Acetil-CoA

Figura 3.1. Vias descritivas da degradao do estireno e acrilonitrila (KEGG, 2004).

3.2.1.2. Efeito da concentrao do cido acrlico STEWART et al. (1995) estudaram a degradao anaerbia de cido acrlico em 55 dias de teste em culturas enriquecidas com glicose e acetato. A concentrao de 100 mg/L de cido acrlico teve efeito mnimo sobre a utilizao de acetato pela metanognese; contudo, concentraes de 500, 1000 e 1500 mg/L inibiram a utilizao de acetato no sistema de tratamento anaerbio. A inibio da utilizao de acetato pela presena de cido acrlico tambm foi observada por DEMIRER e SPEECE (2004), que sugerem como soluo a aclimatao das culturas anaerbias a presena de cido acrlico. HOSSACK et al. (1992) estudaram o efeito do cido acrlico no solo. Nveis de 100 mg de cido acrlico/Kg de solo no afetam a respirao da microflora do solo. Entretanto, uma concentrao de 1000 mg de cido acrlico/Kg de solo inibiu completamente a respirao. BRINGMANN e KUHN (1980) realizaram um estudo do efeito da concentrao de cido acrlico sobre o crescimento de alguns organismos, dentre os quais Pseudomonas putida. O mtodo adotado foi o teste de inibio da multiplicao celular. O limiar de concentrao de cido acrlico, acetato de vinila e estireno que inibiram o crescimento de P. putida foi de 41 mg/L, 6 mg/L e 72 mg/L, respectivamente. 30

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3.2.1.3. Anlise do cido acrlico Diferentes mtodos fsico-qumicos tm sido desenvolvidos para a anlise quantitativa de cido acrlico. Entre estes esto includos a fotometria (IGNATOV et al., 1997), a cromatografia gasosa (IGNATOV et al., 1997, DURST et al., 1975) e cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) (IGNATOV et al., 1997, DURST et al., 1975). IGNATOV et al. (1997) analisaram acrilamida e cido acrlico por cromatografia gs-lquido, usando como padro interno acetamida. Os limites de deteco de cido acrlico em soluo por cromatografia gasosa de 1 mg/L (STEWART et al., 1995); por HPLC, 1 mg/L (MAO et al., 1994); e por tcnicas polarogrficas, 10 mg/L a 100 mg/L. 3.2.1.4. Microrganismos degradadores de cido acrlico MOISEEVA et al., (1991) isolaram vrias linhagens que utilizam acrilonitrila, acrilamida e cido acrlico como nica fonte de carbono e/ou nitrognio foram isoladas do ambiente. As linhagens com maior atividade de decomposio foram identificadas como sendo Pseudomonas pseudoalcaligenes 6P, P. alcaligenes 5g e Brevibacterium spp. 13A. SHANKER et al. (1990) isolaram uma linhagem de Pseudomonas sp. do solo que consegue degradar acrilamida na concentrao de 4 mg/L a cido acrlico e amnia, sendo utilizada como nica fonte de carbono e nitrognio, respectivamente, para crescimento. Ensaios realizados com Bissochlamys sp. mostraram que esta linhagem consegue produzir cido -hidroxipropinico (-HPA), quando cresce em meio contendo alta concentrao de cido acrlico. A mxima produo de -HPA foi de 4,8%, quando o meio de cultura inicial continha 7% de cido acrlico e 2% de glicose e o pH inicial da cultura era ajustado a 7,0 (TAKAMIZAWA et al., 1993). ANDREONI et al. (1990) mostraram que Alcaligenes denitrificans, isolada de aterro sanitrio, consegue degradar cido acrlico. A bactria degrada o cido acrlico atravs da formao dos intermedirios cido-L-(+)-lctico e cido actico, que foram posteriormente metabolizados. Diferentes so os microrganismos degradantes de cido acrlico. As clulas de Pseudomonas chlororaphis K22 e B23 (KEGG, 2004) e de Brevibacterium sp. hidrolisam acrilamida a cido acrlico e amnia. Candida rugosa gera cido -

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hidroxipropinico com 90% de rendimento a partir de 2% de cido acrlico, quando glicose adicionada durante o cultivo (HASEGAWA et al., 1982). LEE et al. (1996) produziram cido D--hidroxiisobutrico (D-HIBA) a partir de cido metacrlico, usando Candida rugosa IFO 0750 numa concentrao de 21,5 g D-HIBA/L. Byssochlamys sp. multiplica-se em uma concentrao de 7% de cido acrlico, quando Ca(OH)2 utilizado como agente neutralizante e 2% de glicose adicionado ao meio. Dessa forma, a mxima produo de 4,8% de cido -hidroxipropinico foi conseguida, configurando um rendimento de converso de 70%, num perodo de 11 dias (TAKAMIZAWA et al., 1993). IWAHASHI et al. (2003) demonstraram que Arthrobacter sp. linhagem NO-18 degrada 70-80% de um oligmero de acrilato em duas semanas. IGNATOV et al. (1997) estudaram a possibilidade de determinar acrilamida e cido acrlico atravs da atividade respiratria de clulas microbianas de Brevibacterium sp. As fermentaes de acrilato a acetato e propionato foram observadas em clulas de Clostridium propionicum (BOCK e ALBERTY, 1953) e em clulas de Megasphera elsdenn (CARDON e BARKER, 1947). SHANKER et al. (1990) demonstraram que Pseudomonas sp. C-3 isolada para degradao de acrilamida pode tolerar concentraes de cido acrlico de 500 mg/L, representando uma melhor adaptao ao substrato quando comparado a concentrao de 41 mg/L apresentada por Pseudomonas putida nos estudos de VERSCHUEREN (1977). Dados referentes ao metabolismo de cido acrlico por clulas de Alcaligenes dinitrificans mostram sua degradao a cido ltico, cido pirvico e cido actico (IGNATOV et al., 1997). WHANGER e MATRONE (1967) mostraram que a via do acrilato est ativa na converso de lactato a propionato em microrganismos no rmen de carneiros, quando a concentrao de enxofre adequada. No cultivo de E. coli JK109 (pBHR71) em meio Luria Bertani (LB) contendo 40 g/L de decanoato, uma concentrao de 0,2 mg de cido acrlico/mL de meio foi o timo observado para o crescimento e o acmulo de PHA, que representa 30% (w/w) do peso seco celular. Contrariamente, sem a presena de cido acrlico, PHA contribui para aproximadamente 1,1% do peso seco celular (QI et al., 1998). Assim, importante observar que vrias espcies de bactrias, leveduras e fungos apresentam potencial para degradar o cido acrlico. Contudo, as exigncias das vias metablicas podem ser diferentes para cada espcie de microrganismo para que haja o metabolismo do cido acrlico.

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3.3. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto a VETEC QUMICA FINA LTDA., exceto o padro de poli-3-hidroxibutirato que foi adquirido junto a SIGMA-ALDRICH e os solventes cido acrlico, estireno e acetato de vinila que foram fornecidos pela RHODIA. 3.3.1. Microrganismo Foi utilizada a bactria Cupriavidus necator DSM545, obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC. 3.3.2. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados foram: a. Agar Nutriente (NA) (g/L): Extrato de carne, 3,0 ; Peptona de carne, 5,0 ; Agar, 15,0 . b. Caldo Nutriente (NB) (g/L): Extrato de carne, 3,0; Peptona de carne, 5,0. c. Meio Mineral (MM) utilizado nos ensaios com cultura de Cupriavidus necator DSM 545, est baseado em RAMSAY et al. (1990), modificado por ARAGO et al. (1996), cuja composio : Soluo 1 (g/L): Citrato Frrico de Amnia, 0,06; MgSO4. 7H2O, 0,5; CaCl2.2H2O, 0,01; Soluo 2 (g/L): Na2HPO4, 0,51; KH2PO4, 0,07; 0,02; Soluo 3 (g/L): (NH4)2SO4, 5,00; Soluo 4 (g/L): H3BO3, 0,3; CoCl2.6H2O, 0,2; ZnSO4.7H2O, 0,1; MnCl2.4H2O, 0,03; Na2MoO4.2H2O, 0,03; NiCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, 0,01. Soluo 5 (g/L): cido acrlico ou estireno ou acetato de vinila ou glicose, cujas concentraes dependem do ensaio a ser realizado. As solues foram esterilizadas separadamente a fim de evitar precipitao dos sais. 3.3.3. Condies de Cultivo As clulas foram cultivadas nas seguintes etapas: a. Etapa 1: Crescimento em meio caldo nutriente (NB), a 180 rpm e 30oC por 24h, a fim de obter massa celular;

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b. Etapa 2: Crescimento em meio mineral (MM). * Cultivo em tubos de ensaio O cultivo seguiu a seqncia apresentada no esquema da Figura 3.2. Um volume de meio NB cultivado em frasco agitado a 180 rpm e 30oC por 24h foi retirado assepticamente, centrifugado, lavado duas vezes com soluo salina 0,85% (v/v) e ressuspendido em gua destilada estril. Deste, um volume igual a 1 mL (10% (v/v)) do MM foi utilizado para inoculao. As clulas foram incubadas a 180 rpm e 30oC por 24h. Posteriormente, volumes correspondentes a 1 mL (10% (v/v)) do volume total foram inoculados no mesmo meio com a concentrao da fonte de carbono em estudo (glicose, cido acrlico, estireno, acetato de vinila) aumentada. cido acrlico, estireno e acetato de vinila foram utilizados para definio da fonte de carbono a ser utilizada durante tese a partir do ensaio de adaptao simultnea.

NaCl (0,85 %)

NaCl (0,85 %)

gua

1 mL

1 mL

1 mL

0
Centrifugar Centrifugar 24 h 30 oC

.........

........

NB

Lavagem das clulas

Adaptao simultnea

Figura 3.2. Esquema do procedimento para cultivo de Cupriavidus necator em tubos de ensaio. * Cultivos em frascos Erlenmeyer. O cultivo seguiu a seqncia apresentada no esquema da Figura 3.3. Um volume de meio NB cultivado em frasco agitado a 180 rpm e 30oC por 24h foi retirado assepticamente, centrifugado, lavado duas vezes com soluo salina 0,85% (v/v) e ressuspendido em gua destilada estril. Este volume corresponde a 1% (v/v) do MM e foi inoculado assepticamente. O mesmo procedimento foi adotado para a etapa seguinte, tambm em MM, sendo o volume de inculo retirado do mesmo meio j cultivado.

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Nesta etapa, conforme a estratgia adotada, a fonte de nitrognio estava limitada ou ausente. Em ambas as etapas as clulas foram incubadas a 180 rpm e 30oC por 24 horas.
1% (v/v)

NaCl (0,85 %)

NaCl (0,85 %)

gua

Centrifugar

Centrifugar

NB

MM

Lavagem das clulas

Cultivo

Figura 3.3. Esquema do procedimento para cultivo de Cupriavidus necator em frascos agitados. 3.3.4. Procedimentos Analticos 3.3.4.1. pH O monitoramento do pH foi realizado por potenciometria, utilizando um potencimetro Metler Toledo, modelo MP220, equipado com eletrodo Ag/AgCl com termopar para ajuste de temperatura. 3.3.4.2. Anlise de cido acrlico A quantificao da concentrao de cido acrlico foi realizada por cromatografia gasosa, com injeo direta do sobrenadante. Preparo da amostra: I. centrifuga-se um volume de meio de cultura; II separa-se o sobrenadante do material celular precipitado por centrifugao a 5000 x g por 20 min; III. armazena-se o material amostrado a -20oC para anlise posterior. Anlise da concentrao de cido acrlico: I. descongela-se a amostra e agita-se vigorosamente;

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II. misturam-se 180 L do sobrenadante a 20 L de soluo de cido actico 5 g/L; III. coleta-se com seringa micrograduada um volume de 1 L, que ento injetado na coluna. IV. calcula-se a concentrao de cido acrlico (AA) no meio conforme segue: A3 AA( g / L) = a + b A4

(3.1)

onde A3 a rea obtida para a concentrao de cido acrlico; A4 a rea obtida para a concentrao do padro interno cido actico e "a" e "b" so as constantes obtidas na curva padro, respectivamente, o coeficiente angular e o coeficiente linear. A curva padro de cido acrlico (Anexo 1) foi feita utilizando o cido actico como padro interno, com a concentrao de cido acrlico variando entre 1 g/L e 4 g/L. A coluna utilizada para dosagem do cido acrlico de slica fundida (0,32mm X 50m) modelo CP-WAX 57 CB. O cromatgrafo um Chrompak, modelo CP 9000, equipado com um detector de ionizao de chama (DIC ar-hidrognio). O gs de arraste utilizado o nitrognio a 9 mL/min e as temperaturas do injetor, detector e coluna so iguais, respectivamente, a 250 C, 250 C e 120 C. 3.3.4.3. Anlise da concentrao celular A concentrao celular determinada por dois mtodos: por espectrofotometria (durante o cultivo) e por gravimetria. 3.3.4.3.1. Espectrofotometria Analisa-se a concentrao de massa celular de C. necator do material coletado em um espectrofotmetro Spectronic 20D+, medindo-se a absorbncia no comprimento de onda de 600 nm contra um branco de gua. Para manter uma preciso adequada (regio linear), a faixa de absorbncia utilizada de 0,0 at 0,8. A partir deste valor, so feitas diluies para manter a linearidade.

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3.3.4.3.2. Gravimetria A medida da massa celular compreende as seguintes etapas: I. separa-se um volume conhecido do meio de cultura, entre 1 mL e 10 mL; II. filtra-se o meio atravs de membranas Millipore de poliamida pr-pesadas (poro de 0,2 m); III. lava-se duas vezes o material retido na membrana com HCl 0,01M, para remover ons e sais presentes na biomassa; IV. seca-se a membrana com a biomassa em estufa a 85C at peso constante. V. calcula-se a concentrao de massa celular (X) na forma: ( MM f MM i ) 1000 VA

X ( g / L) =

(3.2)

onde MMf a massa da membrana final (g); MMi a massa da membrana inicial (g) e VA o volume da amostra do meio de cultivo (mL). A curva de calibrao da concentrao celular em funo da absorbncia (600 nm) (Anexo 2) serve para estimar a concentrao de clulas durante a fase de crescimento da cultura. 3.3.4.4. Anlise da concentrao de poli-3-hidroxialcanoatos (PHAs) A quantificao da concentrao de PHAs foi realizada por cromatografia gasosa, conforme o mtodo de metanlise baseado em BRAUNEGG et al. (1978), com as modificaes propostas por BRANDL et al. (1988). Preparo da amostra: I. coleta-se um volume de amostra do meio de cultura compreendido entre 1,5 e 2 mL; II. centrifuga-se a amostra a 15.000 rpm por 5 minutos; III. lava-se o sedimentado duas vezes com gua destilada; IV. armazena-se o sedimentado a -20oC para que todas amostras sejam analisadas ao mesmo tempo. Metodologia: I. ressuspende-se o sedimentado em 2 mL de metanol acidificado (H2SO4 15%), contendo cido benzico 0,4 g/L como padro interno; 37

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II. adicionam-se 2 mL de clorofrmio; III. aquece-se a mistura a 100C durante 140 minutos em tubos fechados, sendo que aps 60 minutos de aquecimento a mistura agitada durante alguns segundos e devolvida ao aquecimento; IV. resfria-se a mistura at a temperatura ambiente; V. adiciona-se 1mL de gua destilada; VI. agitam-se as amostras durante 30 segundos, deixando separar as fases; VII. retira-se a fase orgnica (inferior) com uma pipeta Pasteur; VIII. armazena-se a fase aquosa em geladeira, para posterior anlise do polihidroxialcanoato em cromatografia gasosa. A curva padro (Anexo 3) feita utilizando-se o poli-3-hidroxibutirato (Sigma) como padro externo, com massa variando entre 0,0010 g e 0,0100 g. Submetem-se os padres mesma metanlise que as amostras. A coluna utilizada para dosagem do P(3HB) de slica fundida (0,32mm X 50m) modelo CP-WAX 57 CB. O cromatgrafo um Chrompak, modelo CP 9000, equipado com um detector de ionizao de chama (DIC ar-hidrognio). O gs de arraste utilizado o nitrognio a 9,19 mL/min e as temperaturas do injetor, detector e coluna so iguais, respectivamente, a 250 C, 250 C e 120 C. O volume injetado de 1 L. O clculo da concentrao de P(3HB) realizado conforme a seguinte equao:
A1 A2 a + b 1000 P (3HB)( g / L) = VA

(3.3)

onde A1 a rea obtida para o P(3HB); A2 a rea obtida para o padro interno cido benzico; "a" e "b" so as constantes obtidas na curva padro, respectivamente, o coeficiente angular e o coeficiente linear, e VA o volume da amostra do meio de cultivo (mL).

3.4. Resultados e discusso 3.4.1. Adaptao simultnea O estudo de produo de P(3HB) a partir de fontes alternativas de carbono como cido acrlico, estireno ou acetato de vinila foi realizado inicialmente com a adaptao simultnea das clulas de C. necator. Estudos qualitativos de adaptao simultnea 38

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permitem verificar se a clula capaz de crescer em um meio de cultura contendo algum dos monmeros como substrato e avaliar de forma preliminar qual a concentrao de substrato que limita o crescimento de Cupriavidus necator. A bactria foi cultivada em tubos de ensaio, em meio MM. Como a cultura assimila a glicose como fonte de carbono para crescimento (KIM et al., 1994), foram realizados repiques sucessivos, em perodos de 24 horas, com aumento gradual da concentrao do substrato em estudo (cido acrlico, estireno e acetato de vinila) e reduo da concentrao de glicose. Os resultados foram obtidos de forma visual; ou seja, ao final do perodo de cultivo a turbidez do meio foi observada e assinalado o amplo crescimento (+), crescimento razovel () e crescimento ruim ou no crescimento (-) (Tabela 3.2). Tabela 3.2. Resultados obtidos para o crescimento de C. necator em acetato de vinila, cido acrlico e estireno em tubos de ensaio contendo 15 mL de meio.
Ensaio 0 (g/L) Acetato de Vinila Glicose C. necator DSM 545 cido Acrlico Glicose C. necator DSM 545 Estireno Glicose C. necator DSM 545 0 20,00 + 0 20,00 + 0 20,00 + Ensaio 1 (g/L) 0,01 20,00 + 0,01 20,00 + 0,01 20,00 + Ensaio 2 (g/L) 0,05 10,00 + 0,05 10,00 + 0,05 10,00 + Ensaio 3 (g/L) 0,09 5,00 + 0,09 5,00 + 0,09 5,00 + Ensaio 4 (g/L) 0,11 3,30 + 0,11 3,30 + 0,11 3,30 + Ensaio 5 (g/L) 0,13 2,50 + 0,13 2,50 + 0,13 2,50 + Ensaio 6 (g/L) 0,33 1,67 + 0,33 1,67 + 0,33 1,67 + Ensaio 7 (g/L) 0,5 1,67 0,5 1,67 + 0,5 1,67

(+) : amplo crescimento; (-) : crescimento ruim ou no crescimento; () : crescimento razovel.

As concentraes de glicose e dos demais monmeros no meio de cultivo variaram nos ensaios 1 a 7, sendo possvel verificar que a cultura de C. necator foi inibida apenas quando a concentrao do monmero acetato de vinila foi de 0,5 g/L, embora ainda em presena de 1,67 g/L de glicose no meio. A cultura de C. necator suportou a concentrao de cido acrlico no nvel mais alto, a partir do qual foram realizados os ensaios.

