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Universidade Federal do Par Instituto de Cincias Biolgicas Faculdade de Biotecnologia Disciplina: Processos Biotecnolgicos Docente: Alberdan Santos Discente:

Clio Maurcio, Francinilson Meirelles, Geovani Oliveira, Giselle Brasil, Lygia Elyse, Mayra Pauline

Relatrio referente Aula Prtica de Crescimento Microbiano

Belm/Par 2013

1. Introduo 1.1 Microrganismos As bactrias, arqueas, protozorios, algas e fungos e, tambm, vrus so microrganismos microscpicos que, embora alguns que em determinadas fases de seu crescimento atingem tamanho macroscpicos, podem viver como clulas independentes ou em aglomerados celulares. Com exceo dos vrus que abrange a discusso de vivo e no vivo, os microrganismos se classificam em: Bactria, Archaea e Eukarya. Os microrganismos no encontrados em diferentes locais e apresentam diferentes modos de sobrevivncia, podendo gerar diferentes graus de mutualismo, parasitismo e comensalismo. Alguns so procariontes e outros eucariontes, podendo ser anaerbios e sobreviver sem oxignio ou aerbios e dependente do oxignio. Os microrganismos podem sobreviver a partir da colonizao do ambiente ou no interior de outros seres vivos. Os auttrofos sintetizam seus alimentos a partir de dixido de carbono; os fotossintticos utilizam a luz como fonte de energia; e os quimiossintticos, algumas reaes qumicas inorgnicas. Os hetertrofos dependem das molculas orgnicas produzidas por outros seres vivos. O metabolismo microbiano se refere a toda reaes qumicas dentro do organismo, liberando ou retendo energia, podendo se dividida em catabolismo e anabolismo. As sequncias de reaes qumicas so determinadas por suas enzimas. As reaes anablicas so direcionadas quebra do ATP e as reaes catablicas so direcionadas sntese do ATP. O ATP armazena as energias oriundas das reaes catablicas e a libera para comandar as reaes anablicas e trabalhos celulares. As reaes enzimticas microbianas que liberam energia so envolvidas no catabolismo, quebrando compostos complexos em simples. As reaes que acontecem no catabolismo so as hidrolticas e exergnicas. As reaes enzimticas microbianas que retm energia esto envolvidas no anabolismo,

produzindo molculas orgnicas complexas a partir de pores simples. As reaes envolvidas no anabolismo so de desidratao e endergnica.

1.2 Crescimento Microbiano O crescimento microbiano desenvolvido a partir das reaes metablicas, resultando em divises celulares. Este depende do meio adequado e da quantidade definida de substrato. As fases de crescimento microbiano so: lag, crescimento exponencial, estacionria e declnio. 1) A fase lag est relacionada com a adaptao fisiolgica do microrganismo ao meio de cultura, no havendo crescimento imediato; 2) A fase exponencial se refere ao ciclo de divises celulares, sendo est influenciada por condies como temperatura, ph, meio de cultura e gentica do microrganismo;

Calculo do crescimento exponencial: Onde x massa celular, t o tempo, a taxa de crescimento especfica;

Rearranjando: Para x ser em duplicata:

Portanto: Onde t o tempo de gerao

3) A fase estacionria quando no h crescimento microbiano e nem morte celular. Essa fase acontece devido a escassez de nutrientes ou acumulao de resduos inibitrios. Porem muitas clulas continuam com seu metabolismo e biossntese de metablitos;

4) A fase de declnio ocorre quando as clulas comeam a morrer. Porm a taxa de morte celular mais lenta que do que o crescimento exponencial;

Onde Kd a taxa especfica de morte celular

1.3 Fungos filamentosos Os fungos podem ser divididos em fungos, unicelulares, filamentosos ou pseudofilamentoso. Os fungos filamentosos so caracterizados pelos bolores e podem apresentar septos ou no. Os filamentos que compe o talo dos fungos filamentosos so chamados de miclio, esse miclio um sistema de filamentos ramificados, muitas vezes, morfologicamente complexos. Os filamentos do miclio so chamados de hifas, estas so simples e contm citoplasma parede celular e podem ser de diferentes formas. Fungos filamentosos so adaptados para crescer em superfcies, o que evidenciado pelo seu modo de nutrio por absoro, sua secreo de enzimas extracelulares para digerir molculas complexas. Os fungos so microrganismos heterotrficos e, em sua maioria, aerbios. Portanto, certas leveduras fermentadoras, aerbias facultativas, se

