Manual de Procedimientos "Diagnóstico y Caracterización de Escherichia Coli O157 Productor de Toxina Shiga"

Manual de Procedimientos
Diagnóstico y caracterización de
Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga
a partir de especimenes clínicos
2007
AUTORES
Marta Rivas
Elizabeth Miliwebsky
Natalia Deza
Departamento Bacteriología
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”
Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv
para América del Sur
Manual de Procedimientos “Diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga”
INDICE
CAPITULO I - INTRODUCCION
1.- Antecedentes 1
1.1.- Marcadores de virulencia 1
1.2.- Patogénesis 6
1.3.- Evolución de Escherichia coli O157:H7 8
1.4.- Manifestaciones clínicas 9
1.5.- Reservorios y vías de transmisión 11
1.6.- Tratamiento 13
1.7.- Epidemiología 14
1.8.- Situación actual del SUH en Argentina 18
1.9.- Prevención 19
CAPITULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE Escherichia coli O157

1.- Especimenes 21
2.-Procesamiento 21
2.1.A.-Aislamiento 21
2.1.B.-Aislamiento con separación inmunomagnética 24
2.2.-Métodos inmunocromatográficos 27
2.3.- Serotipificación 28
2.3.1- Detección del antígeno 0 28
A) Aglutinación en lámina con antisuero policlonal a-O157 28
B) Aglutinación con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos a-O157 31
2.3.2- Detección del antígeno flagelar H 32
A) Prueba y estimulación de la movilidad 33
B) Identificación del antígeno H: Aglutinación en tubo 34
C) Identificación del antígeno H7: Aglutinación en lámina 36
2.4- Caracterización de cepas hemolíticas 36
2.5- Identificación Bioquímica 39
2.5.1- Fundamento y procedimientos para pruebas bioquímicas 40
a) Agar hierro tres azúcares (TSI) 40
b) Utilización de Citrato 40
c) Sulfuro, indol, movilidad (SIM) 41
d) Movilidad, indol, ornitina (MIO) 42
e) Fermentación de hidratos de carbono (Medio Rojo Fenol) 43
f) Actividad β-glucuronidasa 43
g) Lisina, Hierro, Agar (LIA) 44
h) Producción de pigmento amarillo 45
2.6- Biotipificación de E. coli O157:H7 45
2.7- Sensibilidad a los antimicrobianos 46
CAPITULO II - APENDICE
Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 con

tamizaje por PCR multiplex 49
Algoritmo para el diagnostico y caracterizacion de Escherichia coli O157 50
FIGURA 1: Esquema de detección de Escherichia coli O157:H7/NM 51
FIGURA 2: Aglutinación con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos a-O157 52
FIGURA 3: Prueba y estimulación de la movilidad bacteriana 53
3A- Siembra del primer pasaje 53

3B- Lectura de la movilidad a las 18 – 24 h 54
3C- Siembra de pasajes sucesivos 55
FIGURA 4: Prueba de la Enterohemolisina (EHEC-Hly) 56
FIGURA 5: Pruebas Bioquímicas de E. coli 57
FIGURA 6: Actividad de β-glucuronidasa y Biotipificación de E. coli O157 58
PROTOCOLO: Caracterización de Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga 59
TABLA 2A: Interpretación de resultados de antibiogramas según NCCLS 60
TABLA 3: Interpretación de resultados de antibiogramas según NCCLS 66
CAPITULO III - DETECCION DE FACTORES DE VIRULENCIA
1.- Detección genotípica de los factores de virulencia por la técnica de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) 68
A) Preparación de la muestra 69
B) Preparación de la mezcla de reacción 70
C) Carga de los templados y amplificación 72
D) Detección del producto de amplificación 72
1.1.- PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157 75
1.1.1.-Protocolo PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157 76
1.2.- PCR factor eae 78
1.2.1-Protocolo PCR factor eae 79
1.3.- PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA) 81
1.3.1-Protocolo PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA) 82
1.4.- PCR antígeno flagelar h7 84
1.4.1-Protocolo PCR antígeno flagelar h7 85
CAPITULO III - APENDICE
1.- Buffer PCR 10X 87

2.- Cl2Mg 25 ó 50 mM 87
3.- Nucleótidos trifosfatos 87
4.- Primers 87
5.- Buffer Tris-EDTA (TE) 88
6.- Buffer Tris-Acetato EDTA (TAE) 88
7.- Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X. 88
8.- Buffer de siembra 1 88
9.- Buffer de siembra 2 88
10.- BrEt (10mg/ml) 88
CAPITULO IV - TECNICAS DIAGNOSTICAS EN CELULAS VERO
1.- Detección de Stx en células Vero 89

1.1.- Obtención de la muestra 89
A) Extracción de Stx a partir de aislamientos de Escherichia coli 90
B) Extracción de Stx de Materia Fecal (StxMF) 92
1.2-Ensayo de citotoxicidad 92
A) Tamizaje para la detección de citotoxicidad por Stx de cepas STEC
y por StxMF 93
B) Titulación de la actividad citotóxica por Stx de cepas con tamizaje

positivo 94
1.3. - Ensayo de especificidad para detectar StxMF 95
2.- Detección de Anticuerpos anti-toxina Shiga (a-Stx) 99
CAPITULO V - MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
• Medio de transporte Cary Blair 103

• Agar MacConkey sorbitol (SMAC) 103
• Medio Cromogénico CHROMAgar O157 103
• Medio Cromogénico Agar O157:H7 ID (bioMerieux) 104
• Caldo Tripticasa de soja (CTS) 104
• Caldo Tripticasa de soja con cefixime-telurito (CT-CTS) 104
• Caldo GN, Hajna 105
• Agar Tripticasa de soja (TSA) 105
• Agar para conservación 105
• Solución salina buferada estéril (PBS) 106
• Solución fisiológica 106
• Buffer Tween 20 al 0,05% en buffer PBS 1X estéril 106
• Solución fisiológica formulada 1% V/V 107
• Medio de Craigie 107
• Agar base triptosa con glóbulos rojos lavados (AGRL) y sin lavar (AGRSL) 107
• Medio agar hierro tres azúcares (TSI) 109
• Agar citrato de Simmons 110
• Medio para sulfuro, indol, movilidad (SIM) 110
• Medio para movilidad indol ornitina (MIO) 110
• Solución al 1% del hidrato de carbono en el medio base Rojo Fenol 111
• Caldo Rojo Fenol 111
• Solución del hidrato de carbono (10% P/V) 111
• Lisina Hierro Agar (LIA) 112
• Agar Mueller Hinton (MH) 112
• Caldo Penassay (Antibiotic médium 3 – Difco) 112
REFERENCIAS 114
CAPITULO I – INTRODUCCION
1.- Antecedentes
Desde hace más de dos décadas, Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es
considerado un patógeno emergente transmitido por alimentos asociado a casos esporádicos y brotes de
diarrea, colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH). Escherichia coli O157:H7 es el
prototipo de más de 150 serotipos que comparten el mismo potencial patogénico. Las cepas STEC
asociadas a enfermedades severas en el hombre pertenecen a la categoría de E. coli enterohemorrágico
(EHEC) (Levine, 1987; WHO, 1997).
Si bien E. coli O157:H7 fue el primer serotipo reconocido en 1982 como agente causal de brotes
(Riley et al., 1983), otros serotipos no-O157 como O18, O26, O111 y O128 fueron descriptos en niños
con diarrea y aislados por Konowalchuck en 1977. A partir de esos estudios y durante toda la década del
80, otros serotipos fueron asociados a enfermedad humana incluyendo: O4:H-, O45:H2, O111:H- y
O145:H- en Estados Unidos (Tzipori et al.,1988), O4:H5 y O111:H2 en Australia (Gunzgurg et al. 1988),
O5:H-, O26:H11, O55:H7, O103:H2, O104:H2, O153:H25 y O163:H19 en Inglaterra (Scotland et
al.,1988; Dorn et al., 1989).
Dentro del grupo STEC, E. coli O157:H7 es el serotipo aislado más frecuentemente y es al que se
le atribuye la ocurrencia de la mayoría de los grandes brotes como el de la Costa Oeste de Estados Unidos
en 1993 (Barret et al., 1994) y el de Japón en 1996 (Watanabe et al., 1996). Las cepas STEC no-O157 no
tienen una característica bioquímica que los distinga del resto de los E. coli, a diferencia de lo que ocurre
con O157 que no fermenta el sorbitol y no posee actividad de β-glucuronidasa. Por lo tanto, para su
aislamiento se requiere la aplicación de estrategias más complejas. Si bien la mayoría de los estudios están
orientados a la detección de E. coli O157, en la actualidad han aumentado los esfuerzos para la detección
de los diferentes serotipos de STEC.
1.1.- Marcadores de virulencia
Los serotipos de E. coli definidos como EHEC poseen los siguientes marcadores de virulencia (Paton
et al., 1998):
1. Potentes citotoxinas, llamadas toxinas Shiga (Stx) (Calderwood et al., 1996), que poseen estructura de
subunidades A-B y están codificadas por bacteriófagos insertados en el cromosoma bacteriano. Las
cepas STEC de origen humano, animal o de alimentos pueden producir Stx1, Stx2 o variantes de Stx1
o Stx2, solas o en combinación de dos o más toxinas (Stx1/Stx2, Stx1/Stx2v, Stx1c/Stx2, Stx1c/Stx2d,
1
Stx2/Stx2v) (Strockbine et al., 1986; Friedrich et al., 2003). Las Stxs se clasifican en dos grandes
tipos, Stx1 y Stx2, de acuerdo a la neutralización del efecto citotóxico sobre células Vero o HeLa con
anticuerpos específicos, o por la detección de los genes stx por técnicas de biología molecular como
hibridación con sondas genéticas o por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Paton
et al., 1998). El grupo de las toxinas Stx1 es bastante homogéneo. Hasta el momento se ha
identificado la variente Stx1c asociada fundamentalmente al reservorio ovino (Zhang et al., 2002).
Stx1c también se detectó en combinación con Stx2d en aislamientos de origen clínico de casos menos
severos de diarrea (Beutin et al., 2004). Para Stx2 se han descrito numerosas variantes, entre ellas:
Stx2c (stx2vh-a y stx2vh-b), Stx2e, Stx2d y Stx2f [Tyler et al., 1991; Marques et al., 1987; Piérard et
al., 1998; Schmidt et al., 2000]. Stx2c y Stx2d, fueron identificadas en aislamientos humanos, la
primera de ellas en cepas O157 y no-O157, y la segunda solo en cepas STEC no-O157. Stx2e o SLT-
IIv, primera variante de Stx2 descripta, está asociada a la enfermedad del edema en cerdos, pero
raramente a enfermedad humana. Stx2f fue identificada en aislamientos de STEC de heces de paloma
y resultó ser idéntica a una variante de Stx2e descrita previamente como SLT-IIva, y asociada a un
caso de diarrea humana (Ganon et al., 1990).
Si bien los miembros de la familia de Stx muestran similitud en su estructura y función, cada uno de
los subtipos presenta grandes diferencias en su toxicidad en tejidos celulares y en animales. Stx2 tiene
una actividad citotóxica 100 veces superior a Stx1. Por otro lado, se ha determinado que Stx1 y Stx2
son más citotóxicas en células Vero que las variantes Stx2c y Stx2d no activable. Esto es debido
principalmente a la existencia de diferencias en la secuencia nucleotídica de la subunidad B
responsable de la unión de la toxina al receptor glicolipídico específico, globotriaosilceramida (Gb3).
(Melton et al., 1998)
Recientemente, se han realizado estudios que demuestran que cepas STEC Stx2vh-a son menos
virulentas y causan diarrea sanguinolenta menos frecuentemente que cepas Stx2 o Stx2/Stx2vh-a.
Otros estudios sugieren que individuos infectados con cepas Stx2 presentan un riesgo mayor de
desarrollar SUH (Nishikawa et al., 2000). Por lo tanto, la prevalencia de cepas STEC de determinados
genotipos stx, junto a otros factores de riesgo de evolución a SUH, podrían explicar la alta incidencia
de enfermedad humana y/o la severidad de los casos clínicos que se presentan en ciertas regiones.
2. Plásmido de 60 MDa (pO157) esta presente en todas las cepas de STEC O157:H7. Contiene diversos
genes que codifican para los siguientes factores de virulencia: espP (serina proteasa extracelular), katP
(catalasa-peroxidasa), hlyA (enterohemolisina), etp (sistema de secreción tipo II) y para una fimbria
que podría estar involucrada en la colonización inicial de los enterocitos.
2
En algunos serotipos de STEC no-O157 se ha identificado, un plásmido con una secuencia similar al
pO157. Sin embargo, el rol preciso de los genes codificados en este plásmido aún no ha sido
totalmente dilucidado.
3. Factores de adherencia intestinal
A) Codificados en la región LEE (del inglés locus of enterocyte effacement) del cromosoma, entre
ellos el gen eae que codifica una proteína, intimina, responsable de la unión íntima de la bacteria
al enterocito y la desorganización de las microvellosidades con producción de la lesión AE (del
inglés attaching and effacing). La región LEE codifica además un receptor translocado (Tir) para
la intimina y el sistema de secreción tipo III. Ciertos serotipos de STEC-LEE positivos (O157:H7,
O26:H11, O111:NM y O145:NM) están considerados como altamente virulentos y más
comúnmente asociados a brotes y casos esporádicos de enfermedad severa en humanos (Jenkis et
al.,2003 y Paton et al., 1998). Sin embargo la presencia de la región LEE no sería esencial para la
patogénesis, dado que un gran número de cepas STEC-LEE negativas fueron capaces de causar
enfermedad severa y ocasionalmente brotes (Keskimaki et al., 1997; Paton et al., 1999). Por lo
tanto en estas cepas, otros factores de adherencia adicionales estarían involucrados en la
patogénesis.
B) Codificados fuera de la región LEE. Se han descripto un grupo de adhesinas putativas muy
relacionadas con la adherencia de las cepas STEC al enterocito. Las adhesinas Iha (adherence-
conferring chromosomal gene), (Tarr et al., 2001); Efa1 (EHEC factor for adherence), (Nicholls et
al., 2000); LPFO157/OI- 141; LPFO157/OI-154 y LPFO113/OI-154 (long polar fimbria) (Torres et al., 2002;
Doughty et al., 2002), están codificadas en islas genómicas únicas de E. coli EDL 933. Otras tres
adhesinas tales como Tox B (proteína identificada en pO157) (Tatsuno et al., 2001), Saa (STEC
autoaggutinating adhesin) (Paton et al., 2001) y Sfp (sorbitol-fermenting EHEC O157 fimbriaes)
(Jenkis et al., 2003) están codificadas en el megaplásmido de cepas STEC.
Si bien los diferentes serotipos difieren en su virulencia, la incidencia y la severidad de las infecciones por
STEC no pueden solo atribuirse a los factores de virulencia del patógeno sino que es el resultado de la
interacción de éstos con factores del huésped y el ambiente. La clasificación de los serotipos en cinco
seropatotipos (A-E) (Karmali et al., 2003) fue propuesta con el fin de esclarecer las diferencias en la
virulencia de las cepas STEC. La misma se basa en la incidencia de los serotipos en enfermedad humana y
la asociación con la ocurrencia de brotes y enfermedad severa en el hombre. A pesar de presentar ciertas
limitaciones, esta clasificación permite observar la relación de los diferentes serotipos con perfiles
genéticos característicos de factores de virulencia. (Tablas 1 y 2)
3
Tabla 1. Clasificación de serotipos de STEC en seropatotipos
Seropatotipo Incidencia Frecuencia en la Asociación con Serotipos

relativa ocurrencia de enfermedades
brotes severas
A Alta Común Si O157:H7, O157:NM
B Moderada No común Si O26:H11, O103:H2,

O111:NM, O121:H19,
O145:NM
C Baja Rara Si O91:H21, O104:H21,
O113:H21; otros
D Baja Rara No Variados
E Nula en humanos Nula Nula Variados
Tabla 2. Seropatotipos y perfiles de factores de virulencia
Seropatotipo Serotipo Huesped Factores de virulencia

stx1 stx2 eae hlyA espP KatP
A O157:H7 Humano + + + + + +
O157:NM Humano - + + + + +
B O26:H11 Humano + - + + + +
O103:H2 Humano + - + + + -
O103:H2 Humano + - + + - -
O103:H2 Humano + - + + - +
O111:NM Humano + - + - - -
O111:NM Humano + - + + - -
O121:H19 Humano - + + - + -
O145:NM Humano - + + + + +
O145:NM Humano + + + + + +
O145:NM Humano + - + + + +
4
Tabla 2. Seropatotipos y perfiles de factores de virulencia (Continuación)
Seropatotipo Serotipo Huesped Factores de virulencia

stx1 stx2 eae hlyA espP KatP
C O91:H21 Humano - + - - - -
O91:H21 Humano + + - - - -
O104:H21 Humano - + - + + -
O113:H21 Humano - + - + + -
O113:H21 Humano - + - - + -
O113:H21 Humano + + - - + -
O121:NM Humano + + + + + -
O121:NM Humano - + + + + -
O8:H19 Humano + + - + + -
D O103:H25 Humano + - + + - -
O117:H7 Humano + - - - - -
O119:H25 Humano + - + + + -
O146:H21 Humano + + + + - -
O174:H8 Humano + + - - - -
E O39:H49 Bovino + + - + + -
O46:H38 Bovino + + - + + -
O113:NM Bovino - + - - - -
O136:H12 Bovino + - - + - -
5
1.2.- Patogénesis
STEC alcanza el intestino y se adhiere a la célula intestinal sin invadirla. La adherencia bacteriana
mediada por fimbrias, causa el alargamiento de las microvellosidades, y la intimina induce la unión íntima
de la bacteria al enterocito y la desorganización de las microvellosidades con producción de la lesión AE y
acumulación de filamentos de actina en el citoplasma. Esta reducción de la superficie absortiva causa una
diarrea sin sangre.
Mecanismo de patogenia de Escherichia coli productor de toxina Shiga
STEC
STEC
STEC
6
Mecanismo de patogenia de Escherichia coli productor de toxina Shiga – Lesión AE (Nataro and
Keper, 1998).
La toxina Shiga liberada se une, mediante el pentámero B, a la célula epitelial del intestino por
interacción con el receptor Gb3 que se encuentra en la membrana apical. La toxina es luego internalizada
en una vesícula endocítica y transportada al aparato de Golgi, donde la subunidad A es clivada
proteolíticamente liberando el fragmento A1 el cual actúa sobre la subunidad ribosomal 60S, inhibiendo la
síntesis proteica y provocando la muerte celular.
La toxina puede también ser translocada desde la membrana apical a la superficie basolateral, con
inducción de interleuquina-8 (IL-8), que contribuye a la acumulación de leucocitos en la pared intestinal.
Se produce un daño en las células endoteliales de los vasos sanguíneos provocando una colitis
hemorrágica.
Stx entra a la circulación sanguínea y es transportada, por un mecanismo no dilucidado
totalmente, a distintos órganos blanco cuyas células endoteliales poseen el receptor Gb3. El LPS
bacteriano y las citoquinas del huésped aumentan la sensibilidad a las Stxs incrementando la
disponibilidad de dichos receptores. Niveles altos de Gb3 se encuentran en el riñón, particularmente en la
región cortical, sitio principal de lesión renal en los pacientes con SUH. Las lesiones histopatológicas
principales ocurren por interacción de la Stx con las células endoteliales, las cuales se hinchan y se
7
desprenden a nivel del glomérulo. Simultáneamente se produce un depósito de fibrina y plaquetas en la

microvasculatura renal, oclusión de los capilares y reducción del flujo sanguíneo lo que provoca la
insuficiencia renal y ruptura de los glóbulos rojos. También se observan lesiones trombóticas,
particularmente en la microvasculatura del intestino, cerebro y páncreas.
Mecanismo de patogenia de Escherichia coli productor de toxina Shiga
Lumen intestinal
Toxina Shiga
Células epiteliales
Plaquetas
Células endoteliales
Toxina Shiga
Microvasculatura
Neutrófilos
Acheston et al., 1998.