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3.4.2. Definio da concentrao de substrato Visto que as clulas de C. necator apresentaram melhor adaptao ao substrato cido acrlico, conforme apresentado no item anterior, ensaios em frascos Erlenmeyer foram realizados a fim de obter o parmetro velocidade especfica de crescimento. Trs concentraes de cido acrlico foram escolhidas: 0,16 g/L, 0,33 g/L e 0,67 g/L, em meios de cultura MM com pH inicial ajustado a 7,0 e incubados a temperatura de 30oC sob agitao de 180 rpm. Tambm foi observada a influncia da presena e ausncia de oligoelementos no crescimento celular. A Figura 3.4 mostra os resultados do cultivo de C. necator em frascos agitados. Observa-se na Figura 3.4B que o crescimento ocorre at 70 horas de cultivo e, nesse intervalo de tempo, a maior velocidade especfica de crescimento (0,029 h-1) foi obtida somente com cido acrlico na concentrao inicial de 0,33 g/L (Tabela 3.3).
7.6 0.30

7.4

Absorbncia (600 nm)

0.27 0.24 0.21 0.18 0.15 0.12 0.09 0.06 0.03 0.00

pH

7.2

7.0

6.8 0 20 40 60 80 100 120

20

40

60

80

100

120

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 3.4. Resultados do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 em meio mineral contendo cido acrlico como fonte de carbono nas concentraes de 0,16 g/L ( e ), 0,33 g/L ( e ) e 0,67 g/L ( e ) em frascos Erlenmeyers agitados a 180 rpm a 30oC. Smbolos cheios (com oligoelementos); smbolos vazios (sem oligoelementos). Os perfis obtidos para a biomassa celular mostram que os oligoelementos adicionados ao meio de cultura no melhoraram o crescimento celular, de maneira que o meio de cultura pode ser simplificado. Outra observao importante est no fato de que o pH aumenta com o crescimento celular (Figura 3.4A), conforme observado no aumento dos valores da absorbncia, e diminui quando no h mais crescimento. Isso parece ser um claro indicativo do consumo de cido acrlico pela bactria. Na Figura 3.5

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possvel observar que as condies do processo para o crescimento celular so melhores para a concentrao inicial de 0,33 g/L de cido acrlico nas condies de adio e no adio de oligoelementos ao meio de cultura, pois a velocidade especfica de crescimento maior em ambos os casos.

0,030

(h )

-1

0,025 0,020 0,015 0,010

Com oligoelementos

0,030

Sem oligoelementos

(h )
-1

0,025 0,020 0,015 0,010 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Concentrao de cido acrlico (g/L)

Figura 3.5. Relao entre concentrao de cido acrlico e a velocidade especfica de crescimento () para o cultivo de C. necator em meio mineral com e sem a adio de oligoelementos. Os resultados obtidos para os ensaios da Figura 3.5 esto detalhados na Tabela 3.3. Observa-se que provavelmente a concentrao inferior (0,16 g/L) e superior (0,67 g/L) tenham inibido o crescimento, respectivamente, por falta de fonte de carbono e por exceder a concentrao inibitria para o crescimento de C. necator, conforme observado no ensaio de adaptao simultnea (Tabela 3.2). Tabela 3.3. Velocidades especficas de crescimento de C. necator DSM 545 em meio mineral com cido acrlico como fonte de carbono. cido Acrlico (g/L) 0,16 0,33 0,67 (h-1) Sem Oligoelementos 0,019 0,029 0,016 (h-1) Com Oligoelementos 0,010 0,021 0,010

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Assim, o sistema foi realimentado com cido acrlico na mesma concentrao do incio do cultivo (0,33 g/L) a fim de observar se a cultura responde positivamente aumentando os valores da absorbncia. 3.4.3. Monitoramento do crescimento celular Os perfis apresentados na Figura 3.6 mostram o crescimento de clulas em meio mnimo, com e sem oliogoelementos, com uma concentrao de cido acrlico de 0,33 g/L no incio do processo. As linhas tracejadas perpendiculares ao eixo da abscissa representam os momentos em que foram realizadas as alimentaes com cido acrlico durante o andamento do bioprocesso. Cada adio visou incorporar ao meio de cultivo cido acrlico de forma a restabelecer a concentrao inicial de cido acrlico no meio, sendo que a primeira adio ocorreu a 99 horas de cultivo e a segunda, a 169 horas. O momento das alimentaes foi considerado como aquele em que a densidade tica do meio diminuiu.
1,0

Absorbncia (600 nm) pH

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

8,00 7,75 7,50 7,25 7,00 6,75 6,50 0 40 80 120 160 200 240 280

Tempo (h)

Figura 3.6. Resultados do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 em meio mineral, com fonte de carbono cido acrlico, em frascos Erlenmeyers agitados a 180 rpm a 30oC. Sem oligoelementos ( e ), com oligoelementos ( e ). Na primeira adio da fonte de carbono foi observado que a cultura respondeu com um aumento imediato da densidade tica, conforme observado na Figura 3.6A. Aps a segunda alimentao foi observado um tempo de estagnao do crescimento celular, at ser observada uma variao na densidade tica do meio de cultivo.

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Novamente, foi observado que para a concentrao de 0,33 g/L de cido acrlico no meio, o pH varia medida que aumenta a densidade tica, ou seja, medida que a cultura cresce (Figura 3.6B). A presena ou ausncia de oligoelementos tambm no interferiu nos perfis de crescimento celular. Os valores para a produtividade de clulas de C. necator obtida para o ensaio de crescimento celular a partir de duas alimentaes de cido acrlico, representado na Figura 3.6, esto apresentados na Tabela 3.4. Observa-se que a melhor produtividade celular alcanada nas primeiras horas podendo ser reflexo de uma possvel inibio pela concentrao do cido acrlico, uma vez que o mesmo no foi quantificado. Tabela 3.4. Produtividade celular durante o crescimento de C. necator DSM 545 em meio mineral com cido acrlico como fonte de carbono.

Produtividade Celular (g/L.h) Intervalo


19,67h - 68,17h 98,5h - 151,75h 151,75h - 242,72h Com Oligoelementos
0,0013 0,0008 0,0009

Sem Oligoelementos 0,0014 0,0008 0,0008

3.4.4. Avaliao do consumo de cido acrlico com vistas produo de P(3HB) A Figura 3.7 apresenta os resultados referentes ao crescimento de C. necator DSM 545 em cido acrlico (Figura 3.7A) e a manuteno da concentrao de P(3HB) intracelular (Figura 3.7B). Novamente observado que o pH varia medida que ocorre o crescimento celular. O consumo de cido acrlico ocorre nas primeiras 18 horas (Figura 3.7A), coincidindo com a fase de crescimento da cultura (Figuras 3.7C e 3.7D). A fase de crescimento apresenta um perfil linear, com uma velocidade especfica de crescimento aproximada de 0,035 h-1 a um taxa de consumo de cido acrlico igual a 0,01 g/L.h. Aps esse perodo no ocorre mais consumo, tanto que a concentrao de cido acrlico permanece num valor aproximado de 0,033 g/L, o que pode estar limitando o crescimento da cultura de C. necator. Ainda, observado que o pH assume um valor igual a 8,0 aps 39 horas de cultivo (Figura 3.7E). Estes ensaios iniciais mostram que as clulas de C. necator assimilam o cido acrlico e mantm a concentrao de P(3HB). Importante observar que as clulas de C. necator cultivadas

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em meio NB, para o preparo do inculo, apresentaram imediata atividade sobre o cido acrlico mostrando ser esta rota de assimilao constitutiva.

P(3HB) cido Acrlico (g/L) (mg/L) ln (abs) pH

0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 6 4 2 0 -1.0 -1.2 -1.4 -1.6 -1.8 0.4 0.3 0.2 0.1 8.5 8.0 7.5 7.0 0 10 20 30 40

B C D E

Absorbncia (600 nm)

Tempo (h)

Figura 3.7. Resultados do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 e biossntese de P(3HB) em clulas cultivadas em meio mineral contendo cido acrlico como fonte de carbono, em frascos Erlenmeyer sob agitao orbital de 160 rpm a 30oC.

3.5. Concluses A fonte de carbono cido acrlico assimilada para crescimento em meio mnimo pela cultura de C. necator, apresentando maior velocidade especfica de crescimento (0,035 h-1) e uma taxa de consumo de 0,01 g/L.h na concentrao inicial de 0,33 g/L de cido acrlico no meio de cultura. A rota de assimilao do cido acrlico pelas clulas de C. necator parece ser constitutiva, ou seja, a biodegradao ocorre sem haver necessidade de adaptar as clulas de C. necator presena de cido acrlico.

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CAPTULO 3 Cupriavidus necator DSM 545 e o cido acrlico

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CAPTULO 4 Estratgias para biodegradao de cido acrlico visando a produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator.
ndice 4.1. Introduo ...................................................................................................... 4.2. Processo ......................................................................................................... 4.3. Produo/Produtividade ................................................................................ 4.4. Experimental .................................................................................................. 4.4.1. Microrganismo ........................................................................................... 4.4.2. Meios de Cultura ........................................................................................ 4.4.3. Condies de Cultivo ................................................................................. 4.4.4. Procedimentos Analticos ........................................................................... 4.4.4.1. pH ............................................................................................................ 4.4.4.2. Anlise da concentrao de cido acrlico ............................................... 4.4.4.3. Anlise da concentrao celular .............................................................. 4.4.4.3.1. Espectrofotometria ............................................................................... 4.4.4.3.2. Gravimetria ........................................................................................... 4.4.4.4. Anlise da concentrao de polihidroxialcanoatos .................................. 4.5. Resultados e discusso .................................................................................. 4.5.1. Estratgia em batelada para produzir P(3HB) em frascos agitados. ........... 4.5.2. Estratgia em batelada para produzir P(3HB) em biorreator ..................... 4.5.3. Estratgia em batelada para produzir P(3HB) em sistema washed cells 4.6. Concluses ..................................................................................................... 4.7. Referncias bibliogrficas ............................................................................. 51 51 53 55 55 55 55 56 56 56 57 57 58 58 60 60 60 63 66 66

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4.1. Introduo Trs fases metablicas podem ser identificadas durante a biossntese de PHA em bactrias, conforme observado na Figura 4.1.

Fase I
(Protenas associadas membrana)

Fase II
(Protenas solveis)

Fase III
(Protenas associadas aos grnulos)

Anabolismo
P(HA)n

Fonte de carbono

Fonte de carbono

Hidroxiacil-CoA

PHAsintase
P(HA)n+1

Catabolismo

CoA-SH

Figura 4.1. Fases da biossntese de PHA (STEINBCHEL e VALENTIN, 1995).

Primeiro, a fonte de carbono desejada para biossntese de PHA precisa entrar na clula. Para isso existe um sistema de transporte especfico, localizado na membrana citoplasmtica. Segundo, reaes anablicas ou catablicas convertem a fonte de carbono em um tioster hidroxiacil-CoA, que um substrato usado pela PHA sintase. Terceiro, a PHA sintase, que a enzima chave da biossntese de PHA, usa estes tiosteres como substratos e catalisa a formao da ligao ster, com concomitante liberao de coenzima A (STEINBCHEL e VALENTIN, 1995). Trs so as vias de biossntese de PHAs bem conhecidas (TSUGE, 2002): 1. a via que gera monmeros de (R)-3-HB a partir de acetil-CoA; 2. a via que gera monmeros de (R)-3-HA a partir de intermedirios da oxidao de cidos graxos; 3. a via que gera monmeros de (R)-3-HA a partir de intermedirios da biossntese de cidos graxos.

4.2. Processo O processo de produo de P(3HB) microbiano compreende alguns estgios: I. sntese do biocatalisador: crescimento e multiplicao celular do organismo; II. sntese e acmulo de produto (P(3HB)); 51

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III. isolamento do produto desejado da clula (extrao e purificao do P(3HB)). Nas etapas I e II as clulas apresentam uma composio diferenciada, que pode ser vista a partir de tcnicas microscpicas, como apresentado na Figura 4.2 para Ralstonia eutropha. Na Figura 4.2A est apresentada a clula na fase de crescimento, quando os grnulos do biopolmero no aparecem diferenciados no meio intracelular. Na fase de produo do biopolmero (Figura 4.2B), os grnulos aparecem em dimenses maiores, permitindo a ntida diferenciao no meio intracelular.

Figura 4.2. Ralstonia eutropha nas fases de crescimento (A) e produo (B) (JUNG et al., 2000).

Alm da estratgia de batelada, possvel produzir P(3HB) com as estratgias de batelada alimentada e contnua. O cultivo em batelada alimentada permite que seja alcanada alta densidade celular, o que freqentemente necessrio para que se obtenha alta produtividade e alto rendimento do produto desejado (YAMANE e SHIMIZU, 1984). Os nutrientes so normalmente adicionados de forma intermitente ao reator. Em alguns cultivos feito o monitoramento de oxignio dissolvido (YANO et al., 1978) ou de pH de forma contnua (SUZUKI et al., 1990). Esses sinais so usados para alimentar e controlar o processo (KIM et al., 1994). A operao em batelada alimentada tambm permite minimizar os efeitos inibitrios de substratos e de alguns subprodutos. Os cultivos com alta densidade celular apresentam muitas vantagens em relao s culturas de baixa densidade, tais como maior concentrao de produto, maior produtividade e menores custos de recuperao do produto (LEE et al., 1997). Uma das desvantagens

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que pode ser citada o aumento da viscosidade e da tenso cisalhante, que pode ocasionar a ruptura da membrana celular e a maior demanda por oxignio dissolvido em cultivos aerbios. No Brasil, desde 1996, uma unidade piloto de produo foi instalada nas dependncias da Usina da Pedra, interior do Estado de So Paulo, utilizando a tecnologia desenvolvida no pas. A produo realizada em tanques agitados e aerados em condies controladas de pH, temperatura, oxignio dissolvido e aporte de matriasprimas. O copolmero produzido pela adio concomitante de cido propinico e acar (http://www.comciencia.br/reportagens/biodiversidade/bio15.htm, 15/01/2006). Na biossntese de P(3HB) o controle do pH parece ser um dos mais importantes fatores. Nos processos conduzidos com bactrias do gnero Alcaligenes o pH geralmente diminui por causa dos subprodutos cidos produzidos no ciclo dos cidos tricarboxlicos (TCA) (SEO et al., 1998). Alguns mtodos usados para manter o pH constante so (SEO et al., 1998): I. Uso de uma soluo tampo. necessrio observar, contudo, que a alta concentrao de tampo fosfato impede o crescimento celular. Por isso, a concentrao de fosfato de potssio precisa ser menor que 5 g/L. Geralmente a concentrao de subprodutos produzidos pelo ciclo TCA excede a capacidade tamponante da soluo fosfato de potssio (5 g/L); II. Uso de controlador de pH com cidos e bases, tais como HCl e NaOH. A adio de cido ou base pode reduzir a atividade das enzimas, pois HCl e NaOH so conhecidos como desnaturantes de protenas. Ainda, a adio de NaOH aumenta a concentrao de ons Na+ que entram na clula juntamente com os substratos glicose, frutose e sacarose, por exemplo. Os ons de sdio permeados so bombeados para fora da clula pela Na+K+ ATPase e este bombeamento requer energia pela hidrlise de ATP.

4.3. Produo/Produtividade A eficincia e a velocidade de obteno do produto em um bioprocesso so parmetros normalmente relacionados ao gentipo do microrganismo e ao substrato. O coeficiente de rendimento terico do substrato em produto depende do substrato usado (ACKERMANN e BABEL, 1998), mas tambm das condies de operao do sistema de biorreao.

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Uma produtividade volumtrica de 0,22 g/L.h de P(3HB) foi obtida com 6 horas de cultivo de Ralstonia eutropha em meio contendo 10 g/L de cido ltico. O mesmo valor foi obtido com 24 h de cultivo em meio contendo 20 g/L de frutose (LINKO et al., 1993). SEO et al. (1998) obtiveram para as diferentes fontes de nitrognio orgnico os seguintes valores para a velocidade especfica de crescimento: extrato de levedura (0,25 h-1), polipeptona (0,21 h-1), extrato de carne (0,07 h-1), extrato de carne e polipeptona (1:1) (0,41 h-1). Cultivos de E. coli recombinante permitem alcanar concentraes relativamente altas de P(3HB) (89 g/L) em processo tipo batelada alimentada com controle de pH (KIM et al., 1992). Alguns dados tpicos de produo de PHA por diferentes bactrias a partir de substratos distintos so apresentados na Tabela 4.1. Observa-se que as maiores produtividades reportadas na literatura esto associadas ao consumo de sacarose por Alcaligenes latus.

Tabela 4.1. Produo de PHA por vrias bactrias (LEE et al., 1999).
Bactria PHA Fonte de carbono Glicose CO2 Hidrolisado de tapioca Glicose + c. Propinico Sacarose Glicose cido valrico Metanol Tempo (h) 50 40 59 46 X (g L-1) 164 91,3 106 158 PHA (g L-1) 121 61,9 61,9 117 PHA (%) 76 67,8 57,5 74 Produtividade (g L-1 h -1) 2,42 1,55 1,03 2,55

Alcaligenes eutrophus* Alcaligenes eutrophus* Alcaligenes eutrophus* Alcaligenes eutrophus*

P(3HB) P(3HB) P(3HB) P(3HBco-3HV)

Alcaligenes latus P(3HB) 18 Azotobacter vinelandii P(3HB) 47 Chromobacterium P(3HV) violaceum Methylobacterium P(3HB) 70 organophilum Protomonas P(3HB) Metanol 170 extorquens Pseudomonas P(3HHxn-octano 38 co-3HO) Oleovorans Escherichia coli P(3HB) Glicose 39 recombinante Klebsiella aerogenes P(3HB) Melao 32 recombinante * Alcaligenes eutrophus: atualmente Cupriavidus necator.

143 40,1 39,5 250 233 37,1 101,4 37

71,4 32 24,5 130 149 12,1 81,2 24

50 79,8 62 52 64 33 80,1 65

3,97 0,68 1,86 0,88 0,32 2,08 0,75

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4.4. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto a VETEC exceto o padro de poli-3-hidroxibutirato que foi adquirido junto a SIGMA e o solvente cido acrlico que foi fornecido pela RHODIA.

4.4.1. Microrganismo Foi utilizada a bactria Cupriavidus necator DSM545, obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC.

4.4.2. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados foram: a. Agar Nutriente (NA) (g/L): Extrato de carne, 3,0 ; Peptona de carne, 5,0 ; Agar, 15,0 . b. Caldo Nutriente (NB) (g/L): Extrato de carne, 3,0; Peptona de carne, 5,0. c. Meio Mineral (MM) utilizado nos ensaios com cultura de Cupriavidus necator DSM 545, est baseado em RAMSAY et al. (1990), modificado por ARAGO et al. (1996), cuja composio : Soluo 1 (g/L): Citrato Frrico de Amnia, 0,06; MgSO4. 7H2O, 0,5; CaCl2.2H2O, 0,01; Soluo 2 (g/L): Na2HPO4, 0,51; KH2PO4, 0,07; Soluo 3 (g/L): H3BO3, 0,3; CoCl2.6H2O, 0,2; ZnSO4.7H2O, 0,1; MnCl2.4H2O, 0,03; Na2MoO4.2H2O, 0,03; NiCl2.6H2O, 0,02; CuSO4.5H2O, 0,01. Soluo 5 (g/L): cido acrlico. A fonte de nitrognio no foi adicionada em funo das condies exigidas para os ensaios. As solues foram esterilizadas separadamente a fim de evitar precipitao dos sais.

4.4.3. Condies de Cultivo As clulas foram cultivadas nas seguintes etapas: a. Etapa 1: Crescimento em meio caldo nutriente (NB), a 180 rpm e 30oC por 24h, a fim de obter massa celular;

b. Etapa 2: Crescimento em meio mineral (MM). * Cultivos em frascos Erlenmeyer.

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Um volume de meio NB, cultivado em frascos agitados a 180 rpm e 30oC por 24 horas, foi retirado assepticamente, centrifugado, lavado duas vezes com soluo salina 0,85% (v/v) e ressuspendido em gua destilada estril. Este volume corresponde a 10% (v/v) do MM e foi inoculado assepticamente. O mesmo procedimento foi adotado para a etapa seguinte, tambm em MM, sendo o volume de inculo retirado do mesmo meio j cultivado. Nesta etapa, conforme a estratgia adotada, a fonte de nitrognio estava limitada ou ausente. Em ambas as etapas as clulas foram incubadas a 180 rpm e 30oC por 24 horas.

* Cultivos em Biorreator. 400 mL de meio NB correspondente a 10% (v/v) do volume de meio no biorreator (4L) foi cultivado em frasco Erlenmeyer de 1000 mL de capacidade a 160 rpm e 30oC por 24 horas. Em seguida foi transferido assepticamente para o biorreator (New Brunswick, modelo Bioflo III), cujas condies de trabalho so definidas de acordo com o ensaio em andamento.

