Manual Diagnostico HIV 2013

PARA O DIAGNSTICO
MANUAL TCNICO
DA INFECO PELO HIV
Ministrio da Sade Secretaria de Vigilncia em Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
MANUAL TCNICO PARA O DIAGNSTICO DA INFECO PELO HIV
Braslia, dezembro de 2013
2013 Ministrio da Sade. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer m comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra da rea tcnica do Departamento de Aids, DST e Hepatites Virais.
Informaes: MINISTRIO DA SADE Secretaria de Vigilncia em Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais SAF Sul Trecho 2, Bloco F, Torre 1, Edifcio Premium CEP: 70070-600, Braslia DF E-mail: aids@aids.gov.br Home Page: www.aids.gov.br Ministro da Sade Alexandre Rocha Santos Padilha Secretrio de Vigilncia em Sade Jarbas Barbosa da Silva Jnior Diretor do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais Fbio Mesquita Diretora-Adjunta Adele Schwartz Benzaken Coordenadora de Laboratrio - CLAB Miriam Franchini
Projeto grco e diagramao Ana Cristina e Silva Aguiar Fernanda Dias Almeida Mizael Autores Elaine Sanae Sumikawa Wersom Leonardo Rapone da Motta Maria Luiza Bazzo Miriam Franchini Orlando da Costa Ferreira Junior Reviso Ana Flvia Nacif P. Coelho Pires Ester Cerdeira Sabino Maria Ins de Moura Pardini Maria Tereza Magalhes Morais Mariza Gonalves Morgado Roberta Barbosa Lopes Francisco Rodrigo Ribeiro Rodrigues Colaboradores Andra Cristina Vanni Elvira Lcia Soares Mariana Villares Regina Aparecida Comparini
Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV
APRESENTAO
O Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministrio da Sade tem trabalhado constantemente na busca de uma resposta sustentvel epidemia de HIV/aids. Nossas aes e propostas so pautadas em evidncias cientficas, na evoluo tecnolgica e no dilogo com todos os atores envolvidos na luta contra a epidemia. Nesse sentido, novas polticas tm sido adotadas com o objetivo de ampliar o diagnstico, introduzir novas metodologias e fluxos que permitam o diagnstico precoce da infeco pelo HIV, impactando na transmisso do vrus e no surgimento de novos casos. Dentre as inovaes propostas, est a poltica do Tratamento como Preveno (TasP, da sigla em ingls Treatment as Prevention), que oferece a todos os pacientes a possibilidade de iniciar o tratamento logo aps a confirmao do diagnstico. Essa medida melhora a qualidade de vida das pessoas diagnosticadas e reduz a probabilidade de transmisso do vrus. Com o intuito de ampliar as possibilidades de diagnstico, alm de orientar e subsidiar, especialmente, os(as) profissionais de sade na realizao do diagnstico da infeco do HIV, foi elaborado este Manual Tcnico. Esto apresentados cinco fluxogramas que permitem o diagnstico seguro da infeco em indivduos de todas as idades. Essa proposta viabiliza a realizao do diagnstico em diferentes situaes e localidades nas quais a infraestrutura laboratorial esteja ou no disponvel, na capacidade necessria ao atendimento de todos os cidados que buscam esse diagnstico. Esperamos que os profissionais e servios faam as escolhas adequadas sua realidade local, de modo a viabilizar o acesso de todos os indivduos que desejam conhecer seu estado sorolgico. Ao construir essas propostas, consideramos tambm a agilidade da resposta ao indivduos, seu encaminhamento para assistncia mdica e a relao custo-efetividade da testagem. Desejamos a todos sucesso no seu trabalho e nos colocamos disposio para esclarecer qualquer dvida por meio do seguinte endereo de e.mail: clab@aids.gov.br
Jarbas Barbosa da Silva Jnior Secretrio de Vigilncia em Sade
Fbio Mesquita Diretor do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
Sumrio
Glossrio.................................................................................................................................... 9 Lista de abreviaturas.................................................................................................................11 1. Introduo.............................................................................................................................14 2. A estrutura do HIV..................................................................................................................15 2.1. Classificao filogentica do HIV.................................................................................................................17 2.2. Subtipos do HIV-1.......................................................................................................................................17 3. Infeco e resposta imune contra o HIV....................................................................................19 4. Diagnstico da infeco pelo HIV.............................................................................................20 4.1. Imunoensaio de triagem.............................................................................................................................21
4.1.1. Primeira Gerao............................................................................................................................................................22 4.1.2. Segunda Gerao...........................................................................................................................................................23 4.1.3. Terceira Gerao.............................................................................................................................................................23 4.1.4. Quarta Gerao..............................................................................................................................................................24
4.2. Testes Rpidos (TR)......................................................................................................................................25