1.3.- Evolución de Escherichia O157:H7
Escherichia, Salmonella y Shigella, los microorganismos facultativos del tracto intestinal mejor
conocidos, son agentes causales de enfermedad humana. Estudios filogenéticos basados en la
secuenciación de las subunidades 16S y 5S del rRNA indican que Escherichia spp. y Salmonella spp. se
diferenciaron a partir de un ancestro común, hace aproximadamente 120-160 millones de años,
coincidiendo con la aparición de los mamíferos, mientras que Shigella sp se diferenció de E. coli hace 80
millones de años, coincidiendo con la evolución de los primates. Las cepas comensales de E. coli
colonizan el colon, mientras que las cepas patógenas ocupan fundamentalmente nichos extra-colon.
Salmonella spp. parasita reptiles, pájaros y mamíferos, y Shigella spp solo primates.
El ancestro de las bacterias entéricas fue probablemente una cepa de E. coli que tuvo que competir
con mas de 500 especies normales del intestino. La inserción de la isla de patogenicidad LEE en el
cromosoma de la bacteria comensal dio lugar a la aparición del clon de E. coli enteropatógeno (EPEC),
8
fermentador del sorbitol (SOR+) y con actividad de β-glucuronidasa (GUD+). El modelo evolutivo de
Whittman (1998) hipotetiza sobre la aparición de E. coli O157:H7 a partir del ancestro EPEC por
adquisición del gen para la toxina Shiga 2 (Stx2) por transducción, posterior inserción del gen rfbO157 y
adquisición del plásmido EHEC que codifica las hemolisinas, y mas recientemente el gen stx1, con
pérdida de la capacidad de fermentación del sorbitol (SOR-) y la actividad de β-glucuronidasa (GUD-).
Ancestro común Emergencia de Escherichia coli O157:H7

Escherichia (1) Modelo Evolutivo Propuesto
Salmonella (1)
Shigella (2)
Ancestro EPEC con locus LEE

β-glu+ SOR+
unidA -10
A→T
fago
Stx2
O55:H7
β-glu+ SOR+ región
rfb
O55:H7
β-glu + SOR+
fago
Stx2+
Stx1
O157:H7
unidA +92 β-glu+ SOR+
T→G Stx2+
O157:H7
β-glu+ SOR-
Stx2+
E. coli comensal Stx1+ O157:H7
Pérdida
Perdida Fermentación SOR
β -glu- SOR-
motilidad Stx2+
Stx1+
O157:H-
(1) 120 ~ 160 millones de años β-glu+ SOR+
(2) 80 millones de años Stx2+
Whittan et al., 1998.

1.4.- Manifestaciones clínicas
La infección por STEC puede causar casos esporádicos o brotes de diarrea, colitis hemorrágica
(CH) o síndrome urémico hemolítico (SUH) (Remuzzi et al., 1995). Además, puede mimetizar desórdenes
no infecciosos como intususcepción, apendicitis, diverticulosis, colitis isquémica y ulcerativa, como así
también colitis infecciosas causadas por Salmonella, Shigella, Campylobacter, Clostridium difficile,
Yersinia enterocolítica o Entamoeba histolytica (Tarr, 1995).
El cuadro clínico de la infección por STEC incluye un período de 1 a 2 días de vómitos, fiebre
baja o ausente, dolores abdominales severos, diarrea sin sangre y evidencia de edema de la mucosa
colónica como síntomas iniciales, seguidos por diarrea sanguinolenta o colitis hemorrágica durante 4 a 6
días. Aunque en la mayoría de los casos la diarrea por STEC es autolimitada, aproximadamente 5 al 10 %
de los niños infectados evolucionan a SUH, para el cual no existe un tratamiento específico, sino de
9
sostén. Los niños constituyen el grupo más vulnerable, con una mayor incidencia de infecciones
sintomáticas por STEC y riesgo alto de evolución a SUH (Mead et al., 1998).
El SUH, descripto por primera vez en 1955 por Gasser et al., es una enfermedad de comienzo
agudo con anemia hemolítica microangiopática, plaquetopenia y daño renal, que habitualmente puede
seguir o no a un episodio de diarrea con o sin sangre, en un niño previamente sano. Las manifestaciones
comunes son: palidez, petequias, hematomas, oliguria, edema, hipertensión arterial, y cambios
neurológicos como letargia o convulsiones (Comité de Nefrología, 1995).
Los criterios de laboratorio para el diagnóstico de SUH son:
1) Anemia de comienzo agudo, con hemoglobina menor de 10 mg/dl o hematocrito menor de 30% o caída
de al menos 5 puntos, con cambios microangiopáticos en el frotis de sangre periférica (esquistocitos,
células en casco o fragmentados).
2) Injuria renal aguda evidenciada por hematuria, proteinuria, uremia mayor de 50 mg/dl en ausencia de
deshidratación o creatinina mayor de dos desviaciones estandar respecto a la edad y sexo (Swartz, 1976) o
aumento del 50% de los valores al inicio de la enfermedad.
3) Recuento de plaquetas menor a 150.000/mm3.
Esta enfermedad sindrómica puede presentar dos formas, una típica de etiología infecciosa,
precedida por un período prodrómico con diarrea, generalmente sanguinolenta y de características
endemoepidémicas (llamada D+), y otra forma atípica (D-) desencadenada por varios factores, como
drogas, transplantes de órganos, post parto, etc. Se ha reconocido a STEC como agente causal de la forma
infecciosa de SUH (Kaplan, 1990).
En los últimos años, el diagnóstico precoz de la enfermedad y el mejor manejo de la insuficiencia
renal aguda y de la anemia disminuyó la letalidad durante el período agudo, siendo en la actualidad del 3
al 5%. Sin embargo, un 5 % de niños con SUH desarrolla insuficiencia renal crónica, requiriendo en pocos
años procedimientos dialíticos o transplante renal. Otro 20% continúa con microhematuria y grados
variables de proteinuria, pudiendo desarrollar insuficiencia renal crónica terminal en lapsos variables que
pueden llegar a décadas (Spizzirri et al., 1997). Esta patología implica grandes costos económicos para los
sistemas de salud, lo cual tiene un impacto importante en los países en desarrollo.
10
Historia Natural del

Síndrome Urémico Hemolítico Post-Entérico
Síndrome Urémico Hemolítico
3 - 5% 60%
Muerte Resolución
≈ 5% ≈ 30%
Insuficiencia Renal Crónica Proteinuria ?
Secuelas Importantes Secuelas Menores
Complicaciones Posteriores
Mead et al., 1998.
1.5.- Reservorios y vías de transmisión
Los rumiantes en general, y el ganado vacuno en particular, han sido señalados como los
principales reservorios de STEC.
Estudios de prevalencia realizados en distintos países, incluyendo Argentina (Ørskov et al., 1987;
Beutin et al., 1993; Chapman et al., 1993; Wells et al., 1991; Parma et al., 2000; Cobbold, et al., 2001,
confirmaron el rol del ganado vacuno como reservorio.
Los serotipos O5:H-, O26:H11, O103:H2, O111:H8, O111:H11, O111:H- y O118:H16 entre otros
(Butler et al.,1994) son los más comunmemente aislados en el ganado bovino.
El ganado ovino es también un excretor de estos microorganismos (Ramachandran et al., 2001). Los
serotipos más frecuentes son: O5:H-, O91:H-, O128:H2, O77:H4 y OX3:H8. En cambio cerdos, aves,
perros y gatos no son reservorios importantes (Beutin et al., 1993).
Los animales excretan estas bacterias en sus heces, es por ello que la contaminación fecal del agua
y la diseminación de las bacterias contaminantes durante la faena se han señalado como fuentes
importantes de infección. El ganado vacuno no es un huésped específico de STEC. En heces de animales
sanos se pueden aislar distintos serotipos de STEC O157 y no-O157 y un mismo animal puede portar más
de un serotipo.
11
Escherichia. coli O157:H7 es endémico tanto en ganado de carne como lechero. La prevalencia es
variable, de menos del 0,5 a más del 2,0% en campo y a nivel de playa de faena. La bacteria no es
patógena para el ganado, la colonización es de menos de 2 meses de duración, y la portación fecal, que no
es prolongada, es mas frecuente en el ganado joven (2 a 24 meses) que en el ganado adulto. La prevalencia
en el ganado joven es similar a la encontrada en el ganado alimentado a grano (“feedlot”), y está
relacionada con una mayor susceptibilidad de estos animales a ser colonizados por cepas transientes de E.
coli, con dosis menores a 250 unidades formadoras de colonias (UFC). Los animales con una alimentación
reciente en “feedlot” tienen una prevalencia tres veces superior a la de los animales alimentados por meses
en “feedlot”. Esta mayor susceptibilidad posiblemente esté relacionada con alteraciones de la flora normal,
el pH y la concentración de ácidos grasos. La alimentación juega un papel importante por las grandes
cantidades de alimento ingeridas diariamente por los animales y por la habilidad de E. coli de
multiplicarse en el alimento sobre todo cuando tienen una humedad aumentada. El agua, especialmente
con sedimentos, puede constituir un hábitat crítico para la sobreviva y multiplicación de E. coli O157:H7,
sobre todo durante los meses de invierno. La capacidad de colonización de E. coli O157:H7 en el ganado
es función de la dosis infectiva y la susceptibilidad.
Se ha descripto para STEC no-O157 que la excreción en ganado bovino adulto es de un 21% y de
un 50% en terneros. La excreción de ciertos serotipos se produce en forma intermitente lo cual dificulta su
aislamiento (WHO, 1998).
Otras formas de transmisión son: la contaminación cruzada durante la preparación de los
alimentos, el contacto directo del hombre con los animales, y persona a persona, por la ruta fecal-oral,
debido a las bajas dosis infectivas que posee este grupo bacteriano, ya que menos de 100 bacterias por
gramo de alimento puede causar enfermedad.
Distintos alimentos como carne molida y productos cárnicos crudos o insuficientemente cocidos,
hamburguesas, embutidos fermentados, leche no pasteurizada, yogur, quesos, mayonesa, papas, lechuga,
brotes de soja y alfalfa, jugos de manzana no pasteurizados, entre otros, han sido señalados como fuente
de contaminación en casos esporádicos o brotes asociados a STEC. La bacteria es resistente a los ácidos y
puede sobrevivir en alimentos fermentados y vegetales frescos.
Se ha determinado que la temperatura de pasteurización de la leche (72ºC, 16,2s) es un
tratamiento efectivo para eliminar 104 células de E. coli O157:H7 por mililitro. En los alimentos de origen
animal una temperatura interna de 63ºC, constituye un punto de control crítico para asegurar la
inactivación de E. coli O157:H7. Sin embargo, la Food and Drug Administration de EE.UU. recomendó
incrementar la temperatura de cocción de las hamburguesas a 68,3ºC después del brote que ocurrió en
cinco Estados de la costa oeste del país, con mas de 700 afectados (Griffin et al. 1994).
12
Vías de transmisión de STEC

Medio ambiente
Contaminación Fecal
Animales
Otros Carne Leche

Agua
alimentos
Humano
Persona a persona
Humano
Amstrong et al., 1996
1.6.- Tratamiento
Hasta el presente no existe una terapia específica para el tratamiento de las infecciones por STEC.
A pesar que E. coli O157 es susceptible a los agentes antimicrobianos usados comúnmente, los estudios
clínicos realizados no han demostrado que la aplicación de una terapia antimicrobiana en el tratamiento de
estas infecciones aporte algún beneficio para el paciente. Por otra parte, algunos autores han postulado que
dicho tratamiento puede precipitar la evolución a SUH. Se ha demostrado que la trimetoprima-
sulfametoxazol estimula in vitro la liberación de Stx. Es por ello que se debe realizar una cuidadosa
utilización de los antimicrobianos hasta que estudios caso-control demuestren la eficacia de los mismos.
Tampoco se deben usar agentes antidiarreicos, que disminuyen la motilidad intestinal, pues estudios
retrospectivos señalan un riesgo aumentado de evolución a SUH.
En el período agudo del SUH, el tratamiento está basado en el control de las alteraciones
fisiopatológicas como ser: la restricción de agua y sal, las transfusiones de sedimento globular, la diálisis
peritoneal y el adecuado aporte calórico-proteico.
Se hallan en etapa de desarrollo la producción de vacunas para prevenir la infección por EHEC.
Existen distintas vacunas candidatas basadas en:
13
a) utilización del lipopolisacárido bacteriano como inmunógeno;

b) toxoides de Stx;
c) utilización de cepas mutantes atóxicas;
d) inserción de la subunidad B de Stx en una cepa de Vibrio cholerae como vector.
También se encuentran avanzados los estudios de Fase II de anticuerpos murinos anti-Stx
humanisados para ser utilizados en la inmunoprofilaxis.
Teniendo en cuenta que Stx es el factor de virulencia principal, se han desarrollado algunos
productos destinados a unirse a la toxina en la luz intestinal, previniendo así su absorción. Synsorb es el
mejor estudiado de estos productos. Es un compuesto formado por glicósidos unidos covalentemente a
tierra de diatomeas. En un estudio Fase II con 347 pacientes con infección probable o confirmada por
STEC, el tratamiento con Synsorb no mostró efectos beneficiosos en general. Sólo en aquellos pacientes
que recibieron en forma temprana el tratamiento hubo un 40% de disminución de evolución a SUH.
1.7.- Epidemiología
La notificación de las infecciones por E. coli O157:H7 experimentaron un aumento exponencial a

partir de su primera descripción en 1982. Este comportamiento de patógeno emergente refleja, tanto un
aumento real en el número de infecciones, como así también una mejora en los sistemas de vigilancia de
las enfermedades asociadas y de los métodos de detección. Su emergencia ha generado gran preocupación
a nivel mundial por el número de personas afectadas y por los distintos vehículos de transmisión
identificados (carnes, vegetales, alimentos ácidos, aguas de consumo y recreación, etc.), lo que ha llevado
a la Organización Mundial de la Salud a promover estrategias de prevención y control.
En Europa continental las infecciones por cepas STEC no-O157 son mas frecuentes, mientras que
en Gran Bretaña STEC O157 aparece asociado a casos esporádicos y brotes, fundamentalmente por
productos cárnicos. En Alemania, cepas de E. coli O157:NM, Sorbitol+, β-glucuronidasa+, son causa
frecuente de casos esporádicos y brotes de diarrea y SUH.
En Asia hay pocos reportes de infecciones por STEC O157, salvo en Japón a partir del brote
masivo con mas de 10.000 afectados en 1996, posiblemente por falta de sistemas de vigilancia. En
Australia las infecciones por STEC no-O157, fundamentalmente O111:NM, son mas frecuentes que las de
O157.
Respecto a Latinoamérica, en Colombia un reporte prelimar comunicó que E. coli O157:H7 fue el
agente causal del 7,2% de los casos de diarrea y 6,5% del ganado era portador de este patógeno. En Chile,
STEC O157 y no-O157 está asociado a casos de diarrea y SUH, y el 34,5% del ganado faenado es
portador de STEC (Ríos et al., 1999). En Argentina, estudios realizados en ganado bovino demuestran
14
que la frecuencia de detección es de 35% para STEC no-0157 (Meitchtri, et al., 2004) y 0,5% para STEC
O157:H7, (Meitchtri, et al., 2004; Chinen et al., 2003). En relación a alimentos muestreados a nivel de
boca de expendio STEC no-O157 se detectó en 8,4% de hamburguesas congeladas y 0,9% de quesos de
pasta blanda (Gómez et al.; 2002); mientras O157 en 3,9% de productos cárnicos.
En Canadá, la incidencia de las infecciones por E. coli O157:H7 es de 5,3 casos/100.000
habitantes, siendo la exposición a carne molida mal cocida, contacto directo con el ganado, agua de
consumo contaminada y un medio ambiente rural contaminado son los factores de riesgo mas importantes.
En EE.UU. las infecciones por E. coli O157:H7 continúan siendo un problema importante de salud a pesar
de la implementación de sistemas de vigilancia de los patógenos asociados a las ETA (FoodNet) y un
estricto control de la producción de alimentos a partir del brote multiestado ocurrido en 1993. A pesar de
la identificación de nuevos vehículos de transmisión como vegetales, jugos de manzana no pasteurizados,
aguas de consumo y recreacionales, los productos a base de carne molida como las hamburguesas siguen
siendo la principal fuente de infección. La incidencia de las infecciones por E. coli O157:H7 es de 2,1
casos/100.000 habitantes, y representa la segunda causa de las hospitalizaciones (29%) por ETA después
de Listeria.
En cuanto al SUH, esta patología está ampliamente distribuida en el mundo (Griffin et al., 1991).
En América del Sur el problema se concentra en países del Cono Sur, principalmente Argentina, Chile y
Uruguay. Esto podría responder a diferencias en la distribución geográfica como consecuencia directa de
la magnitud de los reservorios del agente causal y/o la influencia de mecanismos de transmisión
específicos presentes en esta área.
Síndrome Urémico Hemolítico

Distribución Geográfica
Voyer, 1996
15
En estos países las tasas son similares a las comunicadas para países industrializados.
Sindrome Urémico Hemolítico:

Comparación de tasas de incidencia
Tasa de incidencia / 100.000 niños < 5 años
10
0
Canada USA Chile Uruguay Argentina
La asociación entre SUH e infección por STEC, particularmente cepas del serogrupo O157, fue
demostrada primero en Canadá en 1983-1985 y posteriormente confirmada por numerosos estudios
realizados en distintos países, incluida Argentina.
A partir de la década del 80 se han producido brotes asociados a la infección por STEC en
distintas partes del mundo, afectando a numerosas personas. La ocurrencia de brotes en distintas partes
permite tener un panorama de la distribución mundial de E. coli O157:H7.
16
La infección por STEC muestra una variación estacional, con aumento de casos en primavera y
verano, épocas que coinciden con el período en que se aíslan mayor cantidad de STEC en el ganado
bovino. Algunos de los brotes más importantes aparecen resumidos en la siguiente Tabla:
Brotes asociados a Escherichia coli O157:H7
LUGAR FECHA Nº DE Nº SUH MORTALIDAD TIPO DE FUENTE

CASOS (%) BROTE
Oregon/EE.UU. 2/82 26 0 0 Comunidad Hamburguesas
Michigan/EE.UU. 5/82 21 0 0 Comunidad Hamburguesas
Nebraska/EE.UU. 9/84 34 1 (2,9) 4 (11,8) Geriátrico Hamburguesas
Ontario/Canadá 9/85 73 12 (16,4) 19 (26) Geriátrico Sándwiches
Ontario/Canadá 4/86 30 3 (10) 0 Escuela Leche cruda
Utah/EE.UU 6/87 51 Cárcel Carne molida
Missouri/EE.UU. 12/89 243 2 (0,8) 4 (1,6) Comunidad Agua
Washington, Idaho, 11/92 a 559 41 (7,3) 4 (0,7) Comunidad/ Hamburguesas
California, 2/93 Multiestado
Nevada/EE.UU.
Washington/EE.UU. 11/94 20 1 (5,0) 0 Comunidad Embutido seco
Suecia 95/96 99 24 (24,2) 0 Comunidad Carne
Washington, 10/96 45 12 (26,7) 0 Comunidad/ Jugo de
California, Multiestado manzana no
Colorado, Columbia pasteurizado
Británica/EE.UU.,
Canadá
Escocia 96 496 0 19 (3,8) Comunidad Carne
Japón 96 9451 101 (1,1) 12 (0,1) Escolares Vegetales,
carne y
pescado
España 2000 158 6 (3,8) 0 Escolares Salchichas
Argentina 2004 4 1 0 J. Infantes Agua de
recreación
17
Brotes asociados a infección por Escherichia coli no-O157 productor de toxina Shiga
AÑO PAIS Nº DE CASOS SEROTIPOS SUH