* Biorreao em Sistema Washed Cells A fim de obter alta concentrao celular, as clulas foram cultivadas previamente em meio NB e ento concentradas por centrifugao, lavadas por duas vezes com soluo salina 0,85% (v/v) e ressuspendidas em meio mineral sem a presena de fonte de nitrognio.

4.4.4. Procedimentos Analticos 4.4.4.1. pH O monitoramento do pH foi realizado por potenciometria, utilizando um potencimetro Metler Toledo, modelo MP220, equipado com eletrodo Ag/AgCL com termopar para ajuste de temperatura.

4.4.4.2. Anlise da concentrao de cido acrlico A quantificao da concentrao de cido acrlico foi realizada por cromatografia gasosa, com injeo direta do sobrenadante. Preparo da amostra: I. centrifuga-se um volume de meio de cultura; 56

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II separa-se o sobrenadante do material celular precipitado por centrifugao a 5000 x g por 20 min; III. armazena-se o material amostrado a -20oC para anlise posterior. Anlise da concentrao de cido acrlico: I. descongela-se a amostra e agita-se vigorosamente; II. misturam-se 180 L do sobrenadante a 20 L de soluo de cido actico 5 g/L; III. coleta-se com seringa micrograduada um volume de 1 L, que ento injetado na coluna.. IV. calcula-se a concentrao de cido acrlico (AA) no meio conforme segue: A3 AA( g / L) = a + b A4

(4.1)

onde A3 a rea obtida para a concentrao de cido acrlico; A4 a rea obtida para a concentrao do padro interno cido actico e "a" e "b" so as constantes obtidas na curva padro, respectivamente, o coeficiente angular e o coeficiente linear.

A curva padro de cido acrlico (Anexo 1) foi feita utilizando o cido actico como padro interno, com a concentrao variando entre 1 g/L e 4 g/L. A coluna utilizada para dosagem do cido acrlico de slica fundida (0,32mm X 50m) modelo CP-WAX 57 CB. O cromatgrafo um Chrompak, modelo CP 9000, equipado com um detector de ionizao de chama (DIC ar-hidrognio). O gs de arraste utilizado o nitrognio a 9,19 mL/min e as temperaturas do injetor, detector e coluna so iguais, respectivamente, a 250 C, 250 C e 120 C.

4.4.4.3. Anlise da concentrao celular A concentrao celular determinada por dois mtodos: por espectrofotometria (durante o cultivo) e por gravimetria.

4.4.4.3.1. Espectrofotometria Analisa-se a concentrao de massa celular do material coletado em um espectrofotmetro Spectronic 20D+, medindo-se a absorbncia no comprimento de 57

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onda de 600 nm contra um branco de gua. Para manter uma preciso adequada (regio linear), a faixa de absorbncia utilizada de 0,0 at 0,8. A partir deste valor, so feitas diluies para manter a linearidade.

4.4.4.3.2. Gravimetria A medida do peso seco celular compreende as seguintes etapas: I. separa-se um volume conhecido do meio de cultura, entre 1 mL e 10 mL; II. filtra-se o meio atravs de membranas Millipore de poliamida pr-pesadas (poro de 0,2 m); III. lava-se duas vezes o material retido na membrana com HCl 0,01M, para remover ons e sais presentes na biomassa; IV. seca-se a membrana com a biomassa em estufa a 85C at peso constante. V. calcula-se a concentrao celular (X) na forma:

X ( g / L) =

( MM f MM i ) 1000 VA

(4.2)

onde MMf a massa da membrana final (g); MMi a massa da membrana inicial (g) e VA o volume da amostra do meio de cultivo (mL).

A curva de calibrao de concentrao celular em funo da absorbncia (600 nm) (Anexo 2) serve para estimar a concentrao de clulas durante a fase de crescimento da cultura.

4.4.4.4. Anlise da concentrao de polihidroxialcanoatos A quantificao da concentrao de PHAs foi realizada por cromatografia gasosa, conforme o mtodo de metanlise baseado em BRAUNEGG et al. (1978), com as modificaes propostas por BRANDL et al. (1988). Preparo da amostra: I. coleta-se um volume de amostra do meio de cultura compreendido entre 1,5 e 2 mL; II. centrifuga-se a amostra a 15.000 rpm por 5 minutos; III. lava-se o sedimentado duas vezes com gua destilada;

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IV. armazena-se o sedimentado a -20oC para que todas amostras sejam analisadas ao mesmo tempo. Metodologia: I. ressuspende-se o sedimentado em 2 mL de metanol acidificado (H2SO4 15%), contendo cido benzico 0,4 g/L como padro interno; II. adiciona-se um volume de 2 mL de clorofrmio; III. aquece-se a mistura a 100C durante 140 minutos em tubos fechados, sendo que aps 60 minutos de aquecimento a mistura agitada durante alguns segundos e devolvida ao aquecimento; IV. resfria-se a mistura at a temperatura ambiente; V. adiciona-se 1mL de gua destilada; VI. agitam-se as amostras durante 30 segundos, deixando separar as fases; VII. retira-se a fase orgnica (inferior) com uma pipeta Pasteur; VIII. armazena-se a fase aquosa em geladeira, para posterior anlise em cromatografia gasosa. A curva padro (Anexo 3) feita utilizando-se o poli-3-hidroxibutirato (Sigma), como padro externo, com massa variando entre 0,0010 g e 0,0100 g. Submetem-se os padres mesma metanlise que as amostras. A coluna utilizada para dosagem do P(3HB) de slica fundida (0,32mm X 50m) modelo CP-WAX 57 CB. O cromatgrafo um Chrompak, modelo CP 9000, equipado com um detector de ionizao de chama (DIC ar-hidrognio). O gs de arraste utilizado o hlio a 9,19 mL/min e as temperaturas do injetor, detector e coluna so iguais, respectivamente, a 250 C, 250 C e 120 C. O volume injetado de 1 L. O clculo da concentrao de P(3HB) realizado conforme a seguinte equao:
A1 A2 a + b 1000 P(3HB )( g / L) = VA

(4.3)

onde A1 a rea obtida para o P(3HB); A2 a rea obtida para o padro interno cido benzico; "a" e "b" so as constantes obtidas na curva padro, respectivamente, o coeficiente angular e o coeficiente linear, e VA o volume da amostra do meio de cultivo (mL).

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4.5. Resultados e discusso 4.5.1. Estratgia em batelada para produzir P(3HB) em frascos agitados. A produo de P(3HB) em meio mnimo em ausncia de fonte de nitrognio j foi observada na literatura para cultivos de Alcaligenes eutrophus (REPASKE e REPASKE, 1976). Na Figura 4.3 possvel observar que, em meio mnimo, sem a fonte de nitrognio, as clulas de Cupriavidus necator DSM 545 produziram o P(3HB) at 140 horas de cultivo. A despolimerizao do P(3HB) acumulado nas clulas observada aps esse instante. Tambm a absorbncia e o pH tm seus valores diminudos. A diminuio dos valores de pH pode ser um reflexo da liberao de metablitos intracelulares e/ou da despolimerizao do P(3HB).
0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 9 8

Absorbncia (600 nm) pH

P(3HB) (mg/L)

7 6 5

50

100

150

200

250

Tempo (h)

Figura 4.3. Perfis da biorreao das clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em MM com cido acrlico como nica fonte de carbono e ausncia de fonte de nitrognio em frascos Erlenmeyer agitados a 160 rpm a temperatura de 30 oC (concentrao inicial de cido acrlico de 0,33g/L).

4.5.2. Estratgia em batelada para produzir P(3HB) em biorreator. A produo de P(3HB) com adio de um agente para controle de pH j foi observada na literatura. O controle do pH importante porque ele parece afetar bastante tanto o crescimento celular quanto a produo de P(3HB). Para controlar o pH do meio nutriente utilizado para biossntese de P(3HB) por Ralstonia eutropha, SEO et al. 60

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visando a produo de polihidroxialcanoatos

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

(1998) utilizaram solues de NaOH, KOH e Na2CO3. A soluo de Na2CO3 foi a mais bem sucedida, pois foi capaz de minimizar o efeito da inibio por substrato, uma vez que CO2 gerado e pode ser assimilado como fonte de carbono pelas clulas. KIM et al. (1992) utilizaram um mtodo de manuteno do valor de pH pela adio de uma soluo de cido propinico para obter o copolmero poli-(3-hidroxibutirato-co-3hidroxivalerato) (P(3HB-co-3HV)), que apresentou um contedo de 50% de unidades HV no polmero. Na Figura 4.4 esto representadas as respostas das clulas de Cupriavidus necator DSM 545 cultivadas em biorreator em meio caldo nutriente, sob agitao de 300 rpm, aerao de 0,125 vvm, temperatura de 30 oC e pH inicial 7,0. Na Figura 4.4A possvel verificar que as clulas cultivadas nessa condio apresentaram uma limitao de crescimento por volta de 10 horas de cultivo, uma vez que pode ser observada a manuteno dos valores para o peso seco celular em torno de 1,3 g/L. Reflexo dessa mudana de estado fisiolgico observado nos valores de pH, que comeam a aumentar de forma pronunciada aps incio da limitao do crescimento.

Absorbncia Peso Seco Celular (g/L) (600 nm) pH

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 3 2 1 0 9 8

7 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Tempo (h)

Figura 4.4. Perfis do crescimento de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em meio caldo nutriente (NB) em biorreator a temperatura de 30 oC sob agitao de 300 rpm e aerao de 0,125 vvm e pH inicial 7,0.

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

O efeito do aumento do pH no meio de cultivo caldo nutriente foi investigado fazendo uso de uma soluo de cido acrlico (2 g/L) para regular o pH. A Figura 4.5A apresenta o perfil de crescimento das clulas quando o pH mantido aproximadamente igual a 7. O crescimento retardado, devido adio de cido acrlico, mas mantido linearmente durante o processo, contrrio ao que foi observado na Figura 4.4A para uma condio experimental inicial similar, embora em ambos os experimentos seja alcanada a mesma concentrao celular final. Isto pode ser reflexo da adio de cido acrlico que, conforme a Figura 4.5E, apresentou acmulo de 0,47 g/L no meio de cultura at aproximadamente 11 horas. Aps este perodo, o crescimento celular parece retardado por fora de alguma limitao, uma vez que observada a reduo da velocidade especfica de crescimento (Figura 4.5F) e o consumo de cido acrlico no meio (Figura 4.5E).

Absorbncia Peso Seco Celular (g/L) (600 nm)

2.0 1.5

0.20 0.16

P(3HB) (g/L) cido Acrilico (g/L) ln (abs)

1.0 0.5 0.0 4 3 2 1 0 9 8 7 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

0.12 0.08 0.04 0.00 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 1

pH

0 -1 -2 -3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

F
Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 4.5. Resultados do crescimento de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator a temperatura de 30 oC sob agitao de 300 rpm, aerao de 0,125 vvm e pH 7,0 controlado pela adio de soluo de cido acrlico a uma concentrao de 2 g/L.

Instantes antes do cido acrlico comear a ser consumido, observado o incio da produo de P(3HB) (Figura 4.5D). Se for considerado o direcionamento do cido

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acrlico para a via de biossntese de P(3HB), observado um fator de converso de substrato em produto (YP(3HB)/cAcrilico) igual a 0,34 gP(3HB)/gcAcrilico e uma concentrao de P(3HB) em relao a biomassa total igual a 12% aps 23 horas, quando o acmulo de P(3HB) interrompido. Interessante observar que o biopolmero acumulado por Cupriavidus necator DSM 545 durante o perodo de crescimento celular. QI et al. (1998) explicam a ao do cido acrlico sobre a produo de P(3HB) como um possvel inibidor de vias metablicas, mais especificamente da -oxidao de cidos graxos, o que faz com que os intermedirios sejam direcionados para a via de P(3HB). Para uma concentrao de 0,24 g/L de cido acrlico, os autores obtiveram um acmulo mximo de PHA, em E. coli RS3097 (pBHR71), de 60% do peso seco de clulas cultivadas em meio contendo decanoato como fonte de carbono. Contudo, VAN DER MAAREL et al. (1996) mostraram que o cido acrlico resultante da clivagem do substrato DMSP pode ser utilizado como um agente aceptor de eltrons, o que pode ser uma alternativa para a produo de P(3HB), uma vez que a exausto de oxignio no meio de cultura induz a biossntese de P(3HB). A introduo do cido acrlico como um aceptor de eltrons parece ser uma alternativa possvel para cultivos anaerbicos, uma vez que j conhecido que as clulas de Ralstonia eutropha crescem em anaerobiose na presena de on nitrato (BERGEY et al., 1983).

4.5.3. Estratgia em batelada para produzir P(3HB) em sistema washed cells Na Figura 4.6 est representada a curva de consumo do cido acrlico na condio de washed cells para C. necator DSM 545, na condio experimental de concentrao celular equivalente a 12g/L. Observa-se que uma concentrao de 0,5 g/L de cido acrlico foi exaurida aps 3 horas de cultivo. Este tempo 6 vezes menor do que aquele obtido quando o sistema de crescimento celular foi utilizado (Figura 3.4). Assim, possvel verificar que o sistema de washed cells pode ser uma boa alternativa para o consumo de cido acrlico por C. necator DSM 545. Alm disso, as clulas bacterianas foram mantidas por 6 horas em meio mineral sem fonte de carbono, quando ento a alimentao foi realizada. A concentrao de cido acrlico alcanou 0,7 g/L, a qual foi totalmente consumida aps 4 horas de cultivo. O pH do meio de cultivo foi determinado em quatro momentos do processo: no comeo do cultivo, antes da alimentao (8,6 h), aps a alimentao (8,9 h) e no final do cultivo (13 h), sendo os valores observados iguais, respectivamente, a 7,0, 8,0, 7,0 e 7,9. 63

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0 ,7

c id o a c r lic o ( g / L )

0 ,6 0 ,5 0 ,4 0 ,3 0 ,2 0 ,1 0 ,0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4

T e m p o (h )

Figura 4.6. Perfis de variao da concentrao de cido acrlico em sistema de washed cells para Cupriavidus necator DSM 545 em bioreator agitado magneticamente temperatura de 30 oC.

O sistema washed cells foi utilizado para avaliar a biossntese de P(3HB) e a influncia de uma menor concentrao inicial de clulas de C. necator DSM 545 sobre a sntese do biopolmero. As clulas foram concentradas a 4,4 g/L em meio mineral com ausncia de nitrognio. As Figuras 4.7C e 4.7A mostram que os valores iniciais para o pH e a concentrao de cido acrlico foram iguais a 7,0 e 0,4 g/L, respectivamente. Todo o cido acrlico foi consumido aps 5 horas de cultivo, quando o pH alcanou um valor igual a 7,6. A alimentao do meio com o cido acrlico foi realizada aps 6,15 horas de cultivo e a concentrao de cido acrlico alcanou 0,6 g/L no meio de cultura, quando o pH foi tambm ajustado a 7,0. Aps uma hora, o pH aumentou rapidamente, alcanando um valor igual a 7,5. No instante em que o pH apresentou um valor igual a 7,8 e a concentrao de cido acrlico atingiu 0,17 g/L, uma nova alimentao foi realizada e o pH ajustado novamente a 7,0. O contedo de cido acrlico atingiu 0,58 g/L e o pH foi rapidamente alterado a 7,7 nas primeiras horas aps a segunda alimentao. No final do cultivo o pH alcanou um valor igual a 7,95. A anlise de P(3HB) (Figura 4.7B) mostra que as clulas apresentam acmulo do biopolmero no incio do cultivo. Tambm possvel observar que, enquanto o cido acrlico estava presente no meio de cultura, a concentrao de P(3HB) foi mantida praticamente constante. Quando a fonte de carbono foi totalmente consumida, a 64

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concentrao de P(3HB) diminuiu e uma nova alimentao foi realizada. Esta alimentao parece ter desativado o sistema de depolimerizao pois a concentrao de P(3HB) permaneceu praticamente constante a 0,2 g/L at o cultivo bacteriano ser finalizado com cido acrlico ainda presente no meio.
0 ,7

c id o a c r lic o ( g / L )

0 ,6 0 ,5 0 ,4 0 ,3 0 ,2 0 ,1 0 ,0 0 5 1 0 1 5 2 0

T e m p o (h )
0 ,7

0 ,6

P (3 H B ) (g /L )

0 ,5

0 ,4

0 ,3

0 ,2

0 ,1 0 5 1 0 1 5 2 0

T e m p o (h )

8 ,0

7 ,8

7 ,6

p H

7 ,4

7 ,2

7 ,0

6 ,8 0 5 1 0 1 5 2 0

T e m p o (h )

Figura 4.7. Perfis de variao da concentrao de cido acrlico, da concentrao de P(3HB) e do pH em sistema washed cells para C. necator DSM 545 mantidas em bioreator agitado magneticamente a 30 oC.

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4.6. Concluses possvel obter P(3HB) a partir da assimilao de cido acrlico pelas clulas de C. necator DSM 545 em meio mnimo sem a presena de fonte de nitrognio. possvel aumentar a produo de P(3HB) com o controle dos valores de pH do meio de cultura (NB), utilizando-se para isso uma soluo de cido acrlico. Com essa estratgia possvel aumentar a concentrao de cido acrlico no meio, de 0,33 g/L em meio mnimo em frascos agitados, para 0,5 g/L em meio caldo nutriente em biorreator, onde as condies de aerao podem ser controladas. O tempo para o cido acrlico ser completamente metabolizado por clulas de C. necator DSM 545 mantidas em sistema washed cells dependente da concentrao celular. O sistema washed cells parece melhor para esse fim do que o sistema de crescimento celular, uma vez que o consumo do cido acrlico ocorreu em um tempo 6 vezes menor no esquema de washed cells. O consumo de cido acrlico pode ser monitorado pelos valores de pH porque estes valores aumentam enquanto a concentrao de cido acrlico diminui. A exausto da fonte de carbono em meio de cultura MM com ausncia de fonte de nitrognio provavelmente ativa o mecanismo de depolimerizao nas clulas de C. necator DSM 545, diminuindo a concentrao de P(3HB).

4.7. Referncias bibliogrficas ACKERMANN, J.U., BABEL, W., 1998, Approaches to increase the economy of the PHB production, Polymer Degradation and Stability, v. 59, pp. 183-186. ARAGO, G.M.F.; LINDLEY, N.D.; URIBELARREA, J.L.; PAREILLEUX, A., 1996, Maintaining controlled residual growth capacity increases the production of polyhydroxyalkanoate copolymers by A. eutrophus, Biotechnology Letters, v. 18, pp. 937-942. BERGEY, D. H., HOLT, J. G., KRIEG, N. R. (1983) Bergeys manual of determinative bacteriology. Baltimore: Williams & Williams, v. 1, p. 167-168. BRANDL, H.; GROSS, R.A.; LENZ, R.W.; FULLER, R.C., 1988, Pseudomonas oleovorans as a source of poly-(-hydroxyalkanoates) for potential applications as biodegradable polyesters, Applied and Environmental Microbiology, v. 54, p. 1977-1982.

