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2 FONTES DE ONS

O ponto de partida para uma anlise espectromtrica de massas a formao de ons gasosos do analito, e o escopo e a utilidade dos mtodos espectromtricos de massas so ditados pelo processo de ionizao. O aspecto do espectro de massas para uma dada espcie molecular depende fortemente do mtodo usado para a formao de ons. As amostras observadas so primeiramente ionizadas, nos dispositivos denominados fontes de ons, para serem analisadas no espectrmetro de massas. Uma grande variedade de tcnicas de ionizao so usadas para a espectrometria de massas. As consideraes de maior relevncia so a energia interna transferida durante o processo de ionizao e as propriedades fsico-qumicas do analito que ser ionizado. Algumas tcnicas de ionizao so muito energticas e causam fragmentaes extensivas, produzido um grande nmero de ons positivos de vrias massas que geralmente so menores que on molecular. Outras tcnicas so mais suaves e produzem somente ons das espcies moleculares. Essas tcnicas encontram-se divididas em duas categorias principais: fontes de fase gasosa (a amostra vaporizada e ento ionizada) e fontes de dessoro (a amostra no vaporizada, sendo ionizada diretamente). As fontes de fase gasosa limitam-se a compostos com massas moleculares menores do que aproximadamente 103 Da (Daltons), enquanto as de dessoro so aplicveis analitos de massas moleculares de at 105 Da. A tabela 1 lista algumas das fontes de ons que vem sendo empregadas na espectrometria de massas moleculares. Tabela 1 Fontes de ons usuais para a espectrometria de massas moleculares. Tipo bsico Fase gasosa Nome e smbolo usual Impacto de eltrons (EI) Ionizao qumica (CI) Ionizao por campo (FI) Dessoro por campo (FD) Ionizao por eletronebulizao (ESI) Dessoro-ionizao assistida por matriz (MALDI) Dessoro por Plasma (PD) Bombardeamento com tomos rpidos (FAB) Espectrometria de massas de ons secundrios (SIMS) Ionizao por termonebulizao (TS) Agente ionizante* Eltrons energticos Eletrodo com alto potencial ons gasosos reativos Eletrodo com alto potencial Campo eltrico alto Feixe de laser Fragmentos de fisso de 252 Cf Feixe atmico energtico Feixe energtico de ons Temperatura alta

Dessoro

*O agente ionizante o responsvel por proporcionar a energia para que ocorra a ionizao do analito de interesse.

Alm dessa diviso, as fontes de ons tambm podem ser classificadas como fontes duras ou fontes moles de acordo com a extenso de sua fragmentao. As fontes duras so aquelas que a energia cedida ao analito to elevada, alcanando um estado bastante excitado, que ao ocorrer a relaxao, as molculas do analito apresentaro rupturas de ligaes, produzindo vrios fragmentos de ons. J as fontes de ionizao moles, caracterizam-se pelo contrrio, ou seja, pela pouca fragmentao, fazendo com que seu espectro apresente poucos picos, alm do pico do on molecular.