4.2.1. Situaes e locais nas quais o Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais recomenda a utilizao de Testes Rpidos.......26
4.3. Ensaios complementares.............................................................................................................................27 4.4. Diagnstico por Deteco Direta do HIV......................................................................................................30 4.5. Diagnstico utilizando amostras de sangue seco em papel filtro.................................................................30 5. Sistema de estagiamento laboratorial da infeco recente pelo HIV: Classificao de Fiebig.......31 5.1. Estgios da infeco recente........................................................................................................................31 5.2. Limitaes do modelo de Fiebig..................................................................................................................32 6. Falhas e erros no diagnstico da infeco pelo HIV....................................................................34 7. Tecnovigilncia......................................................................................................................35 8. Fluxogramas de testagem para HIV.........................................................................................36 8.1. Estratgias para o diagnstico da infeco pelo HIV empregando Testes Rpidos ......................................36
Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
Fluxograma 1..........................................................................................................................................38 Fluxograma 2..........................................................................................................................................40 8.2. Propostas de estratgias de testagem em laboratrios..............................................................................41 Fluxograma 3..........................................................................................................................................42 Fluxograma 4..........................................................................................................................................45 Fluxograma 5..........................................................................................................................................48 9. Estratgias para identificao precoce da infeco pelo HIV em de crianas menores de 18 meses.................................................................................................................50 10. Situaes Especiais do Diagnstico da Infeco pelo HIV..........................................................51 10.1. Recomendao para diagnstico de infeco aguda pelo HIV-1................................................................51 10.2. Recomendaes para diagnstico da infeco pelo HIV-2.........................................................................51 Referncias...............................................................................................................................54
GlossrioG
Amostra do Paciente ou Amostra Biolgica: uma poro de fluido corporal, clulas ou tecido retirado para exame, estudo ou anlise. Anticorpo: uma protena (imunoglobulina) que se liga especificamente a uma substncia ao organismo estranha. Anticorpos so produzidos por linfcitos B em resposta a uma infeco ou imunizao. Antgeno: qualquer substncia ou material estranho que possa estimular a produo de anticorpos em um organismo e que seja reconhecido especificamente por estes. Controladores de Elite: (do ingls, elite controllers) so indviduos que tm a infeco pelo HIV, apresentam resultados reagentes nos testes sorolgicos que detectam anticorpos e no esto em tratamento antirretroviral, porm apresentam consistentemente (por pelo menos 1 ano) Carga Viral inferior ao limite de deteco dos ensaios rotineiramente utilizados. Estima-se que menos de 1% dos pacientes HIV-1 soropositivos pertena a esse grupo. Especificidade clnica ou especificidade diagnstica: refere-se capacidade de um ensaio apresentar resultado negativo ou no reagente quando os indivduos no apresentam uma desordem clnica ou doena. Falso-negativo: um resultado negativo em um teste para uma doena ou condio quando a doena ou condio de interesse est presente. Falso-positivo: um resultado positivo em um teste para uma doena ou condio quando a doena ou condio de interesse est ausente. Fase Eclipse: o intervalo de tempo entre a infeco pelo HIV e a primeira deteco por meio de um ensaio virolgico ultrassensvel. Imunidade Inata: mecanismo de defesa inicial contra infeces. Inclui clulas fagocticas, clulas NK (do ingls natural killer), clulas dendrticas, complemento, citocinas e quimiocinas. Imunidade Mediada por Clulas: reao imunolgica especfica mediada por linfcitos T. Imunoensaio: um mtodo que detecta a presena de um complexo antgeno-anticorpo em uma amostra biolgica. Imunosilenciosos: (do ingls, immunosilents) so indivduos que possuem nveis baixos ou mesmo ausncia de anticorpos especficos e, dessa forma, no so detectados nos testes sorolgicos. Infeco Aguda pelo HIV: a primeira fase da infeco at o estabelecimento do set point de Carga Viral, que dura em torno de trs (3) meses. Durante a infeco aguda existe uma fase de deteco viral que antecede a deteco de anticorpos contra o vrus. Infeco Crnica: a fase da infeco aps a completa maturao da resposta dos anticorpos. Geralmente ocorre entre 6 e 12 meses aps a soroconverso e se estende at a definio de aids. Infeco Recente: a fase entre o surgimento de anticorpos em quantidade detectvel por um teste sorolgico at a completa maturao da resposta dos anticorpos. Janela Clnica ou Janela Aguda ou Perodo de Incubao: so termos relacionados que definem o perodo entre o momento da infeco e o aparecimento dos sintomas e/ou sinais clnicos. Janela de Soroconverso ou Janela Imunolgica ou Janela Sorolgica: a durao do perodo entre a infeco pelo HIV at a primeira deteco de anticorpos anti-HIV, a qual inclui a fase aguda e a fase eclipse (aguda + eclipse). Janela Diagnstica: um conceito mais amplo do que o de janela imunolgica ou sorolgica. O perodo de janela diagnstica o tempo decorrido entre a infeco e o aparecimento ou deteco de um marcador da infeco, seja ele RNA viral, DNA proviral, antgeno p24 ou anticorpo. A durao desse perodo depende do tipo do teste, da sensibilidade do teste e do mtodo utilizado para detectar o marcador. Limite de Deteco: a menor concentrao ou quantidade que um mtodo pode detectar com certeza para um dado procedimento analtico. Ele depende da amplitude da leitura do branco e da preciso dessa medida.
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Padro-Ouro: uma referncia padro que se utiliza para comparar um material ou processo, visando a melhor aproximao da verdade ou valor verdadeiro. Prevalncia: nmero total de casos existentes de uma doena ou condio clnica (novos e antigos) de uma populao em um determinado local e perodo de tempo. Relao DO/CO: nos testes imunoenzimticos, o valor da reao DO/CO o resultado da diviso da densidade tica (obtida com a amostra teste) pelo ponto de corte do teste (determinado pelo fabricante). Outros testes para HIV como, por exemplo, metodologias ELFA e quimioluminescncia tm leitura em sistemas diferentes de densidade; nesses casos, utiliza-se a expresso S/CO (S = amostra, do ingls sample). Resposta Imune Humoral: refere-se resposta imune envolvendo a produo de anticorpos em resposta a um estmulo do antgeno. Resposta Primria: resposta imune resultante do primeiro encontro com o antgeno, que se caracteriza pela produo de IgM. Sensibilidade Clnica ou Sensibilidade Diagnstica: refere-se capacidade de um ensaio apresentar resultado positivo ou reagente quando o indivduo apresenta uma desordem clnica ou doena. Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (Aids): sndrome clnica caracterizada por profunda imunodepresso decorrente da infeco pelo HIV. A definio clnica de incio da aids o aparecimento de infeces oportunistas e/ou neoplasias. Desde 1993, a aids tambm pode ser definida por critrio laboratorial da contagem de linfcitos T CD4+. Teste de Triagem ou Teste Inicial: o primeiro teste realizado para identificar possveis indivduos infectados pelo HIV. Teste Molecular Qualitativo para o HIV: um mtodo de diagnstico do HIV que detecta a presena ou ausncia do vrus (RNA ou DNA-proviral) na amostra analisada. Teste Molecular Quantitativo para o HIV: um mtodo que permite quantificar a Carga Viral do HIV em determinada amostra. Teste Rpido: um dispositivo de teste de uso nico, que no depende de infraestrutura laboratorial e que produz resultado em tempo igual ou inferior a 30 minutos. Testes Complementares: so testes utilizados aps a realizao de outro teste que apresentar resultado reagente. Os dois testes devem possuir natureza antignica e/ou princpios metodolgicos diferentes. Testes Confirmatrios: so testes ou conjuntos de testes que podem definir o diagnstico de uma amostra, aps um resultado inicial reagente. Valor Preditivo Negativo: a proporo de indivduos com um resultado negativo e que no apresentam a doena ou condio de interesse. Esse valor, normalmente, apresentado em porcentagem. Valor Preditivo Positivo: a proporo de indivduos com um resultado positivo e que apresentam a doena ou condio de interesse. Esse valor, normalmente, apresentado em porcentagem. Vrion: a partcula viral completa que est estruturalmente intacta e infecciosa.
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Lista de Abreviaturas
Ac: Anticorpo AEQ: Avaliao Externa de Qualidade Ag: Antgeno Aids: Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (do ingls Acquired Immunodeficiency Syndrome) ANVISA: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ARV: Antirretroviral C: Controle CO: ponto de corte (do ingls, cut-off) CRF: forma Recombinante Circulante (do ingls, Circulating Recombinant Form) CTA: Centro de Testagem e Aconselhamento CV: Carga Viral D: Detectvel DBS: Sangue seco em papel de filtro (do ingls, Dried Blood Spots) DDAHV: Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais DNA: cido Desoxirribonucleico DO: Densidade tica DPP: Plataforma de Migrao Dupla/Imunocromatografia de Dupla Migrao DST: Doena Sexualmente Transmissvel EA: Eventos Adversos Env: Envelope FO: Fluido Oral Gag: Grupo antignico (do ingls, group-specific antigen) Gp: Glicoprotena GPGR: Variante brasileira do HIV (P = Prolina) GWGR: Variante brasileira do HIV (W = Triptofano) HIV: Vrus da Imunodeficincia Humana (do ingls Human Immunodeficiency Virus) IB: Imunoblot IBR: Imunoblot Rpido IE: Imunoensaio IFI: Imunofluorescncia Indireta Ig: Imunoglobulina JD: Janela Diagnstica kd: kilodalton LIA: Imunoensaio em linha (do ingls, Line Immuno Assay)
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LTR: Extremidades em repeties longas (do ingls, Long Terminal Repeat) MS: Ministrio da Sade NAT: Tecnologia de Amplificao de cidos Nucleicos (do ingls, Nucleic Acid Amplification Techonology) ND: No Detectvel Nef: Fator Negativo nm: nanmetro NR: No Reagente P: Protena Pol: Polimerase QT: Queixas Tcnicas R: Reagente Rev: Regulador da transcrio do gene viral (do ingls, Regulator of Expression of Virion Proteins) RF: Formas Recombinantes (do ingls, Recombinant Forms) RNA: cido Ribonucleico ST: Sangue Total T: Teste TasP: Tratamento como preveno (do ingls, Treatment as Prevention) Tat: Protena transativadora TM: Teste Molecular TR: Teste Rpido URF: Forma Recombinante nica (do ingls, Unique Recombinant Form) US: Unidade de Sade Vif: Fator de infecciosidade viral VPP: Valor Preditivo Positivo Vpr: Protena viral R Vpu: Proteina viral U WB: Western Blot
MANUAL TCNICO PARA O DIAGNSTICO DA INFECO PELO HIV
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1. INTRODUO
So vrios os desafios associados implementao de novos fluxogramas que visam caracterizar com acurcia e preciso uma amostra biolgicaG submetida a testes para o diagnstico da infeco pelo HIV. Esses desafios abrangem a reestruturao ou planejamento de polticas pblicas e incluem desde questes estruturais (polticas, legais, custo-efetividade, etc.) e tambm s operacionais (formao de pessoal, validao dos testes e boas prticas de laboratrio). Alguns desafios permanecem constantes: a evoluo tecnolgica que introduz periodicamente novas metodologias no mercado de testes, sua aprovao pelas agncias reguladoras e ainda sua aceitao para uso na rotina diria do diagnstico em diferentes situaes e instalaes. Resultados indeterminados ou inconclusivos, falso-positivosG ou falso-negativosG, podem ser obtidos com a utilizao de qualquer teste ou metodologia, independentemente do fluxograma utilizado, seja devido limitao da prpria metodologia e do que ela capaz de detectar na amostra analisada, seja pela caracterstica singular com que a infeco pode progredir em diferentes indivduos. A reatividade cruzada de anticorposG que podem estar presentes na amostra em virtude de vrias doenas autoimunes, ou mesmo na gravidez, dentre outras situaes, pode produzir resultados falso-positivos ou indeterminados em qualquer ensaio sorolgico. Em amostras que apresentam resultados indeterminados em testes como o Western Blot, Imunoblot ou Imunoblot Rpido, os Testes Moleculares (TM) podem ser muito teis para confirmar a presena da infeco pelo HIV. Porm, existe um perodo entre a exposio do indivduo e a deteco do vrus, no qual nenhum teste atualmente disponvel pode definir o resultado da amostra. Por fim, essencial descrever de forma clara e consistente o significado dos resultados obtidos a partir da utilizao de um fluxograma, esclarecendo suas vantagens, desvantagens e limitaes. Os fluxogramas tambm indicam quais caminhos devem ser seguidos para solucionar casos excepcionais que requerem testes adicionais, at a correta caracterizao da amostra submetida aos testes propostos no fluxograma escolhido em um determinado servio.
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2. A ESTRUTURA DO HIV
O HIV uma partcula esfrica, que mede de 100 a 120 nm de dimetro, pertencente ao gnero Lentivirinae e famlia Retroviridae, apresentando em seu ncleo duas cpias de RNA de cadeia simples, encapsuladas por uma camada proteica ou ncleo-capsdeo, capsdeo e um envelope externo composto por uma bicamada fosfolipdica. O genoma do HIV inclui trs principais genes que codificam as protenas estruturais e enzimas virais: gag, env e pol. A nomenclatura das protenas virais utiliza a abreviao gp para glicoprotena ou p para protena, seguida de um nmero que indica o peso molecular em kilodaltons (kd). O gene gag codifica a p55, a partir da qual quatro protenas estruturais do capsdeo so formadas: p6, p9, p17 e p24. O capsdeo que circunda o cido nucleico viral contm p24, p6 e p9, enquanto a p17 se encontra em uma camada entre o ncleo proteico e o invlucro, denominada matriz proteica, a qual reveste a superfcie interna da membrana viral. Figura 1 - O genoma do HIV-1. As localizaes relativas dos principais genes no genoma do HIV-1 so indicadas, assim como as principais protenas que cada gene codifica (adaptado de Miller, L. E., 2010).
vif* 5LTR gag pol Codica para enzimas virais Codica para p66 nucleocapsdeo e p51 protenas do core p31 p10 p55 precursor vpr*
nef* vpu* env Codica para protenas do envelope viral gp160 precursor 3LTR
gp120 gp 41
p6 p9 p17 p24 *Genes regulatrios
O gene env codifica as glicoprotenas gp160, gp120, e gp41, que so encontradas no envelope viral. A gp160 uma protena precursora, que clivada para formar a gp120 e gp41. A gp120 se projeta na superfcie viral na forma trimrica, enquanto a gp41 uma glicoprotena transmembrana e se associa gp120. Ambas gp120 e gp41 esto envolvidas na fuso e ligao aos receptores de HIV nas clulas do hospedeiro. O terceiro gene estrutural, pol, codifica as enzimas p66 e p51, que compem a enzima transcriptase reversa (RT), necessria replicao do HIV. Essas protenas so subunidades da transcriptase reversa p31, ou integrase, a qual medeia a integrao do DNA viral no genoma das clulas do hospedeiro, e a p10, uma protease que cliva precursores proteicos em unidades ativas menores. A protena p66 tambm est envolvida na degradao do RNA original do HIV. Essas protenas esto localizadas no ncleo, sendo associadas ao RNA do HIV. Vrios outros genes no genoma do HIV codificam produtos com funo reguladora ou acessria. Embora esses produtos no sejam parte integrante da estrutura viral, eles atuam no controle da replicao viral e infectividade. O gene tat (transativador) codifica a p14, uma protena reguladora que ativa a transcrio de genes provirais do HIV. O gene rev (que regula a expresso das protenas do vrion) codifica a p19, uma protena que transporta o RNA viral para a traduo no citoplasma. O gene nef codifica a p27, a qual apresenta mltiplas funes, incluindo a modificao da clula hospedeira para aumentar a replicao viral e torn-la menos suscetvel a ser destruda pelo sistema imune do hospedeiro. O gene vpu (protena viral U) codifica a p16, uma protena com mltiplos papis,
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incluindo a montagem de forma eficiente e brotamento dos vrions para fora das clulas hospedeiras infectadas e a promoo da morte da clula hospedeira. O gene vpr (protena viral R) codifica a p15, que auxilia na integrao do DNA do HIV no ncleo da clula hospedeira. O gene vif codifica a p23, que atua como um fator de infecciosidade viral, estabilizando o DNA HIV recm-sintetizado e facilitando o seu transporte para o ncleo. O HIV-2 tambm apresenta os genes gag, env, pol e genes regulatrios e acessrios com funes semelhantes s observadas no HIV-1. A homologia entre os genomas dos dois vrus de aproximadamente 50%. As regies gag e pol do genoma viral apresentam maior homologia entre os diferentes tipos virais, ao contrrio da regio env, que apresenta diferenas significativas no HIV-1 e HIV-2. As protenas do HIV-2 tm funes equivalentes s do HIV-1; entretanto, apresentam diferenas na composio de aminocidos e no peso molecular, conforme a tabela 1: Tabela 1 Principais Protenas do HIV com Importncia Diagnstica Genes do HIV Env Produtos do HIV Precursor Glicoprotena externa Glicoprotena transmembranar Transcriptase Reversa Transcriptase Reversa Integrase Precursor Cerne Matriz Peso Molecular das Protenas e Glicoprotenas Virais HIV-1 HIV-2 gp160 gp140 gp120 gp105/125 gp41 gp36 p66 p68 p51 p53 p31 p31/34 p55 p56 p24 p26 p17 p16
Pol
Gag
Adaptado de: CLSI. Criteria for Laboratory Testing and Diagnosis of HIV Infection; Approved Guideline. CLSI document M53-A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011
Os principais componentes virais com utilidade diagnstica incluem as protenas do envelope viral (gp160, gp120 e gp41), as protenas codificadas pelo gene gag (p55, p24 e p17) e as protenas codificadas pelo gene pol (p66, p51, p31). A figura 2 apresenta a localizao das principais protenas na partcula viral de HIV-1. Figura 2 - A estrutura do HIV-1.
PROTENA DO ENVELOPE gp120 PROTENA DO ENVELOPE gp41 RNA
PROTENAS MATRIZ p17
MEMBRANA LIPDICA
TRANSCRIPTASE REVERSA
CAPSDEO P24
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2.1. Classificao filogentica do HIV