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CAPTULO 4 Estratgias para biodegradao de cido acrlico por C. necator

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CAPTULO 5 Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545


ndice 5.1. Introduo ....................................................................................................... 5.1.1. Potencial Redox ........................................................................................... 5.2. Experimental ................................................................................................... 5.2.1. Microrganismo ..... 5.2.2. Meios de Cultura .. 5.2.3. Condies de Cultivo ... 5.2.3.1. Preparo do inoculo .... 5.2.3.2. Crescimento em meio caldo nutriente (NB) ..... 5.2.4.1. Membranas de microfiltrao ................................................................... 5.2.4.2. Mdulo de permeao ............................................................................... 70 72 79 79 79 79 79 79 80 80

5.2.4. Concentrao de clulas por microfiltrao ................................................. 80

5.2.4.3. Sistema de microfiltrao .......................................................................... 81 5.2.5. Procedimentos Analticos ..... 82 5.2.1. Medida do pH .... 5.2.5.3. Medida da concentrao de oxignio dissolvido ...... 5.2.5.4.1. Espectrofotometria ..... 5.2.5.4.2. Gravimetria .... 5.3. Resultados e discusso .... 5.4. Concluses .. 82 82 82 83 83 94 5.2.5.2. Medida do potencial redox 82 5.2.5.4. Anlise da concentrao celular .... 82

5.5. Referncias bibliogrficas ... 94

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5.1. Introduo Os fatores que influenciam o desempenho de um bioprocesso podem ser classificados como fsicos, qumicos ou biolgicos. Os fatores fsicos e qumicos descrevem o ambiente do biocatalisador, enquanto que os fatores biolgicos fornecem informaes sobre seu comportamento. As propriedades biolgicas de um sistema apresentam especial desafio quanto a sua mensurao devido ao seu comportamento dinmico no convencional e complexidade dos fenmenos envolvidos (SONNLEITNER, 1996; DOCHAIN e PERRIER, 1997). A possibilidade de fazer uma medida em linha e em tempo real permite que seja aumentada a freqncia de medidas e melhorada a amostragem dos dados. Isso aumenta a significncia estatstica das anlises e possibilita a observao e interpretao de efeitos que poderiam ser negligenciados ou mal interpretados de outra forma (SONNLEITNER e FIECHTER, 1992). Diferentes so as tcnicas de medidas que podem ser utilizadas para o monitoramento de bioprocessos. Dentre as tcnicas mais comumente utilizadas podem ser citadas aquelas que empregam os princpios amperomtricos, potenciomtricos, condutomtricos, trmicos, pticos e acsticos. Cada uma dessas tcnicas apresenta atributos especficos que podem ser avaliados de acordo com a acurcia, preciso, sensibilidade, seletividade, freqncia de anlises, confiana, robustez, rapidez de anlise, multiplicidade de anlise, flexibilidade, facilidade de operao, facilidade de manuteno, consumo de analito, consumo de reagente, risco de contaminao e custo (VAIDYANATHAN et al., 1999). A concentrao de biomassa uma das variveis mais importantes em processos de cultivo submerso e muitos sensores tm sido introduzidos para monitoramento desta varivel in situ e em linha (OLSSON e NIELSEN, 1997). A maneira convencional de medir a biomassa atravs da gravimetria, obtendo-se o peso seco das clulas. Esta tcnica no pode ser usada para medidas em linha, mas a concentrao de biomassa pode ser medida indiretamente por via eltrica ou ptica (HARMS et al., 2002). Na Tabela 5.1 esto apresentados alguns dos mtodos mais conhecidos e utilizados para monitoramento da concentrao celular em condies controladas; isto , em cultivos em escala de laboratrio, cultivos com baixas concentraes ou meios definidos quimicamente.

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Tabela 5.1. Mtodos mais utilizados para o monitoramento da concentrao celular (NEVES et al., 2001; HARRIS e KELL, 1985, REARDON e SCHEPER, 1991). Mtodos Mtodos qumicos Finalidade Quantificao qumica dos constituintes da clula (DNA, RNA, ATP ou fosfolipdeos) Gravimetria (biomassa em base seca) Centrifugao (frao volumtrica de miclio compactado) pticos (densidade ptica) Espectroscpicos em linha e in situ (fluorescncia) Mtodos fsicos Anlise de imagens digitais utilizando luz visvel e marcadores moleculares (epifluorescncia) Espectroscopia dieltrica em linha e in-situ Contagem de clulas (contador de Coulter) Viscosidade aparente do meio de cultura Mtodos inferenciais Mtodos de inferncia com modelos matemticos ou estequiomtricos (taxa de consumo de O2 ou de produo de CO2 em processos aerbios)

Tabela 5.2. Principais variveis monitoradas para avaliao do meio de cultura e da atividade celular (WILSON, 1984). Monitoramento do meio de cultura pH Temperatura Oxignio dissolvido Potencial redox Dixido de carbono dissolvido Substrato Produto Fluxo de massa Monitoramento da atividade celular Oxignio gasoso Dixido de carbono gasoso Evoluo de calor ATP NAD/NADH Metablitos Massa celular Concentrao de enzimas

Os sensores disponveis para bioprocessos podem ser normalmente classificados em duas categorias: (I) aqueles que medem o ambiente do processo e (II) aqueles que medem, geralmente de forma indireta, alguma das propriedades das clulas. Na Tabela

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5.2 esto apresentadas as principais variveis monitoradas em cada uma dessas duas categorias. Para uma eficiente produo de P(3HB) por R. eutropha, a concentrao da fonte de carbono precisa ser mantida em torno de um valor timo. Assim, o desenvolvimento de um mtodo que permita monitorar e controlar as concentraes de substrato parece ser essencial (LEE e YOO, 1991). Alguns mtodos usados para manter a concentrao de glicose em torno de um valor timo para produo de P(3HB) por R. eutropha em altas concentraes so: I. monitoramento da taxa de evoluo do CO2 (CER), utilizado para estimar o consumo de substrato (SUZUKI et al., 1988); II. monitoramento em linha de glicose (MITZUTANI et al., 1987, PARK et al., 1992). MORI et al. (1979) usaram a concentrao de oxignio dissolvido como um indicador do estado de fermentao e para manipular a alimentao de glicose, a fim de conseguir alta densidade celular de cultura. SUZUKI et al. (1990) usaram medidas de pH para monitorar o sistema e controlar a taxa de alimentao de glicose e outros nutrientes. SHIMIZU et al. (1988) monitoraram os nveis de concentrao de certos subprodutos para controlar a taxa de alimentao de glicose. KJAERGAARD e JOERGENSEN (1977) utilizaram o sinal do potencial redox do meio de cultura como sinal para controlar a taxa de alimentao de glicose no meio. 5.1.1. Potencial Redox A primeira medida eletroqumica do potencial redox de uma cultura bacteriana foi realizada em 1910. O potencial redox (Eh) um parmetro global que representa o potencial para reao de xido-reduo de uma variedade de compostos. O valor do potencial redox depende, em princpio, do potencial padro (Eho) das meias reaes e da concentrao dos reagentes. O potencial redox pode ser calculado atravs da Equao de Nernst, se existir uma condio de equilbrio termodinmico. Na prtica, entretanto, a medida do potencial redox determinada pelo composto com maior densidade de carga eltrica disponvel para troca; isto , com maior capacidade para trocar eltrons com a superfcie da platina do eletrodo (JANSSEN et al., 1998).

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Uma definio qumica para o potencial redox est relacionada a um par de componentes dos quais um na forma oxidada (Ox) pode ser reduzido de maneira reversvel em outro na forma reduzida (Red) por meio do movimento de eltrons (e): Ox + ne- Red Em culturas de microrganismos o potencial redox uma das variveis mais facilmente mensurveis, uma vez que os eletrodos disponveis comercialmente so esterilizveis, baratos e estveis para medidas in situ. Apesar da natureza complexa dessa medida que depende de uma diversidade de parmetros ambientais e celulares, o monitoramento do potencial de xido-reduo de culturas celulares tem sido aplicado com sucesso para a identificao de estados fisiolgicos, otimizao de desempenho dos processos e para propostas de controle e de monitoramento (HIGAREDA et al., 1997; JANSSEN et al., 1998). O potencial redox indica a concentrao relativa de agentes oxidantes e redutores no meio; logo, ele um indicador que representa a possibilidade de ligaes redox agirem como doadores e aceptores de eltrons (LEE et al., 1998). Os meios de cultura contm muitos componentes diferentes que so sujeitos a diferentes reaes redox de natureza biolgicas e qumicas. O potencial redox resultante, medido por um eletrodo redox, est relacionado disponibilidade global de eltrons e no pode ser associado a um composto especfico (WINTER et al., 1988). O potencial redox medido potenciometricamente com eletrodos feitos de metais nobres (Pt, Au). A construo mecnica similar a dos eletrodos de pH e o eletrodo de referncia deve satisfazer as mesmas exigncias. Diferentes so as aplicaes em que os eletrodos redox so utilizados em bioprocessos. Alguns exemplos esto apresentados na Tabela 5.3. Visto que possvel monitorar o crescimento de clulas de C. necator no presente captulo este monitoramento ser realizado com as clulas crescendo em meio NB. Tambm ser verificada a correlao dos valores de potencial redox com a concentrao de massa celular e a correlao destas variveis em um sistema de concentrao das clulas de C. necator por microfiltrao.

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

Tabela 5.3. Aplicaes de eletrodos redox em bioprocessos. Aplicao/Estudo


Transformao de L-sorbose em cido 2-ceto-L-glicnico

Estratgia
Ensaios com diferentes taxas de aerao. Fixar os valores de Eh utilizando

Microrganismo
Linhagem mutante de Pseudomonas

Observado
O Eh conseguiu indicar a demanda de oxignio pela cultura. Levorina A foi produzida com

Referncia
TENGERDY, 1961

Influncia de Eh na biossntese de antibiticos levorina A e levorina B

mtodos fsicos (variao da taxa de aerao) e qumicos (adio de compostos qumicos)

Actinomyes levoris

valores de Eh altos ao contrrio da Levorina B. O valor de Eh na fase estacionria leva a produo de

SUKHAREVICH, et al., 1970

Influncia do Eh sobre o metabolismo celular

Mudana da vazo de ar e velocidade de agitao do meio de cultura

diferentes subprodutos, alm Bacillus subtilis disso, inosina no foi acumulada para valores de Eh -160 mV, mas cido ltico. A diminuio dos valores de Eh

WIMPENNY e NECKLEN, 1971

Medir as variaes dos valores de Eh com diferentes tipos de eletrodos. Determinao da quantidade de agentes redutores produzidos durante o crescimento celular. Titular o meio de cultura com soluo 0,001N de K3Fe(CN)6 Manter o pH constante Candida utilis

foi comum a todos eletrodos, porm a magnitude dependeu do tipo de eletrodo. H gerao de compostos redutores durante o crescimento celular.

KANTERE, 1972.

Candida utilis

KANTERE, 1972

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Tabela 5.3 (cont.). Aplicaes de eletrodos redox em bioprocessos. Aplicao/Estudo Estratgia


Definio da capacidade tamponante Correlao entre oxignio dissolvido e Eh Medida de Eh em diferentes meios de cultura

Microrganismo

Observado

Referncia
BALAKIREVA et al., 1974

O valor de Eh diminui 10 vezes mais que o valor de oxignio dissolvido A adio dos agentes redutores resultou em baixo rendimento ISHIZAKI et al., 1974

Influncia do Eh sobre as mudanas fisiolgicas e bioqumicas

Adio de cido ascrbico e hexacianoferrato (III) de potssio

Candida utilis

celular, porm aumentou o consumo da fonte de carbono (glicerol) e da fonte de nitrognio (NH4+). H variao na amplitude do sinal, porm no no perfil

ANDREEVA, 1974

Influncia da limpeza do eletrodo e do seu recobrimento com uma membrana nos valores de Eh

Polimento do eletrodo Limpeza do eletrodo com HNO3 Cobertura do eletrodo com membrana

Proteus vulgaris Staphylococcus aureus SC511

obtido para a variao dos valores. A maior amplitude observada quando o eletrodo est coberto com membrana JACOB, 1974

75

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Tabela 5.3 (cont.). Aplicaes de eletrodos redox em bioprocessos. Aplicao/Estudo Estratgia


Injeo de argnio, ar e oxignio em Avaliao de diferentes tipos de eletrodos de Eh diferentes etapas do monitoramento redox com eletrodos de platina, ouro e vidro. Formulao de uma teoria: o valor de Eh apenas uma medida de apenas alguns compostos (doadores de eltrons) Examinar o efeito de diferentes agentes redutores sobre o Eh e o crescimento bacteriano Adicionar agentes redutores (2mercaptoetanol, cido ascrbico, tioglicolato de sdio) em diferentes concentraes. Crescimento de microrganismos em Seleo de microrganismos na presena de agentes redutores meios de cultura contendo diferentes concentraes de neutral red e quinidrona. Identificao do estado metablico da cultura durante a produo de aminocidos Variao da agitao do meio

Microrganismo

Observado
O eletrodo redox de vidro no sofreu a influncia de sistemas que competem pelo oxignio, permanecendo constante durante todo o tempo.

Referncia

Cndida utilis

BALAKIREVA et al., 1974

WIMPENNY, 1976

Clostridium botulinum type E

O melhor crescimento celular ocorreu com baixa concentrao de agente redutor A quinidrona no afetou o valor SMITH e PIERSON, 1979

Escherichia coli

obtido para max, contudo, o neutral red afetou um pouco. Os valores de Eh permitiram

THOMPSON e GERSON, 1985

Corynebacterium glutamicum ATCC 14296

sinalizar o instante do trmino da produo de cido ltico, bem como incio e fim da produo de aminocidos KWONG e RAO, 1991

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Tabela 5.3 (cont.). Aplicaes de eletrodos redox em bioprocessos. Aplicao/Estudo Estratgia


Trs condies foram adotadas: (a) adio de glucose, etanol, acetato Produo de xilitol ou glicerol como cosusbstratos, (b) variao dos nveis de oxigenao, (c) variao das razes entre xilose e o cosubstrato.

Microrganismo

Observado
O rendimento de xilitol foi maior conforme foi aumentada a razo xilose:cosubstrato O consumo do cosubstrato fez com que o potencial redox intracellular fosse balanceado pela regenerao de NAD(P)+ Os valores obtidos para Eh apresentaram quatro intervalos distintos que parecem estar correlacionados com o crescimento celular. Alm

Referncia

Saccharomyces cerevisiae recombinante

HALLBORN et al., 1994

Correlacionar Eh com variveis de estado de culturas

Crescimento celular com oxignio dissolvido e pH controlados

Brevibacterium ketoglutamicum

disso, o perfil de Eh mantido diferentemente de seus valores quando a concentrao de oxignio dissolvido variada. Foi desenvolvida uma funo polinomial para correlacionar Eh s variveis de estado. A maneira de regular o nvel do

LEE et al., 1998

Produo de cido ctrico pelo controle do potencial redox.

Variao da aerao e agitao. Adio de ferrocianeto do potssio.

Aspergillus niger

potencial redox regular a aerao e a agitao.

BEROVIC, 1999

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Tabela 5.3 (cont.). Aplicaes de eletrodos redox em bioprocessos. Aplicao/Estudo Estratgia

Microrganismo

Observado
A biomassa foi afetada pelo valor de Eh e pela taxa de diluio. A presena de ditiotreitol diminui em 30% o

Referncia

Estudo da modificao dos fluxos de eltrons e carbono a partir da modificao dos valores de Eh extracelular

Adio de agentes redutores qumicos (ditiotreitol, borohidreto de sdio) e borbulhamento de nitrognio/hidrognio Escherichia coli

valor da biomassa final. Entre os metablitos analisados foi observado que o aumento nos valores de Eh fez com que a concentrao de lactato aumentasse em 30%, mostrando um claro deslocamento do fluxo de carbono na clula. Foram observados picos com maior e menor intensidade nos grficos obtidos para dE/dt x Escherichia coli tempo e um deslocamento destes em funo da concentrao de clulas presentes no meio. O potencial redox sinaliza o instante da exausto de fosfato. SILVA e WONG, 1995 RIONDET et al., 2000

Identificar diferentes fentipos bacterianos

Monitorar no tempo suspenses com diferentes linhagens bacterianas

Monitoramento de cultivos celulares

Limitao em fosfato do meio mineral.

Ralstonia eutropha DSM 545

FINKLER, 2002

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5.2. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto a VETEC. 5.2.1. Microrganismo Foi utilizada a bactria Cupriavidus necator DSM545, obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC. 5.2.2. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados foram: a. Agar Nutriente (NA) (g/L): Extrato de carne, 3,0 ; Peptona de carne, 5,0 ; Agar, 15,0 . b. Caldo Nutriente (NB) (g/L): Extrato de carne, 3,0; Peptona de carne, 5,0. 5.2.3. Condies de Cultivo 5.2.3.1. Preparo do inculo. O inculo foi preparado a partir do crescimento das clulas de C. necator em meio caldo nutriente (NB), a 180 rpm e 30 oC por 24h; 5.2.3.2. Crescimento em meio caldo nutriente (NB). * Cultivos em frascos Erlenmeyer. Um volume de meio NB cultivado foi retirado assepticamente, centrifugado, lavado duas vezes com soluo salina 0,85% (v/v) e ressuspendido em gua destilada estril. Este volume corresponde a 1% (v/v) do MM e foi inoculado assepticamente. O mesmo procedimento foi adotado para a etapa seguinte, tambm em MM, sendo o volume de inculo retirado do mesmo meio j cultivado. Nesta etapa, conforme a estratgia adotada, a fonte de nitrognio estava limitada ou ausente. Em ambas as etapas as clulas foram incubadas a 180 rpm e 30oC por 24 horas. * Cultivos em Biorreator. Um volume de meio NB correspondente a 1% (v/v) do volume de meio no biorreator (4L) foi cultivado em frasco Erlenmeyer (1000 mL) a 160 rpm e 30oC por 24 horas. Em seguida foi transferido assepticamente para o biorreator (New Brunswick,

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modelo Bioflo III), cujas condies de trabalho so definidas de acordo com o ensaio em andamento. 5.2.4. Concentrao de clulas por microfiltrao. 5.2.4.1. Membranas de microfiltrao Para o desenvolvimento deste trabalho sero utilizadas membranas de microfiltrao do tipo fibra ocas (Figura 5.1) desenvolvidas no Laboratrio de Separao por Membranas PAM/PEQ/COPPE. As membranas microporosas eram constitudas por poli (ter imida)- PEI (ULTEM) polmero base e polivinilpirrolidona (PVP Fluka Chemika Co.) como aditivo, segundo metodologia proposta por FARIA et al, (2002).

Figura 5.1. Feixe de membranas microporosas de geometria cilndrica do tipo fibra oca. 5.2.4.2. Mdulo de permeao O mdulo de microfiltrao foi preparado numa conformao semelhante a um trocador de calor tipo casco e tubo. As fibras ocas foram posicionadas longitudinalmente em uma carcaa de acrlico com 10 cm de comprimento e 1,2 de dimetro interno (Figura 5.2).

Figura 5.2 Mdulo de permeao. Membranas dispostas longitudinalmente no interior da carcaa de acrlico. Resina epxi nas extremidades do mdulo.

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As caractersticas do mdulo de permeao esto apresentadas na Tabela 4.1. Tabela 4.1 Caractersticas dos mdulos de permeao. Densidade de empacotamento (m2/m3) 1000 Nmero de fibras 38 rea de permeao (m2) x 105 2,69

A alimentao dos mdulos realizada pelo interior da carcaa, a uma presso de 0,3 bar durante de 120 minutos, sendo o permeado coletado no interior das fibras ocas em uma das extremidades do mdulo de microfiltrao. 5.2.4.3. Sistema de microfiltrao O sistema de microfiltrao montado explora o escoamento tangencial da alimentao atravs do mdulo de permeao. O escoamento tangencial visa reduo da camada de polarizao e, conseqentemente, o acmulo de material sobre a mesma, reduzindo a possibilidade de incrustaes e o efeito de polarizao de concentrao. O sistema de microfiltrao ser operado a baixa presso de operao (0,3 bar), variandose tanto a densidade de empacotamento quanto o vazo de escoamento. O sistema de microfiltrao (Figura 5.3) constitudo de tanque alimentao, bomba de engrenagem (Cole Parmer, 201.350), mdulo de permeao, manmetro, vlvula para pressurizao do sistema, rotmetro (alimentao).
8 7

6 1 3

1.Tanque de alimentao 2. Bomba de circulao 3. Mdulo de permeao 4. Manmetro 5. Vlvula para pressurizao 6. Rotmetro 7. Permeado 8. Concentrado

Figura 5.3. Sistema de microfiltrao com escoamento tangencial. Aps o processamento da soluo os mdulos de microfiltrao so imersos em gua pura e levados ao um ultrasom por cerca de 60 minutos, para promover a limpeza destes.

