Implementacin y optimizacin de Mtodos Analticos

Desarrollo

Optimizacin

Validacin

Implementacin

Desarrollo de un Mtodo
1 -Definir cual es el alcance del mtodo a implementar! Ejemplo: Cuantificar la concentracin de arsnico en muestra de pescado

Desarrollo de un Mtodo
2 Realizar una revisin bibliogrfica!
-Normas -Tcnicas -Procedimientos de muestreo -Tratamiento de muestra -mbitos de concentracin en los que se trabajan las curvas. -mbitos de concentracin en los que se encuentran las muestras. -Cualquier otra documentacin que pueda aportar informacin valiosa!
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Desarrollo de un Mtodo
3 Definir cual tcnica es la ms apropiada!
Se debe evaluar: -Disponibilidad de equipos (o el presupuesto para adquirirlos). -La sensibilidad de la tcnica. -Tiempo de anlisis. -Volumen de muestras que se estima procesar -Costos de operacin y mantenimiento. -Procesamiento de muestra (simplicidad).
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Desarrollo de un Mtodo
3 Otros aspectos a considerar!
-Infraestructura. -Calidad de los reactivos. -Equipos calibrados. -Personal entrenado.

Desarrollo de un Mtodo
Como estimar la sensibilidad de la tcnica seleccionar?
Limite de concentracin mximo permitido (LCM): Norma nacional o internacional) LCM de arsnico en pescado = 1000 g As Kg-1 Preparacin de muestra por microondas 0,5 g muestra. 1000 g As 1000 g muestra Masa de analito = 0,5 g As X g As 0,5 g muestra Si la muestra digerida se trasvasa a un baln de 25,0 mL, entonces: Concentracin = 0,5 g As = 20 g As L-1 0,025 L Criterio de aceptacin: 20% del LCM, entonces Mtodo debe poder medir 0,2xLCM 0,2x20 g As L-1 = 4 g As L-1
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Desarrollo de un Mtodo
Cuantificacin de arsnico en muestra de pescado
Tcnicas que podran utilizarse: -Espectroscopia de absorcin atmica por llama (FAAS). -Espectroscopia de absorcin atmica por Horno de Grafito (GFAAS). -Espectroscopia de absorcin atmica por Generacin de Hidruros (HG -AAS). -Espectroscopia de emisin atmica con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-OE). -Espectrometra de masas con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-Ms).

Desarrollo de un Mtodo
Que hacer si ninguna de las tcnicas disponibles tiene la sensibilidad requerida? -Se debe emplear alguna tcnica de pre-concentracin
-En trminos generales es preferible evitar esta situacin por problemas de perdida de analito o contaminacin de muestra

Desarrollo de un Mtodo
4 Definir el pre-tratamiento de muestra
Se debe tomar en cuenta: -Disponibilidad de equipos (o el presupuesto para adquirirlos). -Tiempo de procesamiento. -Cantidad de muestra requerida. -Tipo y calidad de reactivos requeridos. -Costos de operacin.
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Desarrollo de un Mtodo
La etapa de Pre-Tratamiento generalmente es la ms critica. -Es la etapa que consume ms tiempo. -Es la etapa donde se cometen ms errores. Siempre se debe ser cuidadoso a la hora de definir los pasos en esta etapa. Es recomendable evaluar esta etapa a la hora de optimizar el mtodo!

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Desarrollo de un Mtodo
4 Definir el procedimiento base para iniciar con la optimizacin del mtodo -Redactar un borrador del procedimiento con el que se comenzara a trabajar.

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Optimizacin de un Mtodo
Porque se debe realizar?
-Mejorar el rendimiento. -Disminuir costo y tiempo de anlisis. -Minimizar efectos de interferencias.

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Optimizacin de un Mtodo
Etapas de un anlisis
-Muestreo. -Tratamiento de la muestra -Anlisis de la muestra. -Calculo de concentracin e incertidumbre -Emisin de resultado

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Muestreo
Proceso mediante el cual se extrae una porcin representativa de un todo, a la cual se le realizara el anlisis
MUESTRA LABORATORIO Muestra Homognea? NO Cuartear Mezclar Tamizar Moler

SI

Tomar una pequea alcuota o masa

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Tratamiento de muestra
-Filtrado. -Licuado. -Extraccin. -Secado. -Calcinacin. -Digestin (acida o bsica). -Precipitacin.
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Anlisis de muestra
Equipos son ms confiables que humanos? -Limpieza de equipo. -Manipulacin y alineacin de componentes. -Realizar chequeos peridicos en la corrida
-Enriquecidos, duplicados, muestras spike, MRC.

