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Escola Superior de Tecnologia do Barreiro Instituto Politcnico de Setbal CET Tcnicas de Laboratrio

MTODOS DE ANLISE MICROBIANA

Trabalho Prtico n

! Colorao Gram

Docente da disci lina! Pro"essora Brbara Chagas A"tores! #driell$ Carreira In%s #l&es 'uliana (unge

CET ! Tcnicas de Laboratrio )todos de #nlise )icrobiana

Res"mo
# e*ecu+,o desta ati&idade e*peri-ental te&e o principal ob.eti&o saber preparar u-a l/-ina e ta-b- conhecer u- -icroscpio e co-o o seu "unciona-ento0 Para a prepara+,o das l/-inas "oi necessrio a recolha de bactrias dos -eios preparados anterior-ente1 co- u-a ansa1 reali2ando!se u- es"rega+o da l/-ina1 e posterior-ente colocou!se a la-ela1 para se poder obser&ar a -icroscpio0 # obser&a+,o dos -icrorganis-os pode ser "eita atra&s de algu-as tcnicas1 no-eada-ente a tcnica entre l/-ina e la-ela e a tcnica da gota pendente0 3oi usada a tcnica entre l/-ina e la-ela1 co- a especial aten+,o aos -o&i-entos Bro4nianos1 5ue s,o -o&i-entos resultantes dos -o&i-entos aleatrio das -olculas de gua contra as bactrias0 3oi ta-b- reali2ado a colora+,o de gra- 5ue consiste nu-a colora+,o di"erencial per-itindo distinguir os &rios tipos de bactrias presentes na l/-ina0 Podendo ser grapositi&a se apresentar cor ro*a1 ou gra- negati&a se apresentar cor rosa a&er-elhado0 E para se conseguir distinguir as gra- positi&as das gra- negati&as "oi necessrio &isuali2ar ao -icroscpio eletrnico0

#driell$ Carreira1 In%s #l&es e 'uliana (unge

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#ndice
6esu-o00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 I Introdu+,o Terica 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 70)aterial e E5uipa-entos000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000008 06eagentes0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8 80Procedi-ento00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8 8070Prepara+,o das l/-inas0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000008 80 0Prepara+,o da colora+,o de 9ra-00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000: :0;bser&a+<es000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 : =06esultados000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 > ?0Conclus,o0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 @ >0Bibliogra"ia000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 A

#driell$ Carreira1 In%s #l&es e 'uliana (unge

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Introd"o Te$rica
E*iste- &rias tcnicas de colora+,o para posterior &isuali2a+,o no -icroscpio Bcolora+,o si-ples1 negati&a e di"erencialC1 sendo 5ue para todas elas necessria u-a a"i*a+,o da a-ostra a cha-a1 e&itando -o&i-entos Bro4nianos0 # tcnica de colora+,o 9ra-1 descoberta e- 7@@: pelo "Dsico dina-ar5u%s Eans Christian 9ra-1 u- tipo de colora+,o di"erencial pois ser&e para1 na nossa a-ostra1 reconhecer-os as bactrias do tipo 9ra- positi&as pela cor prpura e as 9ra- negati&as pela cor a&er-elhada0 Esta tcnica "unda-ental para a ta*ono-ia e identi"ica+,o de bactrias e- laboratrios de bacteriologia0

Bactrias 9ra- positi&as

Bactrias 9ra- negati&as

Co-o -ostra- as i-agens aci-a1 a di"eren+a de cor1 "ase a colora+,o 9ra-1 de&e! se as di"eren+as da estrutura parede celular de cada u-a das bactrias0 #s bactrias 9rapositi&as possue- u-a espessa ca-ada de peptidoglicano1 en5uanto 5ue nas 9ranegati&as essa ca-ada "ina e rodeada por u-a ca-ada e*terna de proteDnas e lipopolissacarDdeos0 Para a &isuali2a+,o e- -icroscpio1 neste trabalho prtico1 utili2ou!se o -icroscpio tico de ca-po claro1 no entanto e*iste- outros tipos de -icroscpios ticos1 tais co-oF ! Ca-po escuroG ! Contraste de "asesG ! 3luoresc%ncia0 Cada u- destes tipos de -icroscpios per-ite obter u-a i-age- di"erente para a&aliar e obser&ar caracterDsticas distintas da -or"ologia -icrobiana0 Para u- estudo -ais detalhado e apro"undado ta-b- s,o utili2adas -icroscopias eletrnicas de &arri-ento ou de trans-iss,o0

