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Cultivo de larvas en ratones para la obtencin de antgeno

Cultivo de larvas de Taenia crassiceps en ratones BALB/c para la obtencin de antgeno para inmunodiagnstico SP Agudelo L1, LE. Botero P1,2, JG Restrepo S1 y JF Florez2,3 Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinales - GIEPI1 Corporacin de Ciencias Bsicas Biomdicas2 Departamento de Educacin Mdica Grupo Informtica Mdica3 Universidad de Antioquia Correspondencia: SP Agudelo L. GIEPI, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia. Carrera 51 D No. 62 – 29. Tel.: 57 4 219 60 55 e-mail: pilaragudelo@yahoo.com ResumenLos antgenos de cisticercos de Taenia solium (T. so) tienen una impresionante homologa con los antgenos de Taenia crassiceps (T.cra), ventaja que posibilita el uso de estos como un substituto de los cisticercos de T.so, ya que son reconocidos de forma cruzada por los anticuerpos de los pacientes con cisticercosis Adicionalmente se presentan escasas infecciones en humanos por T.cra, y la obtencin de grandes cantidades de cisticercos de T.cra resulta econmica y simple a travs de un modelo experimental de infeccin en ratones. En este reporte, 97 ratones hembras BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad con un promedio de peso corporal de 21 g fueron inoculadas dentro de la cavidad peritoneal con 8 a 10 cisticercos T.cra de la cepa ORF. Posterior a la infeccin, se mantuvieron en el bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia, asegurando la disponibilidad de agua y alimento con periodos de luz y obscuridad de 12 horas cada uno. Los animales se pesaron dos veces por semana y se evaluaron las condiciones fsicas y comportamentales durante la infeccin. Despus de la inoculacin de los cisticercos el tiempo promedio para alcanzar el desarrollo de la infeccin fue de 40 das. Durante este tiempo el peso corporal tuvo una ganancia que representa un incremento del 44% comparado con el peso inicial del ratn. La tasa de infeccin estuvo entre el 66% y el 100%. Al finalizar la infeccin y aplicar la eutanasia fue posible recuperar un promedio de 482 cisticercos por animal. Durante el tiempo que demor el desarrollo de la infeccin las condiciones fisiolgicas de los animales no se vieron alteradas, logrando establecer, de esta forma, en nuestro laboratorio el cultivo de cisticercos de T cra y una fuente alternativa de antgeno para el inmunodiagnstico de la cisticercosis tanto humana como porcina. Palabras Claves: Taenia crassiceps, Cisticercos, Taenia solium, BALB/c, cisticercosis. INTRODUCCINLa alta prevalencia de la cisticercosis humana y porcina como una enfermedad grave y frecuente en pases en desarrollo tiene elevados requerimientos de antgenos de Taenia solium (T. so) tanto para el diagnstico de la enfermedad como para la investigacin. La preparacin de extractos antignicos adecuados en cantidades suficientes para el diagnstico de la cisticercosis est aun ligado a la obtencin de cerdos naturalmente infectados con cisticercos de T.so, los cuales usualmente se encuentran en condiciones clandestinas haciendo difcil de localizarlos, interfiriendo en la produccin de antgeno a gran escala y requiriendo de procedimientos especiales para la purificacin especfica de antgeno. De otro lado, antgenos sintticos de T.so no estn disponibles en pases en desarrollo por sus altos costos, no financiados por entes gubernamentales (1, 2) Taenia crassiceps (T.cra) (Zeder, 1800; Rudolphi, 1810) es un cstodo cuya forma adulta se encuentra en el intestino de zorros rojos (Vulpes vulpes) de Europa y de Norte Amrica. El estado larvario, cisticercus longicollis (Rudolphi, 1819), se desarrolla en pequeos roedores, los cuales adquieren la infeccin por la ingestin de los huevos que se encuentran en las heces de los zorros rojos. En los roedores, los cisticercos pueden multiplicarse asexualmente produciendo gemas en su polo abscolex (3). Posteriormente, el zorro rojo caza y come un roedor pequeo con lo que adquiere los cisticercos y desarrolla la forma adulta de la Taenia en su intestino y comienza a expulsar los huevos en las heces. Varias cepas de T. cra han sido aisladas y mantenidas bajo condiciones de laboratorio (3-5), y la cepa ORF ha sido una de las mas ampliamente utilizadas debido a su capacidad para multiplicarse rpidamente en la cavidad peritoneal del ratn (3, 6). La reactividad antignica cruzada entre cisticercos de T. so y T. cra (7) ha permitido el uso de antgenos de T. cra para la deteccin de anticuerpos en muestras de lquido cefalorraqudeo y suero provenientes de humanos y de muestras de suero de cerdos con cisticercosis por T. so (1, 2, 8-18). Las principales ventajas del cultivo in vivo de cisticercos de Taenia crassiceps en ratones BALB/C como una fuente de antgenos para el inmunodiagnstico de la cisticercosis son:

- El modelo experimental murino se convierte en una fuente de cisticercos de T. cra, evitando el requerimiento de