Algumas consideraes iniciais introduzem os princpios de cada mtodo apresentado na tabela 1. A ionizao eletrnica (impacto de eltrons), a ionizao qumica e a ionizao por campo so adequadas somente para a ionizao na fase gasosa e, por isso, seu uso limitado a compostos suficientemente volteis e termicamente estveis. Entretanto, um grande nmero de compostos so bastante volteis ou no tem presso de vapor suficiente. Molculas destes compostos, devem ser extradas diretamente da condensao da fase gasosa. Essas fontes de ons diretas, subdividem-se em dois tipos: fontes de ons na fase lquida e fontes de ons no estado slido. Na fase lquida, as fontes de ons do analito encontram-se em soluo. Esta soluo introduzida por nebulizao, como gotculas dentro da fonte onde os ons so produzidos presso atmosfrica e so inseridos no espectrmetro de massas atravs de bombas vcuo. A ionizao por eletronebulizao, a ionizao qumica presso atmosfrica e fontes de fotoionizao presso atmosfrica correspondem a este tipo. Nas fontes de ons no estado slido, o analito est em um depsito no voltil. Isto pode ser obtido a partir de vrios mtodos de preparao que frequentemente envolvem a introduo de uma matriz que pode ser tanto slida, quanto um lquido viscoso. Este depsito ento irradiado por partculas energticas ou ftons que dessorvem ons perto da superfcie do depsito. Estes ons podem ser extrados por um campo eltrico e levados para o analisador. A dessoro-ionizao assistida por matriz (MALDI), a espectrometria de massas de ons secundrios, a dessoro por plasma e a dessoro por campo utilizam dessa estratgia para produzir ons. Outro mtodo, o bombardeamento com tomos rpidos usa uma matriz de lquido no voltil. A fonte de on produz ons principalmente pela ionizao de uma molcula neutra na fase gasosa atravs da ejeo de eltrons, captura de eltron, protonao, desprotonao ou pela transferncia de uma espcie carregada de uma fase condensada para uma fase gasosa. Algumas dessas fontes merecem destaquem por terem apresentado grande utilidade no passado ou ainda estarem sendo bastante utilizadas atualmente. Portanto, uma anlise mais aprofundada torna-se necessria para entender melhor as vantagens e desvantagens inerentes a cada mtodo de ionizao.

2.1 - Fontes e espectros de impacto de eltrons


Esse tipo de ionizao largamente utilizado na espectrometria de massas de compostos orgnicos, sendo bastante til na identificao de compostos e grupos funcionais. Esta tcnica de ionizao funciona bem para muitas molculas gasosas, porm, casualmente, induz fragmentaes extensivas fazendo com que o on molecular no seja observado. Como mostrado na figura 1, esta fonte consiste de um filamento aquecido doador de eltrons. Tais eltrons so acelerados para um nodo e colidem com as molculas gasosas da amostra injetada na fonte. Gases e amostras com elevada presso de vapor so introduzidos diretamente na fonte, entretanto, lquidos e slidos geralmente so aquecidos prximos fenda de entrada do espectrmetro para minimizar os efeitos da decomposio trmica, fazendo com que a volatilizao ocorra a uma temperatura mais baixa. Alm disso, seguindo-se esse

procedimento, a amostra fica menos tempo exposta ao aquecimento, o que minimiza, tambm, a degradao da amostra.

Figura 1 Esquema simplificado de uma fonte de impacto de eltrons. Um ponto importante que deve ser analisado para a fonte de impacto de eltrons com relao ao potencial aplicado para que os eltrons atinjam o nodo e passem colidindo com as molculas do analito. Para formar um nmero significativo de ons gasosos, os eltrons do filamento da fonte devem ser acelerados por um potencial maior do que aproximadamente 50 V. Sabe-se que, de todo o potencial aplicado, entre 10 e 20 V so transferidos para as molculas durante o processo de ionizao e que aproximadamente 10 V o bastante para ionizar a maioria das molculas orgnicas. O excesso de energia, portanto, leva fragmentao extensiva. Pela figura 2, observa-se que o nmero de ons mximo formado, d-se aproximadamente no potencial de 70 V.

Figura 2 Nmero de ons produzidos medida que se varia o potencial aplicado. O mximo ocorre no potencial de 70 V, aproximadamente.

A tabela 2 mostra, em resumo, as principais vantagens e desvantagens da fonte de impacto de eltrons. Tabela 2 Algumas vantagens e desvantagens da fonte de impacto de eltrons. Vantagens Desvantagens Altas correntes de ons proporciona boa Necessidade de volatilizar toda a amostra, sensibilidade. podendo resultar na decomposio trmica de componentes volteis. A fragmentao extensiva e o grande nmero A fragmentao extensiva pode provocar o de picos facilita a identificao dos analitos e desaparecimento do on molecular, grupos funcionais. dificultando a identificao de sua massa molecular.