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5.2.5. Procedimentos Analticos 5.2.5.1. Medida do pH O monitoramento do pH foi realizado por potenciometria, utilizando um potencimetro Metler Toledo, modelo MP220, equipado com eletrodo Ag/AgCl com termopar para ajuste de temperatura. 5.2.5.2. Medida do potencial redox O monitoramento do potencial redox (Eh) foi realizado por potenciometria, utilizando um potencimetro MS Tecnopon, modelo mPA 210, equipado com eletrodo redox (Analion, modelo ROX 673-C/S8) com termopar para ajuste de temperatura. 5.2.5.3. Medida da concentrao de oxignio dissolvido A medida da concentrao de oxignio dissolvido no meio de cultura obedeceu algumas etapas: I. a sonda de oxignio (Mettler Toledo) foi autoclavada junto com o biorreator a 121 C e 1 atm por 20 minutos; II. aps resfriado o reator, a sonda foi conectada ao fermentador e mantida por um perodo de 8 horas antes do cultivo, polarizando o eletrodo; III. o cabo do eletrodo foi desconectado do fermentador e foi feito o ajuste da concentrao de oxignio dissovido em 0%; IV. aps esse perodo, o meio de cultura foi agitado a 500 rpm e aerado a 1 vvm por 1 hora para ajustar a concentrao do oxignio dissolvido em 100%. 5.2.5.4. Anlise da concentrao celular A concentrao celular foi determinada por dois mtodos: por espectrofotometria (durante o cultivo) e por gravimetria. 5.2.5.4.1. Espectrofotometria Analisa-se a concentrao de biomassa do material coletado em um espectrofotmetro Spectronic 20D+, medindo-se a densidade tica no comprimento de onda de 600 nm contra um branco de gua. Para manter uma preciso adequada (regio linear), a faixa de absorbncia utilizada de 0,0 at 0,8. A partir deste valor, so feitas diluies para manter a linearidade.
o

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5.2.5.4.2. Gravimetria A medida da massa celular seca compreende as seguintes etapas: I. separa-se um volume conhecido do meio de cultura, entre 1 mL e 10 mL; II. filtra-se o meio atravs de membranas Millipore de poliamida pr-pesadas (poro de 0,2 m); III. lava-se duas vezes o material retido na membrana com HCl 0,01M, para remover ons e sais presentes na biomassa; IV. seca-se a membrana com a biomassa em estufa a 85C at peso constante. V. calcula-se a concentrao do peso seco celular (X) na forma: ( MM f MM i ) 1000 VA

X ( g / L) =

(5.1)

onde MMf a massa da membrana final (g); MMi a massa da membrana inicial (g) e VA o volume da amostra do meio de cultivo (mL). A curva de calibrao de biomassa em funo da absorbncia (600 nm) (Anexo 2) serve para estimar a concentrao de clulas durante a fase de crescimento da cultura.

5.3. Resultados e discusso Estudos cinticos do crescimento de C. necator DSM 545 em meio caldo nutriente foram realizados preliminarmente em frascos agitados. Na Figura 5.1 os ensaios I e II foram realizados para verificar a influncia do volume de inculo sobre a cintica de crescimento de C. necator. Para estes ensaios a velocidade especfica de crescimento foi similar, I = 0,44 h-1 e II = 0,42 h-1 (Figura 5.1C e Figura 5.1F), respectivamente; porm, o trmino da fase exponencial ocorreu mais rapidamente (4 horas de cultivo) quando o volume de inculo foi maior (10%) diferente das 6 horas quando foi realizada uma inoculao com um volume menor (1%). A medida de pH durante o cultivo permitiu observar que h um instante em que os valores do pH diminuem, aumentando em seguida. A mesma observao pode ser feita no ensaio III, que foi realizado com um volume maior de meio e com 1% de volume de inculo. A mudana de comportamento do pH pode sinalizar uma mudana metablica da cultura em meio caldo nutriente, quando os valores de pH no so controlados. Nos ensaios

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apresentados, a mudana de inclinao na curva de pH que aparece em todos os ensaios parece sinalizar a desacelerao do crescimento. A fase lag observada no ensaio III pode ser devido ao maior volume de meio, que pode ter ocasionado uma menor aerao. Para avaliar a utilizao de uma sonda redox para fins de monitoramento, novos ensaios foram realizados e os valores de pH e Eh comparados com as fases de crescimento das clulas de C. necator DSM 545 em meio caldo nutriente. A partir dos resultados apresentados nas Figuras 5.2 e 5.3 possvel observar uma diminuio dos valores de pH (Figura 5.2C e Figura 5.3C) no instante em que as culturas desaceleram o crescimento (Figura 5.2B e Figura 5.3B). Para ambas as culturas foi observado o mesmo valor para a velocidade especfica de crescimento () igual a 0,41 h-1 (Figura 5.4). A leitura de pH, comparada leitura de Eh (Figura 5.2A e Figura 5.3A), mostra que a mudana do comportamento da curva de pH ocorre no instante em que os valores de Eh so iguais a zero. Em seguida, a fase estacionria iniciada. Comparativamente aos perfis de crescimento celular representados pelos valores de absorbncia do meio, possvel descrever o crescimento das clulas de C. necator em meio NB para ensaios em batelada como as etapas de diminuio, estabilizao e brusca diminuio dos valores de Eh durante o cultivo. Aps a passagem pelo valor zero, h uma desacelerao da variao do Eh do meio, o que coincide com a desacelerao do crescimento e o incio da fase estacionria. Perfis semelhantes para a variao dos valores redox podem ser observados nos ensaios realizados por KWONG e RAO (1991) quando investigaram a variao dos estados metablicos de clulas de Corynebacterium glutamicum.

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Figura 5.1. Resultados do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 em meio caldo nutriente em frascos agitados a temperatura de 30 oC

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sob agitao orbital de 160 rpm, sem controle de pH. (Volume de inculo = Ensaio I: 1%; Ensaio II: 10%; Ensaio III: 1%)

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150

300

A B C

Eh (mV)

50 0 -50

Eh (mV) Absorbncia (600 nm) pH

100

200 100 0

-100

-100 3 2 1 0 7,5 7,4 7,3 7,2 7,1 7,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Absorbncia (600 nm) pH

3 2 1 0 7,6 7,5 7,4 7,3 7,2 7,1 0 2 4 6 8 10 12

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 5.2. Perfis do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 meio caldo nutriente em frascos agitados a temperatura de 30 oC sob agitao orbital de 160 rpm, sem controle de pH.

Figura 5.3.. Perfis do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 meio caldo nutriente em frascos agitados a temperatura de 30 oC sob agitao orbital de 160 rpm, sem controle de pH.

ln (abs)

ln (abs)

-1

-1

-2

-3

y = a. x + b a = 0,41 b = -1,75 r = 0,997


0 2 4 6 8

-2

-3

y = a. x + b a = 0,41 b = -3,57 r = 0,991


0 2 4 6 8 10 12 14 16

-4 10 12

-4

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 5.4. Linearizao dos valores de absorbncia obtidos nos cultivos apresentados nas Figuras 5.2 B e 5.3 B.

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Os resultados do comportamento dos valores de potencial redox em cultivos de C. necator realizados em meio caldo nutriente, em biorreator, so apresentados na Figura 5.5. Inicialmente, possvel observar que os valores so negativos, ao contrrio do que foi observado nas culturas em frascos agitados. Tambm observa-se que no so bem definidas as fases de crescimento celular no perfil obtido para os valores de absorbncia (Figura 5.5C) do meio de cultura. Esse comportamento fica mais evidente quando os valores so linearizados (Figura 5.5D). A partir da linearizao podem ser considerados dois estgios de crescimento. O primeiro estgio apresenta uma velocidade especfica de crescimento ao redor de 0,32 h-1, sendo possvel assinalar o trmino desta fase aps aproximadamente 4 horas de cultivo, com o auxlio do pontencial redox (Figura 5.5A), uma vez que novamente observada a estabilizao do sinal do potencial neste instante. A retomada de um patamar superior para os valores de redox pode estar correlacionada com o segundo estgio observado para o crescimento celular. Uma queda no pH observada neste perodo, indicando uma desacelerao do crescimento, como visto anteriormente.
0 7,9 -50 -100 -150 7,8 7,7

Eh (mV)

pH
2 4 6 8

-200 -250 -300 -350 -400 0 3

A
Tempo (h)

7,6 7,5 7,4 7,3 7,2 7,1 10 0 2

B
2 4 6 8 10

Tempo (h)

Absorbncia (600 nm)

1 2

ln (abs)

C
1 0 0 2 4 6 8

D
y = a.x + b a = 0,32 b = -1,35 r = 0,995

-1

-2 10 0 2 4 6 8 10

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 5.5. Perfis do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator a temperatura de 30 oC sob agitao de 300 rpm e aerao de 0,125 vvm sem controle de pH.

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Alm da comparao dos valores de pH e Eh em diferentes cultivos de C. necator em meio caldo nutriente, tanto em frascos agitados quanto em biorreator, parece tambm til fazer a comparao com o perfil de oxignio dissolvido, uma vez que as clulas so aerbias. Na Figura 5.6 esto apresentados os perfis para as variveis pH, oxignio dissolvido e Eh para o cultivo de C. necator DSM 545 em biorreator. O ensaio foi conduzido at o instante em que os valores de Eh comearam a estabilizar no patamar inferior da curva, assumindo um valor ao redor de -80 mV. Observa-se que os perfis de Eh e OD (Figuras 5.6A e 5.6B, respectivamente) so parecidos, diferindo ligeiramente na estabilizao de seus valores no patamar inferior das curvas. Quando o Eh comea a manter seus valores no menor nvel, os valores de oxignio dissolvido aumentam, indicando a fase de desacelerao do crescimento celular. Na Figura 5.6C fica ntida a queda dos valores de pH, como tambm observado nas Figuras 5.1A, 5.1D, 5.1G, 5.2C e 5.3C, quando a cultura atinge a fase de desacelerao do crescimento. Essa cultura celular apresentou um crescimento exponencial desde o incio do cultivo (Figura 5.7A), com uma velocidade especfica de crescimento de 0,47 h-1 (Figura 5.7B).
7,3 7,2 7,1 7,0 6,9 6,8 6,7 6,6 100

pH OD (%) Eh (mV)

80 60 40 20 0 40 0 -40 -80 -120 0 2 4 6

Tempo (h)

Figura 5.6. Resultados do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator, a temperatura de 30 oC sob agitao de 300 rpm e aerao 0,125 vvm sem controle de pH.

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0,40 0,35 0,30

-1

Absorbncia (600 nm)

0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 -4 0 2 4 6 0 2 4 6

ln (abs)

-2 y = a.x+b a = 0,47 b = -3,81 r = 0,998

-3

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 5.7. Resultados do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator, a temperatura de 30 oC sob agitao de 300 rpm e aerao 0,125 vvm sem controle de pH. Como a indicao de incio da fase de desacelerao do crescimento celular pode ser obtida com o monitoramento dos valores de potencial redox, possvel realimentar o sistema. Na Figura 5.8 esto apresentados os resultados obtidos para o cultivo de C. necator em meio caldo nutriente em biorreator, onde as nicas variveis controladas so a temperatura (30 oC), a agitao (300 rpm) e a aerao (0,125 vvm). Durante as primeiras 6 horas de cultivo os perfis para pH, OD e Eh (Figuras 5.8A, 5.8B e 5.8C, respectivamente) apresentam comportamentos similares queles apresentados na Figura 5.6. O nvel inferior dos valores para o perfil do potencial redox antes da alimentao foi atingido apenas duas horas aps a concentrao de oxignio dissolvido ter sinalizado o final do crescimento; ou seja, aps 7,5h de cultivo. Esse intervalo observado entre a concentrao de oxignio dissolvido e o Eh, se comparado ao perfil obtido para a linearizao dos valores da absorbncia do meio de cultura (Figura 5.8F), representa exatamente o perodo compreendido pela fase de desacelerao do crescimento celular. Tendo a cultura atingido o incio da fase estacionria (7,5 horas de cultivo), foi realizada uma alimentao com meio caldo nutriente para que o volume do meio atingisse o nvel e a concentrao de nutrientes presentes no incio da cultura. Todas as variveis medidas sofreram variao. Os valores do pH e da absorbncia diminuram muito pouco, ao contrrio do que foi observado para a concentrao de oxignio dissolvido, que diminuiu drasticamente, de 75% para menos de 10%,

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imediatamente aps a adio da soluo de alimentao. A concentrao de biomassa foi afetada pela diluio do meio aps a alimentao, como pode ser observado na Figura 5.8E, aumentando rapidamente a seguir por causa do crescimento celular. Os valores de Eh sofreram uma variao e assumiram um novo perfil para o perodo aps a alimentao; contudo, a observao de um novo valor mnimo em 10,3 horas coincide com o final da nova etapa de crescimento celular, que apresentou uma velocidade especfica de crescimento de 0,34 h-1, um pouco inferior quela observada para o crescimento celular na primeira etapa (0,41h-1).

7,3 7,2 7,1 7,0 6,9 6,8 6,7 6,6 100

pH

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Abs (600 nm)

OD (%)

X (g/L)

80 60 40 20 0 50

Eh (mV)

ln(abs)

-50 -100 -150 0

C
2 4 6 8 10 12 14

F
y = a.x +b a = 0,41 b = -3,69 r = 0,995 0 2 4 6 8

-2 -4

y = a.x +b a = 0,34 b = -3,26 r = 0,966 10 12 14

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 5.8. Resultados do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 meio caldo nutriente, em biorreator, com alimentao a 8 horas de cultivo, a temperatura de 30 oC sob agitao de 300 rpm e aerao 0,125 vvm sem controle de pH. Na Figura 5.9 esto apresentados os resultados de uma cultura que teve uma perturbao indesejada no sistema. No incio da fermentao houve a formao de muita espuma e leo de oliva foi adicionado como anti-espumante. O leo de oliva parece ter afetado a velocidade especfica de crescimento, uma vez que foi obtido um valor de 0,17 h-1 para a velocidade especfica de crescimento (Figura 5.9F), o qual

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CAPTULO 5 Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

muito inferior queles obtidos nos outros ensaios. Contudo, os valores de Eh (Figura 5.9C) conseguiram sinalizar o final da fase de desacelerao aps 13 horas de cultivo. Observado que o sinal de potencial redox do meio de cultura varia durante o crescimento celular, uma correlao entre os valores obtidos para a absorbncia e para o potencial redox apresentada na Figura 5.10. Embora no seja possvel dizer claramente quais os compostos esto reduzindo ou oxidando em um meio de cultivo de clulas, a correlao linear obtida muito boa (r = 0,97). A equao linear obtida para a correlao talvez possa ser utilizada para definir a concentrao de biomassa no meio de cultura pela simples leitura do sinal redox em substituio medida espectrofotomtrica tradicionalmente realizada.

7,0 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 100

pH

1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 1,0

Abs (600 nm)

OD (%)

X (g/L)

80 60 40 20 0 50 0 -50 -100 -150 -200 -250 -300 -350 0

0,8 0,6 0,4 0,2 1,0

Eh (mV)

ln(Abs)

0,5 0,0 -0,5 -1,0 0 2 4 6 8

C
2 4 6 8 10 12 14 16

F
Tempo (h)

y = a.x + b a = 0,17 b =-1,42 r = 0,991

10

12

14

Tempo (h)

Figura 5.9. Resultados do crescimento de clulas de C. necator DSM 545 em meio caldo nutriente, em biorreator, a temperatura de 30 oC sob agitao de 300 rpm e aerao 0,125 vvm sem controle de pH.

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CAPTULO 5 Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

2,0

Absorbncia (600 nm)

1,5

1,0

0,5

y = a.x + b a = 1,25 b = -0,008 r = 0,97

0,0 -100 -50 0 50 100 150

Eh (mV)

Figura 5.10. Correlao entre os valores de potencial redox e absorbncia, obtidos em cultivo de C. necator em meio caldo nutriente. Ensaios de separao de clulas de C. necator, utilizando mdulo de fibras ocas, foram realizados em triplicata para verificar a correlao existente entre a concentrao de massa celular e o potencial redox. Na Figura 5.11 possvel verificar que nos primeiros 20 minutos de microfiltrao h uma diminuio na concentrao celular. Isto pode ser explicado pela aderncia das clulas membrana de fibra oca. A diminuio da concentrao de massa celular do meio acompanhada com a diminuio dos valores de redox (Figura 5.12); contudo, quando comea a haver a concentrao celular o potencial redox sinaliza com o aumente de seus valores. Os perfis obtidos para as correlaes entre os valores do potencial redox e da concentrao de massa celular para os ensaios esto apresentados na Figura 5.13. possvel observar que a correlao no linear desde o incio do processo devido s propriedades da membrana que apresenta porosidade e permite que as clulas de C. necator sejam adsorvidas.

92

CAPTULO 5 Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,75 0,70

-170 -172 -174 -176 -178 -180 -182 -90 -100 -110 -120 -130 -140 -150 -160 -110 -120 -130 -140 -150 -160 -170 -180 -190 -200 0 20 40 60 80 100 120

X (g/L)

0,60 0,55 0,50 0,45 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0 20 40 60 80 100 120

Eh (mV)

X (g/L)

Eh (mV)

0,65

Eh (mV)

X (g/L)

Tempo (min)

Tempo (min)

Figura 5.11. Perfis da concentrao das Figura 5.12. Perfis da variao do sinal clulas de C.necator durante a do potencial redox do concentrado durante a microfiltrao.
0,75 0,75 0,70 0,65 0,70 0,65

microfiltrao.

X (g/L)

0,60 0,55 0,50 0,45 0,40

X (g/L)

0,60 0,55 0,50

0,45 0,35 -200 -190 -180 -170 -160 -150 -140 -130 -120 -110 -160

-150

-140

-130

-120

-110

-100

-90

Eh (mV)
1,0 0,9 0,8

Eh (mV)

X (g/L)

0,7 0,6 0,5 0,4 -184

-182

-180

-178

-176

-174

-172

-170

Eh (mV)

Figura 5.13. Correlao entre os valores de potencial redox e a concentrao de clulas de C. necator concentradas por microfiltrao. 93

CAPTULO 5 Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

5.4. Concluses Cupriavidus necator DSM 545, cultivada em meio caldo nutriente (NB), apresenta uma velocidade especfica de crescimento de at 0,47 h-1 nos ensaios realizados. Este valor maior do que aqueles obtidos para cultivos de clulas em meios contendo como fontes de carbono a glicose (0,2 h-1), frutose (0,16 h-1) (MULCHANDANI et al., 1989, LORET, 1993), acetato (0,3 h-1) (AMPE e LINDLEY, 1995); semelhante aos obtidos para cido ltico (0,42 h-1) (SONNLEITNER et al., 1979) e inferior aos obtidos para benzoato (0,54 h-1) (AMPE e LINDLEY, 1996). Os valores obtidos para Eh auxiliam na determinao do instante em que se inicia a fase estacionria da curva de crescimento. Isso importante para estratgias de alimentao do cultivo celular a fim de obter maior concentrao de clulas de C. necator o que pode refletir em aumento da produo de polihidroxialcanoatos. Alm disso, o Eh mostrou-se eficaz em caracterizar os estgios de crescimento da cultura, mesmo quando h perturbaes indesejadas no sistema, como no caso da necessidade de adio de antiespumante. Alm disso, possvel verificar que a correlao entre a concentrao de massa de clulas de C. necator e os valores do potencial redox do concentrado podem ser utilizados para monitorar um sistema de microfiltrao.

5.5. Referncias bibliogrficas AMPE, F., LINDLEY, D., 1995, Acetate utilization in inhibited by benzoate in Alcaligenes eutrophus: evidence for transcriptional control of the expression of acoE coding for acety coenzyme A synthase, Journal of Bacteriology, v. 177, pp. 5826-5833. AMPE, F., LINDLEY, D., 1996, Flux limitations in the ortho pathway of benzoate degradation of Alcaligenes eutrophus: metabolite overflow and induction of meta pathway, at high substrate concentrations, Microbiology, v. 142, pp. 1807-1817. ANDREEVA, E.A., 1974, Physiological and biochemical rearrangements of the yeast Candida utilis as a function of the redox potential, Mikrobiologiya, v. 43, pp. 780-785. BALAKIREVA, L.M., KANTERE, V.M., RABOTNOVA, I.L., 1974, The redox potential in microbiological media, Biotechnology and Bioengineering Symposium, n. 4, pp. 769-780.