desenvolvem em ambientes com pouco oxignio ou mesmo na ausncia deste elemento. Nestas condies os fungos podem germinar, ainda que lentamente. O crescimento vegetativo e a reproduo assexuada tambm podem ocorrer, enquanto a reproduo sexuada se efetua apenas em atmosfera rica em oxignio. 1.4. Modelo de Monod Em 1912, Penfold e Norris propulseram o primeiro principio para o crescimento microbiano. Eles estabeleceram que a relao entre e S melhor descrito por um tipo de curva de saturao onde em altas concentraes de substrato, o microorganismo cresce em uma taxa mxima (mx) independente da concentrao de substrato (Penfold e Norris, 1912). A cintica de Monod baseado na observaes metabolismo em termos elementares que representam vrias opes para a utilizao de substrato externo contribuindo cada um para a produo de metabolitos intracelulares, produtos extracelular, e biomassa. Assumindo que cada reao num determinado modo elementar est em estado estacionrio com a taxa de captao, a estimativa da sua taxa ativado por acoplamento estequiomtrico. A captao das taxas so ento modeladas em termos de cintica das enzimas por substrato de modo a que a taxa de produo de biomassa fresca , eventualmente, expresso como uma combinao convexa de numerosos expresses cinticas de enzimas por substrato. A racionalizao da cintica de Monod para a produo de biomassa depende de como ela pode ser obtida a partir de uma combinao convexa de expresses de cintica de enzimas por substrato. O efeito da concentrao de substrato sobre o crescimento especfico mostrado no grfico 1.

A expresso que corresponde ao grfico plotado apresentada em (1).

(1)

= taxa de crescimento especfico, T-1 (day-1) m = taxa de crescimento mximo especfico, T -1(day-1) S = taxa de crescimento em concentrao de substrato limitante, ML-3 (mg/L) Ks = coeficiente de meia saturao; concentrao nde substrato na metade do crescimento mximo, ML-3 (mg/L) = constante de Monod.

A expresso de Monod providencia uma transio entre as cinticas de primeira e segunda ordem baseado sobre a concentrao de substrato limitante.

onde k=m /Ks O modelo deve ser reduzido para a expresso de primeira ordem.

o modelo torna-se uma expresso de ordem zero. A constante de meia saturao caracterstica de cada microorganismo, substrato e condies de cultura.

Grfico de Lineweaver-Burk O grfico de lineweaver-Burk obtido plotando 1/ versus 1/S. A linha crescente representa a inclinao de Ks e uma interceptao de 1/ m no eixo 1/ .

(2)

2. Objetivos 2.1 Geral: O objetivo geral da aula prtica foi observar o crescimento microbiano de fungos filamentosos e determinar os parmetros cinticos Ks e max. 2.2 Especfico Fazer a medio do crescimento de uma cultura de fungos filamentosos atravs de um paqumetro
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Observar o crescimento e a produo de metablitos dos inculos Determinar os parmetros cinticos Ks e max atravs do modelo de Monod.

3. Material e Mtodos

Inculos e Medies Os microrganismos foram inoculados, com tamanho inicial de 0,5 cm, em placas de Petri e, as medies foram realizadas diariamente atravs da tcnica de mensurao do ciclo ortogonal segundo modelo apresentado na figura 1. Com o auxilio de um paqumetro. De acordo com o crescimento do microorganismo o halo formado pde ser medido.

D2

D1

Figura 1. Representao de medio de ciclos ortogonais. Fonte: Imagens do autor

Materiais para Medio Paqumetro Placas E1, E2, E3; F1, F2, F3; G1, G2 e G3 para medio.

As medies foram anotadas em uma tabela de acordo com a tabela 1. Para posteriores clculos. Dias Tempo (h) 1 0 09/12/13 Data
Valores X (mm)

dxa

dxb

Dt

1/x

D1 ...

D2 ... ... ... ... ... ...