A classificao do HIV feita por meio da anlise filogentica de sequncias nucleotdicas dos vrus. A classificao atual hierrquica e consiste em tipos, grupos, subtipos, sub-subtipos e formas recombinantes (Figura 3). O HIV-1 e o HIV-2 so tipos distintos do vrus, mais distantes filogeneticamente. O HIV-1 subdividido em 4 grupos: grupo M (do ingls, major ou majoritrio), grupo N (do ingls, new ou non-M, non-O, ou novo, no-M, no-O), grupo O (do ingls, outlier) o mais divergente dentre os grupos, e ainda o grupo P. A maioria das infeces ocorre com HIV-1 do grupo M, o qual diferenciado em subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K). Os subtipos A e F, por sua vez, so subdivididos em A1, A2, A3, A4 e A5, e em F1 e F2, respectivamente. Quando um indivduo portador de uma infeco mista, composta por dois ou mais vrus de linhagens (subtipos) diferentes, pode ocorrer a transferncia de material gentico entre eles, dando origem s formas recombinantes (RF, do ingls recombinant forms). Caso a transmisso de uma forma recombinante tenha sido documentada em mais de trs indivduos, passa a ser denominada como CRF (forma recombinante circulante, do ingls, circulating recombinant form). Formas recombinantes que foram identificadas, mas cujas transmisses so desconhecidas ou no relatadas, so definidas como URF (forma recombinante nica ou, do ingls, unique recombinant form). A variao gentica do HIV tem implicaes tanto na biologia do vrus e sua transmisso, quanto na reatividade e reao cruzada em testes diagnsticos que detectem a presena de anticorpos especficos para os antgenosG virais. Figura 3 - Representao esquemtica da classificao do HIV.
HIV
HIV-1 Tipo HIV-2
Grupo
A, B, C, D, E, F, G e H
CRF/URF
Subtipos/RF
F1 F2 Sub-Subtipos A1 A2 A3 A4 A5
2.2. Subtipos do HIV-1

A epidemia HIV/aids no Brasil complexa quanto distribuio e prevalncia dos diferentes subtipos de HIV-1, se comparada aos outros pases da Amrica do Sul. O subtipo B do HIV-1 tem sido descrito como o mais prevalente no Brasil, seguido pelo F1 e formas recombinantes nicas B/F1 nas regies Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste, enquanto que na regio Sul observa-se uma alta prevalncia do subtipo C, com valores que variam de um estado a outro, e do CRF31_BC. Alm desses, j foram relatados alguns casos de infeces pelos subtipos A, D, CRF02_AG e genomas mosaicos em potencial, envolvendo recombinao ou infeco dupla entre B/F1, B/C e F1/D e pelo menos 5 CRFs_BF1 (28, 29, 39, 40 e 46) e o CRF31_BC. Em adio diversidade inter-subtipo, diferenas genticas e antignicas tambm foram descritas entre linhagens do subtipo B circulantes no Brasil, com a identificao de uma variante denominada B. Esta difere do subtipo B clssico pela presena do motivo GWGR no topo da ala V3 de gp120 do envelope, no lugar de GPGR. Em algumas reas do Brasil, a variante B mostrou-se altamente prevalente, correspondendo a 57% dos subtipos B detectados em Ribeiro Preto (SP) e 37% dos do Rio de Janeiro (RJ).
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Ao longo do tempo, tem-se verificado um aumento na complexidade da composio de subtipos virais e formas recombinantes nas diferentes regies brasileiras. No Norte do pas, foi descrita a presena do subtipo B em 38,7% das amostras analisadas de Manaus, seguida por uma alta porcentagem de recombinantes B/F (35,5%) e do subtipo F (16%). J em um trabalho mais recente, analisando amostras de Belm e de Macap, verificou-se um predomnio do subtipo B (88,3% e 97,1%), seguido de F1 (9,3% e 2,8%), com identificao do subtipo D e do CRF02_AG. No Nordeste, diversos trabalhos apontam para uma predominncia do subtipo B, registrando uma prevalncia de, aproximadamente, 80%, seguido de recombinantes BF1 na Bahia e do subtipo F1 nos demais estados. No CentroOeste, verificou-se uma alta prevalncia de subtipo B no Distrito Federal (96%), seguido pelo subtipo F1 e recombinantes BF1. Em um estudo incluindo amostras de Gois, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul, verificou-se uma prevalncia de 69,9% do subtipo B, 1,7% do F1, 1% do C e 14,5% de formas recombinantes envolvendo os subtipos B, C, D e F. Estudos mais recentes apontam para um incremento na prevalncia do subtipo C em mulheres dessa regio. Inmeros trabalhos tm procurado avaliar a distribuio dos subtipos de HIV-1 na regio Sudeste. De modo geral, todos apontam para um predomnio do subtipo B, seguido do subtipo F1 e URF_BF1 (10%-15%), alm de casos isolados do subtipo C, verificados no Esprito Santo, Rio de Janeiro, So Paulo e Belo Horizonte. Formas recombinantes circulantes CRF28_BF1, CRF29_BF1 e CRF46_BF j foram identificadas em So Paulo e CRF39_BF1 e CRF40_BF1 no Rio de Janeiro, alm da identificao de infeces por CRF02_AG no Rio de Janeiro. Estudo recente aponta para um incremento da presena do subtipo C em So Paulo. Os primeiros estudos de subtipagem de amostras de HIV-1 provenientes da regio Sul evidenciaram perfil diferenciado, com alta prevalncia do subtipo C. Desde ento, inmeros trabalhos tm sido realizados nessa regio, apontando para grande proporo de infeces pelo subtipo C do HIV-1 nos estados do Paran (30%), Santa Catarina (49-64%) e Rio Grande do Sul (27%-40%), seguidos pelos subtipos B, F1, recombinantes BF, BC, alm do CRF31_BC, descrito em Porto Alegre e Rio Grande (RS). Figura 4 - Distribuio geogrfica dos subtipos e formas recombinantes do HIV-1 identificados no Brasil (atualizado a partir de Morgado et al., 2002).
B, B, F1, BF1 B, B, F1, BF1, C
B, B, F1, BF1, C B, B, F1, BF1, C CRF_28, 29, 39, 40, 46BF, CRF02_AG
C, B, B, BC, CRF_31BC
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3. INFECO E RESPOSTA IMUNE CONTRA O HIV

A maioria das infeces pelo HIV-1 ocorre atravs das mucosas do trato genital ou retal durante a relao sexual. Nas primeiras horas aps a infeco pela via sexual, o HIV e clulas infectadas atravessam a barreira da mucosa, permitindo que o vrus se estabelea no local de entrada e continue infectando linfcitos T CD4+ (T CD4+), alm de macrfagos e clulas dendrticas. Aps a transmisso do vrus, h um perodo de aproximadamente 10 dias, denominado de fase eclipseG (do ingls, eclipse phase), antes que o RNA viral seja detectvel no plasma. Estudos que utilizaram tcnicas avanadas de sequenciamento gentico das primeiras partculas virais detectadas no plasma permitiram demonstrar que aproximadamente 80% das infeces sexuais pelo HIV-1 dos subtipos B e C so iniciadas por um nico vrus. A homogeneidade do vrus, dito fundador, indica que o estabelecimento da infeco resultado de um nico foco de linfcitos T CD4+ infectados da mucosa. A replicao viral nesse local auxiliada, em parte, pela resposta imunolgica inata que encaminha uma quantidade adicional de clulas T suscetveis ao foco da infeco. A partir dessa pequena populao de clulas infectadas, o vrus disseminado inicialmente para os linfonodos locais e depois sistemicamente e em nmero suficiente para estabelecer e manter a produo de vrus nos tecidos linfoides, alm de estabelecer um reservatrio viral latente, principalmente em linfcitos T CD4+ de memria. A replicao viral ativa e a livre circulao do vrus na corrente sangunea causam a formao de um pico de viremia por volta de 21 a 28 dias aps a exposio ao HIV. Essa viremia est associada a um declnio acentuado no nmero de linfcitos T CD4+. Na fase de expanso e disseminao sistmica, h a induo da resposta imunolgica, mas esta tardia e insuficiente em magnitude para erradicar a infeco. A ativao imune, por outro lado, produz uma quantidade adicional de linfcitos T CD4+ ativados que servem de alvo para novas infeces. Ao mesmo tempo, o nmero crescente de linfcitos T CD8+ (T CD8+) exerce um controle parcial da infeco, mas no suficiente para impedir, em ausncia de terapia, a lenta e progressiva depleo de linfcitos T CD4+ e a eventual progresso para aids. A ativao de linfcitos T citotxicos CD8+ especficos (TC CD8+) contra o HIV ocorre normalmente antes da soroconverso. O aparecimento de uma resposta imune celular HIV-especfica e a subsequente sntese de anticorpos anti-HIV levam a uma queda da Carga Viral plasmtica (viremia) - at um nvel (set point) que especfico de cada indivduo - e cronicidade da infeco pelo HIV. A resposta imune mediada por clulas mais importante do que a resposta imune humoralG no controle da replicao viral durante a infeco agudaG, mas os anticorpos tm um papel relevante na reduo da disseminao do HIV na fase crnica da infeco. A resposta imunolgica humoral contra vrios antgenos viral vigorosa. A maioria das protenas do HIV imunognica, mas uma resposta de anticorpos precoce e preferencial induzida contra glicoprotenas do envelope, gp120 e gp41, e contra a protena do core/ capsdeo viral, a p24. Como em qualquer outra infeco viral, a primeira classe de anticorpo produzida durante uma resposta primriaG a imunoglobulina M (IgM). Devido persistncia do HIV, nosso organismo continuamente exposto aos mesmos antgenos e a produo inicial de IgM substituda pela produo de imunoglobulina G (IgG). Entretanto, ao contrrio de outras doenas infecciosas, a presena da IgM no permite diferenciar uma infeco recenteG de uma infeco crnicaG, tendo em vista que a IgM pode reaparecer em outros momentos durante o curso da infeco. A IgG anti-HIV atinge nveis sricos elevados e persiste por anos, enquanto os nveis sricos de IgM tendem a desaparecer com o tempo ou apresentar padro de intermitncia. observado um aumento da afinidade do anticorpo pelo antgeno, ou seja, os anticorpos de baixa afinidade que so produzidos no incio da resposta humoral so pouco a pouco substitudos por anticorpos de alta afinidade. Este um fenmeno devido ocorrncia de mutaes somticas em determinadas regies (hot spots) dos genes que codificam a imunoglobulina (Ig). Essas mutaes ocorrem ao acaso e o aparecimento de clones de linfcitos B com maior especificidade antignica o resultado de um processo de seleo positiva decorrente dessas mutaes. Essa caracterstica de aumento de afinidade (ou avidez), juntamente com o aumento da concentrao srica de anticorpos especficos anti-HIV durante a fase inicial da resposta imune humoral, a base racional para o desenvolvimento de testes laboratoriais que classificam a infeco em recente ou crnica.
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4. DIAGNSTICO DA INFECO PELO HIV

