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Laboratrio de Engenharia Bioqumica

T1 PRODUO DE PENICILINA ACILASE NUMA ESTIRPE DE Escherichia coli POR


CULTURA CELULAR DESCONTNUA EM BIORREACTOR COM MONITORIZAO E CONTROLO

Objectivo: Este trabalho tem por objectivo seguir a produo de penicilina G acilase, por fermentao em modo descontnuo de uma estirpe de Escherichia coli. Introduo: O enzima penicilina acilase de uma estirpe de Penicillium chrysogenum foi descrita e caracterizada em 1950, mas a sua actividade detecta-se em muitos outros microrganismos e nem sempre est relacionada com a resistncia dos mesmos penicilina [1]. As penicilinas acilases classificam-se usualmente pelo substrato que acilam preferencialmente. Para a produo de cido 6-amino penicilnico (6-APA), o enzima preferencial ser uma penicilina G acilase (PGA). O interesse industrial do 6-APA, que resulta da penicilina G por desacilao (Fig. 1), deve-se sua particular estrutura molecular, o ncleo central de muitos dos actuais antibiticos de natureza semi-sinttica. Para a produo destes antibiticos, fundamental a produo de PGA pelas indstrias biolgicas. Para a maioria dos microrganismos naturalmente produtores, a PGA um enzima intracelular, localizado no espao periplsmico. A molcula deste enzima, nos vrios microrganismos produtores, constituda por duas cadeias, e , respectivamente com pesos moleculares que se situam nas gamas de 20,5 a 24,5 kDa e de 60,0 a 66,0 kDa. Estas subunidades esto ligadas entre si por interaces hidrfobas e a actividade enzimtica no foi associada a qualquer das subunidades, mas sim a uma conformao especfica entre elas. A actividade da PGA definida da seguinte forma: 1 IU = 1mol de 6-APA/min, nas condies do teste utilizado.

Figura 1 Hidrlise da penicilina G pela penicilina acilase, que resulta na produo de cido 6-amino penicilnico e cido fenil actico.

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A estirpe ATCC 9637 de Escherichia coli superprodutora de PGA intracelular e est patenteada pela Bayer A.G. O trabalho experimental proposto exemplifica a produo industrial deste enzima que usualmente ocorre em fermentadores a operar em descontnuo. O crescimento em descontnuo de uma populao homognea de microrganismos, num meio de cultura lquido bem agitado, mantida a pH e temperatura constantes, apresenta 6 fases (Fig. 2):

Figura 2 Curva de crescimento de uma populao microbiana por fermentao descontnua. Fases de crescimento: 1- latncia, 2- acelerao, 3- exponencial ou logartmica, 4- desacelerao, 5- estacionria e 6- lise ou declnio.

Fase de latncia- representa o perodo de adaptao ao crescimento e s novas condies ambientais, e envolve a sntese de enzimas necessrios para o crescimento nessas condies. Fase exponencial- nesta fase o crescimento pode ser descrito pela duplicao do nmero de clulas por unidade de tempo (somente para leveduras e bactrias). Apesar das clulas provocarem a alterao da composio do meio de cultura e excretarem produtos metablicos, a velocidade de crescimento mantm-se constante durante esta fase. O crescimento pode ser descrito por: dX/dt = X - kd X ln X = ln Xo + t (>> kd)

em que X a massa celular, t o tempo de fermentao, a velocidade especfica de crescimento e kd a velocidade especfica de morte. Por integrao da equao anterior e como nesta fase >> kd , o aumento da massa celular com o tempo vem:

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ln (X/Xo) = t ou onde Xo a massa inicial de clulas (ao tempo t=0). O tempo de duplicao dado por: td = (ln 2)/

ln X = ln Xo + t

Fase estacionria- nesta fase a taxa especfica de crescimento igual taxa especfica de morte (= kd). A falta de um ou mais nutrientes ou a acumulao de produtos txicos ou alteraes das condies ambientais, provocam a desacelerao e paragem do crescimento. Fase de lise celular- durante a fase estacionria a taxa especfica de morte torna-se maior que a taxa especfica de crescimento, o que provoca uma diminuio da densidade populacional (kd > ; dx/dt < 0). Fases de acelerao e desacelerao- estas fases so de transio das fases de latncia para exponencial e da exponencial para a estacionria, respectivamente.

Parte Experimental: Microrganismo e Meio de Cultura Durante a sesso experimental ser fornecido um inculo de E. coli ATCC 9637, em fase exponencial de crescimento, que foi multiplicado em incubador orbital, a 26C e num meio igual ao que ser utilizado na cultura em fermentador, cuja composio a seguinte: Peptona - 10 g/L g/L g/L g/L

Extracto de levedura (Difco) - 5 NaCl - 5 cido fenil actico - 3

O cido fenil actico (AFA), para as clulas de E. coli, actua como indutor da produo de PGA. Antes de esterilizar o fermentador, deve ajustar-se o valor do pH do meio de cultura a pH 7,3-7,5.

