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DANIEL LIMA SANTOS

PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE Beauveria bassiana PARA O CONTROLE BIOLGICO DE MOLEQUE-DA-BANANEIRA (Cosmopolites sordidus).

So Paulo 2012

DANIEL LIMA SANTOS

PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE Beauveria bassiana PARA O CONTROLE BIOLGICO DE MOLEQUE-DA-BANANEIRA (Cosmopolites sordidus).
Trabalho de Concluso de Curso apresentado ao curso de Cincias Biolgicas da Universidade Nove de julho como parte dos requisitos para a obteno do grau de Bacharel em Cincias Biolgicas
Orientador: Pcq Dr. Antonio Batista-Filho Co Orientadora: Prof Dr Alice Gonalves de Lima

So Paulo 2012

Santos, Daniel Lima Patogenicidade de isolados de Beauveria bassiana para o controle biolgico de moleque-da-bananeira (Cosmopolites sordidus). So Paulo, 2012. 36 folhas, A4 Monografia Trabalho de Concluso de Curso; Entomologia, Biotecnologia. Curso de Cincias Biolgicas, Diretoria de Sade, Universidade Nove de Julho. Orientador: Pcq Dr Antnio Batista Filho. Co Orientadora: Prof Dr Alice Gonalves de Lima. Palavras-chave: Banana, Cosmopolites sordidus, Fungo Entomopatognico, Controle Alternativo.

Dedico a minha me, Maria da Penha e minha irm, Elaine que sempre me apoiaram.

AGRADECIMENTOS

Uninove e seu corpo docente. Ao Instituto Biolgico pela possibilidade de enriquecimento cientifico. Ao Laboratrio de Controle Biolgico do Instituto Biolgico de Campinas. Ao meu orientador, Dr. Antonio Batista-Filho pelo pronto aceite quando muito precisei da sua orientao. Prof. Dr Alice Gonalves de Lima, pela mo estendida e acolhimento com toda sua presteza, disposio, profissionalismo e carinho no momento que mais precisei. Pesquisadora cientifica Harumi Hojo, que sempre prestou grande suporte desde antes da escolha deste tema. Mariana Garcia, que com grande solicitude e em meio as suas responsabilidades, me acolheu e passou as tcnicas utilizadas neste trabalho. Meus sinceros agradecimentos Lucas D. Simi, Roselaine Nunes da Silva Bueno, Patrcia Ballone, Ana Paula dos Santos Bartels, Thas Alessandra Pires e Mariana Garcia Martinez da Silva do Laboratrio de Controle Biolgico do Instituto Biolgico de Campinas. Sem me conhecerem vocs me acolheram de braos abertos e me ajudaram de forma muito rpida e eficiente. A receptividade, desprendimento, humildade e prontido de vocs foram incrveis! Guardo como lembranas boas risadas e um clima extremamente agradvel! Vocs foram fundamentais. Obrigado ao amigo Leonardo Azzali pelas dicas e ao amigo Rafael Dantas pela bibliografia que recebi de presente. A ambos que me cederam uma frao de seus tempos para qualquer coisa que eu tivesse a dizer, muito obrigado. Aos bons amigos e companheiros de estgio Alex Guittens, Amanda dOliveira, Anne Alves, Dbora Ishikawa, Dennis Seroy, Flvia Bonsaver, Juliana B. de Souza e Marcelo Kalil pelos maravilhosos momentos compartilhados que aliviaram meu esprito nos momentos mais complicados. Vocs foram maravilhosos!

Aos amigos e companheiros de graduao Ewerton Clerisse, Jos Edson, Rafael Lima, Rogrio Fernandes e Larysse Coelho que rechearam os quatro anos de estudos com boas e fartas risadas, cervejas, piadas e os comentrios mais incrveis, criativos e inesquecveis! Obrigado tambm a Natalia Siqueira e Camila Hegedus que me presentearam por um perodo da graduao com seus sorrisos, gargalhadas e brincadeiras sem me esquecer da Jani, com quem dividi algumas lgrimas. Por ultimo, porm, no menos importantes, agradeo minha querida me, Maria da Penha e minha linda irm, Elaine, obrigado pelo fundamental suporte dado durante toda a graduao alm do essencial apoio nos contratempos surgidos durante o desenvolvimento deste trabalho.

Sinceramente, obrigado.

Quando o homem aprender a respeitar at o menor ser da criao, seja animal ou vegetal, ningum precisar ensin-lo a amar seu semelhante.
Albert Schwweitzer (Nobel da Paz - 1952).

RESUMO

A banana o quarto alimento vegetal mais consumido no mundo. O Brasil o quinto produtor mundial da fruta concentrando boa parte da produo na regio do Vale do Ribeira, SP, que possui a maior poro de Mata Atlntica existente alm de diversas Unidades de Conservao. Os atuais sistemas de produo utilizam nveis elevados de agrotxicos para o controle de pragas e doenas entre elas, Cosmopolites sordidus. A presena da moleque-da-bananeira nos cultivares causa amarelecimento das folhas, diminuio do tamanho dos cachos alm de reduzirem em at 50% a produo de frutos. Estudos apontam que utilizar Beauveria bassiana para controle biolgico contra a moleque-da-bananeira gera bons resultados. Visando desenvolver subsdios ao mtodo de controle alternativo, objetivou-se identificar em condies de laboratrio a eficcia de diferentes isolados de Beauveria bassiana quando aplicado sobre Cosmopolites sordidus. O experimento foi realizado no Instituto Biolgico de Campinas. Constituiu-se de 6 tratamentos: 5 isolados e uma testemunha onde para cada tratamento, foram utilizados 50 besouros em dez repeties contendo 5 indivduos em cada. O mtodo de inoculao utilizado foi o de imerso em suspenso fungica na concentrao 1 x 10 8 condios/mL e a testemunha foi submetida a imerso em soluo Tween 80 a 0,1%. As avaliaes foram realizadas com 7 e 14 dias e os animais mortos foram colocados em cmara mida para confirmao da mortalidade pelo fungo. Os isolados IBCB 182 atingiu 58 % de letalidade confirmada demonstrando maior eficcia no controle da moleque-da-bananeira em relao aos demais isolados. Palavras chave: banana; Cosmopolites sordidus, fungo entomopatognico, controle alternativo.