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cerdos infectados con T.so. - El costo de la produccin del antgeno es mnimo puesto que los cisticercos de T. cra pueden crecer y permanecer por largo tiempo en ratones de laboratorio (16). - La posibilidad de mantener y controlar condiciones estndar para la obtencin y procesamiento de los antgenos, asegura la estabilidad y reproducibilidad de las pruebas donde aquellos antgenos podran ser utilizados (19). Nuestro objetivo es establecer las condiciones ptimas y mantener un modelo animal para obtener cisticercos de T.cra como fuente de antgeno sustituto de T.so para el inmunodiagnstico de la cisticercosis en pacientes humanos y en cerdos infectados de nuestro pas (Colombia). METODOLOGA Ratones: Todos los ratones fueron obtenidos del bioterio de la Sede de Investigaciones Universitaria de la Universidad de Antioquia (Medelln, Colombia). Para cada repique, se utilizaron grupos de 12 ratones hembras BALB/c, entre 6 a 8 semanas de edad. El promedio del peso corporal de los animales fue de 21.29 g. Todos los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo las recomendaciones del Comit de tica para el Cuidado y el Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Antioquia y acorde con las Leyes Colombianas en Experimentacin Animal. Mantenimiento: Grupos de 4 ratones marcados individualmente se mantuvieron en cajas plsticas de 30*25*15 cm. Los ratones fueron marcados tiendo sus orejas con acido pcrico y asignando un cdigo de acuerdo al nmero de la caja y nmero de experimento. Las camas fueron hechas de viruta previamente esterilizado. La temperatura promedio a la cual se mantuvieron los animales fue de 24C, con una humedad relativa del 71% y con ciclos naturales de luz de aproximadamente 12 horas. La alimentacin (Rodentina ) y agua fueron ofrecidos at libitum. Parsitos e infeccin: La infeccin experimental en los ratones se logr mediante la inoculacin de 8 a 10 cisticercos pequeos no gemantes de la cepa ORF de T. cra en la cavidad peritoneal del ratn utilizando una jeringa tuberculina (Rymco) con una aguja 18G x 1” – 25 x 1,2 mm (Nymco). Los cisticercos del inculo estaban resuspendidos en 0.3 ml – 0.4mL de solucin fosfato salino tamponado al 1% (PBS) (BioWhittaker), pH de 7.2 y con adicin de antibiticos (gentamicina 40μg/mL, Sigma G 1272). La cepa ORF de T.cra fue gentilmente donada por Dr Adelaide J. Vaz, laboratorio de Inmunologa Clnica, Facultad de Ciencias Farmacuticas, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, Brasil. Valoracin de los ratones: Los ratones fueron monitoreados diariamente en cuanto a su condicin de salud general y de comportamiento. Dos veces por semana se determin el peso corporal usando una balanza Ohaus Navigator (Mod. 4210), su temperatura utilizando una termometro rectal HH-25KF Thermometer ΩE (Omega Engineering, Inc.) y las condiciones fsicas generales. Determinacin del Punto Final: Cuando los ratones hembras adquiran la apariencia fsica del final de la gestacin, se determinaba el punto final, es decir, se seleccionaban para someterlas a vapores anestsicos, eutanasia por dislocacin cervical y posteriormente la extraccin de los cisticercos mediante lavado de cavidad peritoneal. Obtencin y seleccin de los cisticercos de T.cra: Para la extraccin de los cisticercos, los procedimientos de lavado de cavidad peritoneal se realizaron en cmara de bioseguridad. As, una vez cada animal fue sometido a eutanasia, se impregn todo el pelaje con una solucin antisptica de alcohol al 70%, luego fue fijado a una tabla de diseccin y se inyectaron 3 mL de PBS estril dentro de la cavidad peritoneal. A continuacin se hizo una incisin de 0.5 cm en la pared abdominal y se extrajeron los cisticercos, succionando varias veces y depositando el material recolectado en tubos Falcon estriles. Una vez recolectados los cisticercos, se evaluaron macroscpicamente los rganos del ratn para determinar si haba alguna clase de dao atribuible al desarrollo de los cisticercos. Estudios histopatolgicos no se realizaron en ninguno de los experimentos. Los cisticercos fueron lavados tres veces con PBS estril con antibiticos, luego fueron depositados en una caja de Petri para seleccionarlos de acuerdo a su aspecto macroscpico como densos (mayor densidad y opacidad ptica) o como viables (mayor brillantez y transparencia), haciendo un conteo final del total de cisticercos viables y determinando su peso neto (sin PBS). Finalmente, dos lavados adicionales fueron realizados antes de ser inoculados nuevamente o de obtener extracto antignico. Anlisis Estadstico: La informacin recolectada fue procesada utilizando Graph Pad Software, Versin 4.00, y Microsoft Excel 2003. El anlisis estadstico que se realiz fue para un estudio de tipo descriptivo. RESULTADOS xito de la Inoculacin: La cepa ORF de T cra fue inicialmente inoculada en trece ratones hembras BALB/c. Slo el 30% de los ratones inoculados fueron exitosamente infectados (Tabla 1). Despus de la inoculacin inicial, 9 repiques ms fueron realizados, incluyendo para esto 97 ratones hembras BALB/c, de los cuales 77 fueron exitosamente infectados. Posteriormente, el xito en la inoculacin fue establecido desde un 66.67% hasta 100% con una produccin estable de cisticercos bajo condiciones controladas de crecimiento.
