Alim. Nutr., Araraquara v. 16, n. 1, p. 17-20, jan./mar.

2005

ISSN 0103-4235

SEPARAO DAS PROTENAS DO SORO DO LEITE POR DEAE-TRISACRYL*

Daniela Parreira MARQUES** Marcos Franqui CUSTDIO** Antonio Jos GOULART** Roberto de Campos GIORDANO*** Raquel de Lima Campos GIORDANO*** Rubens MONTI** RESUMO: O soro de leite, subproduto altamente protico da indstria de laticnios, vem sendo descartado sem nenhum tratamento nos rios, provocando um alto impacto ambiental. No sentido de contribuir para a diminuio da poluio ambiental, o presente trabalho teve por objetivo desenvolver um procedimento simples para separar as protenas do soro, sem alterar a conformao nativa das mesmas, para que, posteriormente, possam ser utilizadas na produo de dietas enterais, sucos, sorvetes, suplementos esportivos, kit para determinao de massa molecular em laboratrios, dentre outros produtos. O soro doce dialisado e filtrado em caulim teve a concentrao de protenas (6,67 0,04 g/L) e lactose (44,90 0,02 g/L) determinados e cromatografia de alta performance foi realizada utilizando-se uma coluna empacotada com DEAE-Trisacryl, combinando gradiente de fora inica e de pH na eluio, permitindo a separao parcial de soroalbumina bovina, lactoglobulina e lactalbumina. Os resultados mostraram que o procedimento de separao de protenas proposto um excelente mtodo de separao, e tratamentos especiais no so necessrios para obter este grau de eficincia. Aps a separao, a -lactoglobulina foi totalmente purificada atravs de cromatografia de excluso molecular em coluna de Sephadex G-25. PALAVRAS-CHAVE: Cromatografia de troca inica; filtrao em gel; separao de protenas; protenas do soro do leite. Introduo Estima-se que anualmente sejam produzidos 100 bilhes de litros de soro de leite pelas indstrias de laticnios. 5 Destes, 40% so descartados sem nenhum tratamento nos rios, causando srios impactos ambientais.16 O soro de leite contm quantidades significativas de lactose e protenas. As principais protenas so: -lactoglobulina ( -Lg); -lactoalbumina ( -La); soro albumina bovina (BSA) e imunoglobulinas (Ig). A Tabela 1 mostra dados das propriedades dessas protenas atravs das mdias retiradas de diferentes fontes.16 , 18 O soro de leite tambm contm, em menor quantidade, outras protenas e peptdeos com propriedades importantes. Fragmentos de -casena ou proteose-peptonas; resduos de casena coagulados; fragmentos de -casena (glicomacropeptdeos, GMP), micelas de casena, e complexos de fosfolipdeos e peptdeos no especficos tambm so encontrados. Existem diferentes aplicaes para o soro de leite. As protenas hidrolisadas podem ser utilizadas em suplementos alimentares ou pela indstria farmacutica. A BSA um exemplo de grande aplicao na bio-indstria e em laboratrios. Pesquisas tm sido efetuadas no sentido de demonstrar as aplicaes para os concentrados de protenas do soro e isolados de protena do soro.10 Algumas delas tm apontado outras possibilidades na utilizao do soro de leite; como por exemplo sua utilizao em culturas ou na produo de bebidas lcteas fermentadas.1, 17 A hidrlise enzimtica controlada das protenas do soro utilizando tripsina e -quimotripsina foi recentemente estudada.6 Diferentes procedimentos de cromatografia so utilizados industrialmente para separar e purificar as protenas do soro.7, 8, 10, 12, 19 Muitos deles utilizam vrios passos para alcanar a separao completa o que acaba por elevar o custo do procedimento. O presente trabalho teve como principal objetivo o desenvolvimento de um procedimento simples e suave para separar as protenas do soro de leite e a subseqente purificao de uma das protenas.

Tabela 1 - Propriedades das protenas do soro de leite.

Protenas Concentrao no soro cru (g/L) Contedo total de fraes, % (m/m) Massa Molecular (kDa) Ponto isoelttrico
Fontes: Morr e Ha16; Richards.18

-Lg 2-4 56-60 18,3 5,2

-La 0,6-1,7 18-24 14,4 4,2-4,5

BSA 0,4 6-12 66,0 4,7-4,9

Ig 0,4-1,0 6-12 146 5,5-8,3

* Trabalho elaborado com apoio financeiro da FAPESP (Processo n 98/11620-8) e PADCT/CNPq (Processo n 620164/97-2). ** Departamento de Alimentos e Nutrio. Faculdade de Cincias Farmacuticas - UNESP - 14801-902 - Araraquara - SP - Brasil *** Departamento de Engenharia Qumica - UFSCar - 13565-905 - So Carlos - SP - Brasil.