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

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CAPTULO 6 Concentrao de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 por floculao/sedimentao


Sumrio 6.1. Introduo ..................................................................................................... 6.2. Experimental ................................................................................................ 6.2.1. Microrganismo .......... 6.2.2. Meios de cultura ............ 6.2.3. Condies de cultivo ......... 6.2.3.1. Preparo do inculo ......... 6.2.3.2. Produo de massa celular ......... 6.2.3.3. Avaliao do crescimento celular .......... 6.2.4. Testes de floculao .......... 6.2.5. Testes de sedimentao ......... 6.2.6. Caracterizao dos flocos .......... 6.2.6.1. Densidade mdia dos flocos ............... 6.2.6.2. Dimetro mdio dos flocos e frao volumtrica de fluido ........... 6.2.7. Procedimentos Analticos .............. 6.2.7.1. Anlise da concentrao de clulas nos testes de 104 100 101 101 101 101 101 101 101 102 103 103 103 103 104

floculao/sedimentao ..................................................................................... 6.2.7.2. Anlise da concentrao de clulas nos ensaios de avaliao do crescimento celular .............. 6.2.7.3. pH ........................................................................................................... 6.2.7.4. Distribuio de tamanhos de partculas .......... 6.2.7.5. Clculo da capacidade operacional de um sedimentador contnuo ........ 6.3. Resultados e discusso ......... 6.3.1. Uso do tanino como agente floculante .......... 6.3.2. Uso do sulfato de alumnio como agente floculante ......... 6.3.3. Avaliao do crescimento celular de C. necator DSM 545 sob a influncia dos agentes floculantes. .............. 6.4. Concluses ................................................................................................... 6.5. Referncias bibliogrficas ............................................................................

105 105 105 105 106 106 110

115 117 118

CAPTULO 6 Concentrao de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 por floculao/sedimentao

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

6.1. Introduo A separao de microrganismos por floculao/sedimentao empregada em muitos processos biotecnolgicos, como no tratamento de efluentes e em operaes downstream em processos fermentativos (SALEHIZADEH e SHOJAOSADATI, 2001). Os floculantes podem ser classificados em trs grupos: floculantes inorgnicos (sulfato de alumnio, sulfato de ferro, cloreto de polialumnio); floculantes orgnicos sintticos de cadeia polimrica longa (derivados de poliacrilamida) e floculantes naturais (quitosana, alginato de sdio, tanino) (SALEHIZADEH e SHOJAOSADATI, 2001). Na produo de PHAs, diferentes estratgias de cultivo so adotadas. No caso especfico da Cupriavidus necator DSM 545, utiliza-se normalmente uma seqncia definida de operaes. Primeiramente h a necessidade de ser obtida uma elevada concentrao de biomassa para, posteriormente, sob limitao de algum nutriente no meio de cultivo, desencadear o processo de biossntese de PHAs. RYU et al. (2000) utilizaram sais base de ferro e de alumnio na sedimentao da massa celular para concentrao e posterior extrao do biopolmero. Os autores verificaram que os agentes floculantes no interferiram na etapa de extrao, auxiliaram na economia de energia na etapa de centrifugao e no deixaram resduos no biofilme confeccionado. LUNA et al. (2003) e PUGET et al. (2000) utilizaram tanino como agente floculante natural para concentrao de clulas de Bacillus sphaericus, usadas para a produo de boinseticida, e de Zymomonas mobilis, usadas para a produo de etanol, respectivamente. Os resultados de concentrao tima de tanino obtidos pelos autores ficaram em torno de 140 ppm. A presente etapa do trabalho tem por objetivo empregar tanino (Tanfloc SG, Tanac S.A., Brasil) e sulfato de alumnio (Al2(SO4)3) para a concentrao das clulas de Cupriavidus necator DSM 545 para, a partir disso, caracterizar o sistema floculento em termos da densidade e dimetro mdio dos flocos, determinar a capacidade operacional de um sedimentador contnuo a partir de testes de sedimentao em batelada e verificar a viabilidade celular na concentrao tima de floculao. Os resultados mostram a viabilidade do mtodo empregado para a obteno de concentrados de clulas de Cupriavidus necator DSM 545.

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CAPTULO 6 Concentrao de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 por floculao/sedimentao

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

6.2. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto VETEC exceto o floculante Tanfloc SG que foi adquirido junto TANAC S.A., Brasil.

6.2.1. Microrganismo Foi utilizada a bactria Cupriavidus necator DSM545, obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC.

6.2.2. Meios de cultura Os meios de cultura utilizados foram: a. Meio de manuteno: As clulas foram mantidas em meio Agar Nutriente (NA, g/L: Extrato de carne, 3,0 ; Peptona de carne, 5,0 ; Agar, 15,0) a 4 oC. b. Meio de produo de massa celular: As clulas foram cultivadas em meio Caldo Nutriente (NB, g/L: Extrato de carne, 3,0; Peptona de carne, 5,0).

6.2.3. Condies de cultivo 6.2.3.1. Preparo do inculo: O inculo foi obtido a partir da ressuspenso de duas aladas de clulas, que estavam mantidas sob refrigerao em NA, em meio NB. O meio NB foi incubado por 24 horas a 160 rpm e 30 oC.

6.2.3.2. Produo de massa celular: Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer, a 30 oC, sob agitao de 60 rpm durante 24 horas.

6.2.3.3. Avaliao do crescimento celular: O crescimento celular de Cupriavidus necator DSM 545 foi avaliado a partir da observao da variao dos valores de absorbncia do meio de cultura em trs situaes: I) meio NB foi inoculado a 1% (v/v); II) meio NB foi inoculado a 1% (v/v) com clulas obtidas nos ensaios de floculao/sedimentao na condio tima. Neste ltimo ensaio, o objetivo foi verificar a influncia dos floculantes na concentrao tima na cintica de crescimento celular.

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CAPTULO 6 Concentrao de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 por floculao/sedimentao

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

6.2.4. Testes de floculao Os ensaios de floculao foram realizados no equipamento Jar Test (marca Digimed, modelo MF 01) utilizando os floculantes tanino (Tanfloc SG, Tanac S.A., Brasil) e sulfato de alumnio (Al2(SO4)3). O volume utilizado foi de 250 mL em Beckeres de 500 mL. A suspenso foi submetida a uma agitao de 90 rpm durante 5 min para a completa mistura do floculante; em seguida, a mistura foi agitada a 40 rpm durante 10 min para a adequada formao dos flocos. Com o trmino do teste de jarros, a suspenso foi mantida em repouso durante uma hora, para observao visual da melhor condio de sedimentao dos flocos e de clarificao do meio. As amostragens foram realizadas nos primeiros 5 minutos de agitao da suspenso e aps o trmino do perodo de repouso (60 minutos). A forma como foram realizadas as amostragens est exemplificada na Figura 6.1 para a adio de sulfato de alumnio.

Figura 6.1. Forma de amostrar a suspenso durante a formao dos flocos pela adio de sulfato de alumnio (A) e do sobrenadante (B) obtido aps a sedimentao dos flocos de clulas de C. necator para o clculo da eficincia de recuperao.

O percentual de recuperao de massa celular (R%) foi calculado pela Equao 6.1, onde CT a concentrao inicial de clulas na suspenso e CS a concentrao de clulas no sobrenadante. A amostragem para o clculo de CT foi realizada na metade da etapa de mistura do floculante e para o clculo de CS aps uma hora de sedimentao. A massa seca foi determinada a partir da filtrao da amostra em membrana Millipore 0,2 m previamente tarada e mantida em estufa a 85oC at alcanar massa constante. Os experimentos foram realizados em duplicata.

102

CAPTULO 6 Concentrao de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 por floculao/sedimentao

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

CT CS R(%) = C T

100

(6.1)

6.2.5. Testes de sedimentao A metodologia de KYNCH (1952) foi utilizada para os testes de sedimentao em batelada. Estes foram realizados em proveta de 500 mL de capacidade, dimetro de 5,0 cm e altura de 35,2 cm, a diferentes concentraes das suspenses floculentas. As velocidades de sedimentao foram calculadas atravs do coeficiente angular obtido para a seo linear de cada curva de sedimentao. A eficincia de recuperao foi determinada atravs da Equao 1. A amostragem do sobrenadante foi realizada aps 300 minutos de sedimentao.

6.2.6. Caracterizao dos flocos 6.2.6.1. Densidade mdia dos flocos: A densidade mdia dos flocos (fl) foi avaliada atravs da tcnica de centrifugao (FRANA, 2000). A seleo do valor da rotao e do tempo de centrifugao foi realizada visualmente, de forma a se obter um sedimento no compactado. A velocidade de rotao estabelecida foi de 250 rpm durante 25 min. Os testes foram repetidos sete vezes.

6.2.6.2. Dimetro mdio dos flocos e frao volumtrica de fluido: O dimetro mdio dos flocos (Dfl) foi determinado de acordo com a metodologia descrita por MASSARANI (2002), a partir da Equao 6.2:
k = k ( f ) = D fl f
2 3

36 (1 f ) 2

(6.2)

onde k a permeabilidade do meio, calculada pela Equao 6.3:

k ( f ) =

f s (1 f )( fl f ) g

(6.3)

e um parmetro que depende da porosidade para sistemas particulados expandidos, calculado atravs das Equaes 6.4 e 6.5:

103

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

= 0 , 60

1 , 94 f f

, 0,5 < f 0,9

(6.4)

=
1

f2
2(1 f )( 4,8 f 3,8)

, 0,9 < f <

(6.5)

onde f a viscosidade do fluido, s a velocidade de sedimentao calculada taxa constante, fl a densidade do floco, f a densidade do fluido e g a acelerao da gravidade. A determinao da frao volumtrica de fluido (f) foi realizada durante os testes de sedimentao atravs da Equao 6.6:

f =

H sob Ht

(6.6)

onde Hsob a altura de fluido sobrenadante e Ht a altura total de suspenso na proveta de ensaio (30 cm).

6.2.7. Procedimentos Analticos 6.2.7.1. Anlise da concentrao de clulas nos testes de

floculao/sedimentao A concentrao celular nos testes de floculao/sedimentao foi determinada por gravimetria. Um volume de 10 mL da suspenso foi filtrado atravs de membranas Millipore de poliamida pr-pesadas (poro de 0,2 m), e em seguida as membranas foram colocadas em estufa a 85C por 24 horas. Calcula-se a concentrao de massa celular (X) na forma:

X ( g / L) =

( MM f MM i ) 1000 VA
(6.7)

onde MMf a massa da membrana final (g); MMi a massa da membrana inicial (g) e VA o volume da amostra do meio de cultivo (10 mL).

104

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

6.2.7.2. Anlise da concentrao de clulas nos ensaios de avaliao do crescimento celular A concentrao celular nos testes de avaliao do crescimento foi avaliada por espectrofotometria, em um espectrofotmetro Spectronic 20D+, medindo-se a densidade tica no comprimento de onda de 600nm contra um branco de gua. Para manter uma preciso adequada (regio linear), a faixa de absorbncia utilizada de 0,0 at 0,8. A partir deste valor, so feitas diluies para manter a linearidade.

6.2.7.3. pH As medidas do pH foram realizadas por potenciometria, utilizando um potencimetro Metler Toledo, modelo MP220, equipado com eletrodo Ag/AgCl com termopar para ajuste de temperatura.

6.2.7.4. Distribuio de tamanhos de partculas A distribuio de tamanhos de partculas foi determinada utilizando-se o equipamento Mastersizer Micro Plus/Malvern, modelo MAF 5001. Os ensaios foram conduzidos com a suspenso celular aps 21 horas de cultivo e com amostras floculadas com sulfato de alumnio.

6.2.7.5. Clculo da capacidade operacional de um sedimentador contnuo Foi realizado utilizando-se os resultados da curva de sedimentao para os dois floculantes com concentrao celular prxima concentrao de final de fermentao (1,0 g/L), com o objetivo de simular a concentrao de alimentao no sedimentador. De acordo com KYNCH (1952), a capacidade de projeto de um sedimentador contnuo (F/A) pode ser expressa pela Equao 6.8:

F Z0 = A t*

(6.8)

onde F a vazo volumtrica da suspenso na alimentao, A a rea da seo transversal do sedimentador, F/A a capacidade operacional do sedimentador, Z0 a altura da coluna de suspenso e t* o tempo transcorrido no ensaio em proveta para que a posio da interface clarificada seja dada por Z* (Equao 6.9):

105

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

C Z * = Z0 a Cl

(6.9)

onde Ca a concentrao de slidos na alimentao e Cl a concentrao de slidos na lama.

6.3. Resultados e discusso 6.3.1. Uso do tanino como agente floculante Na Figura 6.2 so apresentados os resultados obtidos para os testes de floculao. A concentrao tima de tanino foi de 2800 mg/L, atingindo uma recuperao de massa celular de 94%. Tal resultado fica bem visvel na Figura 6.3, que mostra o aumento da clarificao do sobrenadante at a concentrao de 2800 mg/L de tanino.

100 90

Recuperao de massa celular (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Tanino (ppm)

Figura 6.2: Efeito da adio de tanino sobre a recuperao de clulas de C.necator DSM 545.

106

1800 mg/L

2000 mg/L

2200 mg/L

2400 mg/L

2600 mg/L

2800 mg/L

1000 mg/L

1200 mg/L

1400 mg/L

1600 mg/L

2000 mg/L

2200 mg/L

200 mg/L

400 mg/L

600 mg/L

800 mg/L

1000 mg/L

1200 mg/L

CAPTULO 6 Concentrao de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 por floculao/sedimentao

Figura 6.3. Efeito da variao da concentrao de tanino sobre a recuperao das clulas de C. necator DSM 545, cultivadas em meio

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

caldo nutriente, e a clarificao do sobrenadante aps 1 hora de sedimentao.

107

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A Figura 6.4 mostra as curvas de sedimentao dos flocos para diferentes valores de concentrao celular. Aps cerca de 100 minutos, todas as suspenses j haviam atingido a regio de compactao. Dessa forma, os resultados indicam uma diminuio da velocidade de sedimentao com o aumento da concentrao de clulas em suspenso. Os resultados de velocidade de sedimentao e de recuperao da massa celular so apresentados na Figura 6.5, onde se observa que, para concentraes celulares variando entre 0,7 e 2,2 g/L, ocorre uma diminuio da velocidade de sedimentao dos flocos de 2,3 cm/min para 0,5 cm/min, respectivamente. Alm disso, foi observado um aumento no percentual de recuperao de clulas de 83% com 0,7 g/L de clulas para 91% com 2,7 g/L de clulas.

30

25

20

0,7g/L 1,0g/L 1,6g/L 1,8g/L 2,2g/L

Altura (cm)

15

10

0 0 50 100 150 200 250 300 350

Tempo (min)

Figura 6.4. Curvas de sedimentao de clulas de C. necator DSM 545 em presena de 2800 mg/L tanino.

108

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3.0

92

Velocidade de sedimentao (cm/min)

90

2.0 88 1.5 86 1.0 84

0.5

Velocidade de sedimentao Recuperao celular


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 82

Concentrao de massa celular (g/L)

Figura 6.5. Velocidades de sedimentao e percentual de recuperao de massa celular de C.necator DSM 545 em funo da concentrao celular em presena de 2800 mg/L de tanino.

A Figura 6.6 mostra a curva de capacidade do sedimentador contnuo operando com a suspenso floculenta de C. necator DSM 545 a 1,0 g/L, utilizando tanino como agente floculante. Os resultados indicam um decrscimo na capacidade operacional com o aumento da razo de concentrao da suspenso. Para concentrar a suspenso de 2 a 9 vezes, os valores de capacidade diminuem de 2,0 a 0,16 cm/min neste intervalo. Os resultados de caracterizao dos flocos de C. necator DSM 545 em presena de 2.800ppm de tanino para densidade e dimetro apresentaram valores iguais a 1,03g/mL 0,01g/mL e 158m 19m, respectivamente.

Recuperao de massa celular (%)

2.5

109

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2,5

2,0

F/A (cm/min)

1,5

1,0

0,5

0,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cl/Ca

Figura 6.6. Curva de capacidade do sedimentador contnuo operando com suspenso de flocos de C.necator DSM 545 a 1,0 g/L formados pela adio de tanino a 2800 mg/L.

6.3.2. Uso do sulfato de alumnio como agente floculante. Os resultados de recuperao de massa celular a partir da massa celular seca (Figura 6.7) mostram que h uma faixa tima de concentrao de sulfato de alumnio (600 a 1000 mg/L) que possibilita uma eficincia de recuperao superior a 95%.

100

Recuperao de massa celular (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Al2(SO4)3 (mg/L)

Figura 6.7. Recuperao de clulas de C.necator DSM 545 pela adio de sulfato de alumnio na floculao. 110

800 mg/L

1000 mg/L

2000 mg/L

3000 mg/L

4000 mg/L

800 mg/L

1000 mg/L

2000 mg/L

3000 mg/L

4000 mg/L

100 mg/L

200 mg/L

400 mg/L

600 mg/L

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Figura 6.8. Efeito da variao da concentrao de sulfato de alumnio (100 a 4000 mg/L) sobre a recuperao das clulas de C. necator DSM 545, cultivadas em meio caldo nutriente, e a clarificao do sobrenadante. (A: 2 minutos de sedimentao; B e C: 60 minutos de sedimentao)

111

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A Figura 6.8 mostra a clarificao do sobrenadante obtida aps sedimentao das clulas de C. necator pela adio do agente floculante sulfato de alumnio em diferentes concentraes. As Figuras 6.8B e 6.8C mostram que a melhor clarificao e conseqente recuperao das clulas de C. necator fica na faixa de 600 mg/L a 1000 mg/L de sulfato de alumnio. As Figuras 6.8A e 6.8B representam, respectivamente, os tempos de 2 minutos e 60 minutos do perodo de sedimentao dos flocos. No tempo de 2 minutos mostrado que, para a concentrao de 1000 mg/L de sulfato de alumnio, a recuperao das clulas j havia sido alcanada, mostrando assim um processo rpido para recuperao das clulas para extrao de PHA ou adensamento celular com vistas a biodegradao de cido acrlico e/ou produo do biopolmero. A Figura 6.9 mostra as curvas de sedimentao dos flocos de acordo com a concentrao celular, na condio tima de floculao de 800 mg/L de Al2(SO4)3. Aps cerca de 80 minutos, todas as suspenses j haviam atingido a regio de compactao. Os resultados indicam que h diminuio da velocidade de sedimentao com o aumento da concentrao de clulas em suspenso.
30 25 20
Altura (cm) 0,57 g/L 0,89 g/L 0,91 g/L 1,02 g/L

15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220


Tempo (min)

Figura 6.9. Curvas de sedimentao de clulas de C. necator DSM 545 em presena de 800 mg/L de sulfato de alumnio.

112

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Os resultados de velocidade de sedimentao e de recuperao da massa celular so apresentados na Figura 6.10, onde se observa que, para concentraes celulares variando entre 0,57 e 1,02 g/L, h uma diminuio da velocidade de sedimentao dos flocos de 1,45 cm/min para 0,85 cm/min, respectivamente. Alm disso, observa-se um aumento no percentual de recuperao de clulas de 87 a 99% com o aumento da concentrao celular. A Figura 6.11 mostra a curva de capacidade do sedimentador contnuo operando com a suspenso floculenta de C. necator DSM 545 a 1,0 g/L, utilizando sulfato de alumnio como agente floculante. Assim como no caso da suspenso com tanino, a capacidade operacional diminui com o aumento da razo de concentrao da suspenso, sendo obtidos menores valores (variando de 1,18 a 0,15 cm/min) para uma razo de concentrao de 2 a 5 vezes. Os resultados de caracterizao dos flocos de C. necator DSM 545 em presena de 800 ppm de sulfato de alumnio para densidade e dimetro apresentaram valores iguais a 1,05 g/mL 0,01 g/mL e 146 m 14 m, respectivamente.
2,0 100 98 1,5 96 94 1,0 92 90 0,5 88 86 84 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

Velocidade de sedimentao (cm/min)

Velocidade de sedimentao Recuperao celular


0,0

Concentrao de massa celular (g/L)

Figura 6.10. Velocidades de sedimentao e percentual de recuperao de massa celular de C.necator DSM 545 em funo da concentrao celular em presena de 800 mg/L de sulfato de alumnio.