2.2 - Fontes e espectros de ionizao qumica


A fonte de impacto de eltrons leva, como dito anteriormente, fragmentao do on molecular (figura 3a), que algumas vezes, impossibilita sua deteco. A ionizao qumica (CI) uma tcnica que produz ons com pequeno excesso de energia. Desta forma, ela apresenta a vantagem de um espectro com menos fragmentos (figura 3b), alm do on molecular ser facilmente observado. Consequentemente, a ionizao qumica um complemento da fonte de impacto de eltrons, o que explica o fato da maioria dos espectrmetros apresentarem esses dois tipos de fontes. (fontes EI-CI)

Figura 3 Espectros por (a) impacto de eltron e (b) por ionizao qumica. Percebe-se a diferena no nvel de fragmentao.

Na ionizao qumica, os tomos gasosos da amostra (de uma entrada discreta ou de uma sonda aquecida) so ionizados por coliso com os ons produzidos por bombardeamento eletrnico de um excesso de um gs reagente (o mais comum o metano; outros: isobutano e amnia). Geralmente, ons positivos so usados, mas a ionizao qumica com ons negativo ocasionalmente usada com analitos que contm tomos muito eletronegativos. Para realizar experimentos de ionizao qumica, necessrio modificar a rea de ionizao com feixe de eltrons, a fim de fazer com que ocorra uma grande diferena da

concentrao do reagente gasoso e da amostra, ocasionando uma reao, quase que exclusiva, do feixe de eltrons com as molculas do reagente. Entre as muitas possveis reaes entre os fragmentos que ocorrem durante a ionizao, a mais comum a reao por transferncia de prton. Nesse tipo de reao, quando as molculas do analito so introduzidos na regio de ionizao, os ons do gs reagente, expresso por GH + podem, frequentemente, transferir um prton para as molculas M e produzir ons moleculares protonados M+. Portanto, a ionizao qumica pode ser descrita como uma reao cido-base, onde os ons do reagente gasoso (GH+) so os cidos de Bronsted-Lowry (doadores de prton), e as molculas do analito, as bases de Bronsted-Lowry (receptores de prton).

2.3 - Fontes e espectros de ionizao por campo


A fonte de ionizao por campo (FI Field Ionization, em ingls) um mtodo que usa campos eltricos muito altos para produzir ons gasosos. Como a EI e a CI, a FI aplicvel somente para ionizao de amostras gasosas. Outra semelhana, que a amostra introduzida dentro da fonte de FI, pelas mesmas tcnicas que so comumente utilizadas nas fontes EI e CI, por exemplo, usando o aquecimento de uma sonda direta. O intenso campo eltrico usado neste mtodo geralmente produzido por uma diferena de potencial de 8-12 kV que aplicado entre um filamento chamado emissor e um contraeletrodo que est a poucos milmetros de distncia. Molculas da amostra na fase gasosa alcanam a superfcie do emissor que mantido em um potencial altamente positivo.. Se o campo eltrico na superfcie do emissor suficientemente alto, isto , se sua fora atinge cerca de 107-108 V/cm, um dos eltrons da amostra transferido para o emissor por tunelamento mecnico-quntico, no qual os eltrons do analito so extrados pelo anodo, resultando na formao de um radical M+. Este on repelido pelo emissor e viaja para o contra-eletrodo que est carregado negativamente. Um buraco no contra-eletrodo permite que o on passe para dentro do compartimento do analisador de massas. A fim de alcanar o elevado campo eltrico necessrio para a ionizao, o emissor constitudo de tungstnio com milhes de microagulhas de carbono em sua superfcie. nas pontas destas microagulhas que o campo eltrico atinge seu mximo. A fonte de FI leva a formao de ons M+ e/ou MH+ a depender do analito. A formao de espcies moleculares protonadas resulta de reaes on-molcula que podem ocorrer entre o on inicial e as molculas da amostra perto da superfcie do emissor. No comum observar a presena de ambos os ons M+ e/ou MH+ em um espectro de fonte FI. A energia transferida no processo por FI corresponde frao de 1 eV. Ento, esta fonte de ionizao gera ons com muito pouco excesso de energia interna, no exibindo, portanto, fragmentao. Na figura 4, compara-se as fontes de EI e FI quanto ao nvel de fragmentao.