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Ganancia de peso de los ratones infectados: El promedio de la ganancia de peso de cada ratn fue de 9.11g +3.48 (d.s.), lo cual corresponde al 44% del peso inicial corporal. Del total del peso ganado, el 65% pudo justificarse por los cisticercos cultivados en la cavidad abdominal de los ratones (Fig.1). Mortalidad de la Infeccin con T.cra: Ocho (8.25%) de los 97 ratones infectados, murieron durante el desarrollo de los experimentos. De los ocho, slo a 4 se les realiz estudio postmortem en el cual se demostr intususcepcin para los animales analizados. Ninguno de ellos revel infeccin con los cisticercos al momento de la muerte. Tiempo requerido para la obtencin de cisticercos: El tiempo promedio de la infeccin fue de 40.71 das despus de la inoculacin intraperitoneal. Durante este tiempo se obtuvo un nmero significativo de cisticercos (Fig.1), sin poner en riesgo las condiciones de vida de los ratones. Sin embargo, al da 28 despus de la inoculacin, los cisticercos ya haban iniciado su proceso de gemacin en la cavidad abdominal de los ratones inoculados. Cantidad de Cisticercos por cosecha: El recuento promedio de los cisticercos obtenidos se encuentra descrito en la Tabla 2. Observe que el nmero de cisticercos obtenidos oscila entre 85 y 1447 cisticercos por ratn con un promedio total de 482 cisticercos obtenidos de la cavidad abdominal. Efecto de la infeccin con los cisticercos en la temperatura corporal de los ratones: Adems de nuestro objetivo inicial, nosotros decidimos considerar si la temperatura de los ratones estuvo afectada por la infeccin por T cra. Para sto, determinamos la temperatura de cada ratn va rectal dos veces por semana, al mismo tiempo que el peso corporal fuera determinado. La determinacin de la temperatura se realiz en los grupos de los ratones del tercer al octavo repique. La temperatura de los ratones estuvo entre el rango normal (36.5 a 38.0C). Sin embargo, algunos de los ratones presentaron temperaturas por debajo (35.6C) o por encima (38.8C) del rango normal. La temperatura promedio para todos los grupos fue de 37.49C. No se encontraron diferencias significativas entre infectados y no infectados (Informacin no mostrada). DISCUSIN

Este es uno de los pocos reportes que describe en detalle el cultivo in vivo de Taenia cassiceps en ratones BALB/c, despus del trabajo publicado por Reino S. Freeman en 1962 (3). De ah que nuestro objetivo fue establecer las condiciones para un modelo animal como fuente de antgeno sustituto de T.so para el diagnstico de la cisticercosis. De acuerdo con lo reportado por Freeman (3) los primeros resultados de la infeccin experimental con T.cra fueron reportados por Braun, M. en 1896 y por Studer, M. y Baer, J.G. en 1949. Freeman encontr que la especie de ratn y el sexo interferan en el desarrollo de la infeccin con cisticercos de T. cra (3). En su reporte, l hizo ensayos inoculando varias especies de animales encontrando que en hamsters, los cisticercos de T. cra permanecan vivos por ms de 65 das sin reproducirse, y en cerdos ellos sobrevivieron entre 14 y 21 das despus de la inoculacin. En conejos y guinea pigs los cisticercos sufrieron degeneracin. En cambio, los cisticercos sobrevivieron y se multiplicaron en los ratones, siendo as usados para experimentos posteriores (3). Existen reportes que evidencian que la respuesta inmune del hospedero frente al parsito es influenciada por el genotipo del hospedero (20). As, el desarrollo de T.cra se ve favorecido en ratones de la cepa BALB/c y especialmente en ratones de la subespecie BALB/cAnN, pero por el contrario la cepa de ratones C57BL/6J no permite el desarrollo de los cisticercos (3, 21). El sexo del hospedero tambin es un factor importante, puesto que el primer reporte mostr que las hembras ms tolerantes a la infeccin que los machos y esta mayor susceptibilidad parece estar asociada con altos niveles de estrgenos circulantes (6, 22, 23). Un interesante hallazgo fue que la infeccin crnica con cisticercos de T.cra en ratones machos hizo que ellos perdieran su tpica capacidad reproductiva masculina. Los