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%& Material e E'"i amentos


#-ostras das cai*as de Petri Btrabalho prtico anteriorCG #nsasG Bico de BHsenG EsguichoG La-elasG L/-inasG Lu&asG )icroscpio tico0

(& Rea)entes
IlcoolG Indicadores para colora+,o 9ra-F o o o Soluto de Lugol1 (ioleta de CristalG Sa"ranina

*& +rocedimento
*&%& +re arao das l,minas
Inicial-ente1 co- a bancada pre&ia-ente higieni2ada1 "ora- distribuDdos por cada bancada l/-inas e la-elas0 Identi"icou!se1 pri-eira-ente1 as l/-inas co- a "onte e o -eio0 Ligou!se o bico de BHsen0 Co- a a.uda da ansa1 procedeu!se J recolha de bactrias1 e "e2!se o es"rega+o na l/-ina0 Cobriu!se co- a la-ela a l/-ina0 6epetiu!se este procedi-ento para as restantes cinco l/-inas0

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*&(& +re arao da colorao de Gram


#"i*ou!se as prepara+<es das l/-inas J cha-a do bico de BHsen0

Cobriu!se o es"rega+o co- &ioleta da cristal la&ando!se co- gua destilada1 aps se ter aguardado u- -inuto0 Cobriu!se no&a-ente o es"rega+o1 -as desta &e2 co- soluto de Lugol1 aguardando! se -ais u-a &e2 u- -inuto1 la&ando!se e- seguida co- gua destilada0 #ps ests duas colora+<es1 la&ou!se co- etanol0 Ko segui-ento da colora+,o1 cobriu!se co- sa"ranina1 aguardando!se no&a-ente u- -inuto e la&ou!se co- gua destilada0 Ter-inando assi- a colora+,o de 9ra- co- a &isuali2a+,o ao -icroscpio0

-& O.ser/a0es
Co- s e*iste u- -icroscpio tico1 reali2ara-!se apenas colora+<es a dois -eios de cultura1 conta-inados1 di"erentes1 no-eada-ente u- -eio slido e u- -eio lD5uido0 ; -eio slido era o PC# BPlate Count AgarC1 cu.a conta-ina+,o "oi o teclado de uco-putador e*istente no laboratrio1 na 5ual crescera- di&ersos tipos de -icrorganis-os1 e co-o tal1 retirara-!se duas a-ostra para colora+,o 9ra-0 ; segundo -eio seria a gua peptonada1 cu.a conta-ina+,o "oi os degraus da escada e- "rente ao laboratrio da escola0 3ora- retiradas as seguintes colnias1 tal co-o -ostra as i-agens abai*o0

Teclado do +C

De)ra"s

#s colnias utili2adas para colora+,o 9ra-1 5ue posterior-ente "ora- obser&adas ao -icroscpio1 "ora- identi"icadas da seguinte "or-aF o o o )eio PCA1 teclado do PC ! colnia pretaG )eio PCA1 teclado do PC ! colnia rosaG )eio gua peptonada degraus0

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; -eio Plate count agar BPC#C u- -eio de cultura si-ples1 nutriti&o1 co- pE neutro e 5ue proporciona o cresci-ento de todo o tipo de -icrorganis-os a 5ue "or e*posto0 #lguns e*e-plos de -icrorganis-os1 cu.o cresci-ento poder ser propDcio no -eio PC# encontra-!se na tabela seguinte1 co- as respeti&as "or-as associadas0 Meios de Crescimento no +CA Bacteria Staphylococcus Aureus 1oto)ra2ias corres ondentes