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Crescimento Celular e Produo de PGA Neste trabalho sero utilizados fermentadores de 2 litros (Minifors, da INFORS, ou Fermac 320, da ELECTROLAB) com um volume til de 1,65 litros. Na Figura 3 apresenta-se um esquema do fermentador, que constitudo por unidades para medio e controlo da agitao, da temperatura, do pH, do oxignio dissolvido e do nvel de espuma e pelo sistema de arejamento. Durante a preparao do biorreactor h que proceder calibrao das sondas (elctrodos) de oxignio dissolvido e de pH, como descrito no manual do utilizador, e ajustar o controlador destas variveis para as condies de operao ("set-points"), conforme descrito na Tabela 1. Esta calibrao faz-se em dois momentos sequenciais, antes da esterilizao e antes da inoculao.

Figura 2 Representao esquemtica de um fermentador em descontnuo (A: filtros de ar, P: bombas).

Tabela 1 Condies operacionais da fermentao Condies de operao Vel. agitao (rpm) a estipular na aula Min. / Max. (rpm) 200 / 1000 Temperatura (C) 26 pH 6,50 - 8,30 O2 dissolvido set-point (%) 3 (ferm.A) e 18 (ferm.B) modo de controlo em cascata com a agitao Caudal de arejamento a estipular na aula Min. / Mx.(L/min) 0,20 / 1,1 Min. / Mx.(vvm) 0,12 / 0,65 4

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A regulao da velocidade de transferncia de oxignio para a fase lquida, que condiciona fortemente a produo da PGA, ser feita por controlo da velocidade de agitao imposta s turbinas e pelo caudal de alimentao da fase gasosa (ar comprimido) ao biorreactor, com base em conhecimento emprico. Para este cultivo e produo microbiana, no desejvel manter um valor fixo do pH no meio. Contudo, deve garantir-se que, por motivo do metabolismo celular, o valor de pH do meio no sair fora da gama valores necessrios viabilidade celular. Esta garantia consegue-se pela adio controlada de solues esterilizadas de NaOH (2N) e/ou HCl (2N). Com esta estirpe e este meio de cultura, um controlo ligeiro de pH d origem a maiores produtividades em PGA, do que um controlo fino e contnuo de pH [1]. Aps adio do meio de cultura no fermentador (1,5 L), as tubagens para entrada e sada de fluidos que estejam abaixo do nvel do lquido so fechadas e as tubagens acima do nvel do lquido so ligadas a filtros de ar e deixadas abertas. Todas as entradas e sadas do fermentador so envoltas em algodo e papel de alumnio. O fermentador e um balo Erlenmeyer com 150 mL de meio de cultura, para preparar o inculo, so esterilizados em autoclave durante 20 minutos (1 bar; 121C). O inculo para o fermentador (pr-inoculado a partir de colnias retiradas duma placa de Petri recente) incubado no mesmo meio de fermentao, a 26C e 200 rpm, durante ~12 h. O estudo do crescimento de E. coli ATCC 9637 e da produo de PGA, em fermentador, inicia-se ao inocular o meio com as clulas em fase exponencial de crescimento, continuando durante 11 horas (vide Tabela 2).

Mtodos Analticos Retiram-se amostras de uma forma assptica, ao longo de cerca de 11h de fermentao e de acordo com os tempos indicados na Tabela 2, para determinao da biomassa em suspenso. A biomassa determinada por medio da densidade ptica de cada amostra a 600 nm (DO600nm), contra um branco de gua destilada. Sempre que necessrio, as amostras so diludas em tampo fosfato (33 mM, pH 7,0), com o mnimo factor de diluio (FD) que for suficiente. Todas as medies devem ser feitas em duplicado. A densidade ptica obtida convertida em biomassa (peso seco) atravs da correlao abaixo indicada: X (g peso seco/L) = 0,304 DO600nm FD (0,0 DO600nm 0,60)

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Aps esta determinao, as clulas da amostra so lavadas e guardadas no frio, at quantificao da actividade de PGA. Para tal, distribua 4 mL, de cada amostra do fermentador, por dois tubos de Eppendorf e centrifugue a 10.000 rpm (8.900g) durante 8 minutos. Descarte os sobrenadantes e ressuspenda as clulas sedimentadas em tampo fosfato (33 mM, pH 7,0) at perfazer o volume inicial. Volte a centrifugar, descarte o sobrenadante e guarde o pellet. Guarde no frio. A actividade do enzima a ser produzido (PGA) determinada por medio da concentrao do 6-APA formado pelo mtodo do p-dimetilaminobenzaldedo (PDAB; reage com rapidamente com o 6-APA em soluo, originando um composto amarelo). O procedimento para a reaco enzimtica e para a medio analtica esto descritos abaixo:
1. Aquea, a 36C, a suspenso de clulas de E. coli retiradas do fermentador e lavadas

(amostragens).
2. Se prev que a suspenso celular tem actividade de PGA muito elevada, dilua-a com o

mesmo tampo que usou na lavagem celular, aquecido a 36C, usando o mnimo factor de diluio (fd) que for suficiente.
3. Reserve sries de tubos de centrfuga (de 10mL), mnimo 4 por amostragem do

fermentador, e adicione 2,0 mL de reagente de PDAB a cada tubo.


