Perspectivas atuais e falhas no diagnostico antignico de Salmonella spp: importncia no reconhecimento dos sorovares circulantes, emergentes e exticos Dalia

dos Prazeres Rodrigues

dalia@ioc.fiocruz.br

A designao do gnero Salmonella adotada em 1900 por Lignires em homenagem a Daniel Salmon teve sua nomenclatura como orientao inicial dada a informaes relacionadas s condies clnicas ou ao hospedeiro do qual o microrganismo era isolado. Entretanto, a diversidade inicial de sorovares que apresentavam etiologia no especfica para um determinado hospedeiro, levou inicialmente a denominao do mesmo sorovar em hospedeiros distintos, em locais diferentes. A partir de 1920, um grupo de microbiologistas, liderados por Fritz Kauffmann em Copenhagen e Philip Bruce White em Londres unificaram a taxonomia, reconhecida pelo subcomit de Salmonella da Sociedade Internacional de Microbiologia em 1933, como esquema de Kauffmann-White. A partir de ento sua nomenclatura sofreu algumas modificaes tendo por base a utilizao de mtodos clssicos e moleculares. Salmonella o gnero de maior relevncia na famlia Enterobacteriaceae e na atualidade este dividido em duas espcies e seis subespcies ou subgneros, S.enterica (subespcies enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica) e S.bongori. A forma de redao, na nomenclatura atual apresenta o nome do sorovar iniciado com letra maiscula, porm nunca itlico por ex. na subespcie enterica: Salmonella enterica subespcie enterica sorovar Typhimurium, podendo ainda ser redigida de forma reduzida, Salmonella ser. Typhimurium ou Salmonella Typhimurium. Em outras subespcies so designadas por esta, seguida por sua formula antignica, por ex. S.enterica subsp salamae ser. 50: z : e,n,x ou Salmonella sorotipo II 50: z : e,n,x. Em geral, acredita-se que Salmonella e Escherichia coli descendam de um ancestral comum a 160-180 milhes de anos, durante o perodo tercirio, em paralelo

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com os invertebrados. E.coli e Salmonella difsica se adaptaram aos mamferos, enquanto sorovares monofsicos permaneceram adaptados aos repteis. Em cada subespcie so reconhecidos diferentes sorovares, totalizando na atualidade 2.610, com base na caracterizao de seus antgenos somticos (O) e flagelares (H) e de acordo com a espcie e subespcie tendo a seguinte distribuio: Salmonella enterica subsp. enterica (1.547 sorovares); Salmonella enterica subsp salamae (513); Salmonella enterica subsp arizonae (100); Salmonella enterica subsp diarizonae (341); Salmonella enterica subsp houtenae (73); Salmonella enterica subsp. indica (13); Salmonella bongori (23), os quais no reconhecem a especie proposta Salmonella subterranea tendo sido a mesma inserida como sorovar da espcie bongori (Guibourdenche et al, 2010) Seu habitat natural pode ser dividido em trs categorias com base na especificidade do hospedeiro e padro clnico por ele determinado: altamente adaptadas ao homem incluindo S.Typhi e S.Paratyphi A, B e C, agentes da febre entrica; altamente adaptadas aos animais, S.Dublin (bovinos), S.Choleraesuis e S.Typhisuis (sunos), S.Pullorum e S.Gallinarum (aves), responsveis pelo paratifo animal. A terceira categoria inclui a maioria dos sorovares que atingem o homem e animais, designadas salmonelas zoonticas, responsveis por doenas de transmisso alimentar, de distribuio mundial, sendo detectadas na maioria das espcies animais utilizados para consumo humano, alm de animais silvestres e domsticos. A salmonelose uma das zoonoses mais complexas em sua epidemiologia e controle, com padres diferenciados de acordo com a regio. Isto se deve a diferenas nos hbitos alimentares, prticas de elaborao de alimentos, criao de animais e padres de higiene e saneamento. O controle das salmoneloses representa um desafio para a Sade Pblica, tendo em vista a emergncia de novos sorovares e a reemergncia de outros em determinadas reas, tanto nos pases emergentes quanto naqueles industrializados. O fator epidemiolgico mais destacado nos animais o estado de portador, onde a falta de sintomas e as dificuldades tcnicas para sua deteco antes ou durante a inspeo dos produtos de origem animal. Considerando que a principal via de transmisso est na cadeia alimentar, sua presena em animais de produo aponta este microorganismo como o mais incidente
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e relevante agente etiolgico de enteroinfeces. Isto resulta em milhes de dlares em perdas para a indstria, particularmente de bovinos, sunos e aves, tanto para o mercado interno quanto para exportao, onde em alguns pases, a rigidez na inspeo representa uma necessidade constante de qualidade.