1984 Japón 100 O145:NM 0
1986 Japón 22 O111:NM 1
1988 Checoslovaquia 5 O26:H11/NM 5

O1:H?
O157:H7
1991 Japón 234 O111:NM 0
1991 Japón 89 O?:H19 0
1992 Italia 9 O111:NM 9
1994 EEUU 7 O104:H21 0
1995 Australia 200 O111:NM 22
1995 España 13 O111:NM 13
1996 Japón 3 O103:H2 0
1999 EEUU 55 O111:H8 2
1999 EEUU 11 O121:H19 3
2000 Alemania 11 O26:H11 0
1.8.- Situación actual del SUH en Argentina
En Argentina el SUH es endémico, y constituye la primera causa pediátrica de insuficiencia renal

aguda y la segunda de insuficiencia renal crónica, es además responsable del 20% de los transplantes
renales en niños y adolescentes. Se producen alrededor de 300 casos nuevos por año con un importante
subregistro, acumulándose más 7.000 casos desde 1965 hasta el presente (Comité de Nefrología, 1995).
Los niños afectados son menores de 5 años, fundamentalmente entre 6 y 36 meses, de ambos sexos. En la
mayoría de estos niños la diarrea que caracteriza al período prodrómico es el primer episodio de sus vidas.
La enfermedad está distribuida en todo el país, pero la frecuencia es mayor en las provincias del
centro y sur durante los meses cálidos, aunque se registran casos durante todo el año. La letalidad ha
disminuido en los últimos años, debido al diagnóstico precoz de la enfermedad, la instauración temprana
18
de la diálisis en los casos con oliguria severa o anuria y al manejo de la anemia hemolítica. En un estudio
reciente para establecer la etiología del SUH en niños argentinos (López et al., 1989; Miliwebsky et al.,
1999), se encontraron evidencias acumulativas de infección por STEC en el 60% de los casos, siendo
O157:H7 el serotipo más frecuente. Shigella dysenteriae tipo 1, que también fue asociado a casos de SUH
en otros países, es aislado excepcionalmente en nuestro país asociado a esta enfermedad.
Teniendo en cuenta el número de casos que se producen anualmente y la severidad de la
enfermedad, en Abril de 2000 (Resolución Nº 346/00), el Ministerio de Salud estableció la notificación
obligatoria al Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica, con modalidad individualizada e inmediata.
Complementariamente, a fin de reforzar el Sistema de Vigilancia vigente, se implementó una
estrategia de vigilancia adicional, basada en Unidades Centinela (UC). La vigilancia epidemiológica a
través de UC permite determinar tendencias, focalizar actividades de vigilancia y sugerir intervenciones
preventivas. Aunque no tiene representatividad poblacional, esta estrategia tiene el mérito de llamar la
atención en forma especial sobre situaciones de riesgo, y es por ello que cumplen una función clave en la
toma de decisiones. Las UC en lugar de seleccionar un área geográfica con una población definida,
seleccionan una unidad de atención de salud sin población definida. Por esta razón esta estrategia presenta
la limitación de no permitir comparar la magnitud del problema estudiado con otras subpoblaciones o
áreas donde la información no se recolecta mediante esta estrategia. Este sistema de vigilancia está
integrado por tres componentes: epidemiológico, clínico y de laboratorio, que cumplen funciones
específicas con relación a la recolección, el análisis y a la difusión de la información. La Red de Unidades
Centinela es un Subsistema del Sistema Nacional de Vigilancia. Como todo subsistema, debe responder a
las prioridades identificadas como problemas relevantes y debe cumplir con los atributos generales del
sistema de vigilancia. Hasta el presente se han incorporado 24 UC en 14 jurisdicciones del país.
La tasa de hospitalización para el año 2006 fue de 13,9 casos por cada 100.000 niños menores de
5 años. Se notificaron 464 casos de los cuales el 51,5% correspondió al sexo femenino y una edad
promedio de 26,5 ± 26,8 [1-167] meses. La mayoría de los casos ocurrieron durante los meses cálidos, en
los periodos de enero a abril y de noviembre a diciembre. La letalidad en la fase aguda fue del 3.2%. El
Laboratorio Nacional de Referencia recibió muestras de 361 (78%) casos de SUH remitidas de diferentes
jurisdicciones del país. Se registró un 50% de positividad utilizando tres criterios diagnósticos de la
infección por STEC: aislamiento de STEC, determinación de toxina libre en materia fecal y detección de
anticuerpos anti-Stx.
Además del sistema de vigilancia de SUH mediante las UC, Argentina trabaja en conjunto con el
Centro de Enfermedades Infecciosas (CDC) de Atlanta, EE.UU., en la implementación de la Red PulseNet
Latinoamérica. Esta Red de Laboratorios realiza la caracterización molecular de bacterias asociadas a
ETA por electroforesis en campo pulsado (PFGE, del inglés pulse field gel electrophoresis). El objetivo es
19
comparar los patrones de PFGE obtenidos de aislamientos humanos y de alimentos con los existentes en
una base de datos Nacional del INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbran” y de EE.UU. del CDC. Esto
permite: 1) identificar casos de ETA que ocurren al mismo tiempo en áreas geográficas separadas,
producidas por el mismo agente etiológico. 2) identificar el vehículo de transmisión y así establecer las
medidas de intervención correspondientes y, 3) diferenciar un brote de un "pseudos-brote" o de casos
esporádicos.
1.9.- Prevención
Las medidas preventivas para controlar la transmisión de la infección son:

a) Asegurar prácticas de higiene durante el faenamiento del ganado.
b) Aplicar controles en los puntos críticos de la elaboración de alimentos.
c) Asegurar una correcta y homogénea cocción de la carne. La bacteria se destruye a los 70ºC.
d) Tener especial cuidado con la cocción de la carne picada, ya que generalmente se cocina bien la parte
superficial, pero no en el interior, permaneciendo la bacteria viable.
e) Utilizar distintos utensilios de cocina para cortar la carne cruda y para trozarla antes de ser ingerida.
f) Evitar el contacto de las carnes crudas con otros alimentos.
g) Controlar el uso de leche y derivados lácteos correctamente pasteurizados y conservar la cadena de frío.
h) No consumir jugos de frutas no pasteurizados.
i) Lavar cuidadosamente las frutas y verduras.
j) Asegurar la correcta higiene de las manos. Deben lavarse siempre con agua y jabón antes de preparar
los alimentos y después de manipular carne cruda.
k) Lavar las manos con agua y jabón luego de ir al baño.
l) Evitar el hacinamiento en comunidades cerradas (jardines maternales, jardines de infantes, escuelas,
cárceles, etc.).
m) No asistir a comunidades cerradas aquellas personas con diagnóstico bacteriológico positivo de STEC
hasta no tener 2 coprocultivos negativos en un lapso de 72 hs.
n) Evitar el uso de antimicrobianos y antidiarreicos, considerados factores de riesgo en la evolución de
diarrea a SUH;
o) Educar a médicos, microbiólogos, personal de plantas elaboradoras de alimentos y restaurantes, de
jardines maternales, de infantes y geriátricos y la comunidad en general sobre los riesgos que implica la
infección por EHEC.
p) Consumir agua potable. Ante cualquier duda hervirla.
q) Utilizar aguas recreacionales habilitadas
20
CAPITULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE Escherichia coli O157
1.- Especimenes
Materia fecal:
a) Evacuación espontánea: Recolectar 2 g de materia fecal con una espátula y colocarla en un
recipiente estéril. La muestra debe permanecer refrigerada a 4ºC hasta su procesamiento. Si la
muestra no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada, deberá ser colocada utilizando
un hisopo estéril en un medio de transporte (Cary-Blair, Stuart, Amies o solución salina
tamponada con glicerol). Si el procesamiento se efectúa dentro de los 2-3 días, el medio de
transporte deberá ser conservado refrigerado a 4ºC. Si el espécimen no es analizado en ese
lapso de tiempo deberá mantenerse congelado a -70ºC.
b) Hisopado rectal: Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte y

mantenerlo refrigerado hasta su procesamiento. Si el niño usa pañal, tomar la muestra que
queda en el mismo con hisopo o con espátula.
Recomendaciones:
• Recolectar la materia fecal lo antes posible después del establecimiento de la diarrea.
La mayoría de los pacientes excretan STEC, fundamentalmente E. coli O157, por
períodos menores a 7 días.
• El paciente no debe estar con tratamiento antibiótico. Recolectar la muestra después
de suspender la antibioticoterapia por no menos de 48 horas.
2.-Procesamiento
2.1. A.- Aislamiento
Medios
• Agar MacConkey sorbitol (SMAC)
• Caldo tripticasa de soja (CTS)
• CTS con cefixima 0,05 mg/l (medio) y telurito de potasio 2,5 mg/l (medio) [CT-CTS]
Materiales y equipamiento
• Estufa de cultivo a 37ºC
• Ansas de rulo
21
Procedimiento Comentarios
1. Realizar la siembra de la materia fecal • El agregado de cefixima y telurito de potasio
en SMAC, en forma directa y luego del al medio de enriquecimiento proporciona
enriquecimiento en CTS (a 37ºC por 6 mayor sensibilidad y especificidad en la
h) y en CT-CTS (a 37ºC por 6 h). recuperación de STEC O157.
• Se pueden aplicar métodos
inmunocromatográficos para la detección
rápida de STEC O157 a partir del medio de
enriquecimiento. (Ver Procedimiento Métodos
inmunocromatográficos).
2. Incubar las placas de SMAC (a 37ºC por
18 h).
3. Observar morfología y características • La mayoría de las cepas STEC O157 no
fenotípicas de las colonias aisladas en fermentan el sorbitol en 24 horas. En la placa
las placas de SMAC. de SMAC desarrollan colonias pequeñas,
incoloras y translúcidas. En cambio,
microorganismos fermentadores de sorbitol,
desarrollan colonias pequeñas y rosadas.
4. Realizar el diagnóstico presuntivo de E. • Es importante comunicar inmediatamente al
coli O157 de las colonias no médico (a las 24 horas de realizado el
fermentadoras de sorbitol por coprocultivo) la presencia presuntiva de E.
aglutinación en lámina con antisuero coli O157 asociado a un caso de diarrea con o
anti-O157 o reactivo de látex (Ver sin sangre, o colitis hemorrágica, para vigilar
Procedimiento de Serotipificación). la probable evolución a SUH mediante
parámetros bioquímico-clínicos, y el control
del grupo familiar.
• Se debe tener en cuenta que el suero anti-O157
da reacción cruzada con cepas de Escherichia
hermanii. Cuando se observan colonias no
fermentadoras de sorbitol con
seroagrupamiento positivo con el antisuero
anti-O157 se debe realizar la diferenciación
bioquímica entre E. coli y E. hermanii. (Ver
Procedimiento de Identificación Bioquímica).
22
5. Tomar una muestra de la zona de • PCR multiplex se utiliza como técnica de

crecimiento confluente de las placas tamizaje para detectar los genes stx1, stx2 y
SMAC y de las colonias presuntivas rfbO157.
para extracción de ADN y posterior
realización de la técnica PCR multiplex
stx1/stx2/rfbO157 (Ver Preparación de
la muestra para PCR)
6. Realizar la confirmación bioquímica de • Si se obtiene señal positiva por PCR multiplex
las colonias presuntivas con señal de la zona confluente se deberá identificar la
positiva para stx1 y/o stx2 y/o rfbO157 colonia positiva correspondiente. Para tal fin,
por PCR multiplex. (Ver Procedimiento realizar PCR de colonias aisladas. Si no se
de Identificación Bioquímica) observan colonias típicas, realizar un nuevo
aislamiento de la zona de cultivo confluente de
la cual se obtuvo señal positiva.
7. Determinar el fenotipo enterohemolítico • Dado que existe relación entre la producción
de las colonias presuntivas y/o de los de Stx y de enterohemolisina (EHEC-Hly), se
aislamientos stx positivos. (Ver considera que la detección de EHEC-Hly
Caracterización de cepas hemolíticas) puede ser un marcador útil para seleccionar
rápidamente probables cepas STEC.
8. Confirmar la fermentación de sorbitol en • La determinación de la actividad de la enzima
tubo y determinar la actividad de la β-glucuronidasa es utilizada como marcador
enzima β-glucuronidasa (β-glu) de los bioquímico para diferenciar las cepas de E.
aislamientos. (Ver Procedimiento de coli O157, que no presentan actividad β-glu,
Identificación Bioquímica) de otras cepas de E. coli.
9. Realizar la biotipificación de las cepas
E. coli O157 por la fermentación de los
azúcares rafinosa, dulcitol y ramnosa.
(Ver Procedimiento de Biotipificación)
10. Determinar la movilidad de la cepa • La detección del antígeno H requiere de una
aislada utilizando el medio de Craigie. estimulación previa de la movilidad de la cepa
Si la cepa es móvil, se deberá determinar mediante varios pasajes en el medio de
el antígeno flagelar H. (Ver Craigie.
Procedimiento de Serotipificación). • El antígeno H7 puede detectarse por
aglutinación en lámina y/o por PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que amplifican un
fragmento del gen fliCh7.
23
• La técnica de amplificación no requiere de la

estimulación previa de la movilidad. (Ver
Procedimiento PCR h7)
11. Determinar la sensibilidad de las cepas
STEC a los antimicrobianos. (Ver
Pruebas de Sensibilidad)
12. Detectar los marcadores de virulencia
accesorios de cepas STEC, eae y EHEC-
hlyA por PCR. (Ver Detección de
Factores de Virulencia)
13. Detectar la producción de Stx por • Para la realización de estos ensayos se debe
ensayos de citotoxicidad específica en disponer de la línea celular y estufa de CO2.
células Vero.
2.1.B.- Aislamiento con separación innunomagnética

La sensibilidad del procedimiento de aislamiento de E. coli O157:H7/NM puede aumentarse aplicando
la técnica de separación inmunomagnética. (SIM)
Fundamento
Anticuerpos anti-E.coli O157 purificados, adsorbidos y unidos covalentemente a la superficie de
partículas esféricas paramagnéticas de poliestireno, reaccionan con el antígeno somático O157. Se
recupera el microorganismo cuando las partículas unidas al O157, son atraídas magnéticamente y
sembradas en placas de aislamiento.
Medios
• Caldo GN, Hajna
• Tween 20 al 0,05% en buffer PBS 1X estéril
• Agar Mac Conkey sorbitol suplementado con cefixima - telurito de potasio (CT-SMAC)
• Medios cromogénicos. (CHROMAgar O157®, Agar ID O157: H7®)
• Partículas inmunomagnéticas anti-E. coli O157
• Tubos Eppendorf de 1,5 ml
• Pipetas estériles de 10 ml
• Micropipeta rango: 5-40 µl
24

• Tips para micropipetas
• Ansas de rulo
• Agitador rotatorio
• Gradilla imantada
1. Realizar la siembra de la materia fecal
en 5 ml de caldo GN, Hajna.
2. Incubar en forma estática a 37ºC por 5h.
3. Mezclar 1 ml del cultivo con 20 µl de • Las partículas inmunomagnéticas se deben
las partículas inmunomagnéticas anti- E. conservar refrigeradas entre 2º y 8ºC. Antes de
coli O157, en un tubo Eppendorf estéril su uso homogenizar suavemente, con vortex o
de 1,5 ml de capacidad. con micropipeta automática, la solución madre
de las partículas.
4. Colocar el tubo en el agitador rotatorio a • Es importante respetar el tiempo, las

18 rpm durante 10 minutos. revoluciones por minuto y el sistema de
rotación dado que en esta etapa se produce la
unión antígeno-anticuerpo.
5. Introducir el imán en la gradilla

6. Colocar el tubo en la gradilla imantada y • Verificar que en la pared del tubo que contacta
dejar inmóvil durante 3 minutos. con el imán se visualice una suave línea
coloreada correspondiente a las partículas
atraídas magnéticamente.
7. Invertir suavemente la gradilla 5 veces.
8. Extraer el sobrenadante, sin retirar el • Se debe realizar con precaución para no
tubo de la gradilla imantada. desprender las partículas de la pared que
contacta con el imán.
9. Agregar 1 ml de buffer lavado ( Tween • El buffer de lavado debe preparase en el

20 al 0,05% en buffer PBS 1X estéril) momento previo a su uso. (Ver medios de
cultivo y reactivos)
10. Retirar el imán e invertir la gradilla 5
25
veces
11. Colocar el imán en la gradilla y dejar
inmóvil durante 3 minutos.
12. Repetir 2 veces los pasos 7 al 11.
13. Retirar el sobrenadante.
14. Extraer el imán y colocar 100 µl de • Homogenizar con micropipeta las partículas
buffer de lavado (Tween 20 al 0,05% en al agregar los 100 µl de buffer de lavado.
buffer PBS 1X estéril)
15. Dispensar 50 µl en una placa de CT- • Se utilizan placas de CT-SMAC y con
SMAC y 50 µl en una placa de medios medios cromogénicos para aumentar la
cromogénicos para E. coli O157. selectividad del método de aislamiento.
• Es necesario visualizar después del cultivo de
las placas, colonias con morfología y
fenotipo característico de E. coli O157. Para
tal fin se recomienda la siembra de las
partículas en placa completa, utilizando ansa
de rulo, de manera de obtener colonias
aisladas.
16. Incubar las placas a 37ºC por 18 a 24h.
17. Observar morfología y características • Las cepas STEC 0157 desarrollan en placas de
fenotípicas de las colonias aisladas en CT-SMAC colonias pequeñas, incoloras, con
las placas de CT-SMAC y de medios centro negro. En placas de medio
cromogénicos. cromogénico se observan colonias de un color
característico dependiendo del medio
utilizado. En CHROMAgar O157® se
observan de color malva y en Agar ID
O157:H7® de color turquesa verdoso, según
lo descripto por el fabricante respectivamente.
Se recomienda no extender la lectura de las
placas por más de 24 h de incubación.
• En caso de no obtener colonias aisladas se
recomienda repetir la SIM tratando de mejorar
la forma de aislamiento.
18. Continuar con el punto 4 del
procedimiento 2.1. Aislamiento en el
caso de detectar colonias presuntivas de
E. coli O157.
26
2.2.-Métodos Inmunocromatográficos
Fundamento
La muestra sembrada migra en una membrana cromatográfica. En la primera porción se enfrenta con
una zona que contiene anticuerpos específicos anti-LPS O157 conjugados con partículas de oro
coloidal. En caso de estar presente el LPS O157, se forma un complejo antígeno-anticuerpo. La
muestra con el complejo inmune continúa migrando hasta una segunda porción (zona de ensayo)
donde un segundo anticuerpo reacciona contra un epitope del LPS O157. Este anticuerpo captura al
complejo inmune, y lo fija a la membrana. El remanente de la muestra continúa migrando hasta la
zona control donde se encuentran anticuerpos anti-especie, que capturan el resto de anticuerpos
conjugados con partículas de oro que no reaccionaron en la zona de ensayo.
Materiales requeridos
• Micropipeta de 200 µl
• Caldo de enriquecimiento
• Equipo de inmunocromatografía para la detección de E. coli O157:H7/NM:
- Reveal20 Single Step for E. coli O157:H7 Neogen Corporation, Lansing,
Michigan. EE.UU.
- ImmunoCard STAT. E. coli O157:H7 Meridian Diagnostic, Inc. Cincinnati, Ohio,
EE.UU.
- Singlepath E. coli O157 Merck KGaA, Alemania.
- RapidChek E. coli O157 Test Kit. Strategic Diagnostics Inc. Newark, DE, EE.UU
1. Colocar una alícuota del caldo • La alícuota del cultivo enriquecido puede
enriquecido de la materia fecal, en la tomarse del caldo CTS o Hagna, encubados a
región de siembra de la placa 37ºC por 6 h y a 37º por 5 hs.
inmunocromatográfica. respectivamente. (Ver procedimiento de
Aislamiento 2.1.A. y 2.1.B).
• El volumen de la alícuota depende de lo
recomendado por la presentación comercial.
2. Esperar 10 a 20 minutos. • El ensayo funciona correctamente si al cabo
de 10 a 20 minutos aparece una línea de color
rojo en la zona de control.
27
3. Realizar la lectura de la placa • El ensayo es positivo cuando aparece una