As estratgias de testagem em laboratrio tm o objetivo de melhorar a qualidade do diagnstico da infeco recente pelo HIV e, ao mesmo tempo, fornecer uma base racional para assegurar que o diagnstico seja seguro e concludo em tempo hbil. Para construir a base lgica desses fluxogramas, empregamos como referncia a classificao de Fiebig, ou seja, um sistema de estagiamento laboratorial da infeco recente pelo HIV. Os ensaios de terceira gerao permitiram a deteco de IgM e IgG e representaram um avano no diagnstico da infeco recente pelo HIV; porm, novas tecnologias foram desenvolvidas, como por exemplo os testes de quarta gerao que possibilitam a deteco combinada de antgeno e anticorpo, permitindo diminuir ainda mais o perodo de janela diagnstica do HIV. Os testes de 3 e 4 gerao so mais sensveis do que os testes confirmatrios convencionais (Western blot - WB, Imunoblot - IB, ou Imunoblot Rpido - IBR), tornando fluxogramas com essa composio de ensaios inadequados para a deteco de infeces recentes e de baixo custo-efetividade. Por essa razo, testes moleculares empregados como testes confirmatrios so mais adequados para o diagnstico de infeces agudas e/ou recentes. Por outro lado, existem indivduos, chamados de controladores de elite, que mantm a viremia em um nvel que pode ser indetectvel em testes moleculares. Nesses casos, o diagnstico s pode ser realizado mediante a utilizao dos testes confirmatrios WB, IB e IBR citados. A estimativa do nmero de indivduos considerados controladores de eliteG depende de dois parmetros: o valor da Carga Viral e o tempo em que o indivduo permanece com a Carga Viral abaixo (ou igual) a esse valor. Estudos recentes em indivduos infectados e em doadores de sangue sugerem que a ocorrncia de controladores de elite no superior a 1% dos indivduos diagnosticados. importante observar que,em fluxogramas que utilizam testes moleculares para confirmao, indivduos controladores de elite e indivduos no infectados, porm com resultado falso-positivo no teste de triagem, tero resultado igualmente negativo no teste molecular. A distino entre essas duas situaes se dar por meio da realizao de testes como o WB ou IB ou IBR. Diante dessa diversidade de cenrios, no possvel a utilizao de apenas um fluxograma para cobrir todas as situaes que se apresentam para o diagnstico da infeco pelo HIV. Assim, casos de infeco recente so melhor identificados com a utilizao de um teste de 4 gerao como teste de triagem e um teste molecular como teste confirmatrio, enquanto que os controladores de elite so facilmente identificados com IE de 3 ou 4 gerao e um WB como teste confirmatrio. Indivduos na fase crnica da infeco so identificados com sucesso com qualquer combinao de testes de triagem (3 ou 4 gerao), seguido por um teste confirmatrio (WB ou teste molecular). Na realidade, esses indivduos constituem a maioria (>95%) dos casos diagnosticados. Figura 5 - Marcadores da infeco pelo HIV na corrente sangunea de acordo com o perodo que surgem aps a infeco, seu desaparecimento ou manuteno ao longo do tempo.
Concentrao dos marcadores no plasma
RNA
P24
IgM
IgG Total
3 4 5 6 Semanas de infeco
12
16
(Fonte: BUTT, S.; SULIGOI, B.; FANALES-BELASIO, E.; RAIMONDO, M. Laboratory diagnostics for HIV infection. Ann. Ist. Super. Sanit, [S.l.], v. 46, n. 1, p. 24-33, 2010. Adaptado de: HIV - Estratgias para Diagnstico no Brasil Telelab/MS).
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A estimativa dos casos de infeco recente ou aguda que se apresentam para o diagnstico depende da incidncia da infeco. Por exemplo, em populaes em que a incidncia baixa, o nmero de casos com infeco recente ou aguda muito pequeno. O inverso ocorre em populaes de risco acrescido, em que a incidncia alta e a probabilidade de casos com infeco recente ou aguda significativa. Portanto, a escolha do fluxograma deve levar em considerao a populao-alvo da testagem, a fim de maximizar as chances de diagnosticar infeces recentes e/ou agudas. Os testes para deteco da infeco pelo HIV so principalmente empregados em trs situaes: para triagem sorolgica do sangue doado e garantia da segurana do sangue, hemoderivados e rgos para transplante; para os estudos de vigilncia epidemiolgica; e para realizar o diagnstico da infeco pelo HIV. A seguir, comentamos sobre os principais testes utilizados no diagnstico da infeco pelo HIV.
4.1. Imunoensaio de triagem

Logo aps a descoberta do HIV, foram desenvolvidos imunoensaiosG (IE) para o diagnstico da infeco. Nas ltimas dcadas, quatro geraes de IE foram desenvolvidas. Essas geraes foram definidas de acordo com a evoluo das metodologias empregadas, a partir do primeiro ensaio disponvel comercialmente, no ano de 1985. As principais caractersticas das quatro geraes de IE esto descritas a seguir.
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4.1.1. Primeira Gerao

O ensaio de primeira gerao tem o formato indireto (figura 6), ou seja, a presena de anticorpos especficos detectada por um conjugado constitudo por um anticorpo anti-IgG humana. Na fase slida, os antgenos so originados de um lisado viral de HIV. Os antgenos do lisado viral so obtidos a partir de cultura do HIV em linhagens celulares humanas. O vrus obtido do sobrenadante da cultura, concentrado por centrifugao e lisado para expor as protenas virais. Essas protenas so posteriormente purificadas; entretanto, as diferentes protenas virais no so obtidas com a mesma eficincia e algumas sofrem degradao, alterando as propores estequiomtricas das protenas presentes no vrionG. Alm disso, protenas de origem celular e outras impurezas, provenientes do meio de cultura, tambm podem estar presentes na preparao antignica final. Dessa forma, o caldo constitudo por protenas virais (em propores distintas daquelas encontradas no vrion), protenas de clulas humanas e do meio de cultura, so utilizadas como antgenos na fase slida do ensaio de primeira gerao. Essas caractersticas tornam o ensaio pouco especfico e, pelo fato de detectarem apenas IgG, tambm so menos sensveis do que os ensaios de geraes posteriores. Em mdia, a janela de soroconversoG dos ensaios de primeira gerao de 6 a 8 semanas. Atualmente, esses ensaios deixaram de ser utilizados na rotina diagnstica dos laboratrios. Figura 6 - Ensaio imunoenzimtico indireto do tipo ELISA (do Ingls, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
Incubao
Lavagem
Incubao
Lavagem
Degradao do substrato Reao de cor: presena de anticorpos
Legenda Fase slida Poo de uma placa de 96 poos Anticorpo IgG Anti-HIV (Ac) Conjugado (Conj) Anti-IgG Humana+ Enzima Antgeno de HIV (Ag) Ligado fase slida - poo da placa Substrato (S) Cromgeno + H2O2
Fonte: Adaptado de HIV Estratgias para Diagnstico no Brasil - Telelab/MS
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4.1.2. Segunda Gerao

O ensaio de segunda gerao tambm tem formato indireto; porm, utiliza antgenos recombinantes ou peptdeos sintticos derivados de protenas do HIV. A possibilidade de utilizar antgenos recombinantes ou peptdeos sintticos no diagnstico da infeco pelo HIV decorre do conhecimento de que existem regies antignicas em determinadas protenas do HIV - eptopos imunodominantes que so alvos prefernciais da resposta imune humoral. Quanto maior a quantidade de eptopos imunodominantes no ensaio, mais sensvel esse ensaio se torna. Protenas fracamente imunodominantes, ou aquelas em que o aparecimento do anticorpo se d mais tardiamente, no contribuem para melhorar o desempenho do ensaio e ainda podem ser fonte de reatividade inespecfica. Em comparao com os ensaios de primeira gerao, os de segunda gerao so mais sensveis e especficos, por conter uma maior concentrao de protenas (eptopos imunodominantes) relevantes. Em mdia, a janela de soroconverso dos ensaios de segunda gerao de 28 a 30 dias.
4.1.3. Terceira Gerao

O ensaio de terceira gerao tem o formato sanduche (ou imunomtrico). A caracterstica desse ensaio utilizar antgenos recombinantes ou peptdeos sintticos tanto na fase slida quanto sob a forma de conjugado. Esse formato permite a deteco simultnea de anticorpos anti-HIV IgM e IgG. Como a IgG bivalente, ou seja, possui dois stios de ligao ao antgeno (chamados de regio Fab da imunoglobulina) e a IgM pentavalente, um desses stios liga-se ao antgeno adsorvido fase slida e o(s) outro(s) Fab fica(m) livre(s) para posteriormente ligar-se aos mesmos antgenos solveis, sob a forma de conjugado. Dessa forma, o anticorpo fica entre dois antgenos e, por essa caracterstica, qualquer classe de imunoglobulina anti-HIV (IgG, IgM, IgA ou IgE) ser detectada por esse tipo de metodologia. A possibilidade de detectar anticorpos da classe IgM torna esse ensaio mais sensvel do que os de geraes anteriores. Ao mesmo tempo, h aumento da especificidade, pois o conjugado (antgenos) liga-se apenas valncia livre do anticorpo que est no complexo imune (antgenos na fase slida do ensaio e anticorpos da amostra). Em mdia, a janela de soroconverso dos ensaios de terceira gerao de 22 a 25 dias. A figura 7 mostra uma representao esquemtica de um ensaio de terceira gerao. Figura 7 - Ensaio imunoenzimtico sanduche ou imunomtrico de terceira gerao do tipo ELISA (do ingls, EnzymeLinked Immunosorbent Assay).
Incubao Lavagem
Incubao
Lavagem
Degradao do substrato Reao de cor: presena de anticorpos
Legenda Fase slida Poo de uma placa de 96 poos Anticorpo IgG Anti-HIV (Ac) Conjugado (Conj) Antgeno + Enzima Antgeno de HIV (Ag) Ligado fase slida - poo da placa Anticorpo IgM Anti-HIV (Ac) Substrato (S) Cromgeno + H2O2
Fonte: Adaptado de HIV Estratgias para Diagnstico no Brasil - Telelab/MS
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4.1.4. Quarta Gerao