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Clculos de concentracin e incertidumbre

Computadoras son ms confiables que humanos?
-Utilizar siempre plantillas electrnicas (protegidas). -Realizar chequeos peridicos a la plantilla!

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Ejemplo de anlisis de Arsnico en pescado

Laboratorio debe: -Definir la cantidad de muestra que el cliente debe traer al laboratorio. -Definir el tiempo mximo y las condiciones de transporte.

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Ejemplo de anlisis de Arsnico en pescado

Tratamiento de muestra: - Definir si se debe procesar todo el pescado, o solo ciertos rganos especficos! -Definir la forma de homogenizar la muestra! -Definir la forma de digerir la muestra!

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Ejemplo de anlisis de Arsnico en pescado

Digestin de muestra: -Que acido o cidos debo utilizar? -Cantidad de cidos? -Tipo de digestin (plantilla o microondas)?
Se debe trabajar preferiblemente con una muestra de concentracin conocida.

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Como evaluar efecto de los factores?

1- Paso a paso: Elegir la variable que deseo analizar y fijar el resto a un nivel. Definir dos niveles para la variable de estudio y se determina cual aporta mejor rendimiento. Luego con la primer variable ya fijada, vario la segunda y por utilizo vario la tercer variable.

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Ejemplo de anlisis de Arsnico en pescado

Que acido o cidos debo utilizar? -Acido Ntrico o mezcla de Acido Ntrico/ Clorhdrico?
Digerir 3 muestras con HNO3 y 3 muestras con HNO3/HCl Realizar una prueba de comparacin de medias. - Si las medias no difieren significativamente no es necesario utilizar mezcla. - Si las medias difieren significativamente, se debe seleccionar la que haya dado el resultado ms cercano al valor esperado.
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Ejemplo de anlisis de Arsnico en pescado

Cantidad de acido que debo utilizar? Digerir 3 muestras con 6 mL de Mezcla HNO3/ HCl y 3 muestras con 3 mL HNO3/HCl Realizar una prueba de comparacin de promedios. - Si las medias no difieren significativamente se puede utilizar el menor volumen de acido. - Si las medias difieren significativamente, se debe seleccionar el volumen que haya dado el resultado ms cercano al valor esperado.
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Ejemplo de anlisis de Arsnico en pescado

Pureza de acido que debo utilizar? Digerir 3 muestras con 3 mL de Mezcla HNO3/ HCl grado tcnico y 3 muestras con 3 mL HNO3/HCl de alta pureza. Realizar una prueba de comparacin de promedios. - Si las medias no difieren significativamente se puede utilizar los acidos de menor pureza. - Si las medias difieren significativamente, se debe seleccionar el tipo de acido que haya dado el resultado ms cercano al valor esperado.
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Ejemplo de anlisis de Arsnico en pescado

Tipo de digestin que debo utilizar? Digerir 3 muestras utilizando plantilla y 3 muestras utilizando sistema de microondas. Realizar una prueba de comparacin de promedios. - Si las medias no difieren significativamente se puede utilizar cualquiera de los dos sistemas (seleccionar el ms rpido!). - Si las medias difieren significativamente, se debe seleccionar el tipo de digestin que haya dado el resultado ms cercano al valor esperado.
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Ejemplo de anlisis de Arsnico en pescado

Hacer la optimizacin paso a paso, es un procedimiento aceptable pero: Puede consumir un mayor tiempo de estudio. Mayor consumo de reactivos Las condiciones experimentales pueden variar entre mediciones lo que puede inducir a interpretaciones errneas.
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Diseo factorial
Permite extraer la mayor cantidad posible de informacin til del mtodo realizando un numero pequeo de experimentos
-Forma sistematizada de evaluar el efecto de mltiples variables al mismo tiempo. -Generalmente se requieren menos replicas que ir evaluando un estudio de variable por variable.
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Diseo factorial
Cuantas muestras se requieren analizar? -Primero se definen el numero de variables o factores k a estudiar.
-Realizar un diseo factorial completo -Realizar un diseo factorial fraccionado

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Diseo factorial
Para k factores que se estudiaran a dos niveles diferentes cada uno, el numero total de experimentos a realizar es: Diseo factorial = 2K
Niveles Factores

En el ejemplo anterior: -Tipo de acido -Cantidad de acido 3 factores -Tipo de digestin 16 experimentos:

23 = 8 experimentos Por duplicado

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Diseo factorial Completo

Objetivo principal: Descubrir cuales de los valores (niveles) de cada una de las variables produce el mejor rendimiento del mtodo
En el ejemplo anterior: -Tipo de acido -Cantidad de acido -Tipo de digestin.
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Diseo factorial
1- Definir niveles para cada factor.
Factor
A B Tipo de acido Cantidad de acido