cromatográfica línea de color rojo en la zona de ensayo y en
la de control. El ensayo es negativo si solo se
observa una línea roja en la zona control. Ver
FIGURA 1.
2.3.- Serotipificación
2.3.1- Detección del antígeno somático O
Para la detección del serogrupo se puede efectuar la aglutinación en lámina con antisuero policlonal
anti-O157 o reactivo de látex anti-O157.
A) Aglutinación en lámina con antisuero policlonal anti-O157
Fundamento
Los anticuerpos del antisuero específico aglutinan con la bacteria cuando el antígeno O157 está
presente en el lipopolisacárido (LPS) bacteriano.
Medios
• Antisueros anti-O157
• Solución fisiológica estéril (SF)
• Cepa de referencia patrón positivo del antígeno O157
• Cepa de referencia patrón negativo del antígeno O157
• Tubos testigos de la escala de McFarland
• Micropipeta rango 5-40 µl
• Tips para micropipeta
• Lámpara para observar aglutinación
• Lámina de vidrio para aglutinación
• Ansa de rulo
A1) Aglutinación en lámina con inactivación previa por calor
1. Determinar si el aislamiento a ensayar • El aislamiento a ensayar deberá ser inactivado
debe ser previamente inactivado por por calor cuando el antisuero a utilizar haya
28
calor, de acuerdo a la naturaleza del sido producido con un inóculo cuyo antígeno
antisuero a utilizar. capsular ha sido previamente eliminado.
Mediante el calentamiento a 100ºC se elimina
el antígeno capsular de la bacteria quedando
expuesto el antígeno O del LPS.
2. Realizar una suspensión en SF (1ml) • La turbidez de la suspensión debe
con una ansada de la cepa en estudio. corresponder al testigo 7 de la escala de
McFarland (Cl2Ba 0,7 %).
3. Hervir la suspensión durante 1 h.
4. Colocar, en forma separada, dos gotas
de 20 µl de la suspensión en una lámina
de vidrio.
5. Observar las dos suspensiones • No se debe continuar con el ensayo si la
iluminando la lámina con luz de una muestra aglutina por si misma. Una muestra
lámpara. autoaglutinada corresponde a una cepa
rugosa, la cual puede revertir al estado liso
realizando sucesivos pasajes en agar sangre o
agar Mueller Hinton.
6. Agregar 15 µl del antisuero a ensayar a • La suspensión sin el agregado de antisuero se
una de las dos suspensiones y mezclar. utiliza como control negativo.
7. Mover la lámina mediante rotación
suave durante un minuto.
8. Observar las suspensiones con luz de • El ensayo es positivo si solo se observa
una lámpara. aglutinación o formación de pequeños grumos
en la mezcla de la suspensión bacteriana con
el antisuero. El ensayo es negativo si ambas
suspensiones son homogéneas sin
aglutinación.
• El antisuero O157 puede dar falsos resultados
positivos con Salmonella Urbana O:30;
Yersinia enterocolitica O:9; Yersinia
pseudotuberculosis O:IB Citrobacter
freundii; E. hermanii; Haffnia spp. y Brucella
abortus por reacciones cruzadas.
En cada ensayo se debe realizar control de
los reactivos utilizando cepas patrones
positivas y negativas.
29
A2) Aglutinación en lámina sin inactivación por calor
1. Colocar separadamente dos gotas de 20
µl de SF en una lámina de vidrio.
2. Mezclar una ansada del cultivo con las
gotas de SF.
3. Observar las dos suspensiones • Si la muestra aglutina por si misma no se debe
iluminando la lámina con luz de una continuar con el ensayo. Una muestra
lámpara. autoaglutinada corresponde a una cepa
rugosa, la cual puede revertir al estado liso
realizando sucesivos pasajes en agar sangre o
agar Mueller Hinton.
4. Agregar 15 µl del antisuero a ensayar a • La suspensión sin el agregado de antisuero se
una de las dos suspensiones y mezclar. utiliza como control negativo
6. Observar la apariencia de las • El ensayo es positivo si solo, en la mezcla de
suspensiones con luz de una lámpara. la suspensión con el antisuero, se observa
aglutinación o formación de pequeños
grumos. El ensayo es negativo si ambas
aglutinación.
• El antisuero O157 puede dar falsos resultados
positivos con Salmonella Urbana O:30;
Yersinia enterocolitica O:9; Yersinia
pseudotuberculosis O:IB Citrobacter
freundii; E. hermanii; Haffnia spp. y
Brucella abortus por reacciones cruzadas.
En cada ensayo se debe realizar control de
30
B) Aglutinación con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos anti-O157
Fundamento
Los anticuerpos anti-O157 adsorbidos a partículas de látex, aglutinan con la bacteria, cuando el
antígeno O está presente en el lipopolisacárido bacteriano.
Medios
• Reactivo de látex anti-O157
• Control del reactivo de látex
• Cepa de referencia patrón positivo del antígeno O157
• Cepa de referencia patrón negativo del antígeno O157
• Pipetas Pasteur estériles
• Lámina para aglutinación
• Ansa de rulo
1. Colocar los reactivos de látex a
temperatura ambiente antes de usarlos.
2. Mezclar los reactivos de látex hasta

homogenizar las suspensiones.
3. Dispensar con pipeta Pasteur estéril una
gota del reactivo de látex y otra del
control del reactivo de látex en la lámina
para aglutinación.
4. Mezclar una ansada del aislamiento a
ensayar con la gota del control del
reactivo de látex.
5. Mezclar otra ansada del aislamiento a • La mezcla de reacción con el reactivo y
ensayar con la gota del reactivo de látex. control de látex debe ocupar un área de 25
mm.
Observar si hay aglutinación de la cepa • El ensayo es positivo si solo en la mezcla de
con el reactivo de látex. Ver FIGURA 2. la cepa con el reactivo de látex, se observa
31

grumos.
• El resultado no podrá ser válido si se observa
aglutinación de la cepa con el reactivo de
látex y con el reactivo control.
• En cada ensayo se debe realizar control de los
reactivos utilizando cepas patrones positivas
y negativas.
• Este ensayo puede dar falsos positivos por
reacción cruzada con E. hermanii. Es
necesario realizar la diferenciación
bioquímica entre E. coli O157 y E. hermanii.
2.3.2.- Detección del antígeno flagelar H

Se realiza la técnica convencional de aglutinación en tubo, utilizando antisuero anti-H. Para la
detección especifica del antígeno H7 puede realizarse además, la técnica de aglutinación en lámina
utilizando antisuero anti-H7.
Fundamento
Los anticuerpos del antisuero específico aglutinan con el antígeno flagelar correspondiente.
Medios
• Medio de Craigie fraccionado en tubo de ensayo con varilla de vidrio central
• Agar tripticasa de soja fraccionado en forma de pico de flauta en tubo de ensayo. (TSA)
• Antisueros anti-H
• Solución fisiológica (SF) formolada 1% (v/v)
• Cepa de referencia patrón positivo del antígeno H
• Cepa de referencia patrón negativo del antígeno H
• Estufa de cultivo 37ºC
• Baño termo-estatizado 50ºC
• Tubos de hemólisis
• Micropipeta rango 5-40 µl
32

• Lámpara para observar aglutinación
• Lámina de vidrio para aglutinación
• Ansa de rulo
• Ansa de aguja
A) Prueba y estimulación de la movilidad
1º Día
1. Picar con ansa de aguja la colonia en
estudio.
2. Introducir el ansa de aguja en la varilla • Sembrar en el interior de la varilla de vidrio,
central del tubo con medio de Craigie. en el tercio superior del medio de cultivo.
Ver FIGURA 3
3. Incubar el tubo a 37ºC por 18 h. • Anotar en el tubo la fecha de la primera
siembra
2º Día
1. Observar el desarrollo de la bacteria y • La bacteria se considera no móvil cuando
registrar si corresponde al lugar de su desarrollo corresponde al lugar de
siembra o alcanzó la superficie del siembra después de siete días de
medio de cultivo externo a la varilla. incubación a 37ºC.
• La bacteria se considera móvil cuando su
desarrollo alcanza la superficie del medio
de cultivo, externo a la varilla.
• Para identificar el antígeno flagelar H se
requiere la previa estimulación de la
movilidad de la bacteria. Para tal fin, se
realizan siete pasajes en el medio de
Craigie. Se considera que se ha producido
un pasaje, cuando la bacteria desarrolla y
alcanza el medio exterior de la varilla en 18
h de incubación a 37ºC.
2. Anotar el Nº del pasaje en la pared del
tubo. (Por ejemplo: Pasaje Nº 1)
33
3. Picar con el ansa de aguja, la superficie • La bacteria alcanzó su máxima movilidad

del medio de cultivo desarrollado, en la en la superficie del medio de cultivo.
parte externa a la varilla.
4. Sembrar con el ansa cargada el interior
de la varilla (tercio superior del medio
de cultivo) de un tubo con medio de
Craigie.
5. Anotar el Nº de pasaje en la pared del
tubo.
6. Incubar el tubo en estufa a 37ºC por
18 h.
3º al 7º Día
1. Registrar el desarrollo de la bacteria.
Repetir los pasos correspondientes al 2º
día hasta completar siete pasajes.
2. Tomar una ansada del tubo • Se debe tomar la ansada de la superficie del
correspondiente al 7º pasaje y sembrar medio de cultivo desarrollado externo a la
en estría de TSA. varilla.
3. Incubar el TSA en estufa a 37ºC por 18 h.
8º Día
1. Conservar el cultivo en TSA a 4ºC hasta
el procesamiento de identificación del
antígeno H.
B) Identificación del antígeno H: Aglutinación en tubo
1. Sembrar una ansada de cultivo de la • En un mismo ensayo se puede enfrentar el
estría de TSA en caldo CTS. cultivo bacteriano con diferentes antisueros
anti-H. En estos casos, se debe calcular el
volumen de CTS necesario para realizar el
ensayo con Nº antisueros:
Vol. CTS 250 µl Nº

para CTS x
antisueros 250 µl CTS
= +
Nº a ensayar (control
2. Incubar en estufa a 37ºC con agitación antisueros negativo)
por 8 h.
34
3. Mezclar el volumen de cultivo-CTS, con • Se agrega SFformolada al 1% (v/v) con el fin de

igual volumen de SFformolada al 1% (v/v). inactivar el cultivo desarrollado en CTS.
4. Colocar 500 µl de la mezcla (Cultivo- • Se debe disponer de un número de tubos de
CTS/SFformolada) en un tubo de hemólisis. prueba igual a la cantidad de antisueros a
(Tubo de prueba) ensayar.
5. Agregar 50 µl de antisuero anti-H en el • En cada tubo de prueba se agrega el antisuero
tubo de prueba. correspondiente.
6. Colocar 500 µl de la mezcla (Cultivo-
CTS/SFformolada) en un tubo de hemólisis.
(Tubo control)
7. Colocar 50 µl de solución fisiológica en • La suspensión sin el agregado de antisuero se
en el tubo control. utiliza como control negativo. No se debe
continuar con el ensayo si la muestra aglutina
por si misma. Una muestra autoaglutinada
corresponde a una cepa rugosa, la cual puede
revertir al estado liso realizando sucesivos
pasajes en agar sangre o agar Mueller Hinton.
8. Mezclar e incubar los tubos en baño de
agua a 50ºC por 1 h.
9. Observar las dos suspensiones • Para realizar la lectura se recomienda inclinar
iluminando los tubos con luz de una suavemente los tubos.
lámpara. • El ensayo es positivo si solo se observa
aglutinación (botón de aglutinación en el
fondo del tubo) o formación de pequeños
grumos en la mezcla de la suspensión
bacteriana con el antisuero (Tubo de prueba).
El ensayo es negativo si las suspensiones del
tubo de prueba y del tubo control son
homogéneas sin aglutinación.
• En cada ensayo se debe realizar el control de
35
C) Identificación del antígeno H7: Aglutinación en lámina
1. Colocar separadamente dos gotas de 20
µl de SF en una lámina de vidrio.
2. Mezclar una ansada del cultivo con las
gotas de SF.
3. Observar las dos suspensiones
iluminando la lámina con luz de una
lámpara.
4. Agregar 15 µl del antisuero anti-H7 a • La suspensión sin el agregado de antisuero se
una de las dos suspensiones. utiliza como control negativo
6. Observar la apariencia de las • El ensayo es positivo si solo, en la mezcla de
suspensiones a la luz de una lámpara. la suspensión con el antisuero, se observa
grumos. El ensayo es negativo si ambas
aglutinación.
• En cada ensayo se debe realizar control de los
reactivos utilizando cepas patrones positivas
y negativas.
2.4.- Caracterización de cepas hemolíticas
Fundamento
La composición del agar base triptosa suplementado con Cl2Ca y glóbulos rojos lavados de sangre
desfibrinada de cabra u oveja, permite la visualización de la hemólisis debida a la enterohemolisina de
EHEC (EHEC-Hly) después de una incubación a 37ºC por 18 h.
Medios
• Agar tripticasa de soja fraccionado en forma de pico de flauta en tubo de ensayo (TSA)
• Agar base triptosa con glóbulos rojos lavados (AGRL)
• Agar base triptosa con glóbulos rojos sin lavar (AGRSL)
36
Materiales y Equipamiento
• Ansa de rulo
• Cepa control positivo: E. coli 32511 O157:H-
• Cepa control negativo: E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia
1º Día
1. Sembrar colonias presuntivas y cepas
controles en TSA
2. Incubar los tubos en estufa de cultivo a
37ºC por 18 h.
3. Preparar placas AGRL y AGRSL • Ver preparación de las placas de AGRL y
AGRSL.
2º Día
1. A partir del cultivo en TSA, sembrar con • En cada placa se pueden probar varias cepas
ansa de rulo las placas de AGRL (placa presuntivas. Siempre se deben sembrar las
de ensayo) y AGRSL (placa control). cepas controles positivo y negativo. Se
sugiere dividir las placas dibujando una grilla
con espacios no menores de 2 cm2.
2. Incubar ambas placas a 37 ºC por 3 h.
3. Realizar una primera lectura de ambas • El aislamiento se considera no productor de
placas a las 3 h de incubación, EHEC-Hly si después de 3 h de incubación
observando si hay fina hemólisis se observa hemólisis por α-hemolisina (α-
alrededor del desarrollo bacteriano. Hly) en placa control (AGRSL) y o en placa
de ensayo (AGRL). Si no se observa
hemólisis continuar con la incubación.
4. Continuar la incubación de las placas a
37 ºC hasta cumplimentar las 18 h.
3º Día
Realizar una segunda lectura de las • La cepa es productora de EHEC-Hly si
placas. Ver FIGURA 4 después de 18 h de incubación aparece una
fina hemólisis alrededor de la zona de
siembra solo en la placa de ensayo (AGRL).
• Si después de 18 h de incubación también se
37
observa hemólisis en ambas placas (AGRL y

AGRSL), la cepa es productora de α-Hly y
no de EHEC-Hly.
• Se puede visualizar mejor la hemólisis
dejando la placa a 4ºC por 2 h o bien
levantando suavemente el desarrollo
bacteriano con un ansa.
38
2.5.- Identificación Bioquímica

Los aislamientos presuntivos son sometidos a las siguientes pruebas bioquímicas:
Ver FIGURA 5
Pruebas Bioquímicas Bacteria Medio de cultivo

E. coli no-O157 E. coli O157:H7 E. hermanii
Fermentación de + + + Agar triple azúcar y hierro
glucosa (TSI)
Fermentación de + + + TSI
lactosa
Fermentación de + + + TSI
sacarosa
Formación de Ac. - - - TSI
Sulfídrico
Producción de gas + + + TSI
Utilización del Citrato - - - Citrato de Simmons
Producción de indol + + + Sulfuro, indol, movilidad

(SIM)
Movilidad Móvil / no móvil Móvil Móvil SIM
Fermentación de + - - Fermentación de hidratos de
sorbitol carbono
Actividad + - - Disco con glucurónido
β-glucuronidasa
Actividad lisina + (90) * + (100) - (6% ) Lisina Hierro Agar (LIA)
decarboxilasa
Actividad ornitina + (95) + (100) + (100) Movilidad, indol, ornitina.
decarboxilasa (MIO)
Fermentación de - (2%) - (2%) + (97%) Fermentación de hidratos de
Celobiosa carbono
Producción de - (0%) - (0%) + (98%) Tripticasa de soja
pigmento amarillo
* El dato entre paréntesis indica % de cepas positivas

