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Rodrigo A. Moreno y Marco A. Mndez. 2009. Mtodos de reconstruccin filogentica para caracteres morfolgicos y moleculares. Gua de pasos metodolgicos para principiantes en sistemtica filogentica. Versin 1.1. Laboratorio de Gentica y Evolucin, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. 33 pp.

Este documento es propiedad intelectual del Laboratorio de Gentica y Evolucin, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile.

-2009-

RA Moreno & MA Mndez

Introduccin
La presente gua que ponemos a disposicin como material docente para el curso de postgrado Procesos Evolutivos: Mtodos de Reconstruccin Filogentica de la Universidad de Chile, tiene como objetivo brindar apoyo metodolgico a los estudiantes que recin se inician en el estudio de la sistemtica filogentica. Hemos querido ejemplificar de forma simple los mtodos rutinarios que se aplican en las reconstrucciones filogenticas para evaluar hiptesis en ecologa y evolucin. En esta gua se presentan detalladamente los pasos metodolgicos y los programas computacionales informticos ad hoc para reconstruir hiptesis filogenticas basadas en caracteres o rasgos morfolgicos y moleculares (secuencias nucleotdicas). Esperamos que este material contribuya a desarrollar en trminos pedaggicos la habilidad de los estudiantes de comprender el uso adecuado de cada herramienta y su potencial utilidad y restriccin metodolgica e interpretativa desde el punto de vista estadstico y biolgico. Finalmente, entregamos las directrices como realizar anlisis filogenticos utilizando mtodos como Neighbor Joining, Mxima Parsimonia, Mxima Verosimilitud (Maximum Likelihood) e Inferencia Estadstica Bayesiana en distintas plataformas computacionales en su mayora de libre distribucin. A continuacin se procede a mostrar con ejemplos tipos la forma de iniciar el anlisis de los datos en una seccin dedicada a caracteres morfolgicos y una segunda a caracteres moleculares. Cabe destacar que esta gua esta desarrollada exclusivamente para efectuar anlisis en ambiente Windows XP.

RA Moreno & MA Mndez 1.- Reconstruccin filogentica para caracteres morfolgicos

Procedimiento

1) Abrir bloc de notas 2) Proceda a crear un archivo (matriz) en lenguaje #NEXUS Ejemplo tipo: Vertebrados

3) Defina el grupo externo outgroup [por convencin se puede rellenar con ceros] 4) guarde su archivo como Vertebrados. nex 5) Este archivo con extensin nexus podr ser utilizado en la plataforma del software PAUP [Phylogenetic Analysis using Parsimony *and other methods]

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Anlisis Filogentico de Mxima Parsimonia en Software PAUP

Citas Swofford, D.L. 2002. PAUP*: Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods). Version 4. Sinauer, Sunderland, Massachusetts. Page, R. 2001. TREEVIEW 1.6.6. Tree drawing software for Apple Macintosh and Windows. Disponible en http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html. Procedimiento 1) Abrir PAUP 2) Abra el archivo tipo Vertebrados. nex

3) Ejecute los siguientes comandos _ = un espacio 3.1. Defina su tipo de Bsqueda alltree Bsqueda Exhaustiva: <12 taxa hsearch Bsqueda Heurstica bandb Bsqueda Heurstica: [Branch and Bound]

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3.2. outgroup _celacanto [definir Outgroup - ver archivo Nexus]

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3.3. describetree

Descripcin de los datos [estadsticos: Largo rbol, IC, IR]

3.4. ACCTRAN 3.5. pset_opt=deltran 3.6. showtree

Algoritmo de Optimizacin del estado del carcter por defecto de PAUP comando para cambiar el criterio de Optimizacin [Optimizacin del estado del carcter por DELTRAN] Mostrar los rboles

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3.7. contree

rbol de Consenso

3.8. savetree Guardar rbol [archivo queda con la extensin. tree] 3.9. bootstrap_nrep=10000 Soporte de los nodos (rbol de consenso del 50% de la regla de la mayora)

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3.10. savetree_file= Vertebrados.tree_from=1_to=1_brlens=yes Salvar el rbol como archivo con largo de ramas (filograma)

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En su carpeta aparecer Vertebrados con extensin tree para ser desplegado en el software Treeview. Recuerde ir al men Tree y seleccione show internal Edge labels para que despliegue los valores de soporte de los nodos obtenidos en su anlisis de Bootstrap. Guarde la figura como Save as Graphics y seleccione la extensin Enhaced metafile (emf).

RA Moreno & MA Mndez Otros comandos de utilidad 3.11. set_criterion=dist nj set_criterion=parsimony 3.12. exclude_uninf 3.13. includeall 3.14. showmat 3.15. describetree/apolist Cambio de criterio a mtodo de distancia Neighbor-Joining [vecino ms cercano] Cambio de criterio a mtodo de Mxima Parsimonia Excluir caracteres no informativos Incluir todos los caracteres Mostrar matriz de datos Muestra la lista de apomorfas de la matriz

4) utilize el software TREEVIEW para desplegar grficamente el(los) rbol(es) recuperados. 5) Cierre PAUP.

Nota: El procedimiento es similar cuando se utiliza una matriz con secuencias nucleotdicas.

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RA Moreno & MA Mndez 2.- Reconstruccin filogentica para caracteres moleculares

Procedimiento 1) Para obtener secuencias nucleotdicas utilize la plataforma de Genbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html 2) Seleccione en el men Search Nucleotide 3) Posteriormente en el buscador For coloque el taxn de inters y el tipo de marcador(es) molecular(es).