O ensaio de quarta gerao detecta simultaneamente o antgeno p24 e anticorpos especficos anti-HIV. O componente de deteco de anticorpo tem o formato de sanduche; portanto, detecta todas as classes de imunoglobulinas contra protenas recombinantes ou peptdeos sintticos derivados das glicoprotenas gp41 e gp120/160. O componente de deteco de antgeno p24 constitudo por um anticorpo monoclonal na fase slida (para capturar o antgeno p24 presente no soro) e de um conjugado constitudo por um antissoro (anticorpo) poliespecfico contra a protena p24. Em mdia, a janela diagnstica dos ensaios de quarta gerao de aproximadamente 15 dias, dependendo do ensaio utilizado. A figura 8 mostra uma representao esquemtica de um teste de quarta gerao. Figura 8 - Ensaio imunoenzimtico sanduche ou imunomtrico de quarta gerao do tipo ELISA (do ingls, EnzymeLinked Immunosorbent Assay).
Incubao
Lavagem
Incubao
Lavagem
Reao colorida indica a presena do antgeno ou do anticorpo
Legenda Fase slida Poo de uma placa de 96 poos Anticorpo Anti-P24 Ligado fase slida poo da placa Antgeno de HIV (Ag) Ligado fase slida - poo da placa Anticorpo IgM Anti-HIV (AC) Presente na amostra do indivduo Antgeno de HIV (Ag) Ligado fase slida - poo da placa Anticorpo IgG Anti-HIV (AC) Presente na amostra do indivduo Protena P24 do HIV Presente na amostra do indivduo Conjugado (Conj) Antgeno + enzima Substrato (S) Cromgeno + H2O2
Conjugado (Conj) Anticorpo Anti-P24 + enzima
Neste manual, as geraes de imunoensaios esto representadas como testes imunoenzimticosG do tipo ELISA (do ingls Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) porque os primeiros testes que surgiram no mercado, de primeira gerao, usavam essa metodologia. Atualmente, outras metodologias esto disponveis. Para conhec-las ou revis-las, faa o curso HIV-Estratgias para Diagnstico no Brasil, da Srie Telelab do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais, disponvel em www. telelab.aids.gov.br
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4.2. Testes Rpidos (TR)

Os Testes Rpidos (TR) so imunoensaios (IE) simples, que podem ser realizados em at 30 minutos. Por essas caractersticas, sero tratados neste Manual pela denominao de Testes Rpidos. Como consequncia do desenvolvimento e da disponibilidade de testes rpidos, o diagnstico do HIV atualmente pode ser realizado em ambientes laboratoriais e no laboratoriais, permitindo ampliar o acesso ao diagnstico. Existem vrios formatos de TR, e os mais frequentemente utilizados so: dispositivos (ou tiras) de Imunocromatografia (ou fluxo lateral), Imunocromatografia de dupla migrao (DPP), dispositivos de imunoconcentrao e fase slida (figuras 9, 10 e 11). Figura 9 - Exemplos de Testes Rpidos (TR) para HIV, (A) imunocromatografia ou fluxo lateral, (B) imunocromatografia de dupla migrao DPP, (C) imunoconcentrao, (D) fase slida.
rea 3
rea 2
T C
C
CONTROLE
A
rea 1
HIV 2
HIV 1
B
(Adaptado de: HIV - Estratgias para Diagnstico no Brasil - Telelab/MS)
Figura 10 - Exemplos de Testes Rpidos Reagentes (TR) para HIV. Observa-se presena de linha ou ponto na rea T (Teste) e na rea C (Controle), (A) imunocromatografia ou fluxo lateral, (B) imunocromatografia de dupla migrao DPP, (C) imunoconcentrao, (D) fase slida.
rea 3
rea 2
T C
C
CONTROLE
A
rea 1
HIV 2
HIV 1
B
Figura 11 - Exemplos de Testes Rpidos No Reagentes (TR) para HIV. Observa-se presena de linha ou ponto apenas na rea C (Controle), (A) imunocromatografia ou fluxo lateral, (B) imunocromatografia de dupla migrao DPP, (C) imunoconcentrao, (D) fase slida.
rea 3 rea 2
T C
C
CONTROLE
A
rea 1
HIV 2
HIV 1
B
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Tendo em vista que os TR so desenvolvidos para detectar anticorpos anti-HIV em at 30 minutos, em comparao com o IE, que pode levar at 4 horas, os dispositivos so otimizados para acelerar a interao antgeno/anticorpo. Isso requer a utilizao de uma maior concentrao de antgeno e da deteco de complexo antgeno/anticorpo com reagentes sensveis cor, como, por exemplo, o ouro coloidal. Os testes rpidos so ideais para fornecer resultados no mesmo dia em uma variedade de situaes e locais descritos no item 4.2.1.
4.2.1. Situaes e locais nas quais o Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais recomenda a utilizao de Testes Rpidos:
a) Rede de servios de sade sem infraestrutura laboratorial ou localizada em regies de difcil acesso; b) Programas do Ministrio da Sade, tais como Rede Cegonha, Programa de Sade da Famlia, Consultrio na Rua, Quero Fazer, dentre outros programas; c) Centro de Testagem e Aconselhamento CTA e Unidade de Testagem Mvel; d) Segmentos populacionais flutuantes; e) Segmentos populacionais mais vulnerveis; f) Parcerias de pessoas vivendo com HIV/aids; g) Acidentes biolgicos ocupacionais; h) Gestantes no pr-natal e que no tenham sido testadas durante o pr-natal ou cuja idade gestacional no assegure o recebimento do resultado do teste antes do parto; i) Parturientes e purperas que no tenham sido testadas no pr-natal ou quando no conhecido o resultado do teste no momento do parto; j) Abortamento espontneo, independentemente da idade gestacional; k) Laboratrios que realizam pequenas rotinas (rotinas com at 5 amostras dirias para diagnstico da infeco pelo HIV); l) Pessoas em situao de violncia sexual como preveno das DST/aids; m) Pacientes atendidos em pronto-socorros; n) Outras situaes especiais definidas pelo Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais (DDAHV) para aes de Vigilncia, Preveno e Controle das Doenas Sexualmente Transmissveis e Sndrome da Imunodeficincia AdquiridaG. Testes rpidos so primariamente recomendados para testagens presenciais. Podem ser realizados com fluido oral, soro, plasma ou sangue total (o que permite o uso de amostras obtidas por puno digital). Os testes rpidos so simples de executar e podem ser utilizados fora do ambiente de laboratrio por pessoal capacitado. Com o objetivo de ampliar o acesso ao diagnstico do HIV no Brasil e habilitar o maior nmero de profissionais de sade para realizar esses testes, o DDAHV oferece modelos de treinamento presencial ou distncia (Sistema TELELAB, disponvel em www.telelab.aids.gov.br), que aborda vrios aspectos relativos qualidade, segurana e execuo do TR. Diversos TR esto disponveis comercialmente; porm, nem todos possuem as caractersticas de desempenho, de sensibilidade e de especificidade estabelecidas pelo DDAHV neste Manual. Para evitar o emprego de TR com desempenho sub-timos, o DDAHV tem um programa para avaliao da qualidade dos TR (Tabelas 2 e 3). Os resultados dessas avaliaes so publicados periodicamente no site www.aids.gov.br.
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Tabela 2 Caractersticas de desempenho de sensibilidade e especificidade dos Testes Rpidos para HIV estabelecidas pelo DDAHV a partir de 2013.
Parmetro
Especicidade Clnica Sensibilidade Clnica Desempenho operacional do ensaio (DOE) > 99,0% > 99,5% Desempenho satisfatrio (4 pontos de 5 possveis)
Critrio
Tabela 3 Parmetros de desempenho e critrios de pontuao dos Testes Rpidos para HIV estabelecidos pelo DDAHV.
Desempenho desejado Desempenho no desejado Pontuao = 1 Pontuao = 0
Apenas 1 reagente Mais de 1 reagente 2o C a 8o C requeridos Mais do que 4 Mais de 30 minutos Experincia laboratorial requerida
Parmetro do DOE
No de reagentes necessrios
Temperatura de armazenamento dos Inclui temp. ambiente reagentes Total de etapas Tempo total de realizao Mximo de 4 Mximo de 30 minutos
Habilidades tcnicas Sem conhecimento requeridas laboratorial
Outros testes rpidos foram desenvolvidos utilizando o fluido oral (FO) como amostra, coletada por meio de um dispositivo especfico. O FO contm uma menor quantidade de IgG do que amostras de sangue, mas, em quantidade ainda suficiente para permitir o diagnstico seguro da infeco pelo HIV. Os anticorpos presentes no FO so transferidos passivamente do sangue circulante para o fluido gengival (chamado de fluido crevicular). Por essa razo, os anticorpos da classe IgG presentes no FO possuem toda gama de especificidades dos anticorpos presentes no soro. O emprego do FO pode simplificar ainda mais a testagem de HIV, tornando-a mais acessvel, alm de reduzir o risco biolgico associado aos testes baseados em sangue. Entretanto, a sensibilidade e a especificidade dos ensaios que utilizam o fluido oral so inferiores aos ensaios que utilizam amostras de sangue, soro ou plasma. importante ressaltar que a janela de soroconverso dos testes rpidos que utilizam o fluido oral pode chegar at a trs (3) meses, dependendo do conjunto diagnstico utilizado.
4.3. Ensaios Complementares

Embora os testes rpidos e os IE sejam sensveis e especficos, resultados falso-positivos podem ocorrer; por essa razo, os testes complementaresG foram desenvolvidos. Os testes complementares utilizam diferentes formatos e princpios. Esto includos nessa categoria: Western blot (WB), Imunoblot (IB) ou imunoensaios em linha (LIA, do ingls Line Immuno Assay), incluindo o Imunoblot Rpido (IBR) e imunofluorescncia indireta (IFI). A IFI foi muito utilizada como teste complementar durante a primeira dcada da epidemia de HIV, mas atualmente foi substituda pelo WB e Imunoblot. O WB e o Imunoblot envolvem o uso de tiras de membrana com protenas nativas do HIV que so separadas por eletroforese (WB), ou por protenas recombinantes ou peptdeos sintticos impregnados diretamente nessas membranas (Imunoblot). Essas tiras so incubadas com amostras de soro ou plasma. Os anticorpos presentes na amostra se ligam especificamente s protenas das tiras de WB ou IB e esses anticorpos anti-HIV especficos ligados s protenas so detectados por anticorpos secundrios, conjugados com uma enzima, seguido por um substrato que gera um produto colorido. O WB e o Imunoblot so de custo elevado e requerem interpretao subjetiva para estabelecer um diagnstico com base em um padro de
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reatividade definido pelo fabricante do conjunto diagnstico. O DDAHV define o padro mnimo aceitvel de interpretao do WB como reagente (presena de bandas), em pelo menos duas das seguintes protenas: p24; gp41; gp120/gp160. O IBR semelhante ao IB, porm utiliza a metodologia DPP (Plataforma de Migrao Dupla). Na fase slida esto presentes os antgenos recombinantes ou peptdeos sintticos dos vrus HIV-1 (p24, gp41, gp120 e gp160), incluindo o grupo O, e tambm a protena do HIV-2 (gp36). Ao contrrio do WB e IB, o IBR permite a deteco de anticorpos em menos de 30 minutos. A maioria desses ensaios detectam apenas IgG e por isso no so recomendados para confirmar a presena de anticorpos IgM HIV especficos (ensaios de terceira ou quarta gerao) ou a presena do antgeno p24 (ensaios de quarta gerao).
O DDAHV define o padro mnimo aceitvel de interpretao do WB como reagente quando detectada a presena de pelo menos duas das seguintes protenas: p24; gp41; gp120/gp160.
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Figura 12 - Reao de Western blot.