efectos en el sistema reproductivo masculino incluyeron una marcada dilatacin y una fibrosis circundante de los testculos y vesculas seminales. En los testculos se observ adicionalmente disminucin en los espermatozoides. Los machos sufrieron un proceso de feminizacin que se caracteriz por la elevacin de los niveles sricos de 17 - b estradiol en ms de 200 veces por encima de los valores normales en el suero y adems por la disminucin de los niveles de la testosterona alrededor del 90% por debajo de lo normal (24). Otro aspecto importante fue determinar la va de inoculacin mas apropiada. De la misma manera, Freeman llev a cabo estudios en los cuales determin que despus de la inoculacin, la recuperacin de cisticercos vivos tuvo un mayor rendimiento, es decir, se recuper un nmero mayor de cisticercos utilizando la inoculacin intraperitoneal (75%) comparado con otras rutas como la subcutnea (55%) o la intrapleural (15%) (3). Basados en los hallazgos descritos y en la experiencia de otros investigadores (1, 2, 8-18, 25), nosotros decidimos utilizar ratones hembras de la especie BALB/c para inocularles cisticercos de T. cra en la cavidad intraperitoneal. En nuestro estudio, la tasa de xito de la infeccin fue tan alta del 66.67% despus de una nica inoculacin intraperitoneal con 8 a 10 cisticercos pequeos no gemantes, comparado con el 42.4% obtenido por Freeman utilizando
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la ruta oral para ratones de la misma edad (6 a 8 semanas). Aunque Freeman tambin explor y report la ruta intraperitoneal, el enfatiz en la ruta oral para la infeccin y la tasa de reproduccin de los cisticercos. Adicionalmente, es bueno resaltar que l utiliz un solo huevo para inocular los ratones en sus experimentos puesto que su objetivo estaba orientado a conocer la biologa del parsito, mientras que nosotros utilizamos la va intraperitoneal utilizando aproximadamente 10 cisticercos para las inoculaciones puesto que necesitbamos una fuente de antgeno apropiada (3) Nosotros evaluamos el efecto de la infeccin en la supervivencia de los ratones. Slo el 8.25% de los ratones inoculados murieron y no se encontr correlacin con la infeccin con los cisticercos al momento de la necropsia. As mismo, despus de cultivar in vivo los cisticercos y realizar la eutanasia para recolectar los cisticercos, el examen macroscpico no mostr compromiso de ningn rgano, indicando no asociacin con la infeccin. En este reporte, nosotros cosechamos cisticercos a los 40.71 das despus de la inoculacin. Los cisticercos de T.cra se multiplicaron rpidamente en la cavidad peritoneal de ratones susceptibles. Los ratones inoculados tuvieron una ganancia de peso de cerca del 20% del peso inicial durante 28 das postinoculacin. Despus de sto, los ratones que se haban infectado exitosamente incrementaron notoriamente su peso corporal hasta en un 44% del peso inicial, coincidiendo con el momento en que los cisticercos ya se han establecido completamente y habian iniciado su proceso de gemacin exponencial confiriendo al ratn hembra el aspecto fsico del final de la gestacin. Cerca del 65% de la ganancia del peso corporal se pudo justificar por la cosecha de los cisticercos; el resto de la ganancia se debi al crecimiento y desarrollo normal del animal. Estos hallazgos difieren de los de Freeman en 1962 (3), puesto que en su investigacin los cisticercos fueron cosechados desde el da 50 hasta los 553 das, cuando los ratones infectados tuvieron el mencionado aspecto fsico del final de la gestacin; pero su propsito fue evaluar el desarrollo de la infeccin como ya lo habamos mencionado. Adicionalmente en ese reporte, Freeman describe cmo se ven afectadas las funciones fisiolgicas del ratn infectado, situacin que nosotros no permitimos en ningn momento durante el desarrollo de los ensayos, puesto que as como otros autores nuestro inters era establecer la fuente de antgenos para inmunodiagnstico (1, 2, 7-17, 19, 26). La tasa de reproduccin de los cisticercos se incrementa con la edad de los mismos, as podemos decir que en infecciones recientes los cisticercos producen menor cantidad de gemas, mientras