4. No primeiro tubo de cada srie (uma por cada amostra de clulas), que respeita ao tempo

zero de reaco enzimtica, adicione tambm 250 L da soluo de penicilina G potssica (o substrato reaccional) e 750 L de tampo fosfato 200mM, pH 8,0. Tape o tubo com parafilm e agite em vrtice (15s).
5. Coloque num reactor, agitado e termostatizado a 36C, 4 mL de suspenso celular

(referente amostra i), adicione igual volume de uma soluo, tambm a 36C, de penicilina G potssica a 4% (p/v) em tampo fosfato 200mM, pH 8,0. Nesse momento, inicie a contagem do tempo de hidrlise enzimtica.
6. Durante um determinado tempo de incubao (15 a 30 min), retire do reactor 4 ou mais

amostras de 500 L. Coloque cada amostra num tubo contendo o reagente de PDAB. Adicione, de seguida, outros 500 L de tampo fosfato 200mM, pH 8,0. Tape o tubo com parafilm e agite em vrtice (15s).
7. Centrifugue os tubos contendo o reagente de PDAB misturado com as amostras da

reaco de hidrlise da penicilina G (4 min a 6000 rpm). Depois, recolha os sobrenadantes (1 mL) e mea a sua absorvncia a 415nm, contra o sobrenadante do tempo zero de reaco.

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8. Repita os passos 5 a 7 para as vrias amostras de E. coli retiradas do fermentador,

escolhendo os novos tempos de amostragem (indicados em 6) de acordo com a actividade espectvel de PGA.
9. Converta os valores de Abs (415nm) em concentraes de 6-APA produzido, tendo em

conta a calibrao do mtodo do PDAB que se encontra em anexo. A calibrao foi efectuada com padres de 6-APA, preparados e diludos com o mesmo tampo e misturados com o reagente de PDAB nas mesmas propores acima indicadas.

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Resultados:

Tabela 2- Medies efectuadas no laboratrio Tempo


real

Tempo a)
de cultivo

Teste de actividade de PGA das clulas Caractersticas do meio e da operao


T (C) pH O2 (%) arejamento (vvm) agitao rpm

Biomassa
DO600nm FD 0,0

(lavadas e na concentrao da amostra)

Abs (415nm)
(Dia/H:M) t (h) Tempo de hidrlise por PGA, t (min) b)

0,0

a) b)

Escolher os tempos de amostragem de acordo com o objectivos da determinao (quantificar ou Pmax.). Escolher os tempos de amostragem, num intervalo de tempos de reaco de hidrlise de 10 a 30 min.

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Clculos: Tabela 3 Evoluo da biomassa e da produo de PGA em fermentador


Tempo de cultivo Concentrao de Biomassa
-1
-1

Actividade Actividade volumtrica de PGA


-1 -1

especfica de PGA
-1

t (h)

g peso seco L

g (6-APA).L .min

M (6-APA).min

IU.L

IU.g peso seco

-1

Taxa especfica de crescimento: = h


-1

Tempo de duplicao:

Produtividade mxima:

td =

Pmax. =

IU.L .h

-1

-1

Bibliografia: [1] Fonseca, L.J.P., Produo e Purificao da Penicilina Acilase de Escherichia coli, Tese de Doutoramento em Biotecnologia, Instituto Superior Tcnico, Outubro de 1995.

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ANEXO
Abs(415nm) PG (mg/mL) (mol/mL) Heios 0,00 0,00 0,000 0,000 0,25 1,16 0,255 0,261 0,50 2,31 0,521 0,530 0,75 3,47 0,776 0,787 1,00 4,62 1,052 1,063 1,25 5,78 1,309 1,311 1,50 6,94 1,575 1,567 1,75 8,09 1,830 1,791 2,00 9,25 2,036 1,994 [6-APA]

Padro Br 1 2 3 4 5 6 7 8

M todo do PDAB - calibrao do reagente


2,25 2,00 Abs (415nm) 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 [6-APA] (mg/mL)
espectrofotmetro Helios Linear (espectrofotmetro Helios) espectrofotmetro PG PG

y = 1,034x + 0,005 R 2 = 0,999 y = 1,011x + 0,023 R 2 = 0,999

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