Aspectos Gerais sobre os Antgenos de Salmonella spp.

Quanto ao seu perfil antignico, como a totalidade das espcies da famlia Enterobacteriaceae, Salmonella apresenta um antgeno comum, tambm designado de antgeno de Kunin. Sua presena usualmente no avaliada tendo em vista que no representa um critrio relevante para a diferenciao entre gneros ou espcies. Alguns sorovares produzem um antgeno de superfcie ou envoltrio Vi de natureza polissacaridica (Flix & Pitt), o qual apresenta sua localizao espacial externa parede celular impedindo a deteco do antgeno somtico. Usualmente encontra-se presente em cepas de S.Typhi, S.Paratyphi C e S.Dublin. So termolbeis podendo ser destrudos atravs do aquecimento da suspenso a 100oC/10-15 minutos. Outrossim, o antgeno de parede ou antgeno somtico ou antgeno O (Ohne) apresenta especificidade. Tem composio lipopolissacaridica, so resistentes ao calor e estveis ao tratamento com lcool. Apresentam-se constitudos de trs partes: poro lipdica, responsvel pela toxicidade e caractersticas pirognicas; poro basal ou core e o polissacardeo, que confere a especificidade das formas lisas (S). constitudo de cadeias repetitivas, cujo arranjo espacial mostra sua natureza definida, a qual, aliada ao tipo de ligao, determina a especificidade dos antgenos O. Sua sntese codificada por cerca de 20 genes (locus rfb) reconhecido um nmero elevado de fatores antignicos somticos (67), os quais so utilizados para a identificao sorolgica. Estes fatores embora estejam intimamente relacionados, nem sempre so antigenicamente idnticos. Sua caracterizao possvel somente quando as cepas se encontram em fase lisa (S- Smooth) onde apresentam colnias com superfcies homogneas, brilhantes, bordos regulares indicativos de antgeno O completo. A ocorrncia de mutao que afete sua poro basal, ou na sntese de sua cadeia resulta na perda da especificidade
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do antgeno. Neste caso, so designadas rugosas R (Rough) de superfcie e bordos irregulares sendo impossvel a recuperao ou reconhecimento de suas caractersticas originais. So autoaglutinveis em soluo salina, facilmente fagocitveis e sensveis a ao do complemento. No procedimento laboratorial para a confirmao antignica, a aglutinao das clulas bacterianas (somtica ou antgeno O) por antissoros policlonais (7) e especficos (65), apresenta como caractersticas ser lenta, formar grnulos finos no dissociveis pela agitao, tendo em vista que a reao ocorre pela interelao entre a parede celular das clulas bacterianas. Os antgenos flagelares ou antgeno H (Hauch) tem sua composio protica, designada flagelina. As diferenas antignicas surgem devido a variaes na estrutura primria, ou contedo de aminocidos das diferentes molculas de flagelina. Tem como caracterstica importante a termolabilidade podendo ser destrudos a 100oC/10 minutos, bem como aps ao lenta do lcool 50oGL e resistentes soluo de formol a 0,5%. Aglutinao flagelar apresenta como caracterstica a formao de grumos espessos que se dissociam rapidamente atravs de agitao. Esta ocorre em tempo mais rpido do que aglutinao somtica, devido ao elevado nmero de flagelos existente na clula, quando comparado aglutinao somtica, tendo em vista que a ligao se faz entre as clulas bacterianas. O arranjo espacial e caractersticas intrnsecas ao gnero possibilitam a produo de dois tipos de flagelos distintos. Em uma populao bacteriana de uma cepa de Salmonella spp, que produza dois tipos distintos de flagelo, a freqncia de variao de clulas que apresentam um dos tipos ou fases na ordem de 104. Na maioria dos isolados de Salmonella, dois genes codificam antgenos flagelares: gene fliC (>50 diferentes alelos) de extremidade altamente conservada no genero e que codifica os antgenos de fase 1, e o gene fljB (30 alelos) tambem conservado no gnero e que codifica antgenos da fase dois. Estes genes so expressos por um mecanismo de variao de fase, onde fliC est presente em todas as salmonelas possuindo um homlogo em E.coli enquanto fljB est localizado em uma regio do genoma exclusivo de Salmonella e presente em quatro das seis subespcies. Em
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algumas ocasies possivel verificar o isolamento de cepas que se apresentam trifsicas, geneticamente descritas como possuidoras do gene flagelina, flpA, presentes em um plasmdeo. Os genes que codificam a flagelina de Salmonella spp. normalmente so altamente conservados em seus 5 'e 3', enquanto a regio central geralmente muito varivel. Na prtica a determinao de ambas as fases realizada por aglutinao rpida com antissoros policlonais (12 polivalentes e 85 monovalentes), muitas vezes ocorre ausencia de expresso de uma de suas fases impossibilitando a caracterizao do sorovar. Esta pode ocorrer em alguns sorovares, quando sub-populaes de clulas, cada uma possuidora de um dado antgeno ou conjunto de antgenos associado com seus flagelos, capaz de produzir um terceiro ou quarto tipo de flagelos. Para sua identificao muitas vezes se faz necessria a imobilizao de uma das fases para a caracterizao da fase desconhecida, a qual designada de "tcnica de inverso de fase". O no reconhecimento desta pode resultar em erro no diagnstico conclusivo do sorovar, dificultando muitas vezes aes de controle efetivas. Entretanto considerando-se a complexidade dos antigenos flagelares a no utilizao da totalidade de antissoros monovalentes poder levar a resultados incorretos de sua estrutura antignica, como por ex. g,m; g,t; g,p; g,q; g,p,s; g,z61; m,t.