gp 160 gp 120 p 66 p 55 gp 41 p 31 P 24 gp 160 gp 120 p 66 p 55 gp 41 p 31 P 24
Incubao
Lavagem
p 17
p 17
gp 160 gp 120 p 66 p 55 gp 41 p 31 P 24
gp 160 gp 120 p 66 p 55 gp 41 p 31 P 24
Incubao
Lavagem
p 17
p 17
gp 160 gp 120 gp 160 gp 120 p 66 p 55 gp 41 p 31 P 24 P 24 p 66 p 55 gp 41 p 31
Presena de bandas representa reatividade dos anticorpos s protenas do HIV. Neste caso esto presentes anticorpos anti-gp160, anti-gp120, anti-gp41 e anti-p24.
p 17
p 17
Legenda
gp 160 gp 120 p 66 p 55 p 51 p 31 P 24
Anticorpo IgG Anti-HIV (AC) Presente na amostra do indivduo
Ac
p 17
Anticorpo IgG humana + enzima
Conjugado (Conj)
Substrato (S) Cromgeno + H2O2
Membrana de nitrocelulose com protenas do HIV
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4.4. Diagnstico por deteco direta do HIV

A infeco pelo HIV pode ser diagnosticada por meio da deteco direta de componentes do vrus (antgeno p24, RNA ou DNA prviral). A deteco do antgeno p24 do HIV-1 ou de RNA ou DNA desempenha um papel importante quando a deteco de anticorpos no possvel. So especialmente teis para o diagnstico em crianas com idade inferior a 18 meses e na infeco aguda em adultos. A deteco molecular de cido nucleico mais sensvel do que a deteco de p24. Dependendo da fase da infeco, o HIV pode ser encontrado principalmente como DNA pr-viral em clulas infectadas ou como RNA no sangue (como componente da partcula viral livre ou RNA intracelular). Existem testes comerciais que detectam o DNA (qualitativo) e/ ou RNA, quer qualitativamente ou quantitativamente. A deteco de infeco aguda por testes de amplificao de cidos nucleicos (NAT) principalmente utilizada na triagem de doadores de sangue, com o objetivo de aumentar a segurana do sangue e de hemoderivados. importante registrar que a maioria dos indivduos com infeco aguda apresentam Carga Viral elevada e, consequentemente, tm maior risco de transmitir a infeco aos seus parceiros. Outra aplicao importante para os testes moleculares o diagnstico precoce da infeco pelo HIV em crianas com exposio perinatal. Crianas nascidas de mes soropositivas adquirem anticorpos anti-HIV passivamente, e dessa forma ensaios baseados em anticorpos no podem ser utilizados para confirmar ou descartar a infeco pelo HIV (ver captulo 9).
4.5. Diagnstico utilizando amostras de sangue seco em papel filtro

As amostras de sangue seco em papel filtro (do ingls, dried blood spots, DBS) oferecem uma alternativa simples e fcil como amostra para sorologia e testes moleculares para HIV. Existem IE e WB que foram otimizados para utilizar DBS como amostra. O armazenamento e o transporte do DBS devem ser realizados conforme instrues de uso do conjunto diagnstico. As amostras coletadas em papel filtro devem ser testadas apenas com conjuntos diagnsticos que possuem registros vlidos na ANVISA para utilizao nesse tipo de amostra.
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5. SISTEMA DE ESTAGIAMENTO LABORATORIAL DA INFECO RECENTE PELO HIV: CLASSIFICAO DE FIEBIG

5.1. Estgios da infeco recente
Uma compreenso detalhada do tempo de curso da viremia e da soroconverso durante a infeco primria pelo HIV pr-requisito importante para entender e aperfeioar fluxogramas diagnsticos. Nesse sentido, Fiebig e colaboradores (2003) propuseram um sistema de estagiamento laboratorial da infeco recente pelo HIV-1 que inclui tambm projees da durao de cada estgio, com base no padro de reatividade de diferentes ensaios RNA viral, antgeno p24, IE de terceira gerao e Western blot. Uma primeira observao importante a de que a reatividade dos diferentes tipos de ensaios para a deteco da infeco pelo HIV progride sequencialmente e permite que a cada aparecimento de um marcador na circulao, seja atribudo um estgio infeco. Assim, cada um dos seis estgios definido por um padro nico de reatividade a um ou mais ensaios. Esse sistema classifica em detalhes as fases iniciais da infeco e facilita o entendimento de qual teste ou fluxograma mais indicado para fazer o diagnstico da infeco pelo HIV em diferentes situaes. Segue a descrio de cada um destes estgios ( Tabela 4): Tabela 4 Classificao de Fiebig para Estagiamento Laboratorial da Infeco pelo HIV. Marcador p24 Ag IE (3aG) + + + +/+ +/+ +/+ Durao em dias (IC 95%) Individual Cumulativo 10 (7-21) 10 7 (5-10) 17 5 (4-4) 22 3(2-5) 25 6 (4-8) 31 70 (40-122) 101 Sem limite de durao Sem limite de durao
Cohen et al. J. Infect. Dis. 2010, 202 (S2): S270-S277
Estgio 0 I II III IV V VI
RNA + + + + + +
WB Ind +(-p31c) +(+p31)
Estgio 0 (ou perodo de eclipse): caracterizado pela ausncia de marcadores virais em amostras de sangue. Esse perodo tem uma durao mdia de 10 dias, a partir da infeco at a primeira deteco de RNA viral; Estgio I: o RNA viral consistentemente detectvel em amostras de sangue e nenhum outro ensaio laboratorial positivo. A durao mdia desse estgio de 5 dias; Estgio II: os testes para RNA viral e antgeno p24 so positivos, mas os anticorpos esto ausentes (no reagente) no IE. A durao mdia desse estgio de 5,3 dias; Estgio III: RNA, antgeno p24 e IE de terceira gerao (sensveis deteco de IgM anti-HIV) so reagentes, mas o Western blot no mostra bandas especficas do HIV-1. Esse estgio o mais curto e tem durao mdia de 3,2 dias; Estgio IV: como o estgio III, mas com padro indeterminado no Western blot, ou seja, a presena de bandas especficas de HIV-1, mas que no preenchem os critrios de interpretao de WB positivo, que definido pela presena de duas de trs bandas seguintes: p24, gp41 ou gp120/160. A durao mdia de 5,6 dias; Estgio V: como o estgio IV, mas com padro positivo de Western blot, exceto pela ausncia de reatividade da protena p31 (pol). Esse estgio mais longo e o tempo mdio at o aparecimento da p31 de 69,5 dias; Estgio VI: como o estgio V, mas com o padro de reatividade do Western blot completo, incluindo a banda p31. A durao desse estgio no definida; no entanto, ele pode ser subdividido em dois perodos de infeco: recente e crnica. Essa subdiviso
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baseada em testes laboratoriais que exploram certas caractersticas dos anticorpos anti-HIV, como quantidade (concentrao), avidez e proporo. Dependendo do teste utilizado, a infeco recente tem durao de 120 a 180 dias aps a infeco. Os testes de quarta gerao e os TR no foram includos na classificao de Fiebig, mas estudos posteriores demonstraram que os testes de quarta gerao podem detectar amostras do estgio II ou III, dependendo do fabricante do teste. Da mesma forma, os TR de terceira gerao podem detectar amostras no estgio II, III ou IV, dependendo do fabricante do TR. Para os TR que utilizam fluido oral, no possvel determinar em que estgio da classificao de Fiebig eles se encaixam, pois no existem painis com amostras de FO de indivduos em soroconverso para esse tipo de avaliao. Figura 13 - Estgios da infeco recente pelo HIV-1. A anlise de amostras de indivduos recentemente infectados pelo HIV-1 revelou que as primeiras semanas aps a infeco podem ser divididas em estgios com base no padro de reatividade de diferentes ensaios laboratoriais.
Fase Eclipse Estgios de Fiebig V
RNA positivo (Teste Molecular) Antgeno p24 positivo (IE)
II
III
IV
VI
RNA viral no plasma (cpias por mL)
Anticorpo presente: IE de terceira gerao positivo e WB negativo
106 105 10
4
Anticorpo presente: WB Indeterminado Anticorpo presente: WB positivo, sem a presena da p31
Anticorpo presente: WB positivo, com a presena da p31
103 102 101
10
20
30
40
50
100
Seguimento em dias da transmisso do HIV
(Modificado de: MCMICHAEL, A.; BORROW, P.; TOMARAS, G. D. et al. The imune response during acute HIV-1 infection: clues for vaccine development. Nat. Rev., [S.l.], v. 10, p. 11-23, 2010).
5.2. Limitaes do modelo de Fiebig

Esse modelo fornece estimativas para perodos de janelas diagnsticas tendo como referncia testes habitualmente utilizados no diagnstico do HIV-1. Esse sistema de estagiamento tem aplicao direta para fins de diagnstico, especialmente na construo de fluxogramas para o diagnstico da infeco pelo HIV nas fases aguda, recente e crnica; porm, apresenta limitaes. A primeira limitao, inerente proposta de estagiamento laboratorial da infeco pelo HIV, a dependncia da atribuio de um determinado estgio sensibilidade do ensaio. Como a sensibilidade de qualquer categoria de ensaio depende do fabricante, possvel que os resultados de determinados ensaios classifiquem a infeco em estgios diferentes. A segunda limitao que os pacientes geralmente se apresentam para o diagnstico aps a soroconverso e a curta durao dos estgios I a IV limita seu uso. A terceira que, embora raros, existem indivduos nos quais a soroconverso tem curso prolongado, que pode durar entre trs e seis meses. Quarta; os dados desse modelo foram derivados de doadores de plasma que continuaram a se apresentar para a doao, e consequentemente podem representar um grupo de indivduos infectados sem sintomas agudos ou com sintomas mais brandos. Portanto, pacientes que apresentam sintomatologia mais pronunciada da sndrome retroviral podem ter nveis mais elevados de viremia e diferente ritmo de progresso da soroconverso, em comparao com os doadores de plasma.
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Finalmente, uma limitao dessa classificao deve-se utilizao, no estudo, de ensaios sorolgicos desenvolvidos unicamente com protenas do subtipo B do HIV-1. Devido s variaes de sequncias entre os diferentes subtipos do HIV-1, possvel que o reconhecimento de protenas do subtipo B por anticorpos de indivduos infectados por outro subtipo resulte em um estagiamento diferente. Com essas ressalvas, o sistema de estagiamento laboratorial proposto fornece um quadro de referncia para saber quanto tempo esperar at que os marcadores virais tornem-se positivos durante a infeco recente pelo HIV.
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6. FALHAS E ERROS NO DIAGNSTICO DA INFECO PELO HIV