(+): positivo; (-): negativo
Según Manual of Clinical Microbiology (7° ed). 1999, pág. 459.
Estas pruebas bioquímicas son de utilidad para diferenciar E. coli O157 y E. hermanii.
39
2.5.1- Fundamento y procedimientos para pruebas bioquímicas
a) Agar hierro tres azúcares (TSI)
Fundamento:
- Determina la capacidad de un microorganismo de fermentar los hidratos de carbono presentes en el
medio de crecimiento básico con producción o no de gas. La fermentación provoca acidificación del
medio con viraje del indicador (rojo de fenol) al amarillo.
- Permite detectar la producción del sulfuro de hidrógeno por ennegrecimiento del medio debido a la
formación de sulfuro ferroso.
Técnica:
- Inocular la superficie del pico de flauta con estría y el fondo por punción.
- Incubar a 37ºC.
- Efectuar la lectura luego de 18-24 h de incubación.
Interpretación:
Fermentación de azúcares:
Las reacciones que pueden observarse son:
• Pico alcalino (rojo) / fondo alcalino (rojo). No hay fermentación de azúcares.
• Pico alcalino (rojo) / fondo ácido (amarillo). Glucosa fermentada. Lactosa y sacarosa no
fermentadas.
• Pico ácido (amarillo) / fondo ácido (amarillo). Glucosa fermentada. Lactosa y/o sacarosa
fermentadas.
Producción de gas:
• Se evidencia por la aparición de burbujas o fragmentación del medio.
Sulfuro de hidrógeno:
• Se evidencia por el ennegrecimiento del medio.
b) Utilización de Citrato
Fundamento:
- Determina si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el
metabolismo, produciendo alcalinidad. El medio Citrato de Simmons contiene también sales de
amonio inorgánicas. Un organismo que es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono,
utiliza también las sales de amonio como su única fuente de nitrógeno. Las sales de amonio se
desdoblan en amoníaco con la consiguiente alcalinidad. El indicador de pH usado es el azul de
40
bromotimol, el cual en medio alcalino toma un color azul intenso, indicando una prueba positiva. El
medio no inoculado tiene color verde.
Técnica:
- Incubar a 37ºC durante 48 h (a veces se requiere incubación más prolongada).
Interpretación:
• Prueba positiva: desarrollo de color azul
• Prueba negativa: el medio conserva el color verde original y hay ausencia de desarrollo
bacteriano.
c) Sulfuro, indol, movilidad (SIM)
Fundamento:
- Permite detectar la producción de indol, producto de la degradación metabólica del aminoácido
triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. El indol desdoblado de la molécula de
triptofano puede ser detectado cuando reacciona con el grupo aldehído del para-dimetilamino
benzaldehído del reactivo revelador (reactivo de Kovacs), formándose un complejo de color rojo.
- Determina si el microorganismo es móvil por migración a partir del lugar de siembra y se disemina
en el medio provocando turbidez.
Técnica:
- Sembrar por punción única en la región central del tubo, utilizando una aguja recta hasta una
profundidad de 2/3 del medio.
- Incubar a 37ºC durante 18-24 h.
- Agregar 2 ó 3 gotas del reactivo de Kovacs para detección del indol.
41
Interpretación:
• Prueba positiva: Se observa ennegrecimiento del medio.
Indol:
• Prueba positiva: color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el medio.
• Prueba negativa: no hay modificación del color en la interfase del reactivo y el medio.
Movilidad:
• Prueba positiva: Se visualiza turbidez parcial o total del medio.
• Prueba negativa: Hay crecimiento bacteriano solamente en la línea de siembra.
d) Movilidad, indol, ornitina (MIO)
Fundamento:
- Determina si el microorganismo es móvil por migración a partir del lugar de siembra y se disemina
en el medio provocando turbidez.
- Permite detectar la producción de indol, producto de la degradación metabólica del aminoácido
triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. El indol desdoblado de la molécula de
triptofano puede ser detectado cuando reacciona con el grupo aldehído del para-dimetilamino
benzaldehído del reactivo revelador (reactivo de Kovacs), formándose un complejo de color rojo.
- Detecta la capacidad de un microorganismo de decarboxilar la ornitna. Las decarboxilasas son un
grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos carboxilo de los aminoácidos produciendo
aminas, de reacción alcalina. Cada una de las decarboxilasas es específica para un aminoácido. La
ornitina puede ser decarboxilada transformándose en putrescina. Esto produce un viraje al violeta del
indicador púrpura de bromocresol. Como la decarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH
inferior a 6), es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de cultivo, por
fermentación de la glucosa. Por este motivo este medio de cultivo sólo debe utilizarse para la
diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no producen ornitina -
decarboxilasa pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje del medio al amarillo. La
incubación por 24 h produce una alcalinización en la superficie del medio de cultivo y
consecuentemente un viraje del pico del medio al color violeta.
Técnica:
- Sembrar por punción en el centro del medio de cultivo hasta el fondo del tubo.
- Agregar 2 ó 3 gotas del reactivo de Kovacs para la lectura del indol.
42
Interpretación:
Movilidad:
• Prueba positiva: Se visualiza turbidez parcial o total del medio.
• Prueba negativa: Hay crecimiento bacteriano solamente en la línea de siembra.
Indol:
• Prueba positiva: color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo.
• Prueba negativa: no hay modificación del color en la interfase del reactivo y el caldo.
Ornitina:
• Prueba positiva: Pico violeta / fondo violeta
• Prueba negativa: Pico violeta / fondo amarillo
e) Fermentación de hidratos de carbono ( Medio Rojo Fenol)
Fundamento:
- Se produce el viraje del color del indicador si el microorganismo tiene la capacidad de fermentar el
hidrato de carbono presente en el medio.
Técnica:
- Sembrar una ansada del aislamiento en 1ml de medio rojo fenol con hidrato de carbono específico al
1%.
- Para todos los azúcares se deben realizar lecturas diarias durante 7 días, con la excepción del sorbitol
que se debe efectuar a las 24 h.
Interpretación:
• Prueba positiva: Se observa viraje del indicador al amarillo.
f) Actividad β-glucuronidasa
Fundamento:
- Se evidencia la formación de un producto cromogénico amarillo por la actividad de la enzima β-
glucuronidasa sobre el glucurónido.
Técnica:
- Se realiza una suspensión bacteriana con 0,2 ml de agua destilada estéril (pH 7) y una ansada del
aislamiento a identificar.
- Se incorpora un disco impregnado con el glucurónido.
43
- Se incuba a 37ºC durante 4 h.
Interpretación:
• Prueba positiva: Se observa coloración amarilla por la formación del producto
cromogénico.
• Aquellas suspensiones en las cuales no se observa viraje durante las primeras 4 horas se
deben incubar durante 2 horas adicionales.
g) Lisina, Hierro, Agar (LIA)
Fumdamento:
- Detecta la capacidad de un microorganismo de decarboxilar la lisina. Las decarboxilasas son un
grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos carboxilo de los aminoácidos produciendo
aminas, de reacción alcalina. Cada una de las decarboxilasas es específica para un aminoácido. La
lisina puede ser decarboxilada transformándose en cadaverina. Esto produce un viraje del indicador
púrpura de bromocresol al violeta. Como la decarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH
inferior a 6), es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de cultivo, por
fermentación de la glucosa. Por este motivo este medio de cultivo sólo debe utilizarse para la
diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no producen lisina
decarboxilasa pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje del medio al amarillo. La
incubación de 24 h ocasiona una alcalinización en la superficie del medio de cultivo y
consecuentemente un viraje del pico al color violeta. Las cepas Proteus y Providencia, con excepción
de algunas cepas de Morganella morganii, desaminan la lisina y producen ácido alfa-ceto-carbónico.
Este último, con la sal de hierro y por la influencia de oxígeno forma combinaciones pardo-rojizas en
la región superficial del medio de cultivo.
Técnica:
Interpretación:
Decarboxilación de la lisina:
• Prueba positiva: pico violeta / fondo violeta
• Prueba negativa: pico violeta / fondo amarillo
44
Desaminación de la lisina:
• Prueba positiva: pico pardo rojizo / fondo amarillo
• Prueba positiva: Se observa ennegrecimiento del medio.
h) Producción de pigmento amarillo
Fundamento:
- Las cepas de E. hermannii producen con su desarrollo un pigmento amarillo.
Técnica:
- Cultivar los aislamientos en agar tripticasa de soja a 37 ºC por 18 a 24 h.
- Observar la aparición del pigmento amarillo.
- En ausencia del pigmento dejar incubando a 37ºC y observar el cultivo diariamente por siete días.
2.6.- Biotipificación de E. coli O157:H7

Las cepas de E. coli O157:H7 se clasifican en los biotipos A, B, C, D, según la capacidad de fermentar
los azúcares rafinosa, dulcitol y ramnosa.
Ver FIGURA 6
Fundamento:
- Si el microorganismo fermenta el hidrato de carbono presente en el medio, se produce viraje en el
color del indicador.
Medios
• Medio para fermentación de azúcares (Medio Rojo Fenol) con rafinosa
• Medio para fermentación de azúcares (Medio Rojo Fenol ) con dulcitol
• Medio para fermentación de azúcares (Medio Rojo Fenol) con ramnosa
• Ansa de rulo
45
Técnica:
- Seguir procedimiento 2.5.e), Fermentación de hidratos de carbono.(Medio Rojo Fenol), para probar
la capacidad de fermentar rafinosa, dulcitol y ramnosa.
- Realizar lecturas diarias durante 7 días.
- Determinar el biotipo del aislamiento según los resultados de la fermentación.
Interpretación:
• Fermentación positiva: Se observa viraje del indicador al amarillo.
El biotipo se establece según la siguiente tabla:
Prueba Biotipo E. coli O157:H7
A B C D
Rafinosa + + + +
Dulcitol - + + -
Ramnosa - - + +
2.7.- Sensibilidad a los antimicrobianos
Se utiliza el método de difusión en agar por discos (antibiograma) según la técnica de Kirby -Bauer.
Todo el proceso debe responder a las normas establecidas por la NCCLS, en lo referente a la siembra
en las placas, condiciones de los discos, aplicación de los mismos, incubación, lectura por medición de
la zona de inhibición, significado de las colonias que pudieran aparecer dentro de los halos y
utilización de cepas patrones.
Medios
• Placas de agar Mueller Hinton (MH) pH 7,2-7,4.
• Discos con antibióticos para amicacina ampicilina, ciprofloxacina colistin, cloranfenicol,
gentamicina, ácido nalidíxico, norfloxacina, estreptomicina, tetraciclina y trimetoprima-
sulfametoxazol
• Cepas patrones ATCC 25922
• Tubos testigos de la Escala de McFarland
46
Equipamiento
• Hisopo estéril
• Ansa de aguja
• Pinza para discos con antibiótico
• Frezzer -20ºC
• Heladera 4ºC
• Calibre para medir halos de inhibición
Procedimiento Comentario
1º Día
1. Secar las placas de MH a 37ºC durante • Para realizar el antibiograma se debe
30-60 minutos. eliminar la humedad superficial de las placas.
2. Colocar los discos con antibióticos a • Se utilizan discos para los siguientes
temperatura ambiente antes de usarlos. antibióticos: amicacina, ampicilina,
ciprofloxacina, colistin, cloranfenicol,
gentamicina, ácido nalidíxico,
nitrofurantoina, estreptomicina, tetraciclina y
trimetoprima-sulfametoxazol
• Los discos deben conservarse en heladera a
4ºC o en frezzer a -20ºC.
3. Preparar la suspensión bacteriana que se • Siempre se deben probar cepas patrones
utiliza como inóculo en el antibiograma. paralelamente con los aislamientos en
Tomar con ansa de aguja colonias estudio.
aisladas del cultivo a ensayar y
resuspender en 2 ml de SF hasta obtener
una turbidez correspondiente al testigo 5
(Cl2Ba 0,5 %) de la escala de
McFarland.
4. Con hisopo estéril previamente
embebido con el inóculo y escurrido en
las paredes del tubo, estriar las placas de
MH en tres direcciones.
5. Dejar estabilizar las placas hisopadas a
temperatura ambiente por 5 minutos.
6. Tomar con pinza y colocar sobre la • Colocar 6 discos por placa como máximo.
47
placa hisopada los discos con

antibiótico.
7. Incubar en estufa de cultivo a 37ºC por
18-24 h.
2º Día
1. Efectuar la lectura de los halos de • Para la interpretación, los resultados deben
inhibición, correspondientes a cada cotejarse con las tablas publicadas por
disco, con calibre. NCCLS (M100-S13, Enero 2005).
48
Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli

O157 con tamizaje por PCR multiplex
Separación Materia fecal
Inmunomagnética (suspensión)
Ensayo CTS CT-CTS

inmunocromatográfico
37ºC x 6 h 37ºC x 6 h
Agar MacConkey Sorbitol SMAC

(SMAC) SMAC
37ºC x 18 h 37ºC x 18 h 37ºC x 18 h
Seroagrupamiento presuntivo O157
Tamizaje PCR Multiplex stx1/stx2/rfbO157

zona de confluencia, colonias sorbitol (-) y sorbitol (+)
PCR (-) PCR (+)
• Aislamiento
• Identificación bioquímica
Descartar
• Fenotipo enterohemolítico
• Sorbitol en tubo
• β-glucuronidasa
• Biotipificación STEC O157
• Serotipificación
• Sensibilidad a ATB
Caracterización por PCR

• eae, EHEC-hlyA, fliCH7
Centro Nacional de Referencia

• Citotoxicidad especifica células Vero
• Subtipificación de STEC
Genotipo de variantes stx
Fagotipificación STEC O157
PFGE
49
Algoritmo para el diagnóstico y caracterización

de Escherichia coli O157
Materia fecal
(suspensión)
CTS CT-CTS
37ºC x 6 h 37ºC x 6 h
Agar MacConkey Sorbitol
(SMAC) SMAC SMAC
37ºC x 18 h
37ºC x 18 h 37ºC x 18 h
Seroagrupamiento presuntivo O157
Seroagrupamiento (-) Seroagrupamiento (+)
• Aislamiento
• Identificación bioquímica
• Fenotipo enterohemolítico
Detección de Stx
• Sorbitol en tubo
por alguna metodología
• β -glucuronidasa
• Biotipificación STEC O157
• Serotipificación
• Sensibilidad a ATB
Centro Nacional de Referencia

• Caracterización por PCR
stx1, stx2, rfbO157, eae,
EHEC-hlyA , fliCh7
• Citotoxicidad especifica células Vero
• Subtipificación de STEC
Genotipo de variantes stx
Fagotipificación STEC O157
PFGE
50
FIGURA 1
Esquema de detección de E. coli O157:H7/NM por inmunocromatografía
Ac anti-especie
Zona
control Ac anti-LPSO157+ oro coloidal
Sentido de la migración
Ac anti-LPSO157+ oro coloidal
Zona de Antígeno LPSO157

ensayo
Ac anti-LPSO157
1º Zona Ac anti-LPSO157+ oro coloidal

de reacción
Antígeno LPSO157
Zona de
siembra
51
FIGURA 2
Aglutinación con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos anti-O
Reactivo Reactivo control

de latex de latex
Cepa control negativo
Cepa control positivo
Cepa problema autoaglutinada
Cepa problema positiva
52
FIGURA 3
Prueba y estimulación de la movilidad bacteriana
3A- Siembra del primer pasaje
1- Medio de Craigie con varilla de vidrio central.

2- Siembra del medio de Craigie con ansa de aguja en el interior de la varilla de vidrio,
correspondiente al tercio superior del medio de cultivo.
53
3B- Lectura de la movilidad a las 18 – 24 h
1- Cepa STEC móvil

2- Cepa STEC no móvil
54
3C- Siembra de pasajes sucesivos
1- Picar con el ansa de aguja, la superficie del medio de cultivo desarrollado, en la parte
externa a la varilla.
2- Sembrar con el ansa cargada el interior de la varilla (tercio superior del medio de cultivo)
de un tubo con medio de Craigie.
55
FIGURA 4
Prueba de la Enterohemolisina (EHEC-Hly)
1- Aislamiento de E. coli O157:H7 EHEC-Hly positivo

2- Cepa de Referencia E. coli 32511 EHEC-Hly positiva
3- Cepa de Referencia E. coli 25922 EHEC-Hly Negativa
56
FIGURA 5
Pruebas Bioquímicas de Escherichia coli productor de toxina Shiga
1 2 3 4 5
1- TSI: Pico ácido/fondo ácido con producción de gas, SH2 negativo

2- Utilización del Citrato: negativo
3- SIM: SH2 negativo, Indol: positivo, movilidad: positiva
4- LIA: decarboxilación de la lisina positiva, SH2: negativa
5- Fermentación de celobiosa: negativa
57
FIGURA 6
Actividad de β-glucuronidasa y Biotipificación de E. coli O157
1 2 3 4 5
1- Actividad β -glucuronidasa: negativa

2- Fermentación del sorbitol: negativa
3- Fermentación de rafinosa: positiva
4- Fermentación de dulcitol: positiva
5- Fermentación de ramnosa: positiva
58
CARACTERIZACION DE Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga

Fecha: ..............................
Nº de Muestra: .................
Prueba Aislamiento E. coli E. coli E. hermanii E. coli

presuntivo EDL933 32511 ATCC
O157:H7 O157:H- 25922
Morfología de las SMAC
colonias
Sero- Antisuero anti-O
Agrupamiento Látex anti-O
TSI
Citrato de
Simmons
SIM
MIO
Bioquímica
Sorbitol
Actividad
ß-glucuronidasa
LIA
Celobiosa
Pigmento amarillo
Hemólisis EHEC-Hly
Rafinosa
Biotipificación
Dulcitol
STEC O157
Ramnosa
Serotipificación Antisuero anti-H
Acido Nalidíxico
Amikacina
Ampicilina
Sensibilidad a los Ciprofloxacina
antimicrobianos Cloranfenicol
Colistin
Estreptomicina
Gentamicina
Nitrofurantoína
Tetraciclina
Trimetoprima
sulfametoxazol
59
CAPITULO III - DETECCION DE FACTORES DE VIRULENCIA
1.- Detección genotípica de los factores de virulencia por la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)
Fundamento de la Técnica de PCR

La replicación enzimática de una molécula blanco o templado de ADN, mediante ciclos repetitivos de
amplificación, permite obtener un producto fácilmente detectable.
Equipamiento
• Termociclador para PCR
• Micropipeta para reactivos de PCR rango: 0,5 - 10 µl
• Micropipeta para reactivos de PCR rango: 5 - 40 µl
• Micropipeta para reactivos de PCR rango: 40 - 200 µl
• Micropipeta para el templado de ADN rango: 0,5 - 10 µl
• Micropipeta para amplicones: 5- 40 µl
• Baño de agua para hervir
• Microcentrifuga para tubos Eppendorf
• Cuba y fuente de poder para electroforesis
• Transiluminador UV
• Freezer -20ºC
• Heladera 4ºC
Materiales
• Ansa de aguja
• Tubos Eppendorf 1,5 ml
• Microtubos pared delgada PCR 0,2 ml
• Tips con filtro para aerosoles
• Recipiente con hielo
Reactivos
• Buffer Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X
• Buffer PCR10X
• Mezcla de dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, y dTTP: 2,5 mM
• Cl2Mg 25 ó 50 Mm
• Par de primers específicos: 0,1 nmol/µl
68
• Taq polimerasa: 5U/µl

• Agua tridestilada estéril (H2O ddd)
• Aceite mineral
• Agarosa
• Buffer TAE 1X
• Bromuro de Etidio (BrEt): 10 mg/ml
• Buffer de siembra 1: Xilene cyanol 0,25%, glicerol en agua 30%
• Buffer de siembra 2: Azul de Bromofenol 0,25%, glicerol en agua 30%
• Marcador de tamaño molecular: 100 pb
• Marcador de tamaño molecular: 1 kb
a) Preparación de la muestra
1. Tomar una ansada de cultivo • La técnica de PCR es de muy alta
correspondiente a la zona de crecimiento sensibilidad. Se recomienda establecer
confluente de las placas de SMAC. diferentes áreas de trabajo para evitar la
obtención de falsos resultados positivos por
contaminaciones cruzadas:
1. Área de procesamiento de la muestra y
obtención del ADN.
2. Área de preparación de la mezcla de
reacción.
3. Área para el agregado del templado y
amplificación.
4. Área de detección de los productos de
amplificación.
2. Resuspender la muestra en 150 µl de • Fraccionar el buffer Tritón en tubos
buffer Tritón X-100 al 1% en buffer TE Eppendorf de 1,5 ml de capacidad, en el área
1X. de preparación de la mezcla de reacción.
Utilizar micropipeta para uso exclusivo de
reactivos, y tips con filtro para aerosoles.
Luego trasladar los tubos al área de
procesamiento de la muestra para preparar el
extracto de ADN.
• Frotar el ansa cargada de muestra contra las
paredes del tubo con buffer Tritón.
69
3. Además, seleccionar 5 colonias

presuntivas con igual morfología, de las
placas de SMAC.
4. Picar las colonias con ansa de aguja y • Frotar el ansa contra las paredes del tubo.
resuspenderlas en 150 µl de Buffer
Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X.
5. Preparar el extracto de ADN de las cepas • Verificar las cepas de referencia que se
de referencia que serán utilizadas como utilizan en cada protocolo de PCR.
controles (positivo y negativo) en la
reacción. Seguir los pasos 3, 4, y 6.
6. Hervir en baño de agua a 100ºC durante • El efecto conjunto del detergente Tritón y el
15 minutos calentamiento produce la lisis bacteriana y la
liberación del ADN.
• Tomar la precaución de cerrar bien los tubos
Eppendorf antes de hervir.
7. Centrifugar a 10.000 rpm durante 5 • Luego de la centrifugación, se obtiene un
minutos. pellet correspondiente al debris bacteriano y
un sobrenadante donde se encuentra el ADN.
8. Conservar el extracto de ADN a 4ºC • El extracto de ADN puede conservarse en
para ser utilizado como templado en la freezer a -20ºC para ser utilizado en otra
reacción de PCR. PCR. Conservarlos en un área libre de
reactivos.
• Si el extracto es descongelado, es necesario
realizar una centrifugación a 10.000 rpm por
5 minutos antes de utilizarlo.
b) Preparación de la mezcla de reacción