ABSTRACT

Banana is the fourth most consumed vegetable food in the world. Brazil is the fifth worldwide producer of fruit concentrating a good part of production in region Vale do Ribeira, which has the largest portion of Atlantic beyond several protected areas. The current production systems turn to elevate levels of pesticides to control plagues and diseases among them the mains pest insect Cosmopolites sordidus. The presence of the banana weevil in banana fields causes yellowing of the leaves, reduction of the size of bunches as well as reducing to 50% the production of fruits. Studies show that using entomopathogenic fungi Beauveria bassiana in the biological control of the banana weevil has been a success. Aiming to develop subsidies for the alternative control method, the present study was aimed to identify under laboratory conditions the effectiveness of different isolates of Beauveria bassiana when applied in Cosmopolites sordidus. The experiment took place in the Biological Institute of Campinas and consisted of 6 treatments: 5 isolates and one control. To each treatment, 50 beattles were used in 10 replicates with 5 individuals in each. The inoculation method utilized was the imersion in fungal suspension in concentration of 1 x 10 8 conidia/mL and the control wassubmitted to immersion in Tween 80 solution to 0.1%. the assessments were made after 7 and 14 days and the dead animals were put in wet chamber to confirm mortality by the fungi. The isolate IBCB 182 reached 58% of confirmed lethality, demonstrating a greater efficiency over other isolates. Key words: banana, Cosmopolites sordidus, entomopathogenic fungi, alternative control

SUMRIO

1. INTRODUO ..................................................................................................... 10 2. REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................. 12 2.1 Banana .............................................................................................................. 12 2.1.1 Vale do Ribeira ................................................................................................ 13 2.2 Moleque da bananeira (Cosmopolites sordidus)................................................. 14 2.2.1 Aspectos morfolgicos e biolgicos ................................................................. 14 2.2.2 Danos ............................................................................................................. 15 2.3 Controle Qumico ............................................................................................... 15 2.4 Controle Biolgico .............................................................................................. 16 2.4.1 Vantagens x Desvantagens............................................................................. 17 2.4.2 Fungos entomopatogenicos ............................................................................ 18 2.4.2.1 Beauveria bassiana ...................................................................................... 18 3. OBJETIVO ........................................................................................................... 20 4. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................... 21 4.1 Obteno de esporos de Beauveria bassiana .................................................... 21 4.2 Obteno de indivduos de Cosmopolites sordidus ............................................ 22 4.3 Inoculao de Beauveria bassiana em Cosmopolites sordidus .......................... 23 4.2 Manuteno e observao de Cosmopolites sordidus ....................................... 24 4.3 Anlise estatstica .............................................................................................. 26 5. RESULTADOS ..................................................................................................... 27 6. DISCUSSAO ........................................................................................................ 29 7. CONCLUSO ...................................................................................................... 30 8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 31