O diagnstico da infeco pelo HIV suscetvel de falhas e erros. Com exceo do perodo de janela diagnstica, anteriormente discutido neste Manual, existem outras causas de falhas que podem excepcionalmente ocorrer quando se realiza o diagnstico da infeco pelo HIV. A primeira a ocorrncia de infeces causadas por cepas virais com variaes genticas que no so detectadas pelos testes em uso corrente. Citamos, como exemplo, as modificaes que foram feitas ao longo dos anos em testes sorolgicos para incluir antgenos do HIV-2 e do HIV-1 do grupo O (do ingls, outlier), que anteriormente no eram detectados pelos testes disponveis no mercado. O pronto reconhecimento dessas cepas pela comunidade cientfica e a rpida resposta dos fabricantes no desenvolvimento de novos testes mais sensveis e especficos so decisivos nesses momentos. A segunda causa a existncia de indivduos imunosilenciososG (do ingls, immunosilents) que possuem nveis baixos ou mesmo ausncia de anticorpos especficos e, dessa forma, no so detectados nos testes sorolgicos. Excetuando-se indivduos com outras causas de imunodeficincia, a ocorrncia desses casos muito rara, tornando esse tipo de falha desprezvel no contexto de sade coletiva. Outra exceo so os indivduos que cursam a infeco sem viremia, ou com viremia muito baixa, denominados de Controladores de Elite (do ingls, elite controllers) e, devido a isso, podem no ser detectados pelos testes moleculares. Esses indivduos, no entanto, possuem resposta imune humoral intacta e no oferecem risco de no serem detectados quando submetidos a testes sorolgicos. J os erros que ocorrem durante o processo de execuo dos testes laboratoriais e suas causas so de origem humana ou operacional. Estima-se que seja na fase pr-analtica que ocorram aproximadamente 60-70% dos erros laboratoriais. Assim sendo, a adoo de boas prticas laboratoriais contribui para minimizar tais erros, melhorando a qualidade da amostra a ser testada. Esses erros incluem a falta de calibrao ou de manuteno dos equipamentos, a troca de amostras e a utilizao de volumes (de amostra ou de reagentes) distintos do preconizado pelo fabricante do conjunto diagnstico. No ato da coleta, a utilizao de etiquetas com cdigo de barras para a identificao das amostras, o uso dos tubos primrios na testagem, a automao dos testes, a adoo de um programa de qualidade e/ou de boas prticas de laboratrio, assim como a participao sistemtica em programas de Avaliao Externa da Qualidade - AEQ, so fatores importantes na reduo do erro no processo de testagem.
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7. TECNOVIGILNCIA
A Tecnovigilncia, da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA, do Ministrio da Sade MS, tem por objetivo monitorar a segurana sanitria de produtos para sade ps-comercializao (equipamentos, materiais, artigos mdico-hospitalares, implantes e produtos para diagnstico de uso in-vitro). Consiste em um sistema de vigilncia de eventos adversos (EA) e queixas tcnicas (QT) de produtos para a sade na fase de ps-comercializao, e recomenda a adoo de medidas que garantam a proteo e a promoo da sade da populao. Considera-se EA aquele evento que causou dano sade de um usurio. Se, at o momento da notificao, o problema observado no produto ainda no tiver causado nenhum dano sade, este dever ser notificado como queixa tcnica (QT). O objetivo principal da Tecnovigilncia monitorar e, quando apropriado, verificar a segurana e o desempenho de produtos para a sade no perodo de ps-comercializao, com vistas a identificar eventos e desvios da qualidade que produzem ou potencialmente podem produzir resultados inesperados ou indesejveis, que afetam a segurana do paciente. Outro objetivo importante a coordenao nacional dessas atividades. As diversas competncias dessa rea da ANVISA/MS esto descritas pela Portaria n 593, de 25 de agosto de 2000, atualizada pela Portaria n 406, de 14 de outubro de 2005. Os EA e as QT de produtos para a sade, na fase de ps-comercializao, podem ser notificados Tecnovigilncia/ANVISA/MS pelo NOTIVISA. Trata-se de um sistema informatizado na plataforma web, previsto pela Portaria n 1.660, de 22 de julho de 2009, do Ministrio da Sade. Podem utilizar o NOTIVISA os profissionais de servios de sade, ANVISA, Vigilncias Sanitrias Estaduais e Municipais, Secretarias Estaduais e Municipais de Sade, Laboratrios de Sade Pblica, Universidades/Centros de Pesquisa, alm dos profissionais que atuam em drogarias e farmcias e em empresas detentoras de registro de produtos sob vigilncia sanitria (fabricantes, importadores e distribuidores) e os profissionais de sade liberais. Para acessar o Sistema, preciso se cadastrar de acordo com a categoria do notificante. Por exemplo, profissional liberal deve se cadastrar como Profissional de Sade, mas se for um profissional vinculado a alguma instituio/empresa, deve ser providenciado o cadastro institucional. Os cidados podero notificar EA e QT por meio dos formulrios prprios de notificao. O sistema tecnovigilncia da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA est disponvel em: http://www.anvisa.gov.br/ hotsite/notivisa/apresenta.htm e a notificao avulsa em: http://www.anvisa.gov.br/sistec/notificacaoavulsa/notificacaoavulsa1.asp
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8. FLUXOGRAMAS DE TESTAGEM PARA HIV