4) Realice click en el n de acceso de Genbank y baje download la secuencia en formato FASTA

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5) Genere una carpeta con las secuencias recuperadas en GenBank 6) Cierre la pgina. 7) Una vez obtenida las secuencias nucleotdicas se procede a generar una base de secuencias en las plataformas CLUSTALX y BIOEDIT para realizar los alineamientos de secuencias nucleotdicas. Procedimiento CLUSTALX Extensin .fas (formato FASTA) Cita Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.G. 1997. The CLUSTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25: 4876-4882. Para cada archivo realizar el siguiente procedimiento: 1) Abrir el Programa CLUSTALX y dentro de ste, abra el archivo .fas. 2) Proceder a alinear las secuencias utilizando la opcin que viene por defecto Multiple Aligment Mode y vaya al men alignment y ejecute Do complete alignment. 3) En su carpeta aparecer el alineamiento efectuado con la extensin .aln 4) Cierrar el programa CLUSTALX

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RA Moreno & MA Mndez Procedimiento BIOEDIT Cita Hall, T.A. 1999. BIOEDIT: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95-98. 1) En su carpeta aparecer el alineamiento efectuado con la extensin .aln 2) Abrir Bioedit 3) Seleccionar Edit para cortar secuencias y elimine en el men edit delete sequence la secuencia Clustal Consensus. 4) Guardar y cerrar Bioedit

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RA Moreno & MA Mndez Procedimiento MEGA4 Cita Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599. 1) Abrir el Programa MEGA4 2) En el men File elegir la opcin Convert To MEGA Format. Esta opcin permite convertir el archivo .aln en un archivo .meg

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3) Abrir el archivo .meg (Open Data en el men File); ocupar la opcin Neighborjoining en el men Phylogeny

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4) Volver a realizar este anlisis pero utilizando adicionalmente la opcin Bootstrap

5) Guardar los rboles correspondientes

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RA Moreno & MA Mndez Software PAUP (Phylogenetic Analysis using Parsimony *and other methods)

1.- Anlisis Filogentico de Mxima Parsimonia en Software PAUP (idem a pgina 4)

2.- Anlisis Filogentico de Mxima Verosimilitud (Maximum Likelihood) Archivo Tipo: Grupo 16s [secuencias nucleotdicas de especies de anfibios del gnero Bufo]

Procedimiento 1) Buscar el mejor modelo de evolucin molecular que se ajusta a los datos para ello utilizar el software MODELTEST (incluye 56 modelos). Para el uso en ambiente Windows, utilizar WINMODELTEST. 2) Abrir matriz de datos originales en formato nexus en PAUP.

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3) Abrir adems en PAUP el archivo modelblock4.txt que se encuentra en la carpeta System files de WINMODELTEST; esto permite calcular los parmetros de los modelos evolutivos en PAUP creando el archivo model.scores en la carpeta System files de WINMODELTEST.

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4) Abrir WINMODELTEST, hacer click en New Outfile y luego en Run Modeltest; esto crear un archivo outfile en la carpeta System files en que aparecern los parmetros de los modelos escogidos con los criterios de hLRT (Likelihood Radio TestPrueba de Razn de Verosimilitud) y AIC (Criterio Informativo de Akaike).

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5) Agregar al final del archivo Nexus original las lneas de comandos que aparecen en el archivo outfile bajo el modelo escogido (Seleccione el Criterio de Akaike)

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6) Ejecutar el archivo Nexus modificado en PAUP; cambie el criterio a likelihood y realizar una bsqueda exhaustiva o heurstica y un bootstrap no-paramtrico. Guarde las salidas (outputs) y cierre PAUP.

set_criterion=likelihood. [Cambio de criterio a mtodo de Mxima Verosimilitud].

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7) Recuerde de seguir los mismos pasos que se utilizaron para la reconstruccin por Mxima Parsimonia y grabe su rbol el cul aparecer en su carpeta como grupo16s con extensin tree para ser desplegado en el software Treeview. Recuerde ir al men Tree y seleccione show internal Edge labels para que despliegue los valores de soporte de los nodos obtenidos en su anlisis de Bootstrap. Outgroup Barenarum

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RA Moreno & MA Mndez Anlisis Filogentico de Inferencia Estadstica Bayesiana

Plataforma: MRBAYES Cita Huelsenbeck, J.P. & F. Ronquist. 2001. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics 17: 754-755. Procedimiento 1) Copie el archivo Nexus (original) y trasladelo a la carpeta de MRBAYES. Ahora ejecute MRBAYES con los comandos que se indican ms abajo. Ejemplo archivo Tipo: Rag1CCQ [secuencias nucleotdicas del gen nuclear Rag 1 recombination activating gene (RAG) - de gneros de anfibios] exe Rag1CCQ.nex

2) Defina el outgroup Outgroup Leiopelma

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3) Especificar la estructura del modelo lset_nst=6_rates=propinv

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4) Especifique algunos parmetros del anlisis mcmcp_ngen=500000_samplefreq=1000_savebrlens=yes

5) Iniciar el anlisis: mcmc Para detener el anlisis: n

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6) Una vez terminado el anlisis realizar un burnin sump_burnin=10

sumt_burnin=10

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7) Ir a la carpeta de MRBAYES y seleccionar el archivo. CON

8) Visualizar el rbol de consenso del 50% de la regla de la mayora desplegado en Treeview donde se observan las probabilidades a posteriori.

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