1. Retirar los reactivos para la PCR del • Los reactivos para PCR deben conservarse en
freezer de -20ºC. Esperar que los freezer a -20ºC en un área específica para tal
mismos se descongelen y colocarlos en fin.
un recipiente con hielo.
2. Establecer el número de • Realizar el siguiente cálculo para determinar
determinaciones y completar el el número de determinaciones:
protocolo de la PCR a realizar (Ver Nº de Nº de muestras Control Control Control
determinaciones = presuntivas + Positivo + Negativo + Reactivos + 1
Protocolo específico)
70
• Se suma 1 para calcular, en exceso, el

volumen total de la mezcla de reacción. Se
contempla de esta manera los probables
errores de pipeteo que pueda cometer el
operador.
3. Para cada reactivo, calcular los • Las concentraciones de los reactivos de
volúmenes necesarios en la mezcla de trabajo, de los reactivos en la mezcla y los
reacción, de acuerdo al número de volúmenes de los reactivos para una
determinaciones determinación, se indican en el protocolo
específico de cada PCR.
• Realizar el siguiente cálculo para determinar
el volumen de cada reactivo en la mezcla:
Vol. del Rvo. en la Vol. del Rvo. en la Nº de
mezcla para n = mezcla para una x determinaciones
determinaciones determinación
4. Enumerar los microtubos de 0,2 µl de • Marcar la pared del tubo utilizando una fibra
acuerdo al Nº de muestras. indeleble.
5. Preparar la mezcla en un tubo Eppendorf • Preparar la mezcla en un área o superficie
de 1,5 ml. agregando los reactivos en el libre de bacterias, muestras de ADN o
siguiente orden: productos amplificados.
a. H2O ddd • Utilizar micropipetas exclusivas para
b. Buffer PCR reactivos de PCR y tips con filtro para
c. dNTPs aerosoles.
d. Cl2Mg • Homogenizar los reactivos antes de usarlos.
e. Primers • La enzima debe permanecer siempre a -20ºC
f. Taq polimerasa para evitar que baje su actividad.
• En el momento que deba ser utilizada,
retirarla del freezer y colocarla rápidamente
en un bloque frío.
6. Resuspender la mezcla con micropipeta • Descartar el resto de volumen que queda en el
y fraccionar 48 µl en cada microtubo de tubo de 1,5 ml. Este sobrante, corresponde al
PCR. volumen de muestra para una determinación
calculado previamente en exceso.
7. Cerrar y trasladar los microtubos de
PCR al área de carga de los templados y
donde se encuentra el termociclador.
71
c) Carga de los templados y amplificación

1. Agregar a cada microtubo, 2 µl del • Para cargar los templados se debe utilizar una
templado correspondiente. Al microtubo micropipeta exclusiva para manipulear ADN
de control de reactivos se agrega 2 µl de y tips con filtro para aerosoles.
H2O ddd. • El volumen del templado se toma del
sobrenadante del tubo donde se prepara el
extracto de ADN.
2. Agregar una gota de aceite mineral a • Se agrega aceite mineral para evitar que la
cada microtubo. mezcla de reacción se evapore cuando es
sometida a las diferentes temperaturas del
programa de amplificación. No es necesario
el agregado de aceite mineral cuando se
dispone de un termociclador con tapa
aseguradora de tubos.
3. Colocar los microtubos en el • Tomar la precaución de cerrar correctamente
termociclador y activar el programa de los microtubos.
amplificación específico para cada PCR.
(Ver Protocolo PCR)
d) Detección del producto de amplificación

1. Preparar un gel de agarosa en buffer • Se deberá preparar un gel de una consistencia
TAE 1X. (Ver en el protocolo de cada tal, que permita separar y visualizar
PCR que porcentaje de agarosa se utiliza correctamente las bandas después de realizar
para preparar el gel) la corrida electroforética. La concentración de
agarosa a utilizar depende del tamaño de la
banda del producto amplificado.
• Armar la bandeja o el molde para el gel de
agarosa.
• Colocar el peine o molde para hoyos.
• Disolver la agarosa en buffer TAE 1X en
microondas ó en baño de agua caliente.
• Dispensar BrEt hasta una concentración final
de 0,5 µg/ml. Agregar antes que gelifique el
gel y mezclar para homogenizar.
72
El BrEt es agregado al gel para poder

visualizar el ADN. Esta droga es
potencialmente tóxica por sus propiedades
mutagénicas. Se recomienda utilizar guantes
para su manipulación.
• Dejar gelificar y retirar el peine del gel.
• Colocar el molde con el gel en la cuba
electroforética. La molécula de ADN tiene
carga negativa y en la corrida electroforética
migra hacia el polo positivo de la cuba. Por lo
tanto orientar el gel de manera que la zona
de siembra quede conectada al borne
negativo.
• Cubrir con buffer TAE 1X. El buffer debe
penetrar en los hoyos y sobrepasar la
superficie del gel en 0,5 cm.
2. Retirar los microtubos del termociclador
y llevar al área de detección del producto
de amplificación.
3. Diluir los amplificados en buffer de • El buffer de siembra 1 esta compuesto por
siembra 1. Xilene cyanol (0,25%) y glicerol en agua
(30%).
• El glicerol arrastra al ADN hacia el fondo del
hoyo y el colorante Xilene marca el fondo de
corrida.
• Se debe diluir una parte del buffer de siembra
1 (6X) en 5 partes del amplificado.
4. Sembrar los amplificados en el gel. • Utilizar una micropipeta de uso exclusivo
para la siembra de geles.
5. Sembrar paralelamente un marcador de • La elección del marcador de tamaño
tamaño molecular diluido en buffer de molecular dependerá del tamaño del
siembra 2. (Ver el marcador de tamaño fragmento a amplificar. El marcador
molecular que es sugerido en cada adecuado es aquel que permite establecer si la
protocolo de PCR ) banda obtenida para cada producto
amplificado, es del tamaño esperado.
• El buffer de siembra 2 esta compuesto por
73
Azul de Bromofenol 0,25% y glicerol en agua

30%.
• El colorante Azul de Bromofenol marca el
frente de corrida. Se debe diluir una parte del
buffer de siembra 2 (6X) en 5 partes del
marcador.
6. Conectar la cuba a la fuente de poder.
7. Realizar la corrida electroforética a 80
Volts por 30-40 minutos.
8. Colocar el gel en el UV-transiluminador • Una exposición inadecuada a luz ultravioleta
puede dañar la piel y los ojos. Se recomienda
usar anteojos protectores de UV.
• Observar en la calle del control positivo, la
presencia de bandas específicas cuyo tamaño
corresponde al fragmento amplificado. No se
deben visualizar bandas en las calles del
control negativo y del control de reactivos.
• Observar y registrar en el protocolo, la
presencia de bandas específicas en las calles
correspondientes a las muestras presuntivas.
• Descartar el gel de agarosa con BrEt
siguiendo las normas para la eliminación de
residuos tóxicos.
74
1.1.- PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157
Se utilizan los oligonucleótidos o “primers” iniciadores de Pollard et al., que amplifican un fragmento
de 130 pb de la región del gen correspondiente a la subunidad B para Stx1 y un fragmento de 346 pb
de la región del gen correspondiente a la subunidad A para Stx2 y los oligonucleótidos iniciadores de
Paton et al, que amplifican un fragmento de 259 pb del gen rfb correspondiente al LPS O157.
Tamaño
Primer Secuencia del primer (5’-3’) del fragmento de
amplificación (pb)
stx1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG 130
stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA
stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT 346
stx2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT
O157F CGGACATCCATGTGATATGG 259
O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCC
Productos de amplificación por PCR para la detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157 en cepas de referencia y
en cepas STEC de distinto origen. Líneas 1 y 13: control positivo E. coli EDL933 stx1/stx2/rfbO157+. Líneas 2 y
4: E. coli O157:H7 stx2/rfbO157+, aislados de casos de SUH. Líneas 3 y 8: E. coli O157 rfbO157+, aislados de
alimentos. Líneas 5, 6, 7 y 10: E. coli stx2+, aislados de casos de diarrea. Lineas 9 y 11: E. coli stx1+, aislados de
casos de diarrea. Línea 12: control negativo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia. Linea 14: control de
reactivos (mezcla sin templado). Línea 15: marcador de tamaño molecular Cien Marker.
Referencias
• Pollard DR, Johnson WM, Lior H, Tyler SD, Rozee KR. Rapid and specific detection of verotoxin
genes in Escherichia coli by the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1990; 28:540-5
• Paton A, Paton J. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using
Multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and
rfbO157. J. Clin. Microbiol. 1998; 36:598-602.
75
1.1.1.-Protocolo PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157
Cepas de referencia Control

E. coli EDL933, O157:H7 Stx1/Stx2 Positivo
E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia Negativo
Programa de amplificación
Paso Nº Etapa Temperatura Tiempo Va al paso Nº veces
ºC Nº
1 Desnaturalización 94 5 min
2 Desnaturalización 94 30 seg
3 Pegado de primers 58 30 seg
ó
Annealing
4 Extensión 72 30 seg 2 29
5 Extensión 72 2 min
6 Pausa 4
Características del gel Marcador de peso molecular

Agarosa al 2% en buffer TAE 1X 100 pb
Tamaño de los fragmentos

Primers Tamaño del
Fragmento (pb)
stx1a / stx1b 130
stx2a / stx2b 346
O157F / O157R 259
76
Protocolo PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157 Fecha:
Volumen del Volumen del

Concentración Concentración del reactivo en la reactivo en la
Reactivo de trabajo del reactivo en la mezcla para una mezcla para Nº
reactivo mezcla determinación determinaciones
µl)
(µ µl)
(µ
Buffer 10X 1X 5
Mezcla dNTP 2,5 mM 0,1 mM 2
Cl2Mg 1,5 mM 3
25 mM*
Primer stx1a 0,1 nmol/µl 2 pmol/µl 1

Primer stx1b 0,1 nmol/µl 2 pmol/µl 1
Primer stx2a 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2
Primer stx2b 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2
Primer O157F 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2
Primer O157R 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2
Taq polimerasa 5 U/µl 0,02 U/µl 0,2
Templado 2
H2O ddd 35
Vol. Final 50
* La concentración del Cl2Mg puede variar según la marca comercial del equipo de la Taq polimerasa.
En general se comercializa el Cl2Mg a 25 ó 50 mM. Si se dispone la concentración de 50 mM, se
utiliza 1,5 µl de Cl2Mg y 36,5 µl de H2O ddd por determinación.
Microtubo Identificación de la muestra Colonia Resultado

Nº Nº
1 #1
2 #2
3 #3
4 #4
5 #5
6 #6
7 #7
8 #8
9 Control positivo EDL933
10 Control negativo ATCC 25922
N Control reactivos
77
1.2.- PCR factor eae

Se utilizan los “primers” iniciadores de Karch et al., que amplifican un fragmento de 864 pb de la
región conservada del gen eae para EPEC y de EHEC.
Tamaño
amplificación (pb)
SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864
SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
864 pb
Productos de amplificación por PCR para la detección del gen eae en cepas de referencia y en una cepa de STEC
de origen clínico. Línea 1: E. coli O145:NM Stx2 / eae+, aislado de un caso de SUH. Línea 2: control negativo
E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia. Líneas 3 y 4: controles positivos E. coli 2348/68 eae+ (EPEC) y
E. coli E32511 eae+ (STEC). Línea 5: control de reactivos (mezcla sin templado). Línea 6: marcador de tamaño
molecular Cien Marker.
Referencia
• Karch H, Bohm H, Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S, Heesemann J. Clonal structure and
pathogenicity of Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H-. J.
Clin. Microbiol.1993; 31: 1200-5.
78
1.2.1-Protocolo PCR factor eae

E. coli 2348/69 (EPEC) Positivo
E. coli E32511 (STEC) Positivo
ºC Nº
3 Pegado de primers 54 1 min
ó
annealing
4 Extensión 72 2 min 2 29
6 Pausa 4

Tamaño del fragmento

Primers Tamaño del
Fragmento (pb)
SK1 / SK2 864
79
Protocolo PCR factor eae Fecha:

µl)
(µ µl)
(µ
Buffer 10X 1X 5
Mezcla dNTP 2,5 mM 0,1 Mm 2
Cl2Mg 1 mM 2
25 mM*
Primer SK1 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/ul 0,2

Primer SK2 0,1 nmol/ul 0,4 pmol/ul 0,2
Taq polimerasa 5 U/ul 0,02 U/ul 0,2
Templado 2
H2O ddd 38,4
Vol. Final 50
*La concentración del Cl2Mg puede variar según la marca comercial del equipo de la Taq polimerasa.
utiliza 1 µl de Cl2Mg y 39,4 µl de H2O ddd por determinación.
Microtubo Nº Identificación de la muestra Colonia Resultado

Nº
1 #1
2 #2
3 #3
4 #4
5 #5
6 #6
7 #7
8 Control positivo 2348/69
9 Control positivo E32511
N Control reactivos
80
1.3.- PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA)

Se utilizan los “primers” iniciadores de Schmidt et al., que amplifican un fragmento de 1551pb de la
región 5’ del gen EHEC-hlyA.
Tamaño
amplificación (pb)
hlyA1 GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG 1551
hlyA4 TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA
1551 pb
Productos de amplificación por PCR para la detección del gen EHEC-hlyA en cepas de referencia y en cepas
STEC de origen clínico. Línea 1: marcador de tamaño molecular 1kb. Línea 2: control negativo E. coli ATCC
25922 sin factores de virulencia. Línea 3: control positivo E. coli E32511 EHEC-hlyA+. Líneas 4: E. coli
O157:H7 stx2/EHEC-hlyA+ aislado de un caso de SUH. Linea 5: E. coli O145:NM stx2/ EHEC-hlyA+ aislado de
un caso de diarrea sanguinolenta. Línea 6 control de reactivos (mezcla sin templado)
Referencia
• Schmidt H, Beutin L, Karch H. Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of
Escherichia coli O157:H7 stain EDL 933. Infect. Immun. 1995; 63:1055-61.
81
1.3.1-Protocolo PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA)

E. coli E32511 Positivo
ºC Nº
ó
annealing
5 Extensión 72 3min
6 Pausa 4

Agarosa al 0,8% en buffer TAE 1X 1 kb

Primers Tamaño del
Fragmento (pb)
hlyA1 1551
hlyA4
82
Protocolo PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA) Fecha:

µl)
(µ µl)
(µ
Buffer 10X 1X 5
Cl2Mg 1,5 mM 3
25 Mm*
Primer hlyA1 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2

Primer hlyA4 0,1 nmol/µl 0,4 pmol/µl 0,2
Templado 2
H2O ddd 37,2
Vol. Final 50

Nº
1 #1
2 #2
3 #3
4 #4
5 #5
6 #6
7 #7
8 #8
9 Control positivo E32511
N Control reactivos
83
1.4.- PCR antígeno flagelar h7

Se utilizan los “primers” iniciadores de Gannon et al., que amplifican un fragmento de 625-pb de la
región 5’ del gen fliCh7.
Tamaño
amplificación (pb)
FLICH7-F GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC 625
FLICH7-R CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC
625 bp
Productos de amplificación por PCR para la detección del gen fliCh7 en cepas de referencia y en cepas STEC de
origen clínico. Línea 1: control positivo E. coli EDL933 O157:H7. Líneas 2 y 3: E. coli O157:H7 aislado de un
caso de SUH. Línea 4: control negativo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia. Línea 5: control negativo
(mezcla sin templado). Línea 6: marcador de tamaño molecular Cien Marker.
Referencia
• Gannon VP, D’Souza S, Graham T, King RK, Rahn K, Read S. Use of the flagellar H7 gene as a
target in multiplex PCR assays and improved specificity in identification of enterohemorrhagic
Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol.1997; 35: 656-62.
84
1.4.1-Protocolo PCR antígeno flagelar h7

E. coli EDL933, O157:H7 Positivo

ºC Nº
ó
annealing
6 Pausa 4


Primers Tamaño del
Fragmento (pb)
FLICH7-F 625
FLICH7-R
85
Protocolo PCR antígeno flagelar h7 Fecha:

µl)
(µ µl)
(µ
Buffer 10X 1X 5
Cl2Mg 1,5 mM 3
25 mM*
Primer FLICH7-F 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3

Primer FLICH7-R 0,1 nmol/µl 0,6 pmol/µl 0,3
Templado 2
H2O ddd 36,2
Vol. Final 50

Nº
1 #1
2 #2
3 #3
4 #4
5 #5
6 #6
7 #7
8 #8
9 Control positivo EDL933
N Control reactivos
86
CAPITULO III – APENDICE
Composición y preparación de reactivos para PCR

Los reactivos utilizados pueden ser adquiridos comercialmente o pueden ser preparados como se
describe a continuación:
1. Buffer PCR 10X

• KCl 500 Mm
• Gelatina 0,1%
• Tris-HCl 100 mM (pH 8,3)
Este buffer forma parte del Kit Taq polimerasa y puede presentar variaciones según la marca
comercial.
2. Cl2Mg 25 ó 50 mM
Este reactivo forma parte del equipo de reacción de la Taq polimerasa
3. Nucleótidos trifosfatos
Reactivo de stock
• Set de dATP, dCTP, dGTP y dTTP 100 mM (c/u)
Reactivo de trabajo
Mezcla 2,5 mM de los cuatro nucléotidos
Para 1000 µl
• dATP 100 mM 25µl
• dCTP 100 mM 25µl
• dGTP 100 mM 25µl
• dTTP 100 mM 25µl
• H2O ddd 900µl
4. Primers
Se recomienda el uso de oligonucléotidos desalados. Para su reconstitución seguir las indicaciones del
fabricante. Llevar a una concentración de trabajo de 0,1 nmol/µl
87
5. Buffer Tris-EDTA (TE) 1X

• Tris- HCl 10 mM (pH 8)
• EDTA 1 mM (pH 8)
6. Buffer Tris-Acetato EDTA (TAE)

Solución concentrada 50X
Por litro
• Tris base 242 g
• Acido acético glacial 57,1ml
• 0,5 M EDTA (pH 8) 100 ml
Solución de trabajo 1X
• Se realiza una dilución 1:50 de la solución concentrada 50X.
7. Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X.