1. INTRODUO

setor

agropecurio

brasileiro

possui

grande

relevncia

para

desenvolvimento econmico, sendo apontado no terceiro trimestre de 2011 como o nico setor que apresentou aumento do PIB com uma arrecadao de R$ 46,6 bilhes de reais, e alta de 6,9% em relao ao mesmo perodo do ano de 2010 (MAPA, 2011). Neste contexto, a bananicultura leva o Brasil quinta posio na produo mundial de bananas (FAO, 2010). Seu cultivo est presente em todos os estados brasileiros, ocupando o patamar de segunda fruta mais produzida no pas. Corresponde a 15,1 % da produo nacional de fruticultura com destaque para So Paulo que segundo IBGE (2010) foi responsvel por 24,4% do total de produo de bananas no ano de 2010. A principal regio produtora de bananas de So Paulo est localizada ao sul do estado. O Vale do Ribeira detm importantes ecossistemas e Unidades de Conservao onde manguezais, restingas e Mata Atlntica compem um cenrio de expressiva importncia para a biodiversidade (MORAES, 2007). Os atuais sistemas de produo lanam mo de nveis elevados de agrotxicos para o controle de pragas e doenas. A exponencial freqncia no uso de tais substncias levou o Brasil a manter pelo terceiro ano consecutivo o patamar de maior consumidor mundial destes qumicos (CARNEIRO et al., 2012). Agrotxicos, agroqumicos, produtos fitossanitrios ou pesticidas so termos utilizados para produtos qumicos usados no combate e controle s pragas que acometem as lavouras (MONQUERO et al., 2009). Pragas agrcolas so organismos pertencentes aos mais diversos filos, representados por vrus, fungos, bactrias, nematoides, protozorios, caros, aranhas, peixes, anfbios, rpteis, aves e mamferos sendo responsveis por danos econmicos causados lavoura (SANTOS et al., 2011). O uso indiscriminado de agrotxicos gera grande acumulo de resduos, principalmente em ecossistemas aquticos que recebem fluxos de gua provenientes dos cultivos (MOREIRA et al., 2002). A contaminao de guas superficiais e subterrneas tida como devastadora principalmente quando se observa sua abrangncia, uma vez que o transporte destes qumicos para regies afastadas da origem contaminadora amplificam a alterao na qualidade das guas.
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Como resultado, observa-se um impacto negativo na variedade de espcies e populaes da biota aqutica, modificao dos aspectos abiticos e bioacumulao destes compostos ao longo da cadeia trfica (PERES et al,, 2003; SOARES e PORTO, 2007; RICKLEFS, 2011). Diante do impacto causado pela utilizao de agroqumicos, assim como a forte presso seletiva exercida sobre os animais alvos e no alvos tm-se como resultados mutantes cada vez mais resistentes. Por este motivo so estudados meios alternativos para controlar as pragas agrcolas de forma a minimizar o uso destes produtos (FRANCESCHINI et al., 2001). Controle Biolgico um processo natural que pode ser observado independente da ao antrpica. Consiste na regulao populacional de espcies vegetais e animais por meio de organismos considerados inimigos naturais que agem na taxa de mortalidade destas espcies contribuindo para o equilbrio do meio (PARRA et al., 2002). Dentre os organismos mais utilizados, destaca-se a ao do fungo Beauveria baussiana, amplamente utilizado para controle da praga popularmente conhecida por broca-do-rizoma ou moleque-da-bananeira. Trata-se do besouro Cosmopolites sordidus (Coleoptera, Curculionidae), de hbitos notvagos que em geral vive dentro ou ao redor de bananeiras. Quando adultos, possuem o corpo preto com cerca de 11 mm de comprimento e 5 mm de largura, apresentam alta longevidade em um ciclo de vida varivel de cinco a oito meses, podendo chegar at quatros anos de vida (PRESTES, 2005). A oviposio realizada na regio do rizoma ou prxima s bainhas foliares com um perodo de incubao que dura entre sete e dez dias (BATISTA-FILHO et. al., 2002). Aps a ecloso, observase larvas podas, de colorao branca que constroem galerias no rizoma da bananeira e desta forma, ocasionam grande enfraquecimento da planta, resultando em desenvolvimento retardado, amarelecimento, morte da gema apical, diminuio dos cachos, e por fim, maior sensibilidade ao tombamento alm de facilitar a introduo de patgenos oportunistas (EMBRAPA, 2004). Tendo em vista os impactos degradantes que os agrotxicos exercem no meio ambiente, associado com os danos causados pelo moleque-da-bananeira sobre os cultivares e a seleo artificial que este besouro sofre por ao dos qumicos, faz-se necessrio estudos alternativos e eficazes no combate a este inseto de forma a se desenvolver prticas sustentveis de controle de pragas.
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2. REVISO BIBLIOGRFICA 2.1 Banana

Taxonomicamente, as bananeiras pertencem ao grupo das angiospermas, classe das monocotiledneas, ordem Scitamales, famlia Musaceae. As espcies comestveis e de interesse econmico esto agrupadas no gnero Musa. So vegetais no lenhosos, compostos por sucessivas camadas foliares que