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Material e mtodos Material Soro de leite obtido em laboratrio. Mtodos Obteno do soro doce de leite Na preparao do soro no laboratrio foi utilizado 0,6% v/v de renina animal, seguido da adio de 0,3% de soluo de CaCl2 0,5M a 35C. Aps uma hora, os slidos foram separados atravs de filtrao simples com gaze. O soro resultante foi dialisado por 12 horas em membrana celulsica Trip-Fort (Hoechst) contra gua destilada e filtrado em caulim (20g/L). Determinao da concentrao de protena e lactose A concentrao de protena foi determinada pelo mtodo de Lowry modificado por Hartree.9 A protena soroalbumina bovina (BSA) foi utilizada na obteno da curva padro. O mtodo de Miller15 foi utilizado para determinar a quantidade de acar redutor (lactose) no soro. Separao das protenas por coluna de DEAE-Trisacryl O soro de leite dialisado e filtrado foi fracionado utilizandose uma coluna DEAE-Trisacryl (Sigma) medindo 1,4 x 24 cm previamente equilibrada utilizandose tampo fosfato de sdio 5 mM pH 6,8. A eluio foi realizada com fluxo de 27 mL/h, com fraes de 2,2 mL coletadas em coletor FRAC-200 (Amersham Biosciences), combinando-se gradientes do mesmo tampo de 5 a 200 mM, NaCl de 0 a 100mM e de pH 6,8 a pH 5,6. A concentrao protica das fraes foi determinada pela absorbncia a 280nm em espectrofotmetro Ultrospec 1000 (Amersham Biosciences). Anlise de protenas por SDS-PAGE O acompanhamento da separao das protenas foi realizado por SDS-PAGE em gel 12%, de acordo com Laemmli13, e corado com Coomassie Brilliant Blue G Colloidal (Sigma). A massa molecular aparente foi determinada utilizando-se um kit Amersham Biosciences composto por fosforilase b (97 kDa), BSA (66 kDa),

ovoalbumina (45 kDa), anidrase carbnica (31 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa) e -La (14,4 kDa). Purificao de protena atravs de coluna de gel Sephadex G-25 Aps a separao das protenas e observao da eletroforese correspondente, a frao contendo lactoglobulina (frao V) foi submetida cromatografia de excluso molecular em uma coluna de Sephadex G-25 medindo 2 x 73 cm. A essa coluna foram aplicados 2 mL da amostra inicialmente separada pela coluna de DEAETrisacryl. O fluxo foi de 30mL/h a 24C. Fraes de 2,2mL foram coletadas e analisadas atravs de PAGE. A eluio das protenas foi analisada em 280nm. Anlise de protenas por PAGE A PAGE foi realizada de acordo com o procedimento descrito por Davis4 em pH 8.9 utilizando-se gel a 9%, tampo Tris-HCL e corrente de 2mA por tubo (0,5 x 8 cm). As protenas de soro de leite foram aplicadas em volume de 50 L, com concentrao de 74 g de protena, respectivamente. Para a protena purificada o volume foi de 25 L. O indicador de corrida empregado foi o azul de bromofenol. Aps a eletroforese, os gis foram corados com Coomassie Blue R 250 Sigma (mtodo modificado por Bautista3).

Resultados e discusso Caracterizao do soro As quantidades de lactose e protena do soro preparado em laboratrio foram comparadas com a literatura, e os resultados obtidos esto apresentados na Tabela 2. As diferenas observadas nas dosagens realizadas de protena podem ser explicadas pelo fato de a lactose atuar como interferente no mtodo utilizado. Aps a realizao da dilise e filtrao os valores encontrados de protena se aproximaram da literatura. A concentrao de protena determinada est um pouco acima dos valores citados em literatura, provavelmente devido presena de fragmentos de casena provenientes da hidrlise da casena . A filtrao em caulim mostrou-se eficiente na remoo destes fragmentos e possveis micelas de casena no hidrolisadas. Aps este procedimento, os valores obtidos foram mais prximos aos reportados por Morr & Ha.16

Tabela 2 - Concentraes de lactose e protenas determinadas em soro de leite.

Condies Soro produzido em laboratrio* Soro produzido em laboratrio dialisado* Soro produzido em laboratrio dialisado e filtrado em caulim* Morr e Ha16
*os resultados so expressos em mdias de triplicatas.

Lactose (g/L) 36,80 0,60 1,83 0,04 1,11 0,03 46,00

Protena (g/L) 14,71 0,35 6,99 0,08 6,18 0,04 6,15

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Separao das protenas do soro Os resultados obtidos pela cromatografia, em que foi utilizada a conjuno de fora inica e pH no mesmo gradiente, so observados na Figura 1. O perfil das protenas eludas mostrado na Figura 2. Na frao I a protena predominante a BSA mas, tambm podemos encontrar, em menor quantidade, a protena -lactoglobulina. Nas fraes II e III temos presentes a BSA, -lactoglobulina e -lactoalbumina sendo que, na frao III a protena lactoglobulina est quase ausente e a quantidade de lactoalbumina um pouco menor que na frao II. Na frao IV temos quase somente a -lactoglobulina porm, ainda encontramos pequena quantidade de BSA. J na frao V encontramos somente a -lactoglobulina. A frao VI no apresenta quantidades significantes de nenhuma protena. A separao da -La e BSA pela cromatografia de excluso molecular pode ser facilmente realizada, mantendo-se, deste modo, as propriedades nativas destas protenas. Outras protenas no identificadas presentes na amostra foram eludas na frao I, II e III. James & Stanworth11 estudaram o fracionamento de protenas sricas humanas por DEAESephacel e obtiveram resultados similares.
5.4 5.6 5.8
2.0 3.0