• Buffer TE 1X 50 ml (estéril)
• Tritón X-100 0,5 ml
Dispensar el Tritón en el buffer TE 1X y mezclar enérgicamente
8. Buffer de siembra 1
Para 100 ml
• Glicerol 30% 30 ml
• Xilene cyanol 0,25% 0,25 g
• Agua estéril 70 ml
9. Buffer de siembra 2
Para 100 ml
• Glicerol 30% 30 ml
• Azul de Bromofenol 0,25% 0,25 g
• Agua estéril 70 ml
10. BrEt (10mg/ml)

• Agregar 1 g de Bromuro de Etidio en 100 ml de agua. Mezclar con agitación magnética hasta
lograr la completa disolución de la droga. Conservar a 4ºC en un frasco oscuro.
88
CAPITULO IV – TECNICAS DIAGNOSTICAS EN CELULAS VERO
Las células Vero poseen una alta sensibilidad a las toxinas Shiga (Stx), y el ensayo de citotoxicidad
utilizando esta línea celular, es considerado la técnica “gold standard”. Estas células poseen en su
membrana plasmática una alta concentración de receptores Gb3 y Gb4, lo que permite detectar Stx1,
Stx2 y sus variantes.
Las técnicas diagnósticas en células Vero se utilizan para determinar la producción de Stx por los
aislamientos bacterianos, para la detección de Stx libre en la materia fecal del paciente y para la
detección de anticuerpos anti-Stx en el suero.
Estas técnicas son laboriosas, lentas y de alto costo, por lo que su uso está restringido a laboratorios de
mayor complejidad, fundamentalmente a los laboratorios de referencia.
1.- Detección de Stx en células Vero

1.1.- Obtención de la muestra
Medios
• Caldo Penassay (Medio de Antibióticos Nº 3, Difco)
• PBS 0,2M (1X) pH 7,2
• Sulfato de Polimixina B 8200 U/mg
• Cepa control de referencia E. coli O157:H7 C984 productor de Stx1
• Cepa control de referencia E. coli O157:H7 1271-84 productor de Stx2
• Tubos de vidrio de 30 ml
• Tubos de vidrio 13/100 con tapa a rosca
• Tubos de centrifuga de 16 ml
• Tubos de centrífuga de 50 ml
• Tubos Ependorff de 1,5 ml
• Erlenmeyer de 125 ml
• Probetas de 10 y 25 ml
• Pipeta descartable estéril de 10 ml
• Unidad filtrante de 0,22 µm
• Baja lengua
• Micropipeta rango: 200 -1000 µl
• Estufa de cultivo
• Agitador orbital termoestatizado
89
• Centrífuga refrigerada
• Microcentrífuga
A) Extracción de Stx a partir de aislamientos de Escherichia coli

1. Sembrar la cepa de E. coli en tubos de
ensayo de 30 ml de capacidad, conteniendo
10 ml de caldo Penassay (Medio de
Antibióticos Nº 3).
2. Incubar a 37ºC por 18 h sin agitación.

3. Transferir 1 ml del cultivo a un • Se utilizan Erlenmeyers de 125 ml de
Erlenmeyer de 125 ml de capacidad, capacidad porque permiten establecer un
conteniendo 25 ml de caldo Penassay. sistema de cultivo (medio líquido/aire)
óptimo para el desarrollo de la bacteria y la
producción de toxinas.
4. Incubar a 37ºC por 18 h, con agitación a
140 rpm.
5. Centrifugar el cultivo en tubos de 50 ml
a 8.000 rpm a 4ºC, durante 10 minutos.
6. Separar y conservar 5 ml del • Las cepas STEC liberan las toxinas al medio
sobrenadante en un tubo estéril. Esta de cultivo. La toxina Stx2 es producida y
muestra se identifica como Sbte. liberada al medio en forma continua durante
la fase de crecimiento exponencial, mientras
que la toxina Stx1 se acumula en el espacio
periplásmico de la bacteria con liberación al
final de la fase exponencial. Por lo tanto, el
efecto citotóxico del sobrenadante de cultivo
es debido principalmente a la Stx2.
7. Desechar el sobrenadante restante y
retener el pellet celular en el tubo de
centrífuga.
8. Resuspender el pellet en 1 ml de PBS
1X.
90
9. Pasar la suspensión a un tubo Ependorff

y centrifugar a 10.000 rpm a temperatura
ambiente, durante 2 minutos.
10. Descartar el sobrenadante y resuspender
el pellet en 1 ml de PBS 1X.
11. Centrifugar con las condiciones del
punto 9 y repetir 2 veces los pasos 10 y
11.
12. Descartar el sobrenadante del tercer • El antimicrobiano Polimixina B es utilizado
lavado y resuspender el pellet en 1 ml de para lisar la bacteria y liberar la toxina
una solución de Sulfato de Polimixina B retenida en el espacio periplásmico de la
en PBS (0,1mg/ml). bacteria. El efecto citotóxico del pellet es
debido principalmente a Stx1.
• Se debe preparar para realizar los puntos 12 y
13, un volumen de 3 ml por muestra de la
solución de Sulfato de Polimixina B en PBS
(0,1mg/ml).
13. Pasar la suspensión a un tubo de
centrifuga de 16 ml de capacidad y
agregar 2 ml de la solución de Sulfato de
Polimixina B en PBS (0,1mg/ml).
14. Incubar a 37ºC por 30 minutos con
agitación.
15. Centrifugar a 10.000 rpm, a 4ºC durante
2 minutos.
16. Conservar 5 ml del sobrenadante en un • La denominación de esta muestra como
tubo estéril y descartar el pellet. El “Pellet” se debe a que, proviene del producto
sobrenadante se identifica como Pellet. de la lisis del pellet bacteriano.
17. Filtrar las muestras de Sbte y Pellet con
unidad filtrante de 0,22 µm y conservar a
-20ºC hasta la realización del ensayo de
citotoxicidad.
91
Referencia
• Karmali MA, Petric M, Lim C, Cheung R, Arbus GS. Sensitive method for detecting low numbers
of verotoxin-producing Escherichia coli in mixed cultures by use of colony sweeps and polymyxin
extraction of verotoxin. J. Clin. Microbiol. 1985; 22: 614-9.
B) Extracción de Stx de Materia Fecal (StxMF)

1. Suspender y homogenizar 1 g de materia • Tomar 1 ml de la materia fecal si tiene
fecal en 3 ml de PBS 1X. consistencia líquida y resuspender en 2 ml de
PBS.
2. Centrífugar a 8.000 rpm, a 4ºC durante
15 minutos
3. Filtrar el sobrenadante con unidad
filtrante de 0,22 µ y conservar a -20ºC
hasta la realización del ensayo.
1.2-Ensayo de citotoxicidad
Se utiliza la técnica de cultivo de células Vero en microplacas.
Medios
• Microplaca Nunclon de 96 hoyos con 100 µl/hoyo de una suspensión de 1,4x105 células Vero, en
el medio 199 adicionado con 7% de suero fetal bovino (SFB) y gentamicina (50 µg/ml).
• Medio 199 sin el agregado de suero fetal bovino (SFB)
• Solución de cristal violeta (0,75%) en 40% de metanol.
• Cepa control de referencia E. coli O157:H7 C984 productor de Stx1
• Cepa control de referencia E. coli O157:H7 1271-84 productor de Stx2
• Extracto de materia fecal control positivo para StxMF
• Micropipeta rango: 5 - 40 µl
• Micropipeta multicanal de 8 canales rango: 40 - 200 µl
• Microplaca Nunclon de 96 hoyos y estéril
• Microscopio óptico invertido
• Estufa con 5% de CO2
92
A) Tamizaje para la detección de citotoxicidad por Stx de cepas STEC y por StxMF
1. Observar en el microscopio óptico • Verificar que la monocapa sea continua
invertido el estado de la monocapa de uniforme, de morfología normal y libre de
células Vero. contaminaciones con aumentos de 40x y
100x.
2. Sembrar por duplicado 25 y 50 µl por • Realizar un esquema de la microplaca
hoyo del Sbte y Pellet de cada una de las indicando donde se siembra cada muestra.
cepas problema y de cepas de referencia.
3. Sembrar 25 y 50 µl de los extractos de • En cada ensayo se debe utilizar como control
materia fecal y del extracto control un extracto positivo para StxMF.
positivo.
4. Incubar la microplaca a 37ºC en estufa • Introducir la placa en su envoltorio original o
con 5% de CO2. en un sobre de nylon para evitar
contaminaciones.
5. Realizar lecturas diarias observando la • A las 72 h se determina la actividad
microplaca con el microscopio citotóxica evidenciada por alteraciones de la
invertido. monocapa (células redondeadas y encogidas,
muchas flotando libres en el medio de
cultivo).
6. Descartar el contenido de las placas a las
72 h de incubación en un recipiente con
lavandina.
7. Teñir las células con solución de cristal • Para teñir las células se agregan 50 µl por
violeta 0,75% en metanol 40% y hoyo de la solución de cristal violeta. Se deja
confirmar que hoyos presentan el efecto a temperatura ambiente durante 15 minutos y
citotoxico característico producido por luego se lava con abundante agua.
Stx. • La tinción es una coloración vital. Las células
vivas se tiñen de color violeta mientras que
las células dañadas y muertas por el efecto
citotóxico no captan el colorante.
93
B) Titulación de la actividad citotóxica por Stx de cepas con tamizaje positivo

1. Realizar diluciones al medio de las • Seguir el siguiente procedimiento para
muestras positivas en medio 199 sin preparar las diluciones de las muestras
SFB. Incluir en cada ensayo extractos de positivas y de las cepas de referencia en
cepas de referencia productoras de Stx1 forma seriada:
y Stx2 y medio Penassay. - Realizar dos diluciones 1:10 y 1:100 de las
muestras en el medio 199 sin SFB en tubos
de vidrio.
- Colocar con micropipeta multicanal, 100 µl
de medio 199 sin SFB en toda la microplaca
Nunclon de 96 hoyos.
- Sembrar 100 µl de las diluciónes 1:100 de
cada una de las muestras en la columna 1
(hoyos A-H).
- Mezclar 10 veces el contenido de la primera
columna con micropipeta multicanal de 8
canales y con los mismos tips transferir 100
µl a la columna 2.
- Utilizando los mismos tips repetir el paso 4
para la columnas 2 hasta la 12.
- Transferir con micropipeta multicanal, 100 µl
de cada columna a la microplaca Nunclon de
96 hoyos con células Vero.
- Reservar las posiciones A-12 y B-12 para
agregar a las células Vero 100 µl de caldo
Penasay como control de células.
2. Incubar la microplaca a 37ºC en estufa • Introducir la placa en su envoltorio original o
con 5% de CO2. en un sobre de nylon para evitar
contaminaciones.
3. Realizar lecturas diarias observando la • A las 72 h se determina el título de la
microplaca con el microscopio actividad citotóxica.
invertido.
94
• El título es igual a la inversa de la dilución

más alta que presenta destrucción en el 50%
de la monocapa. Esta dilución se considera
una unidad citotóxica 50% (DC50)
Ejemplo:
51200 = 1 unidad DC50
25600 = 2 unidades DC50
12800 = 4 unidades DC50
4. Descartar el contenido de las placas a las
72 h de incubación, en un recipiente con
lavandina.
5. Teñir las células con solución de cristal
violeta 0,75% en metanol 40% y
confirmar el título de la actividad
citotóxica.
1.3. - Ensayo de especificidad para detectar StxMF

Se utiliza la técnica de neutralización en células Vero, empleando anticuerpos monoclonales a-Stx1 y
a-Stx2
Medios
• Extractos de materia fecal control positivo para Stx1MF y Stx2MF
Anticuerpos monoclonales
• MAb 13C4 (a-Stx1)
• MAb C5BB12 (a-Stx2)
• Los anticuerpos fueron suministrados por la Dra. Nancy Strockbine, Centers for Disease Control
and Prevention, Atlanta, Ga, USA.
95
• Microplaca Nunclon de 96 hoyos
1. Realizar una dilución 1:250 para a-Stx1 • Para calcular el volumen necesario de Mab
y 1:100 para a-Stx2 en el medio 199 que se debe preparar hay que tener en cuenta
sin SFB que se utilizan 50 µl de cada MAb por
extracto de materia fecal
2. Colocar 50 µl del extracto de materia
fecal en tres hoyos de la microplaca
Nunclon.
3. Colocar 50 µl del extracto de materia • En cada ensayo se deben utilizar como
fecal, control positivo para Stx1MF en controles, extractos de materia fecal
tres hoyos de la microplaca Nunclon. positivos para Stx1 y Stx2.
fecal, control positivo para Stx2MF en
tres hoyos de la microplaca Nunclon.
5. Mezclar 50 µl del MAb a-Stx1 en el
primer hoyo, 50 µl del MAb a-Stx2 en
el segundo hoyo y 50 µl del medio 199
sin SFB en el tercer hoyo.
6. Incubar en estufa a 37ºC durante 2 h. • Durante la incubación, el anticuerpo
monoclonal neutraliza específicamente la
actividad citotóxica.
7. Transferir 90 µl del contenido de los • Introducir la placa en su envoltorio original o
hoyos a una microplaca Nunclon con en un sobre de nylon para evitar
células Vero. contaminaciones.
8. Incubar la microplaca a 37ºC en estufa
con 5% de CO2.
96
9. Descartar el contenido de las placas a

las 72 h de incubación, en un recipiente
con lavandina.
violeta 0,75% en metanol 40%.
11. Se determina el tipo de Stx por • Si hay Stx libre en la materia fecal la
neutralización de la actividad citotóxica actividad citotóxica se neutraliza con el MAb
por el MAb correspondiente. específico y las células permanecen vitales y
coloreadas después de la tinción.
• En la siguiente tabla se indican los posibles
resultados:
Hoyo 1 Hoyo 2 Hoyo 3

MF + a-Stx1 MF + a-Stx2 MF Resultado
CV CM CM Stx1MF
CM CV CM Stx2MF
CV y M* CV y M* CM Stx1/2MF
CV CV CV Negativo
CM CM CM Inespecífico
CV: Células vivas coloreadas

CM: Células muertas no coloreadas
CV y M: Células vivas y muertas
*El efecto citotóxico que se neutraliza

corresponde a la toxina del MAb específico
agregado. Por lo tanto, en estos hoyos se puede
observar un efecto citotóxico residual
correspondiente a la toxina no específica sin
neutralizar.
• Si se obtienen resultados como Stx1/2MF o
Inespecífico se los debe confirmar con el
siguiente procedimiento.
97
12. Realizar las siguientes diluciones de los

MAbs en el medio 199 sin SFB
MAb Dilución Vol.

medio
a-Stx1 1:250 50 µl
a-Stx2 1:100 50 µl
a-Stx1/a-Stx2 1:250/1:100 50 µl

fecal en cuatro hoyos de la microplaca
Nunclon.
14. Mezclar 50 µl del MAb a-Stx1 en el
primer hoyo, 50 µl del MAb a-Stx2 en
el segundo hoyo, 50 µl de la dilución de
los MAbs a-Stx1/a-Stx2 en el tercer
hoyo y 50 µl del medio 199 sin SFB en
el cuarto hoyo.
15. Incubar en estufa a 37ºC durante 2 h. • Durante la incubación, el anticuerpo
monoclonal neutraliza específicamente la
actividad citotóxica.
16. Transferir 90 µl del contenido de los • Introducir la placa en su envoltorio original o
tres hoyos a una microplaca Nunclon en un sobre de nylon para evitar
con células Vero. contaminaciones.
17. Incubar la microplaca a 37ºC en estufa
con 5% de CO2.
18. Descartar el contenido de las placas a
las 72 h de incubación, en un recipiente
con lavandina.
20. Determinar de acuerdo a las siguientes • Si hay Stx1/Stx2 libre en la materia fecal la
observaciones, si el efecto sobre las actividad citotóxica de cada una de ellas se
células Vero es debido a la actividad de neutraliza con el MAb específico. En los dos
las dos toxinas presentes en la materia primeros hoyos el efecto citotóxico que se
fecal o es un efecto citotóxico neutraliza corresponde a la toxina del MAb
inespecífico. específico agregado (CV) y el efecto
98
citotóxico residual corresponde a la toxina no

Hoyo 1 Hoyo 2 Hoyo 3 Hoyo 4 específica sin neutralizar (CM). En cambio en
MF MF MF MF el tercer hoyo al agregar conjuntamente el
+ + + Rdo.
a-Stx1 a-Stx2 a-Stx1
Mab a-Stx1 y a-Stx2 se neutraliza el efecto de
+ ambas toxinas y las células permanecen vivas
a-Stx2
y coloreadas.
CV y M CV y M CV CM Stx1/Stx2
MF • Si en el tercer hoyo no se observa
CM CM CM CM Inespecífico neutralización y las células permanecen
muertas no coloreadas, el efecto observado no
es debido a la acción de las toxinas sino que
CV: Células vivas coloreadas
es un efecto inespecífico.
CM: Células muertas no coloreadas
CV y M: Células vivas y muertas
2.- Detección de Anticuerpos anti-toxina Shiga (a-Stx)

Medios
• Extracto previamente titulado de la cepa control de referencia E. coli O157:H7 C984 productor de
Stx1 (Pellet)
• Extracto previamente titulado de la cepa control de referencia E. coli O157:H7 1271-84 productor
de Stx2 (Sbte)
• Suero control negativo: pool de sueros negativos para a-Stxs
• Micropipeta multicanal 12 canales rango: 40 - 200 µl
• Microplaca Nunclon de 96 hoyos estéril
99
1. Preparar diluciones correspondientes a 4 • Los extractos bacterianos de las cepas de
DC50 del Sbte de la cepa de referencia referencia deben ser previamente titulados
para Stx2 y del Pellet de la cepa de para determinar la dilución correspondiente a
referencia para Stx1. 4 DC50.
2. Preparar un suero control basal, • El suero control basal negativo se prepara

negativo para a-Stx mezclando volúmenes iguales de sueros
negativos para a-Stx. El pool de sueros debe
ser fraccionado en alícuotas y conservado a
-20ºC
3. Realizar diluciones seriadas al medio y • Continuar con el siguiente procedimiento
por duplicado (para la detección de a- para diluir en forma seriada las muestras de
Stx1 y a-Stx2) de los sueros de los sueros de los pacientes y del suero control
pacientes y del suero control basal basal negativo:
negativo, en una microplaca estéril, 1. Colocar 75 µl del medio 199 sin SFB en
partiendo de una dilución 1:4 y llegando la Fila A, 50 µl en las filas B hasta G, y
a 1:128. 100 µl en la fila H.
2. Agregar 25 µl de la muestra 1 de suero en
los hoyos A1 y A7, 25 µl de la muestra 2
en A2 y A8, etc. (dilución 1:4).
3. Mezclar 10 veces el contenido de la fila
A con micropipeta multicanal de 12
canales. Transferir 50 µl a la fila B.
4. Utilizando los mismos tips repetir el paso
3 para la fila B hasta la F, de la cual se
descartan 50 µl luego de mezclar bien.
5. La fila G queda con 50 µl y la fila H con
100 µl de medio 199 sin SFB.
4. Agregar 50 µl del extracto (Pellet) de • Se producirá neutralización del efecto
Stx1 en el sector comprendido entre las citotóxico de Stx1 si el suero del paciente
columnas 1 a 6 y la fila A a la G. posee anticuerpos a-Stx1. Este efecto
neutralizante disminuye en las diluciones
sucesivas del suero.
100
5. Agregar 50 µl del extracto (Sbte) de • Se producirá neutralización del efecto

Stx2 en el sector comprendido entre las citotóxico de Stx2 si el suero del paciente
columnas 7 a 12 y la fila A a la G. posee anticuerpos a-Stx2. Este efecto
neutralizante disminuye en las diluciones
sucesivas del suero.
6. Incubar en estufa a 37ºC por 2 h.
7. Transferir 90 µl de la mezcla contenida • La fila G es el control del efecto citotóxico
en cada uno de los hoyos, a una (Células Vero + medio 199 sin
microplaca con un cultivo en monocapa SFB+extractos de toxinas).
de células Vero. • La fila H es el control de la células Vero
(Células Vero + medio 199 sin SFB)
8. Incubar a 37ºC en estufa con 5% de • Introducir la placa en su envoltorio original o
CO2 durante 72 h. en un sobre de nylon para evitar
contaminaciones.
9. Realizar una primera lectura a las 72 h • Interpretación de resultados: se considera
de incubación en el microscopio que un suero tiene protección cuando la
invertido monocapa está intacta. El título está dado por
la inversa de la dilución en la que se observa
50% de destrucción de la monocapa. Se
comienza con la lectura del título (a-Stx1 y a-
Stx2) para el suero control basal negativo. El
título del mismo varía de acuerdo al nivel
basal de anticuerpos de la población en
estudio y de variaciones propias del ensayo.
Se considera que un suero es positivo para a-
Stx1 o/y a-Stx2 cuando los títulos son
mayores a los títulos leídos para el suero
control basal negativo.
• En la fila G y en la fila H se debe observar
destrucción de la monocapa de células y
células intactas, respectivamente.
10. Descartar el contenido de las placas en
un recipiente con lavandina.
101
12. Realizar una segunda lectura en el • Confirmar el título determinado en la primera

microscopio invertido. lectura.
Referencia
• Karmali MA. Infection by verotoxin-producing Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 1989; 2:
15-37.
102
Manual de Procedimiento “Diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga”
CAPITULO V - MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

• Medio de transporte Cary Blair
Composición:
Para 1000 ml
Tioglicolato de sodio 1,5 g
Fosfato disódico 1,1 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agar 5,0 g
pH final a 25 ºC 8,0 ± 0,5
Preparación:
1. Disolver 12,6 g del polvo en un litro de agua destilada.
2. Calentar a ebullición hasta disolución completa.
3. Dispensar 3 ml del medio en tubos 13/100 con tapa bacteriológica.
4. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
5. Conservar a 4ºC.
• Agar MacConkey sorbitol (SMAC)

Medio selectivo y diferencial empleado para el aislamiento de Escherichia coli O157:H7
Composición:
Para 1000 ml
Peptona 20 g
Sorbitol 10 g
Sales biliares Nº3 1,5 g
Cloruro de sodio 5 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,001 g
Agar 15 g
pH final a 25 ºC 7,1 ± 0,2
Preparación:
1. Resuspender 51,5 g del polvo en un litro de agua destilada.
3. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50ºC
4. Mezclar para homogenizar el medio
5. Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa.
6. Conservar a 4ºC
7. Secar el agar en un área estéril, antes de usar.
Recomendación:
No calentar el medio a ebullición antes de autoclavar. El calentamiento excesivo destruye el sorbitol.
• Medio Cromogénico CHROMAgar O157

Medio con cromógeno específico para detectar E. coli O157
Preparación:
1. Disolver el polvo comercial (un envase) en un volumen de agua destilada estéril fría. Utilizar el volumen
de agua indicado por el fabricante.
2. Calentar a ebullición hasta disolución completa. Se debe tener la precaución de no excederse en el
tiempo de calentamiento.
3. Homogenizar el medio.
4. Transferir los frascos a un baño de agua a 50 ºC.
5. Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa, evitando la formación de burbujas.
103
6. Conservar a 4 ºC, protegidos de la luz, preferentemente envueltos en papel metalizado.