4. Resultados e discusso Curva de Crescimento e Formao de Metablitos A medio da curva de crescimento para os grupos em triplicata de E, F e G apresentaram grandes diferenas em relao s fases de crescimento. Conforme representado nas tabelas 1-3. Os dados para obteno das mdias encontra-se em anexo.
Mdia E Dias 1 2 3 4 5 6 7 8 Hora 0 24 48 72 96 120 144 168 Data Valores X (mm) X 1/X dX D1 D2 0,5 0,5 0,5 2 0 2,43 2,366667 2,4 0,417536 -1,58246 6,87 7,1 6,983333 0,143219 -0,27432 9,1 9,1 9,1 0,10989 -0,03333 9,1 9,1 9,1 0,10989 0 9,1 9,1 9,1 0,10989 0 9,1 9,1 9,1 0,10989 0 9,1 9,1 9,1 0,10989 0 dt dx/dt u

0 0 0 24 -0,06594 -0,02752 24 -0,01143 -0,00164 24 -0,00139 -0,00015 24 0 0 24 0 0 24 0 0 24 0 0

Tabela 1. Mdia para obteno de velocidade especfica de crescimento () para cepa E

Mdia F Dias 1 2 3 4 5 6 7 8 Hora 0 24 48 72 96 120 144 168 Data Valores X (mm) D1 D2 0,5 0,5 0,6 0,7 1,6 1,6 2,4 2,7 2,9 2,9 3,6 3,6 4,35 4,3 5 5 X 0,5 0,65 1,6 2,5 2,85 3,65 4,325 5,05 1/X 2 1,538462 0,625 0,4 0,350877 0,273973 0,231214 0,19802 dX 0 -0,46154 -1,01215 -0,20833 -0,06579 -0,0731 -0,03844 -0,0326 dt 0 24 24 24 24 24 24 24 dx/dt 0 -0,01923 -0,04217 -0,00868 -0,00274 -0,00305 -0,0016 -0,00136 u 0 -0,02959 -0,02379 -0,00362 -0,00096 -0,00085 -0,00037 -0,00027

Tabela 2. Mdia para obteno de velocidade especfica de crescimento () para cepa F.

Mdia G Dias 0 1 2 3 4 5 6 7 Hora 0 24 48 72 96 120 144 168 Data 09/dez 10/dez 11/dez 12/dez 13/dez 14/dez 15/dez 16/dez D1 Valores X (mm) D2 0,5 0,5 0,9 0,9 1,9 1,9 2,6 2,4 2,9 2,7 3,2 2,9 2,05 3,05 4,9 4,8 X 0,5 0,9 1,9 2,6 2,95 3,25 4,05 4,85 1/X 2 1,111111 0,526316 0,384615 0,338983 0,307692 5,05 0,206735 dX 0 -0,82353 -0,45946 -0,1417 -0,04563 -0,03129 6,05 -0,0397 dt dx/dt u

0 0 0 24 -0,03431 -0,04037 24 -0,01914 -0,01035 24 -0,0059 -0,00227 24 -0,0019 -0,00064 24 -0,0013 -0,0004 7,05 8,05 9,05 24 -0,00165 -0,00034

Tabela 3. Mdia para obteno de velocidade especfica de crescimento () para cepa G.

Para o grupo E foi observada uma rpida fase de adaptao caracterizada pelo acelerado crescimento da colnia conforme apresentado na figura 1, e posterior entrada na fase exponencial. Os valores do crescimento especfico da biomassa () apresentaram uma mdia de -0,001637455 h-1 caracterizando uma rpida adaptao em relao aos demais grupos descritos a seguir. Nestas placas a entrada nas fases Lag, Log e estacionria conseguiu ser caracterizada.

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Quanto formao de metablitos a partir do 5 dia, foi observada a presena de uma colorao escura que se estendia do centro para a periferia, sobre tudo em E3. Figura 1. E ao final do 8 dia houve uma maior formao de metabolitos caractersticos na triplicata.

Figura 1. Imagens da cepa E no 1 e 8dia.

No grupo F, o crescimento foi menos acelerado do que em E, apresentando uma pequena velocidade de adaptao representada pelo valor de -0,0009 h-1 conforme descrito na tabela 2. A presena de colorao foi verificada tambm a partir do 5 dia. Neste grupo a colorao foi vermelha em toda a periferia com o centro

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esbranquiado. Figura 2. Ao final do 8 dia a presena desses metablitos caractersticos estava mais acentuada.

Figura 2. Imagens da cepa F no 1 e 8dia.