Nivel (-)
HNO3 3 mL

Nivel (+)
HNO3 / HCl 6 mL

Tipo de digestin

Microondas

Plantilla
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Diseo factorial
2- Utilizar matriz del modelo para definir combinaciones
Muestra 1 Factor A Factor B Factor C

+ + + +

+ + + +

+ + + +
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Matriz Modelo 23

2 3 4 5 6 7 8

Diseo factorial
Muestra
1 2 3 4 5

Factor A
HNO3 HNO3 / HCl HNO3 HNO3 / HCl HNO3

Factor B
3 mL 3 mL 6 mL 6 mL 3 mL

Factor C
Microondas Microondas Microondas Microondas Plantilla

6 7 8

HNO3 / HCl HNO3 HNO3 / HCl

3 mL 6 mL 6 mL

Plantilla Plantilla Plantilla

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Diseo factorial
3- Realizar mediciones de acuerdo a las combinaciones.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Factor C Replica 1 Replica 2 Promedio
0,070 0,0681 0,0686 0,0675 0,0647 0,0671 0,0634 0,0663 0,0683 0,0673 0,0658 0,0659 0,0671 0,0648 0,0619 0,0634 0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265 0,06485

Des. Est
0,00020 0,03125 0,03125 0,02880 0,00500 0,00510 0,02645 0,03125
35

+ + + +

+ + + +

+ + + +

Diseo factorial
4- Evaluacin de efectos de cada factor.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Factor C Replica 1 Replica 2 Promedio
0,070 0,0681 0,0686 0,0675 0,0647 0,0671 0,0634 0,0663 0,0683 0,0673 0,0658 0,0659 0,0671 0,0648 0,0619 0,0634 0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265 0,06485

Des. Est
0,00020 0,03125 0,03125 0,02880 0,00500 0,00510 0,02645 0,03125
36

+ + + +

+ + + +

+ + + +

Diseo factorial
4- Evaluacin de efectos de cada factor.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Promedio
0,06915 0,0677 0,0672

Des. Est
0,00020 0,03125 0,03125

+ + + +

0,0667
0,0659 0,06595 0,06265 0,06485

0,02880
0,00500 0,00510 0,02645 0,03125
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Diseo factorial
4- Se multiplica cada valor por el signo correspondiente y se suman y promedian los valores.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Promedio
0,06915 0,0677 0,0672

+ + + +

Efecto FA

A a N/2

0,0667
0,0659 0,06595 0,06265 0,06485
38

N= # muestras

Diseo factorial
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Promedio
0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265 0,06485

Promedio
- 0,06915 0,0677 - 0,0672 0,0667 - 0,0659

+ + + +

0,06595
- 0,06265 0,06485

39

Diseo factorial
Efecto FA
Promedio
- 0,06915 0,0677 - 0,0672 0,0667 - 0,0659 0,06595 - 0,06265 0,06485
40

0,0677 0,0667 0,0660 0,0649 0,0692 0,0672 0,0659 0,0627

4 Efecto FA

0,2652 0,2649
4

Efecto FA 0,000075

Diseo factorial
5- Se repite el anlisis para el factor B
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor B Promedio
0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265 0,06485

Promedio
-0,06915
-0,0677 0,0672 0,0667 -0,0659

+ + + +

Efecto FB

B b N/2

-0,06595
0,06265 0,06485
41

Diseo factorial
Efecto FB
Promedio
-0,06915
-0,0677 0,0672 0,0667 -0,0659

0,0672 0,0667 0,0627 0,0649 0,0692 0,0677 0,0659 0,0660

4 Efecto FB

0,2614 0,2687
4

Efecto FB 0,00183

-0,06595
0,06265 0,06485
42

Diseo factorial
5- Se repite el anlisis para el factor C
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor C Promedio
0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265 0,06485

Promedio
-0,06915
-0,0677 -0,0672 -0,0667 0,0659

+ + + +

Efecto FC

C c N/2

0,06595
0,06265 0,06485
43

Diseo factorial
Efecto FC
Promedio
-0,06915

0,0659 0,0660 0,0627 0,0649 0,0692 0,0677 0,0672 0,0667

4 Efecto FC

0,25935 0,27075
4

-0,0677
-0,0672 -0,0667 0,0659 0,06595 0,06265 0,06485
44

Efecto FC 0,00285

Diseo factorial
6- Para evaluar si los efectos son significativos, primero se calcula la varianza conjunta
2 2 1 s12 2 s2 .... n sn s 1 2 ..... n 2 c

45

Diseo factorial
En el presente ejemplo, cada muestra se analiz por duplicado, por lo tanto = 1 para las n muestras (8 en total).