que en las infecciones crnica hay una mayor tasa de gemacin. De esta forma la mayora de los ratones infectados va inoculacin intraperitoneal por un perodo mayor de 300 das, alcanzaban a perder su abdomen al punto de tener el aspecto del final de la gestacin. De los estudios llevados a cabo por Freeman en 1962, se encontr que un ratn infectado en su cavidad abdominal haba vivido 553 das despus de la inoculacin y haba desarrollado un total de 4412 cisticercos (3). Los nmero de cisticercos recuperados en nuestro trabajo, tuvo un promedio de 482, en un rango desde 85 hasta 1447 (Table N2). Contrario a los estudios de Freeman, nosotros solo permitimos el desarrollo de la infeccin hasta alrededor de los 40 das para evitar las disfunciones fisiolgicas de los animales o hasta que el aspecto del final de la gestacin fuera alcanzado por los ratones hembras inoculados. La variabilidad en la cantidad de cisticercos obtenido de cada ratn se pudo explicar por el tamao de los cisticercos que variaban entre un milimetro y hasta un centmetro de dimetro mayor. Interesantemente observamos que al incrementar el tiempo de infeccin despus de la inoculacin mas all de las 6 semanas, los cisticercos incrementan el nmero de gemas y la cantidad de aquellos que se clasifican como densos, no siendo este tipo de cisticercos ptimo para el antgeno o para repiques. De acuerdo con nuestras observaciones, podemos concluir que los ratones que desarrollan de manera ptima la infeccin con cisticercos de T.cra deben tener una edad entre las 6 y las 8 semanas; la inoculacin intraperitoneal debe realizarse con 8 a 10 cisticercos pequeos no gemantes en un volumen de 0.3 – 0.4 mL de PBS estril. Luego de la inoculacin, el momento ideal para obtener el antgeno es alrededor de 6 semanas (40 das) postinfeccin cuando los ratones han alcanzado un incremento del peso corporal de 44% con relacin al peso previo a la inoculacin y se refleja con el aspecto fsico del estado final de la gestacin, sin afectar las funciones fisiolgicas de los ratones de laboratorio. Adicionalmente, cuando los cisticercos obtenidos tuvieron un tamao ms grande (mayor de 1 cm), fue posible obtener mayor volumen de fluido vesicular con mayor cantidad de protena, en promedio 2 mg de protena/ml (datos no mostrados). Las condiciones experimentales controladas ac evaluadas y estandarizadas permite la generacin de grandes cantidades de cisticercos bajo parmetros homogneos y a un bajo costo, como alternativa de fuente de antgeno para el diagnstico de las cisticercosis, para diferentes objetivos de investigacin y para laboratorios de diagnstico. Agradecimientos

Al CODI (Comit para el Desarrollo de la Investigacin), Universidad de Antioquia, por el soporte financiero, al personal del Bioterio de la SIU, Universidad de Antioquia, por proporcionarnos los animales de experimentacin y facilitarnos las condiciones de mantenimiento de los animales para el desarrollo de la investigacin. Tabla No 1. Porcentaje de xito de inoculacin. En la primera inoculacin de la cepa ORF de T cra, slo el 30,76% de los
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ratones inoculados lograron desarrollar la infeccin (Valor no mostrado en la tabla). Del repique N1 hasta el N9 se tuvieron en cuenta para determinar los valores promedios de la media, el mnimo y el mximo, as como la desviacin estndar. Min: mnimo, Max: Mximo, Std: Desviacin estandar. Tabla N2. Recuento promedio de cisticercos en cada repique. La inoculacin inicial de la cepa ORF no fue incluida en los clculos matemticas para la media. Los promedios totales no incluyen la informacin de la primera inoculacin. Fig 1. Variacin a travs del tiempo del peso corporal de los ratones inoculados. En la grfica se muestra el repique N9. Diez de los doce ratones hembras inoculados desarrollaron la infeccin. Cada lnea representa el peso ganado a travs del tiempo. El peso promedio final en este repique fue de 31.52 +2.91 (DS) con un promedio de ganancia de peso de 12.87+2.41 g el cual se alcanz en 44.7+6.13 dias. J29-SM y J29-AO no desarrollaron la infeccin.

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