sobrepostas, formam uma estrutura rgida muitas vezes identificada por tronco, mas na verdade trata-se do pseudocaule, j que o verdadeiro caule tambm conhecido por rizoma subterrneo (RAVEN et al., 1996; ZANDONADI, 2009). Suas folhas se desenvolvem a partir da regio apical do pseudocaule para formar uma copa de folhas longas e largas com nervura central facilmente identificada. Do centro da copa evidenciam-se as brcteas de forma ovalada e cor arroxeada. Das axilas das brcteas surgem as flores, que por sua vez, originam as pencas. (EMBRAPA, 2004). De grande relevncia no contexto econmico nacional, o cultivo de bananas detm a marca de segunda fruticultura mais produtiva ficando atrs somente da produo de laranjas (SEBRAE - ESPM, 2008). Com um crescimento de 2,6 % em relao ao ano anterior, a bananicultura obteve no ano de 2010 a marca de quase 7 milhes de cachos de bananas produzidos. Tal condio levou a soma de R$ 3,7 bilhes e a marca de 15,5% do total da produo de frutas no pas (IBGE, 2010). Seu cultivo amplamente difundido pelo pas, sendo encontrado em todos os estados brasileiros com presena primordial de pequenos produtores que formam em sua maioria, uma maneira tradicional de cultivo (SEBRAE - ESPM, 2008). Grande parte da produo direcionada ao abastecimento do mercado interno. Apenas 1,8% do total produzido exportado e a principal dificuldade encontrada para a exportao se d pela mnima quantidade de frutas que atingem o nvel de qualidade exigido (EMBRAPA, 2009; DOMINGUES, 2011). Alguns pases europeus como Reino Unido, Holanda e Itlia so abastecidos, em parte, por bananas produzidas no Brasil e pases do Mercosul como Uruguai e Argentina tambm recebem uma frao da produo nacional, sendo o ultimo, o principal importador da fruta (EMBRAPA, 2004). De grande notoriedade, a banana a fruta mais popular do Brasil e o quarto alimento vegetal mais consumido no mundo sendo a maior parte na forma in natura.
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Moraes (2011) cita que somente 2,8% da produo nacional passa por processo de industrializao. Sua grande aceitao devido ao baixo preo para o consumidor final e a alta flexibilidade de usos culinrios e industriais como na fabricao de banana chips, banana passa, doces, bebidas, entre outros usos (SEBRAE - ESPM, 2008). Estudos sobre benefcios obtidos com o uso da farinha de banana para incremento nutricional (FASOLIN et al., 2007), mostram que alm de ser uma alternativa promissora para pessoas intolerantes ao glten (ZANDONADI, 2009) corroboram o fato da importncia da banana tanto para a sade como para a economia nacional. 2.1.1 Vale do Ribeira Formado por vinte municpios, o Vale do Ribeira fica entre a regio sul do estado de So Paulo e leste do Paran abrangendo um total aproximado de 25.000 Km sendo que dois teros (aproximadamente 17.000 Km) esto localizados em territrios paulistas (HOGAN et. al, 2000). Com IDH (ndice de Desenvolvimento Humano) mais baixo do estado, a regio do Vale do Ribeira tem sua populao formada basicamente por caiaras, indgenas e quilombolas, sendo a rea menos urbanizada do estado com uma populao que vive basicamente em reas rurais onde desenvolvem atividades agrcolas (MORAES, 2007). As atividades econmicas so voltadas principalmente para o ecoturismo, minerao, piscicultura e agricultura, sendo a maior regio produtora de bananas do estado de So Paulo. Duas das principais atividades econmicas so conflitantes, pois o uso de agrotxicos empregados nas lavouras acaba por contaminar parte dos rios de onde provm a renda de muitas famlias da regio, j que a piscicultura uma das atividades mais antigas do Vale do Ribeira (HOGAN et al, 2000, CASTELLANI e BARRELLA, 2005). Com caractersticas bem peculiariares, grande parte do territrio formado por Unidades de Conservao que esto divididas entre reas de proteo ambiental, estaes ecolgicas e parques estaduais (KARMANN e FERRARI, 2002). O Vale do Ribeira possui a maior poro do que resta de Mata Atlntica do pas, sendo este um dos biomas mais ameaados do planeta. Abriga tambm ecossistemas de grande importncia como os formados por manguezais, restingas e rios que somados apresentam grande biodiversidade (HOGAN et al, 2000).
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2.2 Moleque da bananeira (Cosmopolites sordidus) 2.2.1 Aspectos morfolgicos e biolgicos

Acredita-se que a origem de C. sordidus seja na regio Indo-Malsia, porm, atualmente sua presena constatada em diversos pases. Seus hbitos e morfologia conferem a este besouro alguns nomes variveis de acordo com a regio do pas onde encontrado como, por exemplo: broca-da-bananeira, broca-dorizoma, trombudo, dorminhoco, gorgulho e o mais comumente usado: moleque-dabananeira. Identificado inicialmente por Germar em 1824, recebeu o nome de Calandra sordida, e posteriormente, em 1985, Chevrolat alterou sua nomenclatura para Cosmopolites sordidus (PRESTES, 2005). Sua classificao taxonmica se d pela ordem Coleptera, superfamlia Curculionoidea, famlia Curculionidae, gnero Cosmopolites (PRESTES, 2005; SANTOS, 2010) So notvagos, apresentando maior atividade entre as 21h e as 04h e sedentarismo na maior parte do dia. Possuem colorao uniformemente preta, litros longitudinalmente estriados, e as demais partes do corpo so delicadamente pontuadas. A regio do rostro possui um alongamento formando uma espcie de bico (caracterstica peculiar famlia Curculionidae). Quando adultos, vivem em mdia um ano, porm, SUPLICY e SAMPAIO (1982 apud Prestes, 2005) cita tempo de vida de at dois anos, enquanto GOLD e MESSIAEN, (2000) e GOLD (2001) indicam que esta espcie pode chegar a quatro anos de idade quando expostas a condies climticas de temperaturas entre 20 e 30. Atingem de 9 a 13 mm de comprimento por 3 a 5 mm de largura e desenvolvem hbitos de tigmotactismo, gregaridade, higrofilia e tanatose (SILVA, 1985 apud Prestes, 2005). As fmeas ovopositam em mdia 5 ovos por ms em orifcios abertos com a mandbula na regio do rizoma ou na base do pseudocaule onde h a insero das bainhas foliares (BATISTA-FILHO et al., 2002; EMBRAPA, 2004). MESQUITA e ALVES (1983 apud Prestes, 2005) aponta que o perodo de incubao dura de 4 a 14 dias apresentando variao de acordo com a temperatura do ambiente). A fase larval abrange perodos variveis que so influenciados por condies climticas, sendo de 12 a 48 dias podendo chegar a 120 dias onde o inseto imaturo atinge no mximo 12 mm de comprimento. Suas larvas so enrugadas e brancas exceto na regio anterior que possui colorao avermelhada. So apodas e locomovem-se por
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contraes torcicas, utilizando as fortes mandbulas para se alimentar e abrir caminho para as extremidades das galerias onde entram no estgio de pupa. O perodo de metamorfose ocorre em torno de uma semana, a pupa que mede em torno de 12 mm de comprimento e 6 mm de largura se abriga pelo perodo de 7 a 10 dias para concluir seu ciclo evolutivo (RAGA, 2005). 2.2.2 Danos Embora possuam asas funcionais, C. sordidus raramente voa, se dispersando na maioria das vezes de forma passiva, por meio de plantas infestadas com ovos, larvas pupas e/ou adultos (PRESTES, 2005; EMBRAPA, 2004). No Brasil, sua primeira ocorrncia foi registrada no ano de 1885 por Chevrolat e atualmente pode ser identificado nos cultivares de banana em todos os estados do pas (BATISTA-FILHO et al., 2002). Nos anos 80, este besouro foi considerado a mais devastadora praga de bananas e ainda hoje consideravelmente nociva para os cultivares nacionais (PRESTES, 2005) Ao abrir galerias nos rizomas e nas bases dos pseudocaules, C. sordidus destri parte do sistema radicular da planta, limita a absoro de nutrientes, retarda a florao, ocasiona amarelecimento de folhas, morte da gema apical, diminuio do tamanho dos cachos e do vigor da bananeira que se torna incapaz de manter-se ereta com peso dos cachos , agravada pela ao dos ventos (GOLD e MESSIAEN, 2000; GOLD, 2001; BATISTA-FILHO et al. 2002; EMBRAPA, 2004; PRESTES, 2005; RAGA, 2005). Associadas s aes diretas, as perfuraes causadas pelo moleque-da-bananeira desencadeiam aes indiretas que facilitam a introduo de microorganismos fitopatognicos como o Fusarium oxysporum cubense, responsvel pela doena conhecida como Mal do Panam, e outros agentes causadores de podrido que somados, chegam a causar at 50% de perda na produo de bananas (BATISTA-FILHO, et. al., 2002; PRESTES, 2005; RAGA, 2005, ALMEIDA e MACHADO, 2006).