Figura 4 Espectros (a) fonte EI e (b) fonte FI. A partir de agora, analisar-se- as fontes de ionizao por dessoro. Como dito anteriormente, so aquelas que dispensam a volatilizao, ionizando amostras slidas ou lquidas de forma direta, o que simplifica bastante o espectro resultante por consistir basicamente, apenas do on molecular ou do on molecular protonado. Neste tipo de fonte, as espcies analisadas podem possuir elevada massa molar (da ordem de 106 Da), alm de ser aplicvel a compostos termicamente instveis.

2.4 - Dessoro por campo


Tcnica indicada para operadores experientes, a dessoro por campo (FD), foi baseada na FI (tpico 2.3), tendo sido o primeiro mtodo que combinou dessoro e ionizao do analito. Na FD, a amostra depositada, atravs da evaporao de uma soluo contendo um sal, em um filamento de tungstnio coberto pelas microagulhas de carbono. Uma diferena de potencial ento aplicada a este filamento e um eletrodo, obtendo um campo que pode passar de 108 V/cm. Este filamento aquecido at que a amostra seja fundida. Em seguida, os ons migram e se acumulam nas pontas das agulhas, onde elas sero, enfim, desorvidas, carregando muitas molculas da amostra. A ionizao ocorre em uma fase condensada ou prximo superfcie do filamento, pela interao com o elevado campo eltrico, de acordo com o mesmo mecanismo descrito para a FI. Como relatado antes, a FD produz ons de muito pouca energia interna, quase no acusando fragmentao. A FD vem sendo muito substituda por outras tcnicas de dessoro. Entretanto, ela continua sendo um excelente mtodo para ionizar molculas apolares de elevada massa molecular, como os polmeros.

2.5 Espectrometria de massas de ons secundrios lquidos (SIMS) e Bombardeamento com tomos rpidos (FAB)
A Espectrometria de massas de ons secundrios lquidos (SIMS) analisa os ons secundrios emitidos quando a superfcie irradiada com um feixe energtico de ons primrios. Fontes de ons com baixo valor de corrente primria para os feixes de ons so chamadas fontes estticas porque elas no prejudicam a superfcie da amostra, em oposio s chamadas fontes dinmicas, que produzem eroso na superfcie. Esta tcnica usada principalmente com slidos e em usos especiais no estudo de superfcies condutoras. Mapas qumicos de alta resoluo so produzidos por digitalizao de um feixe de radiao ionizante bem focada em toda a superfcie. O bombardeamento com tomos rpidos (FAB) e a espectrometria de massas de ons secundrios lquidos (SIMS) so tcnicas que consistem em focalizar uma amostra com um feixe de alta corrente primria de tomos neutros/molculas (FAB) ou ons (SIMS). Caractersticas essenciais destas duas tcnicas de ionizao so que as amostras podem ser dissolvidas em uma matriz lquida no voltil. Na prtica, a matriz mais utilizada o glicerol, enquanto m-lcool nitrobenzlico uma boa matriz lquida para compostos apolares, e di ou trietanolamina so eficientes, devido sua basicidade, em produzir ons negativos. Como dito anteriormente, ambas as tcnicas usam feixes de corrente, onde as partculas energticas atacam a soluo que contm a amostra, induzindo uma onda de choque que retira ons e molculas desta soluo. Ento, os ons so acelerados em direo ao analisador por uma diferena de potencial. Vale lembrar que essas tcnicas induzem pouca ou nenhuma ionizao. Elas geralmente retiram da fase gasosa ons que j estavam presentes na soluo, o que torna tanto o bombardeamento inico, quanto o feito por meio dos tomos, tcnicas bastante prticas. O feixe de tomos neutros com um potencial de cerca de 5 keV obtido pela ionizao de um composto, mais frequentemente argnio (Ar) e algumas vezes, xennio (Xe). Primeiramente, ons so acelerados com potenciais de muitos kV e focalizados para o composto a fim de serem levados ao analisador. Estes ons, ento, vo para uma clula de coliso onde sero neutralizados pela troca de cargas entre os tomos dos gases presentes. Os ons restantes so eliminados do feixe quando passam entre os eletrodos. A figura 5 exibe um diagrama de como ocorre a ionizao. A reao mostrada como se segue:

Ar+ (rpido) + Ar (lento) Ar+ (lento) + Ar (rpido)

Figura 5 Fonte de ionizao por bombardeamento de tomos rpidos. Os passos so descritos a seguir: 1. Ionizao do argnio (Ar). 2. Os ons resultantes so acelerados e focalizados para a regio 2. 3. O ons argnio trocam suas cargas com os tomos neutros, tornando-se tomos neutros rpidos. 4. Quando o caminho do feixe passa entre os eletrodos, em 4, todas espcies inicas so defletidas. 5. Somente os tomos neutros rpidos alcanam esta regio, onde est a amostra dissolvida no glicerol, por exemplo. 6. Nesta regio, os ons so acelerados pelo impulsor. 7. Os eletrodos focalizam os ons para a regio 8. 8. Passagem dos ons para o analisador.

2.6 Dessoro-ionizao a laser assistida por matriz

A MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization), caracterizada como uma fonte generalizada e ponderosa para a produo direta de ons em fase gasosa a partir de uma ampla gama de compostos no volteis e termicamente instveis como as protenas, oligonucleotdeos, polmeros sintticos e muitos compostos inorgnicos. O uso de uma matriz MALDI, que provoca tanto a dessoro quanto a ionizao, um fator crucial para o sucesso deste mtodo de ionizao. O mtodo tambm caracterizado pelo simples preparo das amostras e por ter uma grande tolerncia contaminao de sais, tampes, detergentes, etc. Alm disso, ela permite a dessoro e a ionizao de analitos com massas moleculares bastante elevada, acima de 106 Da. Tomando como exemplo as protenas, o processo por MALDI capaz de detectar fento-mols de protenas com massa molar acima de 3.106 Da. A ionizao por MALDI conseguida em duas etapas. Na primeira, o composto a ser analisado dissolvido em um solvente contendo uma soluo de molculas orgnicas pequenas, chamada de matriz. Estas molculas devem ter uma grande absoro no comprimento de onda

do laser. A mistura secada antes da anlise e qualquer solvente lquido usado no preparo da soluo removido. O resultado um depsito soluo slida de cristais de matriz dopado com analitos. As molculas do analito so incorporadas em toda a matriz, de modo que elas esto completamente isoladas umas das outras. A segunda etapa ocorre sob vcuo dentro da fonte do espectrmetro de massas. Este passo envolvem a extrao de pores de volume desta soluo por intensos pulsos de laser durante uma curta durao de tempo. (figura 6a) O mecanismo exato do processo de MALDI no completamente compreendido. Entretanto, a irradiao pelo laser induz rapidamente o aquecimento dos cristais por causa do grande acmulo de energia na fase condensada atravs da excitao das molculas da matriz. Acredita-se que esse rpido aquecimento causa sublimaes localizadas dos cristais da matriz, extraindo uma poro da superfcie do cristal e expandindo a matriz para a fase gasosa, formando uma pluma de ons com ons do analito e da matriz. Espectros tpicos da MALDI incluem principalmente espcies moleculares carregadas mono carregadas (M+1) pela protonao em modo de on positivo. Compostos mais facilmente desprotonados so geralmente detectados no modo de on negativo. Alguns mltiplos ons carregados, alguns multmeros (dmeros, trmeros...) e muito poucos fragmentos podem ser observados nesses espectros. Como tais espectros so simples, os processos utilizando MALDI so bastante teis na anlise de misturas complexas. A figura 6b mostra um espectro de massas de um instrumento MALDI. O material da matriz era o cido nicotnico e o analito um anticorpo monoclonal de um rato, com massa molar de aproximadamente 150 kDa.

Figura 6 (a) diagrama dos princpios da MALDI. (b) Espectro MALDI de uma matriz de cido nicotnico irradiada com um feixe de laser de 266 nm.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS HOFFMANN, Edmond de; STROOBANT, V.. Mass spectrometry: Principles and Applications. 3 ed., Chichester, UK: Wiley, 2002.

HOLLER, F. James; SKOOG, D. A.; CROUCH, S.R.. Princpios de anlise instrumental. Porto Alegre: Bookman, 2009.