Para a triplicata G3 ocorreu o deslocamento de esporos na placa do 3 para o 4 dia o que dificultou a medio atravs do eixo ortogonal. Porem as medies dos parmetros d1 e d2 foi realizadas. Para este grupo o valor de foi de -0,00064 h-1. Apresentando o maior valor de , caracterizando assim uma pequena velocidade de adaptao. Quanto a formao de metablitos caractersticos, este apresentou uma colorao semelhante ao grupo F tambm a partir do 5 dia. Figura 3.

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Figura 3. Imagens da cepa G no 1 e 8dia

Parmetros Cinticos A medio dos parmetros cinticos, no foram calculadas para este experimento pois, o cultivo foi realizado em cultura de meio solido ento, no houve quantificao de substrato portanto, os valores de mx, ks no puderam ser calculados.

Crescimento de Biomassa Os grficos obtidos a partir da produo de biomassa atravs do tempo foram apresentados nos grfico de 1-3. A produo de biomassa para a cepa E obteve uma curva onde foi possvel observar o fim da fase log no 3 dia, sendo tambm a nica cepa que chegou a fase estacionria, de acordo com o valor

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de velocidade especfica de crescimento calculado, em comparao s outras cepas. Grfico 1.

Grfico 1. Curva de crescimento de biomassa pelo tempo para a cepa E

A biomassa produzida na Cepa F se mostrou crescente, como mostrado no grfico 2, onde a reta explicita uma pequena fase de adaptao e posteriormente sua extensa fase do crescimento da biomassa. A partir do 2 dia de cultivo, a fase exponencial se iniciou e se prolongou at o ultimo dia. O encontrado, -0,000644524, se mostrou coerente porque o baixo nvel de crescimento se mostrou constante at o 8 dia de medio. Grfico 2.

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Grfico 2. Curva de crescimento de biomassa pelo tempo para a cepa F

Para a biomassa produzida na Cepa G o crescimento foi diminudo provavelmente devido ao crescimento de esporos que se deslocaram e interferiram no seu valor de sobre tudo no grupo G3. Em detrimento disso, nos dias 7 e 8 no foi possvel fazer a medio dos eixos ortogonal d1 e d2. Neste grupo a sua fase lag foi bem rpida conforme apresentado no grfico 3.

Grfico 3. Curva de crescimento de biomassa pelo tempo para a cepa G.

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6. Concluso Atravs das medies, foi possvel observar o crescimento nos trs tipos de cepas, podendo observar as fases lag, exponencial e estacionria do microrganismo, e com isso foi possvel fazer a curva de crescimento bacteriano. Foi possvel observar tambm a produo de metablitos atravs da colorao que foi diferenciada em cada tipo de cepa. Os dados do substrato no foram apresentados, por isso no foi possvel determinar os parmetros cinticos, como Ks e max. As aulas prticas foram de grande importncia para fixar os conhecimentos obtidos nas aulas tericas sobre crescimento microbiano, alm de possibilitar o contato com as culturas microbianas.

7. Referncias

Okpokwasili G.C. & Nweke C.O.. Microbial growth and substrate utilization kinetics. African Journal of Biotechnology Vol.5 (4), pp. 305317, 16 February, 2005 Available ISSN online at 2005 16845315

http://www.academicjournals.org/AJB Academic Journals.

Penfold W. Norris D (1912). The relation of concentration of food supply to generation time bacteria. J. Hyg. 12: 527-531. Introduo a Microbiologia. Disponvel em:

<http://portal.virtual.ufpb.br/biologia/novo_site/Biblioteca/Livro_4/6Biologia_de_Microrganismos.pd>. Acesso em 16 de Dezembro de 2013.


Fungos. Disponvel em. <http://www.icb.usp.br/~crpmicol/materiais/apostila_fungos.pdf>. Acessado em 16 de Dezembro de 2013

Fungos.

Atlas

virtual.

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Engenharia

Bioqumica.

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<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/c onst_microorg/fungos.htm>. Acessado em 16 de Dezembro de 2013 Fungos filamentosos e produo de biofilme. Disponvel em

<http://www.rc.unesp.br/ib/ceis/mundoleveduras/2011/Fungos_filamento sos_e_a_produ%C3%A7ao_de_biofilme_1.pdf>. Acessado em 17 de Dezembro de 2013

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