O procedimento inicial proposto (coluna de separao por DEAE- Trisacryl) de um modo geral obteve uma boa separao das protenas do soro. No foram necessrios tratamentos especiais para alcanar este grau de eficincia. A filtrao em Sephadex G-25 da frao V (Figura 3), realizada aps o procedimento de separao, tambm foi satisfatria para a purificao at homogeneidade da protena lactoglobulina, conforme mostra a Figura 4. Alomirah & Alli2 tambm separaram a -Lg e a -La; porm, a metodologia utilizada se mostrou bem mais complexa do que a proposta neste trabalho. Mat & Krochta 14 tambm desenvolveram um mtodo de separao da -lactoglobulina em larga escala; entretanto, foi utilizado um isolado protico comercial e no soro in natura, como neste trabalho.
1.4 1.2 1.0

A 280 nm

0.8 0.6 0.4

II

200

100

2.5

IV

Tampo fosfato de sdio (mM)

160

80

0.2
60

pH

6.0 6.2 6.4 6.6 6.8

V
1.5

120

NaCl (mM)

A 280 nm

0.0 0 10 20 30 40 50 60

I
1.0 III

80

40

Fraes
FIGURA 3 - Cromatografia de excluso molecular em Sephadex G-25 (2 x 73 cm) da frao V obtida da coluna de DEAE-Trisacryl. ( ) Absorbncia em 280nm.

0.5

40

VI
0 0 20 40 60 80 100 120

20

0.0

Fraes

FIGURA 1 - Perfil de eluio das protenas do soro: coluna de 1,4 x 23 cm empacotada com DEAE-Trisacryl. ( ) Absorbncia a 280nm; ( - ) gradiente de pH, NaCl e tampo.

A
Imunoglobulinas

97 kDa 66 kDa 45 kDa

Soro Albumina Bovina -lactoalbumina -lactoglobulina (fraes A e B)

31 kDa

FIGURA 4 - PAGE 9% pH 8,9 de soro de leite (A) e da frao obtida da coluna de Sephadex G-25 (B). Concluses A cromatografia em DEAE-Trisacryl permitiu a purificao parcial das protenas do soro do leite e, aps filtrao em Sephadex G-25, a purificao at homogeneidade da -lactoglobulina. As fraes no

20,1 kDa A B C D E F G

FIGURA 2 - SDS-PAGE das fraes eludas da coluna cromatogrfica de DEAE-Trisacryl. (A) Marcadores de massa molecular; (B) Frao I; (C) Frao II; (D) Frao III; (E) Frao IV; (F) Frao V; (G) Frao VI.

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totalmente puras podero ser purificadas por procedimentos cromatogrficos adicionais como o realizado neste trabalho para a purificao de -lactoglobulina. O mtodo desenvolvido permite a separao das protenas nas suas formas nativas, as quais podero ser utilizadas em estudos nutricionais bem como em kits para determinao de massas moleculares em experimentos de bioqumica em laboratrios.

Agradecimentos Agradecemos Francisco Carlos Rocatelli pelo suporte tcnico.

MARQUES, D.P.; CUSTDIO, M.F.; GOULART, A.J.; GIORDANO, R.C.; GIORDANO, R.L.C.; MONTI, R. Whey proteins separation by DEAE-Trisacryl. Alim. Nutr., Araraquara, v. 16, n.1 , p. 17-20, jan./mar. 2005. ABSTRACT: Cheese whey, by-product from dairy industry that contains many proteins, has been discard without any treatment in rivers promoting many environmental impact. Aiming contribute to decrease the environmental pollution, the present work focuses on the development of a simple and mild procedure to fractionate the whey proteins so they can be used in the production of diets, juices, ice cream, sporting supplement and other products. Sweet whey dialyzed and filtrate in Kaolin had the protein (6.67 0.04 g/L) and lactose (44.90 0.02 g/L) concentrations were determined. A column packed with DEAE-Trisacryl used to separate the proteins, combining gradient of ionic strength and pH in the elution, allowed the partial separation of bovine soroalbumin, -lactoglobulin and -lactalbumin. The results showed that the procedure proposed is an excellent separation method, and special treatments were not necessary to obtain this efficiency degree. After the separation, -lactoglobulina was purified to homogeneity through molecular exclusion chromatography in a column of Sephadex G-25. KEYWORDS: Cheese whey proteins; gel filtration; ion exchange chromatography; protein separation.

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