7. Secar el agar en un área estéril antes de usar.
• Medio Cromogénico Agar O157:H7 ID (bioMerieux)

Medio con cromógeno específico para detectar E. coli O157:H7, basado en la detección de la actividad
de dos enzimas: β- D galactosidasa y β- D glucuronidasa.
Preparación:
1. Abrir suavemente sin destapar el frasco de agar.
2. Fundir el agar a baño maría hirviente hasta disolución.
3. Homogenizar después del cierre de la tapa.
4. Transferir los frascos a un baño de agua a 50 ºC.
5. Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa, evitando la formación de burbujas.
6. Conservar a 4 ºC, protegidos de la luz, preferentemente envueltos en papel metalizado.
7. Secar el agar en un área estéril antes de usar.
• Caldo Tripticasa de soja (CTS)

Medio utilizado para fines generales para el cultivo de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos.
Composición:
Para 1000 ml
Triptona 17 g
Soitona 3 g
Dextrosa 2,5 g
Fosfato dipotásico 2,5 g
pH final a 25 ºC 7,3 ± 0,2
Preparación:
1. Disolver 30 g del polvo en un litro de agua destilada.
2. Dispensar el medio de acuerdo al uso.
4. Conservar en la heladera.
• Caldo Tripticasa de soja con cefixime-telurito (CT-CTS)

Medio selectivo y diferencial empleado para el aislamiento de Escherichia coli O157:H7
Composición:
Para 1000 ml
CTS estéril 1000 ml
Cefixima 0,05 mg
Telurito de potasio 2,5 mg
Preparación:
1. Preparar el CTS, esterilizar y dejar enfriar a temperatura ambiente.
2. Agregar cefixima y telurito al medio.
3. Mezclar para homogenizar.
104
• Caldo GN, Hajna

Medio base empleado para el aislamiento y el cultivo de microorganismos gram negativos
Composición:
Para 1000 ml
Digerido pancreático de caseína 12 g
Peptona de proteosa Nº3 8 g
Dextrosa 1 g
D-Manitol 2 g
Citrato desodio 5 g
Desoxicolato de sodio 0.5 g
Fosfato dipotásico 4 g
Fosfato monopotásico 1,5 g
pH final: 7,0 ± 0,2
Preparación
• Agar Tripticasa de soja (TSA)

Medio utilizado para fines generales para el cultivo de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos.
Composición:
Para 1000 ml
Triptona 15 g
Soitona 5 g
Agar 15 g
pH final a 25 ºC 7,3 ± 0,2
Preparación:
• Agar para conservación

Medio utilizado para conservar microorganismos no fastidiosos.
Composición:
Para 1000 ml
CTS 1000 ml
Agar 8g
Preparación:
1. Preparar el CTS y agregar el agar.
105

Procedimiento:
1. Sembrar el aislamiento en el vial con agar.
2. Incubar a 37º durante 18ºC.
3. Conservar el vial sembrado a 4ºC.
4. Realizar una vez por mes, un repique un nuevo vial para mantener viable al microorganismo.
• Solución salina buferada estéril (PBS)

Composición:
Solución concentrada 10X
Para 1000 ml
Cloruro de potasio 2 g
Fosfato ácido disódico anhidro (Na2HPO4 PM 142,1) 11,5 g
Fosfato diácido monopotásico (KH2 PO4) 2 g
pH final a 25 ºC 7,3 ± 0,2
Solución de trabajo 1X
Se realiza una dilución 1:10 de la solución concentrada 10X.
Preparación:
1. Disolver los componentes de la solución concentrada 10X en 1000 ml de agua destilada.
2. Esterilizar la solución 10X, en autoclave a 121ºC, durante 15 minutos.
3. Realizar una dilución 1:10 de la solución 10X.
4. Esterilizar la solución 1X, en autoclave a 121ºC, durante 15 minutos.
• Solución fisiológica
Composición:
Para 1000 ml
pH final a 25 ºC 7 ± 0,2
Preparación:
1. Disolver el cloruro de sodio en un litro de agua destilada.
2. Dispensar la solución de acuerdo al uso.
3. Esterilizar en autoclave a 121ºC, durante 15 minutos.
• Buffer Tween 20 al 0,05% en buffer PBS 1X estéril

Buffer de lavado utilizado en la técnica de separación inmunomagnética.
Composición:
Para 10 ml
PBS 1X estéril 99.5 ml
Tween 20 0.5 ml
Preparación:
1. Disolver 0.5 ml de Tween 20 en 99,5 ml de PBS 1X estéril.
Recomendación:
Preparar el buffer inmediatamente antes de su uso.
106
• Solución fisiológica formolada 1% V/V

Se utiliza para inactivar cultivos de bacterias
Composición:
Para 100 ml
Solución fisiológica estéril 97,5 ml
Formol 40% V/V 2,5 ml
Preparación:
1. Mezclar 2,5 ml de formol 40% V/V con 97,5 ml de Solución fisiológica estéril.
2. Conservar a temperatura ambiente.
• Medio de Craigie
Se utiliza para la estimulación de la movilidad y expresión del antígeno flagelar.
Composición:
Para 1000 ml
Caldo nutritivo 8 g
Extracto de levadura 2 g
Nitrato de potasio 1 g
Agar 3 g
pH final a 25 ºC 7,6 ± 0,2
Preparación:
1. Disolver los componentes en un litro de agua destilada.
3. Dispensar 5 ml por tubo de ensayo.
4. Colocar varilla de vidrio central.
Recomendación:
Se utiliza varilla de vidrio hueca de 0,6 cm de diámetro por 5 cm de largo aproximadamente. El medio debe
cubrir la mitad inferior del largo de la varilla, quedando libre el extremo superior.
• Agar base triptosa con glóbulos rojos lavados (AGRL) y sin lavar (AGRSL)
Estos medios se utilizan para la detección de la enterohemolisina de EHEC. Se emplean placas con agar base
triptosa suplementado con 10 mM de cloruro de calcio y 5% de sangre desfibrinada de cabra u oveja,
previamente lavada tres veces con solución salina buferada esteril pH 7,2. (AGRL) y como control se
emplean placas de agar con 5% de sangre desfibrinada de oveja, sin lavar y sin el agregado de cloruro de
calcio. (AGRSL)
Placa de AGRL
Composición:
Para 20 ml de agar (una placa)
Agar Base triptosa (TBA) 10 ml
Agar TSA 10 ml
Cloruro de calcio 1M 0,1 ml
Glóbulos rojos lavados (GRL) de sangre desfibrinada de cabra u oveja 0,5 ml
107
Recomendación:
Se debe emplear sangre fresca, de no más de 10 días de extraída.
Preparación de la placa AGRL:

1. Dispensar el medio de TSA en cada placa de Petri y dejar solidificar.
2. Mantener el medio de TBA a 50ºC.
3. Agregar el Cloruro de calcio al TBA y homogeneizar.
4. Incorporar el volumen necesario de GRL al TBA.
5. Mezclar suavemente con movimientos circulares.
6. Agregar el agar TBA con los GRL en las placas de Petri con TSA.
7. Identificar a las placas como placas de ensayo.
9. Utilizar dentro de los 15 días posteriores a su preparación.
Placa de AGRSL
Composición:
Para 15 ml de agar (una placa)
Agar Base triptosa (TBA) 15 ml
Glóbulos rojos sin lavar (GRSL) de sangre desfibrinada de cabra u oveja 0,75 ml
Recomendación:
Se debe emplear sangre fresca, de no más de 10 días de extraída.
Preparación de la placa AGRSL:

1. Mantener el medio de TBA a 50ºC.
2. Incorporar el volumen necesario de GRSL al TBA.
3. Mezclar suavemente con movimientos circulares.
4. Dispensar el agar TBA con los GRSL en las placas de Petri.
5. Identificar a las placas como placas controles.
7. Utilizar dentro de los 15 días posteriores a su preparación.
Preparación de los componentes de las placas de AGRL y AGRSL

TBA
Composición:
Para 1000 ml
Triptosa 10 g
Extracto de carne 3 g
Agar 20 g
Preparación:
1. Disolver los componentes en un litro de agua destilada.
4. Dejar enfriar.
5. Mantener en baño de agua termoestatizado a 50ºC para la preparación de las placas de AGRL y
AGRSL
Cloruro de calcio 1M
Composición:
Para 10 ml
Cloruro de calcio 1,11 g
108
Preparación:
1. Disolver el cloruro de calcio en 10 ml de agua destilada.
2. Esterilizar con unidad filtrante de 0,22 µm.
3. Conservar el cloruro de calcio 1M a temperatura ambiente para la preparación de la placa de AGRL
Obtención de GRL de sangre desfibrinada de cabra u oveja.

Preparación:
1. Centrifugar 5 ml de sangre desfibrinada de cabra u oveja a 2500 rpm por 10 minutos.
2. Desechar el plasma
3. Resuspender suavemente con micropipeta, 1 volumen de glóbulos rojos en 2 volúmenes de solución
salina buferada esteril pH 7.2. Se debe obtener una suspensión homogénea sin romper los glóbulos
rojos.
4. Centrifugar a 2500 rpm por 10 minutos.
5. Repetir 2 veces los pasos 2, 3 y 4.
6. Desechar el sobrenadante.
7. Guardar el paquete globular para la preparación de la placa AGRL
Obtención de GRSL de sangre desfibrinada de cabra u oveja.

Preparación:
1. Centrifugar 5 ml de sangre desfibrinada de cabra u oveja a 2500 rpm por 10 minutos.
2. Desechar el plasma.
3. Guardar el paquete globular para la preparación de la placa AGRSL
• Medio agar hierro tres azúcares (TSI)
Composición:
Para 1000 ml:
Peptona 20 g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1 g
Sulfato amónico ferroso 0,2 g
Tiosulfato de sodio 0,2 g
Rojo de fenol 0,025 g
Agar 13 g
pH final a 25 ºC 7,3 ± 0,2
Preparación:
1. Resuspender 65 g del polvo en un litro de agua destilada.
3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 con tapa bacteriológica.
5. Solidificar en forma de pico de flauta para obtener 2 cámaras de reacción: fondo de 1 cm (anaerobiosis);
pico (aerobiosis).
109
• Agar citrato de Simmons

Composición:
Para 1000 ml
Fosfato diácido de amonio 1 g
Fosfato dipotásico 1 g
Sulfato de magnesio 0,2 g
Agar 15 g
Azul de bromotimol 0,08 g
Citrato de sodio 5 g
pH final a 25 ºC 6,8 ± 0,2
Preparación:
5. Solidificar en forma de pico de flauta permitiendo la formación de una base profunda
• Medio para sulfuro, indol, movilidad (SIM)

Composición:
Para 1000 ml
Tripteína 20 g
Peptona 6,1 g
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g
Tiosulfato sódico 0,2 g
Agar 3,5 g
pH final a 25 ºC 7,3 ± 0,2
Preparación:
5. Solidificar en posición vertical.
• Medio para movilidad indol ornitina (MIO)
Composición:
Para 1000 ml
Peptona 10 g
Triptona 10 g
Hidrocloruro de L-ornitina 5 g
Dextrosa 1 g
Agar 2 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
pH final a 25 ºC 6,5 ± 0,2
110
Preparación:
5. Solidificar en posición vertical.
• Solución al 1% del hidrato de carbono en el medio base Rojo Fenol

Solución para la prueba de fermentación de azúcares.
Composición:
Para 10 ml
Medio base Caldo Rojo Fenol estéril 9 ml
Hidrato de carbono 10% estéril 1 ml
Preparación:
1. Disolver 1 ml del hidrato de carbono 10 % en 9 ml de caldo Rojo Fenol estéril.
2. Fraccionar 1 ml de la solución en tubos estériles 13/100 con tapa bacteriológica.
3. Conservar los tubos a 4ºC.
• Caldo Rojo Fenol

Medio base para la fermentación de azucares
Composición:
Para 1000 ml
Digerido pancreático de caseína 10 g
Rojo fenol 0,018 g
Ph final: 7,0 ± 0,2
Preparación:
1. Disolver 15 g del polvo en 1 litro de agua destilada.
4. Conservar en heladera.
• Solución del hidrato de carbono (10% p/v)
Composición:
Para 10 ml
Hidrato de carbono 1g
Preparación:
1. Disolver el hidrato de carbono en 10 ml de agua destilada estéril.
2. Esterilizar con unidad filtrante de 0,22 µm.
3. Conservar en heladera.
Recomendación:
La solución de dulcitol al 10% debe ser utilizada inmediatamente antes de su uso, dado que precipita el
hidrato de carbono a 4ºC.
111
• Lisina Hierro Agar (LIA)

Composición:
Peptona 5 g
Dextrosa 1 g
Hidrocloruro de lisina-L 10 g
Citrato amónico férrico 0,5 g
Tiosulfato de sodio 0,04 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agar 15 g
pH final a 25 ºC 6,7 ± 0,2
Preparación:
5. Solidificar en forma de pico de flauta permitiendo la formación de una base profunda.
• Agar Mueller Hinton (MH)

Composición:
Para 1000 ml
Infusión de carne 300 g
Casaminoácidos 17,5 g
Almidón 1,5 g
Agar 17 g
pH final a 25 ºC 7,2 ± 0,2
Preparación:
3. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50ºC
4. Dispensar 25 ml del medio por cada placa para obtener una capa de 4 mm de espesor.
5. Conservar a 4ºC. Las placas así conservadas pueden utilizarse hasta 4 días después de su preparación.
• Caldo Penassay (Antibiotic médium 3 – Difco)
Composición:
Para 1000 ml
Extracto de carne 1,5 g
Extracto de levadura 1,5 g
Peptona 5 g
Dextrosa 1 g
Fosfato monopotásico 1,32 g
Fosfato dipotásico 3,68 g
Ph final a 25ºC 7,0± 0,05
112
Preparación:
1. Disolver 17,5 g del polvo en un litro de agua destilada.
113
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Manual de Procedimientos

CAPITULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE Escherichia coli O157

Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de Escherichia coli O157 con

3A- Siembra del primer pasaje 53

CAPITULO III - DETECCION DE FACTORES DE VIRULENCIA

CAPITULO III - APENDICE

1.- Buffer PCR 10X 87

CAPITULO IV - TECNICAS DIAGNOSTICAS EN CELULAS VERO

1.- Detección de Stx en células Vero 89

B) Titulación de la actividad citotóxica por Stx de cepas con tamizaje

CAPITULO V - MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

• Medio de transporte Cary Blair 103

1.1.- Marcadores de virulencia

Tabla 1. Clasificación de serotipos de STEC en seropatotipos

Seropatotipo Incidencia Frecuencia en la Asociación con Serotipos

B Moderada No común Si O26:H11, O103:H2,

Tabla 2. Seropatotipos y perfiles de factores de virulencia

Seropatotipo Serotipo Huesped Factores de virulencia

Tabla 2. Seropatotipos y perfiles de factores de virulencia (Continuación)

Seropatotipo Serotipo Huesped Factores de virulencia

Mecanismo de patogenia de Escherichia coli productor de toxina Shiga

desprenden a nivel del glomérulo. Simultáneamente se produce un depósito de fibrina y plaquetas en la

Mecanismo de patogenia de Escherichia coli productor de toxina Shiga

Acheston et al., 1998.

Ancestro común Emergencia de Escherichia coli O157:H7

Ancestro EPEC con locus LEE

Whittan et al., 1998.

Historia Natural del

Síndrome Urémico Hemolítico

Mead et al., 1998.

1.5.- Reservorios y vías de transmisión

Vías de transmisión de STEC

Otros Carne Leche

a) utilización del lipopolisacárido bacteriano como inmunógeno;

La notificación de las infecciones por E. coli O157:H7 experimentaron un aumento exponencial a

Síndrome Urémico Hemolítico

Sindrome Urémico Hemolítico:

Brotes asociados a Escherichia coli O157:H7

LUGAR FECHA Nº DE Nº SUH MORTALIDAD TIPO DE FUENTE

AÑO PAIS Nº DE CASOS SEROTIPOS SUH

1988 Checoslovaquia 5 O26:H11/NM 5

1.8.- Situación actual del SUH en Argentina

En Argentina el SUH es endémico, y constituye la primera causa pediátrica de insuficiencia renal

Las medidas preventivas para controlar la transmisión de la infección son:

CAPITULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE Escherichia coli O157

b) Hisopado rectal: Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte y

2.1. A.- Aislamiento

5. Tomar una muestra de la zona de • PCR multiplex se utiliza como técnica de

• La técnica de amplificación no requiere de la

2.1.B.- Aislamiento con separación innunomagnética

• Micropipeta rango: 200-1000 µl

4. Colocar el tubo en el agitador rotatorio a • Es importante respetar el tiempo, las

5. Introducir el imán en la gradilla

9. Agregar 1 ml de buffer lavado ( Tween • El buffer de lavado debe preparase en el

10. Retirar el imán e invertir la gradilla 5

3. Realizar la lectura de la placa • El ensayo es positivo cuando aparece una

A) Aglutinación en lámina con antisuero policlonal anti-O157

A1) Aglutinación en lámina con inactivación previa por calor

A2) Aglutinación en lámina sin inactivación por calor

B) Aglutinación con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos anti-O157

2. Mezclar los reactivos de látex hasta

aglutinación o formación de pequeños

2.3.2.- Detección del antígeno flagelar H