2.3 Controle qumico Prestes (2005) sintetiza a evoluo do uso de agrotxicos para controle das populaes de C. sordidus iniciando pelos qumicos clorados que na dcada de 50
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foram o principal meio de combate a esta espcie. Na dcada de 70, houve uma mudana no cenrio quando foram identificadas populaes de moleque da bananeira resistentes a tais qumicos que alm de no fornecerem mais os resultados esperados, ainda persistiam nos frutos in natura. O uso de carbamatos foi introduzido posteriormente, porm, RAGA e OLIVEIRA (1996, apud Santos 2010) cita que o uso exclusivo deste qumico se tornou ineficaz devido seleo sofrida pelos tratamentos anteriores. Atualmente indica-se o uso alternado de agrotxicos dos grupos qumicos organofoforados e fenilpirazol como alternativa aos

carbamatos, porm, o largo espectro de ao destes agrotxicos pode resultar em surgimento de pragas secundrias, mortalidade de espcies no alvo e contaminaes severas de ecossistemas principalmente pela bioacumulao nos tecidos vegetais e animais gerando efeitos altamente crnicos e nocivos mesmo aps dcadas de contato com tais substncias (SANTOS, 2010; CARNEIRO et al., 2012). O Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento informa que atualmente so utilizados agroqumicos com os princpios ativos carbofuran (carbamato), fostiazato e terbufs (organofosforados) para o combate a C. sordidus (MAPA, 2012). A aplicao pode ser por imerso de mudas de banana em calda preparada com carbofuran durante cinco minutos antes do plantio ou aplicao de 20 g/cova de fostiazato ou terbufs repetindo esta ao aps 180 dias (EMBRAPA, 2004; PRESTES, 2005; RAGA, 2005; SANTOS, 2010).