Escherichia Ecoli

Enterococos

Esporos de clostridium

Bacilos

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Salmonela

Shigella

Tal co-o o -eio PC#1 o -eio lD5uido de gua peptonada ta-b- propDcio para o cresci-ento de u- certo tipo de -icrorganis-os1 tais co-o -ostra a seguinte tabela0

Meios de Crescimento na )"a de +e tona Salmonella sorotipo enteritidis

1oto)ra2ias corres ondentes

Escherichia Ecoli

Salmonella sorotipo typhi

Streptococcus

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Escherichia Aerogenes.

3& Res"ltados
#ps a obser&a+,o ao -icroscpio do "ungo presente no -eio de PC#1 correspondente ao teclado do co-putador1 co-o se pode obser&ar pela i-age- ao lado aparenta de-onstrar ser u- "ungo1 tal co-o de-onstra&a ser a olho nu1 de&ido as hi"as 5ue se -ostra- bastante nDtidas0 #ps a obser&a+,o ao -icroscpio da bactria presente no da -eio de gua de peptona correspondente aos degraus escada1 co-o se pode obser&ar pela i-age- ao lado aparenta de-onstrar ser bactrias tanto do tipo 9rapositi&o1 co-o do tipo 9ra- negati&o1 algo co-u- de acontecer e- -eios de cultura lD5uidos0

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4& Concl"so
Este trabalho prtico te&e co-o principal ob.eti&o o desen&ol&er da tcnica de colora+,o 9ra-1 e posterior classi"ica+,o das colnias de bactrias co-o 9ra- positi&as e 9ra- negati&as0 Lurante a reali2a+,o da tcnica de a"i*a+,o e colora+,o do riscado apercebeu!se de 5ue as a-ostras1 nas la-elas1 n,o obti&era- u-a cor caracterDstica a olho nu1 ou se.a1 n,o era percetD&el a di"eren+a entre possD&eis 9ra- negati&as e 9ra- positi&as0 #o obser&ar ao -icroscpio a u-a a-plia+,o de M*7M1 B-aior a-plia+,o possD&el1 de&ido ao "acto de 5ue as restantes ob.eti&as se encontra&a- inutili2&eis1 por "alta de -anuten+,oC a a-ostra1 do aparente "ungo cor!de!rosa1 do -eio PC# &eri"icou!se 5ue este real-ente seria u- "ungo de&ido as hi"as 5ue se -ostrara- nDtidas0 Portanto1 este ao ser classi"icado co-o "ungo seria i-possD&el a classi"ica+,o sob a colora+,o 9ra-0 # outra a-ostra1 do "ungo preto1 da -es-a conta-ina+,o e ta-b- do -eio PC# "oi obser&ada1 por- n,o se conseguiu obter u-a i-age- t,o nDtida de 5ue ta-b- se trata&a de u- "ungo1 tal co-o "oi obser&ado a olho nu0 Por "i-1 na a-ostra do -eio lD5uido1 gua peptonada1 &eri"icou!se a presen+a de bactrias1 por-1 u- grupo de bactrias -isto1 ou se.a1 9ra- positi&os e 9ra- negati&as0 ; "acto de n,o se ter classi"icado ao certo n,o "oi estranho1 isto por5ue u-a das caracterDsticas dos -eios lD5uidos precisa-ente o cresci-ento de bactrias co- paredes celulares de estrutura di"erente0 #pesar de n,o ter sido possD&el classi"icar u-a colnia co-o sendo 9ra- positi&a ou 9ra- negati&a1 o grupo co-preendeu a parte terica e conseguiu aplicar be- a colora+,o aos tipos de -icrorganis-os 5ue ti&era- cresci-ento nos seus -eios de cultura0

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5& Bi.lio)ra2ia
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