Recuperao de massa celular (%)

113

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1,4

1,2

1,0

F/A (cm/min)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 1 2 3 4 5 6

Cl/Ca

Figura 6.11. Curva de capacidade do sedimentador contnuo operando com suspenso de flocos de C.necator DSM 545 a 1,0 g/L formados pela adio de sulfato de alumnio a 800 mg/L.

Na Figura 6.12 esto representadas as distribuies de tamanhos das clulas de C. necator DSM 545 cultivadas em meio NB, bem como dos flocos formados pela adio de sulfato de alumnio na melhor faixa de recuperao (600, 800 e 1000 mg/L). Sem a presena de sulfato de alumnio (Figura 6.12A) as clulas apresentaram duas populaes distintas, sendo a primeira com um maior percentual de clulas com dimetro de 0,91 m e a segunda com 4,2 m. Tambm apresentam duas populaes distintas as distribuies obtidas quando sulfato de alumnio adicionado ao meio cultivado com clulas C. necator (Figuras 6.12B, 6.12C e 6.12D). Contudo, possvel observar que, para a concentrao de 1000 mg/L (Figura 6.12D), os flocos apresentam um dimetro de partcula maior do que observado para as outras condies. Alm disso, observa-se um maior percentual de clulas no floculadas. Tal fato pode significar o limiar de concentrao de floculante para remover as clulas do meio.

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

60

14

A
Volume (%)

50 40 30 20 10 0 0 8 2 4 6

B
Volume (%)

12 10 8 6 4 2 0

0 mg/L

600 mg/L

0 18 16 14 12

10

12

14

16

C
6

Dimetro da partcula (m)

D
Volume (%)

Dimetro da partcula (m)

800 mg/L

1000 mg/L

Volume (%)

10 8 6 4 2

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Dimetro da partcula (m)

Dimetro da partcula (m)

Figura 6.12. Curva de distribuio de tamanhos de C. necator DSM 545 cultivada em meio NB (A) e sob a influncia do agente floculante sulfato de alumnio na melhor faixa de recuperao (600, 800 e 1000 mg/L) (B, C e D).

6.3.3. Avaliao do crescimento celular de C. necator DSM 545 sob a influncia dos agentes floculantes. Na Figura 6.13 esto apresentados os perfis da variao da absorbncia e do pH durante o cultivo de C. necator DSM 545 na ausncia de agente floculante. A partir desses valores possvel que seja observado um comportamento exponencial de crescimento at 10 horas de cultivo, e uma condio estacionria aps este intervalo. A fase exponencial apresenta uma velocidade especfica de crescimento igual a 0,41 h-1 (Figura 6.13A). O perfil do pH (Figura 6.13C) apresenta um aumento de seus valores durante o cultivo, sendo mais expressiva a variao aps atingir a condio estacionria do crescimento.

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

2 1

ln (abs)

0 -1 -2 -3 -4 3,0

y = 0,41 * x - 3,57

Absorbncia (600 nm) pH

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 8,0 7,8 7,6

7,4 7,2 7,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tempo (h)

Figura 6.13. Perfis de crescimento de C. necator DSM 545 (B), pH (C) e ln (abs) () (A) em meio caldo nutriente sob agitao de 160 rpm e 30 oC, sem influncia anterior de agente floculante sobre as clulas.

Nas Figuras 6.14C e 6.15C esto apresentados os perfis da variao da absorbncia durante o cultivo de clulas de C. necator que sofreram a ao do tanino e do sulfato de alumnio nas concentraes timas de recuperao, respectivamente, 2800 ppm e 800 ppm. O crescimento celular ocorre at 15 horas de cultivo para as clulas submetidas ao do tanino e 11 horas para as clulas submetidas ao do sulfato de alumnio. Nessa mesma ordem de anlise, as velocidades especficas de crescimento observadas foram de 0,14 h-1 (Figura 6.14B) e 0,31 h-1 (Figura 6.15B), o que representou uma considervel influncia do tanino sobre a viabilidade celular e um menor efeito do sulfato de alumnio. Assim como observado no ensaio sem presena de floculante, os perfis obtidos para a variao dos valores de pH (Figura 6.14A e Figura 6.15A) apresentam uma variao ascendente durante o cultivo.

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

8,0 7,6

8,0

A
pH

7,6 7,2 6,8 6,4 6,0 1

pH ln (abs)

7,2 6,8 6,4 6,0 1 0 -1 -2

B
y = a.x + b a = 0,14 b = -1,61 r = 0,986

ln (abs)

0 -1 -2 -3

B
y = a.x + b a = 0,31 b = -2,13 r = 0,996

Absorbncia (600nm)

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 2

Absorbncia (600 nm)

1,2 0,8 0,4 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

C
4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 6.14. Teste de viabilidade de clulas de C. necator floculadas com o tanino na concentrao tima de 2800 mg/L.

Figura 6.15. Teste de viabilidade de clulas de C. necator floculadas com o sulfato de alumnio na concentrao tima de 800 mg/L.

6.4. Concluses Os resultados de floculao de C. necator DSM 545 demonstraram que a eficincia de recuperao das clulas foi de 94% quando uma concentrao de 2800 mg/L de tanino foi utilizada e assumiu valores acima de 95% para a faixa de 600 a 1000 mg/L de sulfato de alumnio. A partir de testes de sedimentao em batelada, foi possvel obter as curvas de capacidade operacional de um sedimentador contnuo operando com as suspenses floculentas a uma concentrao celular de 1 g/L. As clulas de C. necator DSM 545 cultivadas por 21 horas em meio NB apresentaram um maior percentual de clulas com 0,91 m de dimetro. Os flocos com tanino apresentaram um dimetro correspondente a 158m 19m e densidade de 1,03g/mL 0,01g/mL, enquanto os resultados de caracterizao dos flocos com sulfato de alumnio para densidade e dimetro apresentaram valores iguais a 1,05 g/mL 0,01 g/mL e 146 m 14 m, respectivamente.

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

Os estudos de crescimento celular mostraram que a presena dos agentes floculantes tanino e sulfato de alumnio, nas concentraes timas de floculao, afetaram, respectivamente, com maior e menor intensidade a cintica de crescimento. Assim, a utilizao dos agentes floculantes tanino e sulfato de alumnio so boas alternativas para a remoo das clulas de C.necator DSM 545 do ponto de vista de minimizar os custos com gastos com energia na utilizao de centrfugas. Contudo, a reutilizao das clulas floculadas com tanino no vivel, pois h uma diminuio acentuada da velocidade especfica de crescimento.

6.5. Referncias bibliogrficas FRANA, S.C.A. (2000) Equaes Constitutivas para a Sedimentao de Suspenses Floculentas. Tese de D.Sc., COPPE/UFRJ, p 210. . KYNCH, G.J. (1952) A theory of sedimentation. Transaction Faraday Society, vol. 48, p.166-176. LUNA, C. L.; LOPES, C; MASSARANI, G. (2003) Recovery of Bacillus sphaericus 2362 spores from growth medium by flocculation/sedimentation, Bioprocess and Biosystems Engineering, vol, 25, p. 213-216. MASSARANI, G. (2002) Fluidodinmica em Sistemas Particulados, 2 ed. Rio de Janeiro: E-papers, p. 101. PUGET, F. P.; HALASZ, M.R.T.; MASSARANI, G.; ALVES, T.L.M. (2000) Influence of the flocculating agent in sedimentation and performance of a non flocculent strain of Zymomonas mobilis in the ethanol production process, Bioseparation, vol. 9, p. 119-124. RYU, H.W.; CHO K.S.; LEE, E.G; CHANG, Y.K. (2000) Recovery of poly(3hydroxybutyrate) from coagulated Ralstonia eutropha using a chemical digestion method, Biotechnology Progress, vol. 16, p. 676-679. SALEHIZADEH, H.; SHOJAOSADATI, S.A. (2001) Extracellular biopolymeric flocculants: recent trends and biotechnological importance, Biotechnology Advances, vol. 19, p. 371-385.

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CAPTULO 7 Utilizando um biorreator no convencional para cultivo de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de cido acrlico visando a produo de polihidroxialcanoatos.

ndice 7.1. Introduo ................................................................................................. 7.2. Biorreatores assistidos por membrana de dilise ..................................... 7.3. Experimental ............................................................................................ 7.3.1. Microrganismo ...................................................................................... 7.3.2. Meios de Cultura ................................................................................... 7.3.3. Bioreator coluna de bolhas (BCB) ........................................................ 7.3.4. Condies de Cultivo ............................................................................ 7.3.4.1. Preparo do inoculo ............................................................................. 7.3.4.2. Crescimento em meio caldo nutriente ................................................ 7.3.5. Procedimentos Analticos ...................................................................... 7.3.5.1. Medida do pH ..................................................................................... 7.3.5.2. Medida do potencial redox ................................................................. 7.3.5.3. Anlise da concentrao celular ......................................................... 7.3.5.3.1. Espectrofotometria .......................................................................... 7.3.5.3.2. Gravimetria ...................................................................................... 7.3.5.4. Anlise da concentrao de cido acrlico ......................................... 7.3.5.5. Anlise da concentrao de polihidroxialcanoatos ............................ 7.4. Resultados e discusso ............................................................................. 7.5. Concluses ............................................................................................... 7.6. Referncias bibliogrficas ........................................................................ 120 120 122 122 122 122 125 125 125 126 126 126 126 126 126 127 128 129 135 135

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7.1. Introduo Entre os biorreatores no convencionais est o reator do tipo coluna de bolhas. Esses reatores so versteis e apresentam vantagens econmicas como o baixo custo de investimento, devido a sua construo simples, e o baixo custo de operao, devido ao baixo requerimento de energia necessrio para manter as fases dispersas na mistura (MOO-YOUNG, 1985). Por isso, esses reatores so utilizados em diferentes processos, como na produo de leveduras, no tratamento de efluentes (VERHAAGEN, 1978), na produo de cerveja e vinagre (SMITH e GREENSHIELDS, 1974), no cultivo de fungo (MORRIS et al., 1973).

7.2. Biorreatores assistidos por membrana de dilise METCHNIKOFF, ROUX e SALIMBENI (1896) foram os primeiros a empregar membranas semipermeveis para o crescimento de Vibrio cholera em sacos de dilise. A cultura assistida por membrana de dilise tem sido aplicada em algumas reas como na produo de bactria fastidiosa, de suspenses de clulas de mamferos, de exotoxinas bacterianas e de esporos, alm de ser usada em propagaes simbiticas (GERHARDT e GALLUP, 1963). VINET e FREDETTE (1951) desenvolveram um sistema de cultivo com membranas que utiliza tubos de celofane para produo de clulas e produtos bacterianos, concluindo que o processo pode operar de forma contnua. NURMIKKO (1952) observou que molculas pequenas (metablitos)

produzidas pelas bactrias podem ser facilmente dialisadas por uma membrana de celofane. Contudo, os autores no conseguiram prevenir o crescimento associado de Lactobacillus arabinosus 17-5 e Streptococcus faecalis R. GALLUP e GERHARDT (1963) desenvolveram um sistema de fermentao em saco de dilise para crescimento de Serratia marcescens e posterior concentrao das clulas por desidratao osmtica. A desidratao era feita por contato direto do saco de dilise com um colide hidroflico (polietilenoglicol ou dextrana). A necessidade de promover fluxos hidrulicos elevados atravs da membrana, em processos de ultra e microfiltrao, podem causar o fouling da membrana e o conseqente bloqueio dos poros. Assim, pode ocorrer uma indesejada diminuio do fluxo de fluido, especialmente quando a densidade celular alta (BELFORT, 1989,

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SCHIRALDI et al., 1999). O uso de membrana de dilise uma alternativa filtrao, pois permite remover os metablitos do meio de cultura por difuso; ou seja, o fluxo de material controlado pelo gradiente de concentrao sobre a membrana, evitando que as clulas bloqueiem dos caminhos por onde escoa o material em soluo (FUCHS et al., 2002) Um mdulo externo de dilise j foi usado em cultivos do tipo batelada alimentada com reciclo de clulas de Escherichia coli para reduzir a concentrao de metablitos inibidores de crescimento presentes no caldo de fermentao

(LANDWALL e HOLME, 1977). MRKL et al. (1993) desenvolveram um biorreator cilndrico com duas cmaras de dilise para obter alta concentrao de clulas de E. coli. Algumas caractersticas foram observadas nos ensaios: * contnua disponibilidade de nutrientes; * eliminao das oscilaes das concentraes de substrato e oxignio dissolvido, normalmente observadas em um sistema de cultivo em batelada alimentada convencional; * no h diluio do meio de cultura durante a alimentao; * os produtos inibidores de crescimento podem ser removidos sem a necessidade de bombeamento do caldo nutriente atravs de unidade externa de dilise, o que evita o estresse fisiolgico das clulas. Uma desvantagem do cultivo em biorreator assistido por membrana de dilise que o meio na cmara de alimentao continuamente alterado, sendo necessrio manter a concentrao de substrato relativamente alta. Isso pode ocasionar grandes perdas de substrato no efluente da cmara de alimentao. Com um sistema de dupla cmara, separadas por membrana de dilise, MRKL et al. (1993) obtiveram uma concentrao celular de E. coli de 174 g/L. Essa concentrao foi maior que as concentraes obtidas em cultivo com controle da taxa especfica de crescimento (110 g/L) (RIESENBERG et al., 1991); cultivo em batelada alimentada com controle da concentrao de oxignio dissolvido (125 g/L) (MORI et al., 1979); cultivo semi-contnuo (144 g/L) (LANDWALL e HOLME, 1977) e em cultivo com reciclo de clulas utilizando membranas (145 g/L) (LEE e CHANG, 1990).

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A separao de produtos de baixo massa molar, por dilise, representa uma etapa de purificao que pode tornar o processo ainda mais eficiente. A aplicao da dilise, dentre as diferentes tcnicas de cultivo assistido por membrana parece promissora. Estudos so estimulados pela simplicidade e a pela existncia de uma base terica para sua aplicao a culturas bacterianas (SCHULTZ e GERHARDT, 1969).

7.3. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto a VETEC exceto o padro de poli-3-hidroxibutirato que foi adquirido junto a SIGMA-ALDRICH e o solvente cido acrlico que foi fornecido pela empresa RHODIA-Brasil.

7.3.1. Microrganismo Foi utilizada a bactria Cupriavidus necator DSM545, obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC.

7.3.2. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados foram: a. Agar Nutriente (NA) (g/L): Extrato de carne, 3,0 ; Peptona de carne, 5,0 ; Agar, 15,0 . b. Caldo Nutriente (NB) (g/L): Extrato de carne, 3,0; Peptona de carne, 5,0.

7.3.3. Biorreator coluna de bolhas (BCB) O sistema para operao do biorreator coluna de bolhas est apresentado na Figura 7.1. Um biorreator tipo coluna de bolhas com membrana de dilise (Figura 7.2) foi construdo em vidro com as partes, superior (cabea) e inferior (difusor de ar), removveis, a fim de permitir a insero da membrana de dilise no interior do bioreator. O conjunto todo pode ser autoclavado. A biorreao ocorre no interior da membrana de celulose para dilise (SIGMA), com 2,1 cm de dimetro e 34 cm de comprimento com um valor de cut-off de 12000, que isola os microrganismos da fonte de alimentao contendo o substrato de interesse.

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O substrato passa atravs da membrana em funo da variao do gradiente de concentrao no meio de cultura, que uma funo da atividade dos microrganismos.

3 6

2 4

5 7

Figura 7.1. Foto do sistema para operao do biorreator coluna de bolhas (BCB) composto por: 1) Frasco de alimentao, 2) Bomba Peristltica, 3) Bioreator Coluna de Bolhas (BCB), 4) Bomba, 5) Umidificador de ar, 6) Rotmetro e 7) Banho termostatizado.

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9 8

9 10

7
Partes do biorreator coluna de bolhas: 1. Entrada de ar 2. Difusor de ar (placa porosa) 3. Camisa termostatizada 4. Zona de alimentao 5. Membrana de dilise 6. Zona de bioreao 7. Zona de disperso das bolhas 8. Entrada para soluo de cido/base 9. Entrada para eletrodo 10. Entrada para condensador

6 5

4 3

2 1
Figura 7.2. Desenho esquemtico do biorreator no convencional assistido por membrana de dilise construdo no laboratrio.

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7.3.4. Condies de Cultivo 7.3.4.1. Preparo do inculo. O inculo foi preparado a partir do crescimento das clulas de C. necator em meio caldo nutriente (NB), a 180 rpm e 30 oC por 24h;

7.3.4.2. Crescimento em meio caldo nutriente. * Preparo do inculo Um volume de meio NB correspondente a 1% (v/v) do volume de meio (300 mL) no biorreator BCB foi cultivado em frasco Erlenmeyer (150 mL) a 160 rpm e 30oC por 24 horas. Em seguida, foi transferido assepticamente para o biorreator projetado no laboratrio (Figura 1), cujas condies de trabalho so definidas de acordo com o ensaio em andamento.

** Cultivo para obteno de massa celular A zona de biorreao foi preenchida com o meio NB, inoculado e mantido em agitao pelo borbulhamento de ar a uma vazo de 36 ml/min temperatura de 30 oC. A zona de alimentao foi preenchida com meio NB com auxlio de uma bomba peristltica (Marca Gilson, modelo M312) quando foi indicada, pelo sinal redox, o incio da fase de desacelerao de crescimento das clulas de Cupriavidus necator DSM 545.

** Cultivo para consumo de cido acrlico em biorreator coluna de bolhas. A obteno de concentrado celular foi realizada conforme descrito no Captulo 5, Seco 5.2.4. O concentrado celular foi transferido para a zona de biorreao no BCB, onde foi mantido sob agitao pelo borbulhamento de ar a 36 mL/min a temperatura de 30 oC. Em seguida a zona de alimentao foi preenchida com a soluo de cido acrlico (40 g/L e pH 6,0).

** Cultivo para consumo de cido acrlico em sistema washed cells. A fim de obter alta concentrao de clulas, foi realizado um cultivo em meio NB. Em seguida a concentrao foi realizada por centrifugao, seguindo a lavagem, por duas vezes, em soluo salina 0,85% (v/v) e posterior ressuspenso em meio

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mineral (descrio na Seo 3.4.2, Captulo 3) sem a presena de fonte de nitrognio ou em gua destilada sem suplementao dos nutrientes que compem o meio mineral.

7.3.5. Procedimentos Analticos 7.3.5.1. Medida do pH O monitoramento do pH foi realizado por potenciometria, utilizando um potencimetro Metler Toledo, modelo MP220, equipado com eletrodo Ag/AgCL com termopar para ajuste de temperatura.

7.3.5.2. Medida do potencial redox O monitoramento do potencial redox (Eh) foi realizado por potenciometria, utilizando um potencimetro MS Tecnopon, modelo mPA 210, equipado com eletrodo redox (Analion, modelo ROX 673 C/S8) com termopar para ajuste de temperatura.

7.3.5.3. Anlise da concentrao celular A concentrao celular determinada por dois mtodos: por espectrofotometria (durante o cultivo) e por gravimetria.

7.3.5.3.1. Espectrofotometria Analisa-se a concentrao de biomassa do material coletado em um espectrofotmetro Spectronic 20D+, medindo-se a densidade tica no comprimento de onda de 600 nm contra um branco de gua. Para manter uma preciso adequada (regio linear), a faixa de absorbncia utilizada de 0,0 at 0,8. A partir deste valor, so feitas diluies para manter a linearidade.

7.3.5.3.2. Gravimetria A medida do peso seco celular compreende as seguintes etapas: I. separa-se um volume conhecido do meio de cultura, entre 1 mL e 10 mL; II. filtra-se o meio atravs de membranas Millipore de poliamida pr-pesadas (poro de 0,2 m); III. lava-se duas vezes o material retido na membrana com HCl 0,01M, para remover ons e sais presentes na biomassa; 126

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IV. seca-se a membrana com a biomassa em estufa a 85C at peso constante. V. calcula-se a concentrao de massa celular (X) na forma: ( MM f MM i ) 1000 VA

X ( g / L) =

(7.1)

onde MMf a massa da membrana final (g); MMi a massa da membrana inicial (g) e VA o volume da amostra do meio de cultivo (mL).