2.4 Controle biolgico Segundo Alves (1998), o desenvolvimento da entomopatologia no Brasil, se iniciou no ano de 1923 quando Pestana identificou o fungo Penicillium anisopliae, hoje Metarhizium anisopliae como agente de controle de Tomaspis spp, uma praga da cana de acar. Desde ento, diversos estudos sobre o uso de agentes biolgicos so desenvolvidos como forma alternativa de controle s pragas agrcolas. Deve ser ressaltada a importncia do uso de agentes de controle biolgico como forma complementar e no substituta ao uso de agrotxicos. Os agentes de controle biolgico devem ser utilizados como ferramentas estratgicas que visem um
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entendimento geral de todos os fenmenos envolvidos na agricultura (ALVES et al, 2010) 2.4.1 Vantagens x Desvantagens Ao se trabalhar com controle biolgico, alguns aspectos devem ser considerados para o sucesso dos objetivos traados. Por se tratar da utilizao de organismos vivos que dependem de condies favorveis para seu desenvolvimento e estabelecimento, imprescindvel a escolha correta dos patgenos. Luminosidade, umidade, temperatura, modos corretos de armazenamento e aplicao so fundamentais para o sucesso de atuao dos agentes, j que a manipulao inadequada pode levar a perda do potencial de ao. A utilizao de inseticidas microbianos requer planejamentos, de forma que o patgeno possa se estabelecer antes da praga, evitando danos econmicos (ALVES, 1998). Aps a aplicao, os organismos microbianos podem se multiplicar e dispersar por meios naturais no ambiente seja pelos insetos contaminados, solo, cadveres ou por permanecer na rea aplicada, afetando assim o ciclo reprodutivo e consequentemente as geraes seguintes. Quando bem estabelecido, o patgeno permanece em ao tempo o suficiente para que a doena continue seu desenvolvimento de forma enzotica, tornando os indivduos mais suscetveis a ao de outros agentes biolgicos e qumicos, pois a pratica de controle biolgico permite associaes a outros compostos compatveis (ALVES, 1998; ALVES. et al, 2010). Ao contrrio do controle qumico, o controle biolgico no cria condies favorveis para o surgimento de pragas secundarias e tercirias, minimizando a necessidade de maiores aes de combate a tais organismos. Alm de no poluir o meio ambiente, o controle biolgico torna-se uma ferramenta cada vez mais necessria para o desenvolvimento da agricultura sustentvel quando avaliada a baixa taxa de resistncia das espcies expostas aos patgenos (ALVES, 1998; BATISTA-FILHO, 2006). Estudos indicam que a utilizao de agentes microbianos para controle biolgico tornam-se uma alternativa sustentvel, principalmente quando regies produtoras como o Vale do Ribeira so focos de estudo. Como citado no item 2.2.1, trata-se de uma regio extremamente importante para a biodiversidade, detentora de
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grande parte mata atlntica remanescente onde estudos de controle alternativo so necessrios (HOGAN et al, 2000). A possibilidade de mesclar controle biolgico com menores quantidades de agrotxicos legitima o controle biolgico como tcnica vivel onde a resistncia do inseto aos qumicos diminui, alm de atenuar os impactos negativos de tais compostos no meio ambiente (ALVES, 1998). 2.4.2 Fungos entomopatogenicos O inicio do uso de fungos entomopatogenicos para controle de pragas no Brasil datado da dcada de 1960 quando o fungo Metarhizium anisopliae foi empregado em lavouras de cana-de-acar para controle da cigarrinha-da-folha. Desde ento, houve disseminao desta tcnica e surgimento de fabricantes de micoinseticidas pelo pas (ALVES et al, 2010) Atualmente, dentre as pesquisas de controle biolgico, os fungos destacamse devido ao seu largo espectro, pois so causadores de 80% das patologias identificadas em insetos (ALVES, 1998; ALVES et al, 2010). Os modos de ao dos diferentes fungos aplicados so muito semelhantes sendo que o principal contgio atravs da germinativa, que so os condios e blastoporos. Quando o inseto ingere ou entra em contato com tais clulas, ocorre a dilatao destas em estruturas de absoro de nutrientes e de fixao denominadas hifas e apressrios. Tais estruturas produzem enzimas que degradam a cutcula que reveste o animal, possibilitando a penetrao mecnica. Uma vez instaladas, as hifas se desenvolvem a partir das regies gordurosas, se expandindo para o tubo digestivo e interrompendo a alimentao. Em seguida avana pelo sistema nervoso tornando-o rgido e se expandindo para fora do animal quando atinge a traquia. em seguida incia-se a produo de novos esporos os quais sero liberados no ambiente e buscaram novos alvos para inciar o ciclo (ALMEIDA e MACHADO, 2006). 2.4.2.1 Beauveria bassiana O fungo Beauveria bassiana est classificado no Filo Ascomycota Classe Sordariomycetes, Ordem Hypocreales, Famlia Clavicipitaceae (NATURDATA, 2012). uma espcie de frequncia endmica em muitos pases, podendo ser encontrada em amostras de solo e insetos. Em ambiente natural, sua virulncia caracterizada de forma enzotica e epizotica em individuos das ordens
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Lepidoptera, Himoptera e Coleoptera e de forma enzotica nos pertencentes s ordens Diptera, Himenoptera e Orthoptera, possuindo capacidade de permanecer em estado latente por longos perodos (ALVES, 1998). Em laboratrio, chega a colonizar a maior parte dos insetos com infeco ocorrente entre 12 e 18 horas. Em 72 horas de inoculao, as estruturas do animal apresentam colnias completamente desenvolvidas, levando o animal morte devido falta de nutrientes e do acumulo de micotoxinas. Sobre o animal morto, a esporulao se torna bastante evidente e internamente, cristais de variados tipos de toxinas se acumulam (ALVES, 1998; ALMEIDA e MACHADO, 2006). As condies timas para o comportamento satisfatrio de B. bassiana so de umidade por volta de 90 % e temperatura entre 23 e 28C. A faixa de tolerncia para o desenvolvimento da doena est entre 5 e 35C sendo as mais altas, mais prejudiciais para o desenvolvimento do patgeno, pois segundo Alves (1998), o fungo apresenta capacidade de causar infeco em temperaturas entre 0 e 5C. Para controle de C. sordidus, B. bassiana amplamente recomendada devido a sua significativa ao em campo. A aplicao pode ser feita na forma de emulso de arroz cozido (meio slido para cultura do fungo) associada a leo mineral emulsionvel (que tem funo de potencializar a ao do bioinseticida) A pasta formada deve ser aplicada sobre iscas de pseudocaule de bananeira que j produziram, sendo utilizadas as do tipo telha (corte horizontal) ou tipo queijo (corte vertical), depositando prximo a base da bananeira, voltando a parte tratada para o solo. Estas iscas tem como funo atrair insetos que ao passar por elas, se contaminam com o fungo (ALVES et al, 2010).

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3. OBJETIVO Avaliar a patogenicidade de diferentes isolados do fungo entomopatognico Beauveria bassiana, quando aplicado sobre o besouro moleque-da-bananeira (Cosmopolites sordidus).

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4. MATERIAL E MTODOS O presente trabalho foi iniciado no Laboratrio de Controle Biolgico do Centro Experimental Central do Instituto Biolgico, localizado em Campinas e sua continuidade foi dada no Laboratrio de Entomologia Geral do Instituto Biolgico em So Paulo no perodo de 10 de setembro a 10 de outubro de 2012.