Caracterizao Antignica de Salmonella: A sorotipificao constitui uma importante ferramenta epidemiolgica complementar na identificao de Salmonella permitindo determinar a

prevalncia/emergncia ou apontar tendncias de um sorovar em distintas zonas geogrficas, bem como identificar surtos, conhecer as fontes de infeco e vias de transmisso. A identificao dos sorovares definida pelo esquema de Kauffmann & White e envolve a identificao dos antgenos somticos e flagelares. A identificao da estrutura somtica baseada no reconhecimento dos sorovares, representados por letras maisculas. Ex. grupo A (O:2), grupo B(O:4); grupo C1(O:6,7), grupo C2 (O:6,8,20), grupo D (O:9), grupo E1 (O:3,10), grupo E2 (O:3,15), grupo E4 (O:1,3,19),etc.

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Alguns fatores identificam o grupo antignico, por ex. O:4, O:9. Outros tm pouco ou nenhum valor discriminatrio e se apresentam normalmente associados por representarem um complexo como O:12 (121, 122, 123), com O:2, O:4 e O:9 por ex. S. Paratyphi A (O:1,2,12), S.Typhimurium (O:1,4,5,12) e S.Enteritidis (O:1,9,12). Determinados antgenos surgem como conseqncia de uma modificao da estrutura, por exemplo: O:1 resulta da insero de uma cadeia de galactose no polissacardeo; O:5 de uma reao de acetilao da abequose, presente nas unidades repetidas do polissacardeo responsvel pela especificidade, como por ex. sorovar S.Typhimurium como O:4,12 e O:1,4,5,12. Na caracterizao dos antgenos flagelares, devemos levar em conta que alguns sorovares de Salmonella dispem de apenas uma fase flagelar, sendo designadas monofsicas: S.Enteritidis (9,12: g,m: -), S.Typhi (9,12 [Vi]:d: -); porm a grande maioria dos sorogrupos apresentam duas fases flagelares ou seja so cepas difsicas, como S.Typhimurium (1,4,5,12: i: 1,2) e S.Hadar (6,8: z10: e,n,x) que expressam a fase 1 (antgenos i ou z10) e fase 2 (antgenos 1,2 ou e,n,x respectivamente), sendo tambm reconhecidas cepas desprovidas de flagelos (imveis). Deve-se ter em considerao a ocorrncia de variaes fenotpicas como a variao capsular (V-W), a qual impede aglutinao somtica e da variao flagelar (OH-O) a qual pode resultar na perda de uma de suas fases, sendo, na maioria das vezes, recuperadas. Entretanto a ocorrncia de variao genotpica ou variao da estrutura somtica (S-R), alm de determinar alteraes quanto morfologia colonial, muitas vezes no perceptvel, resulta na impossibilidade de caracterizao antignica conclusiva dos sorovares de Salmonella spp. No computo geral importante considerar que na perspectiva atual a sorotipagem representa um mtodo de tipagem essencial para o diagnostico de Salmonella. altamente reproduzvel e discriminatria se empregada corretamente, representando uma ferramenta bsica para adoo de medidas efetivas de controle da salmonelose. Acredita-se que, futuramente, esta ser substituda por mtodos de seqenciamento, mltiplas PCR ou ainda metodologias, com base na avaliao do DNA, que venham a surgir.
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A utilizao, na atualidade, de tcnicas moleculares representa um conjunto de ferramentas complementares ao diagnstico laboratorial, que podem ser empregadas em seu rastreamento e relevantes ferramentas para o controle deste microorganismo na cadeia de produo de alimentos. Entretanto, sua utilizao exige que a caracterizao antignica tenha sido empregada de modo correto, a fim de impedir que o elevado investimento de recursos resulte em fracasso no controle de Salmonella spp. nas diferentes etapas da cadeia produtiva.

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