A curva de calibrao de biomassa em funo da absorbncia (600 nm) (Anexo 2) serve para estimar a concentrao de clulas durante a fase de crescimento da cultura.

7.3.5.4. Anlise da concentrao de cido acrlico A quantificao da concentrao de cido acrlico foi realizada por cromatografia gasosa, com injeo direta do sobrenadante. Preparo da amostra: I. centrifuga-se um volume de meio de cultura; II separa-se o sobrenadante do material celular precipitado por centrifugao a 5000 x g por 20 min; III. armazena-se o material amostrado a -20oC para anlise posterior. Anlise da concentrao de cido acrlico: I. descongela-se a amostra e agita-se vigorosamente; II. misturam-se 180 L do sobrenadante a 20 L de soluo de cido actico 5 g/L; III. coleta-se com seringa micrograduada um volume de 0,1 L, que ento injetado na coluna.. IV. calcula-se a concentrao de cido acrlico (AA) no meio na forma: A3 AA( g / L) = a + b A4

(7.2)

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onde A3 a rea obtida para a concentrao de cido acrlico; A4 a rea obtida para a concentrao do padro interno cido actico e "a" e "b" so as constantes obtidas na curva padro, respectivamente, o coeficiente angular e o coeficiente linear.

A curva padro de cido acrlico (Anexo 1) foi feita utilizando o cido actico como padro interno, com a concentrao variando entre 1 g/L e 4 g/L. A coluna utilizada para dosagem do cido acrlico apresenta a fase de Crossbond Carbowax PEQ (0,32mm X 30m) modelo STABILWAX., marca RESTEK. O cromatgrafo um Chrompak, modelo CP 9000, equipado com um detector de ionizao de chama (DIC ar-hidrognio). O gs de arraste utilizado o hlio a 5,0 mL/min e as temperaturas do injetor, detector e coluna so iguais, respectivamente, a 250 C, 250 C e 120 C.

7.3.5.5 4. Anlise da concentrao de polihidroxialcanoatos (PHAs) A quantificao da concentrao de PHAs foi realizada por cromatografia gasosa, conforme o mtodo de metanlise baseado em BRAUNEGG et al. (1978), com as modificaes propostas por BRANDL et al. (1988). Preparo da amostra: I. coleta-se um volume de amostra do meio de cultura compreendido entre 1,5 e 2 mL; II. centrifuga-se a amostra a 15.000 rpm por 5 minutos; III. lava-se o precipitado duas vezes com gua destilada; IV. armazena-se o precipitado a -20oC para que todas amostras sejam analisadas ao mesmo tempo. Metodologia: I. ressuspende-se o precipitado em 2 mL de metanol acidificado (H2SO4 15%), contendo cido benzico 0,4 g/L como padro interno; II. adiciona-se um volume de 2 mL de clorofrmio; III. aquece-se a mistura a 100C durante 140 minutos em tubos fechados, sendo que aps 60 minutos de aquecimento a mistura agitada durante alguns segundos e devolvida ao aquecimento; IV. resfria-se a mistura at a temperatura ambiente; V. adiciona-se 1mL de gua destilada; 128

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VI. agitam-se as amostras durante 30 segundos, deixando separar as fases; VII. retira-se a fase orgnica (inferior) com uma pipeta Pasteur; VIII. armazena-se a fase aquosa em geladeira, para posterior anlise em cromatografia gasosa. A curva padro (Anexo 3) feita utilizando-se o poli-3-hidroxibutirato (Sigma ou Biopol), como padro externo, com massa variando entre 0,0010 g e 0,0100 g. Submetem-se os padres mesma metanlise que as amostras. A coluna utilizada para dosagem do cido acrlico apresenta a fase de Crossbond Carbowax - PEQ (0,32mm X 30m) modelo STABILWAX., marca RESTEK. O cromatgrafo um Chrompak, modelo CP 9000, equipado com um detector de ionizao de chama (DIC arhidrognio). O gs de arraste utilizado o hlio a 5,0 mL/min e as temperaturas do injetor, detector e coluna so iguais, respectivamente, a 250 C, 250 C e 120 C. O volume injetado de 0,1 L. O clculo da concentrao de P(3HB) realizado conforme a seguinte equao:

A1 + b 1000 A2 a P(3HB)( g / L) = VA

(7.3)

onde A1 a rea obtida para o P(3HB); A2 a rea obtida para o padro interno cido benzico; "a" e "b" so as constantes obtidas na curva padro, respectivamente, o coeficiente angular e o coeficiente linear, e VA o volume da amostra do meio de cultivo (mL).

7.4. Resultados e discusso Os resultados do ensaio realizado no biorreator coluna de bolhas para obteno de altas concentraes de massa celular a partir da alimentao externa de fonte de carbono, usando o sinal do potencial redox como indicador do momento de alimentao, esto apresentados na Figura 7.3. A massa de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 foi obtida a partir do crescimento das clulas em meio caldo nutriente temperatura de 30 oC sob agitao de ar a 36 mL/min e sem controle de pH. Inicialmente as clulas foram cultivadas na Zona de Biorreao. A Zona de Alimentao foi mantida vazia at 6,3 horas, quando o sinal redox estabilizou-se em torno de 125 mV, instante esse que coincide com a desacelerao de crescimento observado na Figura 7.3A. Nessa etapa do 129

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crescimento a velocidade especfica foi de 0,61 h-1 (Figura 7.4), valor maior que o valor de 0,47 h-1 observado para o crescimento de C. necator em biorreator agitado mecanicamente (Figura 5.7). A bomba peristltica foi ento acionada para encher a Zona de Alimentao com meio caldo nutriente (NB). Os valores de potencial redox sofrem uma pequena alterao no sentido positivo, mas imediatamente comeam a diminuir, confirmando a relao com o aumento da massa celular at 8 horas de cultivo, quando novamente os valores se estabilizam em -170 mV, indicando mais uma vez a desacelerao da etapa de crescimento celular, que apresentou uma velocidade especfica de 0,48 h-1. A bomba peristltica foi acionada novamente, adicionando mais caldo nutriente, e os valores do potencial redox apresentaram o mesmo comportamento da alimentao anterior, estabilizando-se ao redor de -225 mV. Nesse momento foi acionada novamente a bomba peristltica para reposio de nutrientes. Nestas duas ltimas etapas os valores obtidos para a velocidade especfica de crescimento foram respectivamente 0,27 h-1 e 0,18 h-1 (Figura 7.4). A reduo dos valores de velocidade especfica de crescimento provavelmente devida diluio da soluo de alimentao, uma vez que aps cada acionamento da bomba peristltica a soluo contida na Zona de Alimentao foi retornada ao frasco de alimentao contendo a soluo com o meio caldo nutriente (NB). Ao final de 10,2 horas foi obtida uma concentrao de clulas de C. necator igual a 3,0 g/L. A utilizao da sonda redox para sinalizar o instante em que a soluo de caldo NB na Zona de Alimentao deveria ser substituda foi eficaz e o sistema de coluna de bolhas assistido por membrana de dilise mostrou-se eficiente para obter clulas de C. necator em alta densidade. Comprovada a eficincia de alimentao do sistema de coluna de bolhas, atravs da membrana de dilise, um novo ensaio foi realizado para suprir as clulas de C. necator com cido acrlico para biodegradao. O concentrado de clulas de C. necator foi obtido conforme descrito na Seo 6.2.4 do Captulo 6, com o uso de sulfato de alumnio como agente floculante. O concentrado celular (7 g/L) foi transferido para a Zona de Biorreao do biorreator BCB. Atravs da Zona de Alimentao foi realizada a circulao de gua por um intervalo de 1 hora, a fim de remover nutrientes presentes na suspenso de clulas. A gua foi removida da Zona de Alimentao e uma soluo de cido acrlico (40 g/L, pH 7,0) foi bombeada.

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4 3

X (g/L)

2 1 0 0 100 50 0 -50 -100 -150 -200 -250 0 2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12

Eh (mV)

Tempo (h)
Figura 7.3. Resultados do crescimento de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator coluna de bolha assistido por membrana de dilise a temperatura de 30 oC sob agitao de ar a 36 mL/min sem controle de pH.
2 1

ln (abs)

-1 -2 -3 0 2
= 0,61 h
-1

= 0,48 h

= 0,27 h

= 0,18 h

-1

-1

-1

10

12

Tempo (h)
Figura 7.4. Linearizao dos resultados do crescimento de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator coluna de bolha assistido por membrana de dilise a temperatura de 30 oC sob agitao de ar a 36 mL/min sem controle de pH.

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7,2 7,0 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 250 200

pH Eh (mV) cido Acrlico (g/L)

150 100 50 0 4

0 0 2 4 6

Tempo (h)
Figura 7.5. Resultados da biorreao para consumo de cido acrlico por clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em biorreator coluna de bolhas assistido por membrana de dilise a temperatura de 30 oC, sob agitao de ar a 36 mL/min e sem controle de pH.

Na Figura 7.5 pode ser observado que, aps o preenchimento da Zona de Alimentao, a concentrao de cido acrlico na Zona de Biorreao alcanou um valor de 2,1 g/L. A soluo de cido acrlico foi circulada continuamente pela zona de alimentao por 1 hora e ento observado que os valores de pH e de Eh diminuram, mas que a concentrao de cido acrlico aumentou para 3,9 g/L. Aps esse intervalo de tempo a circulao foi cessada por 20 minutos e foi observado que a concentrao de cido acrlico diminui de 3,9 g/L para 3,4 g/L. Acionada novamente a bomba peristltica, por mais uma hora, para circulao da fonte de carbono, foi observado um

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aumento de 0,2 g/L de cido acrlico na Zona de Biorreao. Interrompida novamente a circulao da soluo de cido acrlico por 1,3 horas, a concentrao de cido acrlico diminuiu para 0,15 g/L na Zona de Biorreao. Retomada a circulao por mais 2,3 horas, a concentrao de cido acrlico na Zona de Biorreao atingiu 4,57 g/L. Durante as 6,05 horas de cultivo os valores de pH e Eh continuaram diminuindo, contudo no sinalizaram o incio da etapa de desacelerao do crescimento celular. Alm disso, anlises realizadas de P(3HB) mostraram no haver a presena deste produto nas clulas no final do processo.
7,4 7,3 7,2

pH

7,1 7,0 6,9 0 0,0013 0,0012 0,0011 0,0010 0,0009 0,0008 0 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8

P(3HB) (g/L)

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 7.6. Resultados do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 em meio mineral (MM) com adio de fonte de nutriente, em Erlenmeyer (150 mL), a temperatura de 30 oC sob agitao de 160 rpm sem controle de pH.

O suprimento indireto de cido acrlico ao meio de cultura, a partir de uma soluo concentrada (40 g/L), no levou biossntese do biopolmero. A fim de verificar se o suprimento direto de alta concentrao de cido acrlico favoreceria a biossntese de P(3HB) novos ensaios foram realizados em Erlenmeyers (150 mL) com e sem a adio de macro e micronutrientes. Nas Figuras 7.6 e 7.7 so apresentados, respectivamente, com e sem adio de nutrientes, os ensaios em condio washed cell com uma concentrao de clulas de C. necator de 17 g/L obtida por floculao/sedimentao utilizando o sulfato de alumnio como o agente floculante.

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CAPTULO 7 Utilizando um bioreator no convencional para cultivo de clulas

de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de cido acrlico visando produo de polihidroxialcanoatos
Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

possvel observar que em ambos casos h a depolimerizao do PHB. Entretanto, quando h correo dos valores de pH, nos tempos de 3 horas e 6 horas de cultivo, no meio sem a adio de nutrientes (Figura 7.7), observada a biossntese de P(3HB). Uma repetio do ensaio sem o fornecimento de nutrientes cultura apresentou apenas depolimerizao de P(3HB), mesmo quando so corrigidos os valores de pH (Figura 7.8).
8 7

pH

6 5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 8

P(3HB) (mg/L)

2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 1 2 3

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 7.7. Resultados do cultivo de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em gua destilada sem adio de nutrientes, em Erlenmeyer (150 mL), a temperatura de 30 oC sob agitao de 160 rpm com ajuste de pH a 7,0 durante o ensaio.
8 7

pH

6 5 4 0
2,0

10

12

Tempo (h)

P(3HB) (mg/L)

1,5 1,0 0,5 0,0

10

12

Tempo (h)

Figura 7.8. Resultados do cultivo de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em gua destilada sem adio de nutrientes, em Erlenmeyer (150 mL), a temperatura de 30 oC sob agitao de 160 rpm com ajuste de pH a 7,0 durante o ensaio.

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

7.5. Concluses O sistema de obteno de concentrado de clulas de Cupriavidus necator DSM 545 em um biorreator coluna de bolhas assistido por membrana de dilise eficiente e a substituio da soluo com a fonte de carbono na Zona de Alimenttao para disponibilizar nutrientes ao crescimento das clulas na Zona de Bioreao pode ser sinalizada com eficincia pela sonda de potencial redox. A concentrao de cido acrlico metabolizada pelas clulas de C. necator em condio de no crescimentos, em reator coluna de bolhas assistido por membrana de dilise, foi 6 vezes maior que a concentrao metabolizada no sistema washed cells (Figura 4.6). Igualmente ao observado no sistema washed cells (Figura 4.7B), no foi verificada a biossntese de polihidroxialcanoato. Ainda assim, no significa que a sntese de P(3HB) no ocorre. O fato que as clulas podem j estar reguladas para uma outra situao, pois antes da reao elas so submetidas condies experimentais diferentes, provavelmente na condio estacionria.

7.6. Referncias bibliogrficas BELFORT, G., 1989, Membrane and bioreactors: a technical challenge in biotechnology, Biotechnology and Bioengineering, v. 33, pp. 1047-1066. FUCHS, C., KSTER, D., WIEBUSCH, S., MAHR, K., EISBRENNER, G., MRKL, H., 2002, Scale-up of dialysis fermentation for high cell density cultivation of Escherichia coli, Journal of Biotechnology, v. 93, pp. 243-251. GERHARDT, P., GALLUP, D.M., 1963, Dialysis flasck for concentrated culture of microorganisms, Journal of Bacteriology, v. 86, pp. 919-929. GALLUP, D.M., GERHARDT, P., 1963, Dialysis fermentor systems for concentrated culture of microorganisms, Applied Microbiology, v. 11, pp. 506-512. LANDWALL, P., HOLME, T., 1977, Removal of inhibitors of bacterial growth by dialysis culture, Journal of General Microbiology, v. 103, pp. 345-352. LEE, Y.K., CHANG, H.N., 1990, High cell density culture of a recombinant E. coli producing penicillin acylase in a membrane cell recycle fermentor,

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CAPTULO 7 Utilizando um bioreator no convencional para cultivo de clulas

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Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

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CAPTULO 7 Utilizando um bioreator no convencional para cultivo de clulas

de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de cido acrlico visando produo de polihidroxialcanoatos
Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

VINET, G., FREDETTE, V., 1951, Apparatus for the culture of bacteria in cellophane tubes, Science, v. 114, pp. 549-550.

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CAPTULO 8 Concluses e sugestes


ndice 8.1. Concluses ....................................................................................................... 139 8.2. Sugestes .......................................................................................................... 140

CAPTULO 8 Concluses e Sugestes

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

8.1. Concluses Neste trabalho foi desenvolvido um processo para biodegradao de cido acrlico e simultnea produo de polihidroxialcanoatos. Diversas reas foram exploradas e bons resultados foram alcanados. Abaixo so apresentadas as principais concluses obtidas e algumas sugestes para atividades futuras. 1. A fonte de carbono cido acrlico assimilada em meio mnimo pela cultura de C. necator. A maior velocidade especfica de crescimento (0,035 h-1) obtida para uma concentrao de 0,33 g/L de cido acrlico.

2. A estratgia de cultivo em batelada, em frascos agitados, utilizando meio mnimo sem a presena de fonte de nitrognio, pode ser usada para a biossntese de P(3HB) a partir da assimilao de cido acrlico pelas clulas de C. necator. No entanto o processo muito demorado por causa da limitao da concentrao de cido acrlico que pode ser adicionada no meio de cultura (0,33 g/L cido acrlico) para evitar inibio da multiplicao das clulas.

3. A estratgia de controlar os valores de pH do meio de cultura (NB) pela incorporao de uma soluo de cido acrlico permite aumentar a taxa de biodegradao desse composto. Os resultados mostraram que essa estratgia permite aumentar a concentrao de cido acrlico no meio, de 0,33 g/L em meio mnimo em frascos agitados, para 0,5 g/L em meio caldo nutriente em biorreator, onde as condies de aerao podem ser controladas.

4. O monitoramento dos cultivos de C. necator em meio NB utilizando uma sonda de potencial redox permite sinalizar o final da fase de crescimento das clulas. Assim, pode ser implementada uma tcnica de sucessivas alimentaes do meio de cultivo para obteno de massa celular.

5. Um concentrado de clulas de C. necator pode ser obtido a partir da utilizao de agentes floculantes, como o tanino e sulfato de alumnio, com posterior sedimentao. Foi verificada maior atividade celular quando as clulas foram concentradas com a adio de sulfato de alumnio. A viabilidade celular foi definida a partir da resposta que as clulas de C. necator apresentaram ao serem inoculadas aps

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CAPTULO 8 Concluses e Sugestes

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

concentrao da suspenso em meio caldo nutriente. Em ambos os casos foi observado o decrscimo da velocidade especfica de crescimento celular.

6. O biorreator coluna de bolhas, assistido por membrana de dilise, eficaz para obteno de alta densidade de clulas de C. necator e para alimentao com cido acrlico e conseqente biodegradao.

8.2. Sugestes 1. Desenvolver uma estratgia de controle de alimentao de nutrientes, a partir do potencial redox, ao meio de cultivo no bioreator coluna de bolhas para obteno de alta densidade celular.

2. Estruturar um plano de experimentos para alimentar com cido acrlico a Zona de Biorreao no bioreator coluna de bolhas visando a otimizao da produo de polihidroxialcanoatos.

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ANEXOS

ANEXOS

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

ANEXO 1

c id o A c r lic o ( g / L )

4 ,0 3 ,5 3 ,0 2 ,5 2 ,0 1 ,5 1 ,0 0 ,5 0 ,0 0 2 4 6 8 1 0 1 2

A 3 /A 4

FIGURA 1. Curva de calibrao da razo entre as reas de cido acrlico e cido actico (A3/A4) vs. concentrao de cido acrlico obtida por cromatografia gasosa.

A equao da reta obtida foi: y = ax +b a = 0,3649 b=0 r = 0,995

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ANEXOS

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

ANEXO 2

1 ,6

B io m a s s a ( g /L )

1 ,4 1 ,2 1 ,0 0 ,8 0 ,6 0 ,4 0 ,2 0 ,0 0 ,0 0 ,5 1 ,0 1 ,5 2 ,0 2 ,5 3 ,0 3 ,5

A b s o r b n c ia ( 6 0 0 n m )

FIGURA 2. Curva de calibrao da absorbncia (600 nm) vs. concentrao de biomassa, obtida pelo mtodo de gravimetria a partir de clulas de Ralstonia eutropha DSM 545 cultivadas em meio caldo nutriente em biorreator.

A equao da reta obtida foi: y = ax +b a = 0,3866 b=0 r = 0,9895

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ANEXOS

Produo de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando cido acrlico como fonte de carbono

ANEXO 3

0 ,0 1 2 0 ,0 1 0

P (3 H B ) (g )

0 ,0 0 8 0 ,0 0 6 0 ,0 0 4 0 ,0 0 2 0 ,0 0 0 0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5

3 ,0

3 ,5

A 1 /A 2

FIGURA 3. Curva de calibrao da razo entre as reas de P(3HB) e cido benzico (A1/A2) vs. concentrao de P(3HB) obtida por cromatografia gasosa.

A equao da reta obtida foi: y = ax +b a = 0,00316 b=0 r = 0,9994

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