4.1 Obteno de esporos de Beauveria bassiana Foram utilizados os isolados Beauveria bassiana obtidos da Coleo de Fungos Entomopatognicos Oldemar Cardim Abreu do Laboratrio de Controle Biolgico do Centro Experimental Central do Instituto Biolgico, localizado em Campinas, SP, credenciada como fiel depositria junto ao IBAMA (tabela 1). A repicagem destes fungos foi feita em trs pontos, em meio de cultura BDA (Batata, Destrose, gar) em placas de Petri (9 cm de dimetro), utilizando fluxo laminar para garantir a esterilidade do ambiente. As placas foram incubadas por catorze dias em cmara de germinao do tipo B.O.D. (25 1C e fotofase de 12 horas) e posteriormente raspadas com o auxlio de uma esptula, conforme mostrado na figura 01. O material obtido das placas foi adicionado em um tubo de ensaio contendo 10 mL de gua destilada mais espalhante adesivo (Tween 80) a 0,01%. As suspenses foram diludas e quantificadas em cmara de Neubauer, com o auxlio do microscpio ptico e aumento de 400x e posteriormente padronizados na concentrao de 1 x 10 8 condios/mL.
Tabela 1 - Isolados do fungo Beauveria bassiana provenientes da Coleo de Fungos Entomopatognicos Oldemar Cardim Abreu utilizados em experimento de seleo de isolados para o controle de Cosmopolites soridus, 2012. Isolado IBCB 31 IBCB 182 IBCB 240 IBCB 247 IBCB 264 Hospedeiro/ Substrato Nezaria viridula Solo Hypothenemus hampei Hypothenemus hampei Solo Localizao Piracicaba SP Cascavel PR Campinas SP Taubat SP Ribeiro Preto SP

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Figura 01 Raspagem de condios de Beauveria bassiana da placa de Petri para posterior preparo de suspenses em gua mais espalhante adesivo (Tween80) a 0,1%.

4.2 Obteno de indivduos de Cosmopolites sordidus Os indivduos utilizados neste experimento foram obtidos no municpio de Registro, Vale do Ribeira por meio de iscas do tipo telha em bananais comerciais. As iscas (figura 02 A) foram depositadas nas bases dos pseudocaules com a regio cortada voltada para baixo (figura 02 B).

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Figura 02 A Pseudocaules utilizados como isca do tipo telha para captura de Cosmopolites sordidus. Figura 02 B Iscas depositadas na base dos pseudocaules, com a regio cortada voltada para baixo.

4.3 Inoculao de Beauveria bassiana em Cosmopolites sordidus O mtodo de inoculao utilizado neste experimento foi o de imerso. Os besouros foram imersos em 30 ml da soluo citada no item 3.1 durante 60 segundos (figura 03). Aps o tempo estipulado, os animais foram imediatamente retirados e separados em placas de Petri descartveis em grupos de cinco indivduos por placa. Para cada isolado foram realizadas dez repeties nomeadas de A a J somando 50 indivduos por tratamento e totalizando 300 besouros no experimento. As placas foram identificadas com o nome do isolado, data de inoculao e a repetio na qual os indivduos pertenciam. As testemunhas utilizadas foram submetidas ao mesmo processo de imerso em soluo Tween 80 a 0,1% no mesmo volume utilizado para o tratamento. As placas foram vedadas com plstico filme para evitar a fuga dos insetos. Houve privao de alimento pelo perodo de 24 horas para que houvesse maior fixao do fungo no corpo do animal sem a interferncia da seiva do pseudocaule que poderia alterar quantidade de condios presentes nos tegumentos dos besouros, pois os mesmos poderiam praticar processos de assepsia.

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Figura 03 Inoculao de C. sordidus imersos em 30 ml da suspenso de condios de Beauveria bassiana (imagem cedida por Mariana Garcia).

4.2 Manuteno e observao de Cosmopolites sordidus Todo o experimento foi conduzido em temperatura ambiente com fotoperodo de 12 horas. No perodo, foi registrado temperaturas de 29,1 em mdia. Aps a inoculao, as placas foram dispostas de modo aleatrio, utilizando um desenho experimental inteiramente casualizado (figura 04). Com 24 horas de inoculao, foi fornecido como alimento uma frao de pseudocaule de bananeira medindo cerca de 5 cm x 5 cm por placa de Petri. O apuramento da taxa de mortalidade foi realizado em duas etapas: aps sete e catorze dias da inoculao, os besouros mortos foram individualmente acomodados em cmara mida (composta de uma placa de Petri devidamente higienizada com lcool 70% e um pedao de algodo hidrfilo umedecido em gua (figura 05 A).

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Tais cmaras midas proporcionaram condies para a esporulao do fungo (figura 05 B) e assim a mortalidade foi confirmada aps sete dias de morte do animal, onde era possvel visualizar a contaminao do inseto (Figura 06).

Figura 04 Placas dispostas inteiramente casualizadas aps 24 horas da inoculao de Beauveria bassiana em Cosmopolites sordidus, com uma frao de aproximadamente 5 x 5 cm de pseudocaule para alimentao dos besouros.

Figura 05 A: Preparao de cmara mida com individuo de Cosmopolites sordidus morto para confirmao da morte pelo fungo Beauveria bassiana. Figura 05 B: Confirmao da morte causada pelo fungo por meio da esporulao.

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Figura 06 Comparao entre dois indivduos de Cosmopolites sordidus mortos. esquerda o animal antes de ser submetido cmara mida (no possvel ainda confirmar a morte pelo fungo entomopatognico Beauveria bassiana). direita, o besouro j demonstra grande parte de seu corpo coberto pelo fungo, confirmando a morte pelo agente biolgico.