1 2 ..... n 8

2 2 2 s s .... s 2 2 8 Sc 1 8

46

Diseo factorial

Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8

Des. Est
0,00020 0,03125 0,03125 0,02880 0,00500 0,00510 0,02645 0,03125

2 2 2 s s .... s 2 2 8 sc 1 8

2 sc 0,0000022

47

Diseo factorial
7- A partir de la varianza conjunta se calcula el error efectivo.
4sc2 JxN

Efectivo

Donde: J = Nmero de replicas por ensayo N = Nmero de muestras

48

Diseo factorial
En el ejemplo
s
Efectivo

4sc2 JxN

Efectivo

4 0,0000022 2 x8

s Efectivo 0,000746

49

Diseo factorial
8- A partir de s efectivo se calcula el valor critico.
Valor
Critico

t s efectivo

Donde: t = valor de t student para =N-1, /2=0,025

50

Diseo factorial
En el ejemplo
Valor
Critico

t s efectivo

t= 2,365 (v=7, /2=0,025)

Valor
Critico

2,365 0,000746 0,00176

51

Valor

Critico

Diseo factorial
9- Graficar los efectos de cada factor (valor absoluto), as como el valor critico.

52

Diseo factorial
10- Aquellos valores que sobrepasen el valor critico, se consideran factores crticos y se deber escoger el nivel del factor que da el mejor resultado.

53

Diseo factorial
En el ejemplo Si la muestra que se estaba estudiando tiene una concentracin reportada de 0,0700 mg As/Kg
Factor cidos Cantidad de cidos Tipo de digestin

0,000075 -0,001825 -0,00285

54

Diseo factorial
En el ejemplo
Factor
cidos

Efecto

Criterio

0,000075

Cantidad de cidos

-0,001825

Tipo de digestin

-0,00285

Es indiferente utilizar HNO3 o mezcla de HNO3/ HCl. Se seguira utilizando unicamente HNO3 Disminuir el volumen de acidos de 6 mL a 3 mL si afecta el resultado. Se mantiene 6 mL El digerir con plantilla afecta negativamente el resultado. La digestion por Microondas da mejores resultados

55

Diseo factorial
11- Evaluacin de efectos de la combinacin de 2 factores.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Factor C Replica 1 Replica 2 Promedio
0,070 0,0681 0,0686 0,0675 0,0647 0,0671 0,0634 0,0663 0,0683 0,0673 0,0658 0,0659 0,0671 0,0648 0,0619 0,0634 0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265 0,06485

Des. Est
0,00020 0,03125 0,03125 0,02880 0,00500 0,00510 0,02645 0,03125
56

+ + + +

+ + + +

+ + + +

Diseo factorial
11- Evaluacin de efectos de la combinacin de 2 factores.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Promedio
0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265 0,06485

Des. Est
0,00020 0,03125 0,03125 0,02880 0,00500 0,00510 0,02645 0,03125
57

+ + + +

+ + + +

Diseo factorial
- Se genera una nueva columna, respectando la combinacin de smbolos matemticos.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Factor AB
+ + + +

Promedio
0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265

Des. Est
0,00020 0,03125 0,03125 0,02880 0,00500 0,00510 0,02645

+ + + +

+ + + +

0,06485

0,03125

58

Diseo factorial
- Se calcula el efecto de la misma manera que se hizo para los efectos individuales.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Factor AB
+ + + +

Promedio
0,06915 0,0677 0,0672 0,0667 0,0659 0,06595 0,06265

Des. Est
0,00020 0,03125 0,03125 0,02880 0,00500 0,00510 0,02645

+ + + +

+ + + +

0,06485

0,03125

59

Diseo factorial Fraccionado

Objetivo principal: Descubrir cuales son los factores ms significativos sin tener que realizar un gran numero de muestras.
Ejemplo: Si se desea analizar el efecto de 7 factores, en un diseo factorial completo deberian hacerse un total de
27=128 muestra x 2 replicas = 256
60

Diseo factorial Fraccionado

- Se define la cantidad de factores que se van a variar y el resto de factores quedara en funcion de los primeros
27-4= 23=8 muestra x 2 replicas = 16

61

Diseo factorial
Matriz de un diseo 27-4
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Factor C

+ + + +

+ + + +

+ + + +
62

Diseo factorial
Matriz de un diseo 27-4
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Factor C Factor D

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +
63

Diseo factorial
Matriz de un diseo 27-4
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Factor A Factor B Factor C Factor D Factor E Factor F Factor G

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +
64