4.3 Anlise estatstica O teste foi submetido anlise de varincia atravs do teste Tukey utilizando o programa STAT 2.0. Foram utilizados um nmero igual de repeties, como coeficiente de variao ideal foi estabelecido o valor igual ou menor que 30, quando no foi possvel os dados foram transformados em .

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5. RESULTADOS A mortalidade alcanada com os isolados variou entre 14 e 58% (Tabela 02). A esporulao pode ser bem observada na grande maioria dos besouros mortos onde alguns indivduos apresentaram esporulao antes mesmo da acomodao em cmara mida. Dois besouros inoculados pelos isolados IBCB 264 e IBCB 31 apresentaram esporulao pouco evidente, sendo sucintamente visvel na juno dos tegumentos.
Tabela 2. Resultados de mortalidade obtidos com inoculao de 1 x 10
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condios/mL de Beauveria

bassiana quando aplicado por imerso sobre Cosmopolites sordidus em condies de laboratrio. Temperatura mdia de 28,1 e fotoperodo de 12 horas 2012. Isolado IBCB 31 IBCB182 IBCB 240 IBCB 247 IBCB 264 TESTEMUNHA P. M. C. I. 18 % 58% 34% 38% 14% 0% M. T. 5,10 bc 8,13 a 5,94 bc 6,77 ab 4,64 cd 3,16 d

P.M.I.= percentual de morte confirmada por isolado. M.T.= mdia transformada em Tukey. C.V.= 25,43 Desvio padro= 1,43 Erro padro da mdia= 0,45 . Letras iguais na coluna no diferem entre si pelo teste de

O isolado IBCB182 de destacou, diferindo estatisticamente dos demais isolados, exceto quando comparado ao IBCB 247, porm, os resultados absolutos (considerando apenas o valor percentual e no os dados estatsticos) de 58% contra 38% respectivamente indicam diferena de letalidade entre os dois isolados.

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Os isolados IBCB 31, IBCB 240 e IBCB 247 no diferiram estatisticamente entre si e apresentaram respectivamente taxas de mortalidade confirmada de 18 %, 34 % e 38 %. Os isolados IBCB 31, IBCB 240 e IBCB 264 atingiram os menores nveis de mortalidade e no diferiram estatisticamente entre si atingindo apresentando respectivamente 18 %, 34 % e 14 % de mortalidade confirmada. O isolado IBCB 264 ao atingir 14 % de mortalidade confirmada no diferiu estatisticamente da testemunha, que no houve morte confirmada por B. bassiana.

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6. DISCUSSAO Nas condies deste experimento onde a taxa de mortalidade variou de 14 a 58% utilizando condios na proporo de 1 x 108/mL, os dados obtidos indicam resultados parecidos com os de Almeida et al, (2006; 2009) que utilizou condios na proporo de 1,12 x109 /ml e de Prestes (2006) utilizando 2 x 208/mL de outros isolados, onde a variao de letalidade oscilou entre 16 e 66% e 15 e 25% respectivamente.Os isolados IBCB 240 e IBCB 247 alcanaram respectivamente 34 e 38% de letalidade e nas condies deste experimento atingiram nveis prximos quando comparado aos de Batista-Filho (2002), que obteve sucesso de 37,5% em condies de laboratrio nos anos de 1990 e 1991 do isolado IBCB 66, ao qual no foi objeto de estudo neste trabalho. Os isolados IBCB 31 e IBCB 264 atingiram nveis baixos de mortalidade, sendo de 18 e 14% respectivamente, ficando mais prximos dos dados fornecidos por Prestes (2006). Costa (2010) ao usar a proporo de 2 x 108/ml de isolados distintas aos usados neste experimento, obteve resultados bastante expressivos, chegando a atingir nveis de mortalidade entre 90 e 100%. O isolado IBCB 182, ao alcanar 58% de sucesso, destacou-se dentre os isolados testados. A diferena de resultados obtidos entre o isolado IBCB 182 e os demais, indicam que a variabilidade gentica de B. bassiana pode ser um fator determinante para o sucesso do controle biolgico devido a diferenas de virulncia entre isolados distintos (ALVES, 1998; FANCELLI et al.; 2004). Para resultados mais abrangentes, Batista-Filho (2002) indica que entre dezembro de 1990 e junho de 1991, o resultado de adicionar leo mineral B. bassiana na forma de pasta, aumentou a taxa de mortalidade, passando de 37,5% para entre 77,5 e 100% quando aplicado em condies de laboratrio.

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7. CONCLUSO A diferena de 44% na taxa de letalidade entre os isolados IBCB 264 E IBCB 182 indicam que determinadas cepas de B. bassiana podem no ser eficazes para o controle de C. sordidus. Os isolados IBCB 182 IBCB 247 e IBCB 240 destacam-se por apresentarem maior poder de virulncia sobre C. sordidus, quando comparado com as demais cepas, atingindo respectivamente 58 %, 38 % e 34% de letalidade. Os resultados obtidos demonstram potencialidade na utilizao destes isolados para controle de C. sordidus. Para utilizao comercial, os isolados destacados neste estudo devem ser avaliados em campo para que seus potenciais sejam aferidos sob condies naturais. evidente a necessidade de estudos peridicos que visem avaliar a virulncia de diferentes isolados, assim como possveis surgimentos de resistncia de C. sordidus ao patgeno ou processos de coevoluo entre os mesmos. .

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