Desde o incio da epidemia do HIV, o diagnstico sorolgico da infeco realizado com pelo menos dois testes, um para triagem e um segundo, mais especfico, para confirmar o resultado da triagem. A combinao mais utilizada, habitualmente denominada de padro- ouroG, era realizada por meio de um IE de triagem seguido pelo Western blot (WB), como teste confirmatrio. Dois ou mais testes combinados, formando um fluxograma, tm o objetivo de aumentar o valor preditivo positivo (VPP)G de um resultado reagente no teste inicialG. Na maioria das situaes, o fluxograma mais comumente utilizado inclui o emprego de testes em srie ou sequenciais (fluxograma em srie). O resultado no reagente liberado com base em um nico teste - entretanto, caso persista a suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta da primeira amostra. O resultado reagente sempre confirmado com um segundo teste diferente. Com base na especificidade dos testes de triagem, dois resultados reagentes so utilizados para o diagnstico da infeco. importante ressaltar que todos os indivduos recm-diagnosticados devem realizar o exame de quantificao da Carga Viral - CV que, na realidade, compe um terceiro teste e cujo resultado ratifica a presena da infeco no indivduo. O fluxograma em srie lgico e custo-efetivo. O primeiro teste deve ser sempre o mais sensvel, seguido por um segundo teste mais especfico, a fim de eliminar resultados falso-positivos. No caso de resultados discordantes, os testes devem ser repetidos e, permanecendo a discordncia, o indivduo deve ser testado em uma data posterior - para confirmar ou descartar a soroconverso recente. Finalmente, importante selecionar a correta combinao de testes para garantir o diagnstico preciso. O constante aperfeioamento dos ensaios de laboratrio e a consequente elevao da sensibilidade dos testes de triagem fez com que os testes confirmatriosG anteriormente utilizados no sejam mais adequados para confirmar a infeco em um indivduo com infeco recente pelo HIV. Ainda cabe destacar o surgimento de ensaios que permitem a utilizao de outros fluidos corporais, como, por exemplo, o fluido oral, e que oferecem importante alternativa para a ampliao do diagnstico da infeco pelo HIV. Por outro lado, ao definirmos o fluxograma como um mtodo para resolver um problema utilizando um nmero definido de etapas, fica claro que mais de um fluxograma ser necessrio para cobrir todas as necessidades de triagem e confirmao da infeco pelo HIV nas diferentes configuraes de testes e perfis de pacientes que esse diagnstico requer. Apresentamos a seguir cinco (5) fluxogramas de testagem para HIV, considerando diversas situaes nas quais se faz necessria a realizao do diagnstico da infeco, e fornecemos explicaes para fundament-los.
Os fluxogramas de nmeros 1, 2 e 3 so os preferenciais por combinarem os testes mais modernos, os quais permitem agilizar o diagnstico da infeco, sendo tambm os que apresentam melhor custo-efetividade. Por esses motivos, o DDAHV os indica como sendo os de primeira escolha nas situaes em que est recomendada sua aplicao.
8.1. Estratgias para o diagnstico da infeco pelo HIV empregando Testes Rpidos
Em termos gerais, o teste rpidoG (TR) refere-se ao teste de HIV realizado em local que permite fornecer o resultado durante o perodo da visita do indivduo (consulta mdica, atendimento em Centro de Testagem e Aconselhamento - CTA, atendimento em domiclo, atendimento em unidade de testagem mvel, organizao no governamental etc.). Uma vez diagnosticado como portador da infeco pelo HIV, o indivduo deve ser encaminhado prontamente para atendimento em uma Unidade Bsica de Sade (UBS) do SUS ou para um Servio de Assistncia Especializada (SAE). importante ressaltar que a sensibilidade de um determinado fluxograma para o diagnstico da infeco pelo HIV igual sensibilidade do primeiro ensaio utilizado no fluxograma. Por isso, deve-se observar que nenhum dos fluxogramas que emprega TR melhora a sensibilidade do diagnstico da infeco pelo HIV, em comparao com os fluxogramas que utilizam testes convencionais
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equivalentes nas etapas Fiebig, e que cada estratgia ter a sensibilidade do primeiro teste utilizado no fluxograma. O emprego de fluxogramas com TR amplia o acesso ao diagnstico e permite a antecipao do incio do tratamento, preservando, dessa forma, o sistema imunolgico do indivduo infectado e reduzindo a transmisso, em concordncia com a estratgia TasP (do ingls, Treatment as Prevention), adotada como poltica nacional para o enfrentamento da epidemia pelo DDAHV.
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Fluxograma 1
Dois testes rpidos (TR1 e TR2) realizados em sequncia com amostras de sangue. Dois testes rpidos diferentes so usados sequencialmente, com amostras de sangue, com o objetivo de melhorar o valor preditivo positivo do fluxograma de testagem. A amostra de sangue pode ser obtida por puno da polpa digital ou por puno venosa em tubo contendo anticoagulante. Esse fluxograma indicado para ser aplicado nas situaes definidas no item 4.2.1 - Situaes e locais nas quais o Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais recomenda a utilizao de Testes Rpidos. Alm de sangue total, a maioria dos TR permite a utilizao de soro ou plasma como amostra para a realizao do teste. Leia atentamente as bulas/instrues/ guia de uso do produto, que acompanham todos os conjuntos diagnsticos, antes de selecionar a amostra a ser testada. Figura 14 - Fluxograma 1: TR1 + TR2: sequencial. TR-1 e TR-2 de fabricantes diferentes.
FLUXOGRAMA 1
Amostra (sangue)
Realizar Teste Rpido 1 (TR1)
Vlido? no Repetir Teste Rpido 1 (TR1)
sim
Resultado Reagente?
sim
Vlido?
sim
Resultado Reagente? no
sim
Amostra Reagente para HIV
no Amostra No Reagente para HIV
no Repetir Teste Rpido 2 (TR2)
Vlido?
sim
Primeira discordncia?
sim
no
Coletar uma amostra por puno venosa e encaminh-la para ser testada com um dos fluxogramas definidos para laboratrio.
no
Vlido?
sim
no
Utilizar um conjunto diagnstico do mesmo fabricante, preferencialmente de lote de fabricao diferente. Encaminhar o paciente para realizar o teste de Quantificao de Carga Viral (RNA HIV-1). Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra.
Legenda: Processo predefinido. Processo. Exige uma tomada de deciso. Finalizador.
Este fluxograma indicado para ser utilizado nas situaes descritas no item 4.2.1.
Fundamentao
No Fluxograma 1, dois testes rpidos so utilizados sequencialmente, ambos com amostras de sangue, com o objetivo de melhorar o valor preditivo positivo desse fluxograma. importante que o primeiro TR (TR1) tenha sensibilidade equivalente ou superior ao segundo teste (TR2). O objetivo dessa estratgia diferenciar os indivduos que esto infectados (ambos TR1 e TR2 reagentes) daqueles que provavelmente tiveram um resultado falso-reagente no teste de triagemG (TR1).
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Procedimento
A amostra com resultado no reagente no teste rpido 1 (TR1) ser definida como: Amostra No Reagente para HIV. Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta dessa amostra. A amostra com resultado reagente no TR1 dever ser submetida ao teste rpido 2 (TR2). A amostra com resultados reagentes no TR1 e no TR2 ter seu resultado definido como: Amostra Reagente para HIV. A amostra com resultados discordantes entre TR1 e TR2 no ter seu resultado definido. Nesse caso, devem-se repetir os dois testes; persistindo a discordncia dos resultados, uma amostra dever ser coletada por puno venosa e encaminhada para ser testada com um dos fluxogramas definidos para laboratrio. Um teste rpido s pode ter seu resultado interpretado se for considerado um teste vlido. Para o teste ser considerado vlido, necessria a presena visual de uma linha ou ponto na regio controle (C) do teste. Caso o resultado do TR1 ou do TR2 seja invlido, devese repetir o teste com o mesmo conjunto diagnstico, se possvel com um lote distinto do que foi utilizado inicialmente. Persistindo o resultado invlido, uma amostra dever ser coletada por puno venosa e encaminhada para ser testada com um dos fluxogramas definidos para laboratrio.
Desdobramentos do Fluxograma 1
O Fluxograma 1, com a utilizao de dois TR, permite um rpido diagnstico e imediato encaminhamento do indivduo para atendimento mdico, em uma nica visita ao servio de sade. Nessa ocasio, dever ser solicitado o teste de quantificao da Carga Viral do HIV (HIV-RNA). A Carga Viral, quando igual ou superior a 5.000 cpias/mL, confirma a infeco pelo HIV. Na eventualidade da Carga Viral ser inferior a 5.000 cpias/mL, deve-se considerar a ocorrncia de um duplo resultado falso-positivo (TR1 e TR2) e a no infeco do indivduo pelo HIV. Nessa situao, recomenda-se a realizao de um ensaio sorolgico complementar, como o Western blot, Imunoblot ou Imunoblot Rpido para esclarecer se se trata, de fato, de um resultado falso-positivo ou de um indivduo controlador de elite. Os TR realizados presencialmente no requerem a coleta de uma segunda amostra, ou seja, no necessria a coleta de uma nova amostra para confirmar o resultado.
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Fluxograma 2
Um teste rpido utilizando fluido oral (TR-FO) seguido por um teste rpido utilizando sangue (TR). Neste fluxograma, dois testes rpidos de fabricantes diferentes so utlilizados sequencialmente, o primeiro com amostra de fluido oral e o segundo com amostra de sangue, que pode ser obtida por puno da polpa digital ou por puno venosa, em tubo contendo anticoagulante. Este fluxograma deve ser preferencialmente utilizado fora de unidades de sade, em campanhas de testagem e em populaes de alta vulnerabilidade. As amostras de FO oferecem baixo risco biolgico. Figura 15 - Fluxograma 2: TR-FO + TR.
FLUXOGRAMA 2
Amostra (Fluido Oral - FO)
Vlido? no Repetir Teste Rpido 1 (TR1)
sim
Resultado Reagente?
sim
Amostra (Sangue)
Vlido?
sim
Resultado Reagente?
sim
no sim Amostra No Reagente para HIV
no Repetir Teste Rpido 2 (TR2)
no
Vlido?
Primeira discordncia?
sim
no Coletar uma amostra por puno venosa e encaminh-la para ser testada com um dos fluxogramas definidos para laboratrio. sim no Vlido?
no
Utilizar um conjunto diagnstico do mesmo fabricante, preferencialmente de lote de fabricao diferente. Encaminhar o paciente para realizar o teste de Quantificao de Carga Viral (RNA HIV-1). Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra.
Fundamentao
O Fluxograma 2 uma variao do Fluxograma 1 que permite a utilizao de uma amostra obtida de forma no invasiva, no qual o primeiro TR realizado em amostra de fluido oral e o segundo TR com uma amostra de sangue. Esse fluxograma foi idealizado para melhorar o valor preditivo positivo do TR que utiliza uma amostra de fluido oral. O objetivo dessa estratgia diferenciar os indivduos que esto infectados (ambos TR-FO e TR reagentes) daqueles que provavelmente tiveram um resultado falso-positivo no teste de triagem (TR-FO). Deve-se considerar que, dependendo do fabricante do TR-FO, a janela de soroconverso do teste pode chegar a trs (3) meses aps a infeco.
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Procedimento
A conduta para a coleta da amostra de fluido oral deve seguir rigorosamente as recomendaes do fabricante. A amostra com resultado no reagente no teste rpido utilizando fluido oral (TR-FO) ser definida como: Amostra No Reagente para HIV. Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta dessa amostra. A amostra com resultado reagente no TR-FO dever ser submetida ao teste rpido utilizando sangue (TR). A amostra com resultados reagentes no TR-FO e no TR ter seu resultado definido como: Amostra Reagente para HIV. Um teste rpido s pode ter seu resultado interpretado se for considerado um teste vlido. Para o teste ser considerado vlido necessria a presena de uma linha ou ponto na regio controle (C). Caso o resultado do TR1 ou do TR2 seja invlido, deve-se repetir o teste com o mesmo conjunto diagnstico, se possvel com um lote distinto do que foi utilizado inicialmente. Persistindo o resultado invlido, uma amostra dever ser coletada por puno venosa e encaminhada para ser testada com um dos fluxogramas definidos para laboratrio. A amostra com resultados discordantes entre TR-FO e TR no ter seu resultado definido. Ambos os testes devero ser repetidos. Persistindo a discordncia, uma amostra dever ser coletada por puno venosa e encaminhada para ser testada com um dos fluxogramas definidos para laboratrio.
Desdobramentos do Fluxograma 2
O Fluxograma 2, com a utilizao de dois TR, permite um rpido diagnstico e imediato encaminhamento do indivduo para atendimento mdico. Nessa ocasio, solicitada a quantificao da Carga Viral do HIV (HIV-RNA). A Carga Viral igual ou superior a 5.000 cpias/mL confirma a infeco pelo HIV. Na eventualidade de a Carga Viral ser inferior a 5.000 cpias/mL, deve-se considerar a ocorrncia de um duplo resultado falso-positivo (TR-FO e TR) e a no infeco do indivduo pelo HIV. Nessa situao, recomenda-se a realizao de um ensaio sorolgico complementar, como o Western Blot, Imunoblot ou Imunoblot Rpido para esclarecer se se trata, de fato, de um resultado falso-positivo ou de um indivduo controlador de elite. Os TR realizados presencialmente no requerem a coleta de uma segunda amostra, ou seja, no necessria a coleta de uma nova amostra para confirmar o resultado.
8.2. Propostas de estratgias de testagem em laboratrios

A testagem laboratorial utilizada para triagem e confirmao de amostras, assim como para a confirmao de amostras encaminhadas aps teste de triagem reagente ou com resultados discordantes nos Fluxogramas 1 e 2. Cada vez mais, os imunoensaios (IE) empregados estritamente em laboratrio (e alguns TR) detectam qualquer classe de anticorpos anti-HIV, incluindo IgM, o que melhora a sensibilidade analtica. Como discutido no item 5 - Sistema de estagiamento laboratorial da infeco recente pelo HIV: Classificao de Fiebig, na fase inicial da infeco estes IE apresentam maior sensibilidade do que os testes complementares do tipo Western Blot (WB), Imunoblot (IB) e Imunoblot Rpido (IBR). Alm disso, os IE de quarta gerao, que detectam simultaneamente antgeno e anticorpo, e os testes moleculares, de amplificao de cidos nucleicos (NAT), oferecem alternativas para a deteco cada vez mais precoce da infeco pelo HIV. Os fluxogramas propostos com testes utilizados em laboratrio incorporaram essas consideraes, e oferecem opes que podem ser selecionadas dependendo da capacidade do laboratrio e contexto clnico. Todos os IE utilizados devem possuir antgenos do HIV-1, incluindo o grupo O, e do HIV-2.
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Fluxograma 3
Triagem com Imunoensaio de 4 Gerao e Teste Molecular como Teste Complementar/Confirmatrio. O Fluxograma 3 utiliza um imunoensaio de 4 gerao (IE4G) como teste de triagem, e um teste molecularG como teste complementar para amostras reagentes na triagem. O IE deve possuir, alm de antgenos do HIV-1, tambm antgenos do HIV-1 grupo O e do HIV-2. O IE de triagem, apesar de ser de 4 gerao, menos sensvel do que o teste molecular confirmatrio. Portanto, amostras reagentes no teste de triagem e positivas no teste molecular representam infeco pelo HIV. No entanto, uma amostra reagente no IE de triagem, mas negativa no teste molecular, pode representar infeco pelo HIV-2 ou indicar infeco em um indivduo com Carga Viral abaixo do limite de detecoG. Esta ltima situao pode ocorrer tambm em indivduos em tratamento com antirretrovirais (ARV) ou em indivduos denominados controladores de elite. O diagnstico desses indivduos pode ser realizado com um teste sorolgico confirmatrio (WB/IB/IBR). O Fluxograma 3 o que permite o diagnstico mais precoce da infeco pelo HIV. Figura 16 - Fluxograma 3: IE4aG + Teste Molecular.
Amostra (soro ou plasma)
FLUXOGRAMA 3
Realizar IE 4G (T1)
Resultado Reagente?
no
Amostra No Reagente para HIV
sim Realizar Teste Molecular (T2)
Resultado 5.000 cpias/ml?
no
Realizar Teste WB ou IB ou IBR (T3)
sim
Resultado Reagente?
no
Resultado No Reagente?
no
Resultado Indeterminado
sim Amostra No Reagente para HIV
sim
Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra. Coletar uma segunda amostra para repetir IE 4G para concluir o resultado.
Legenda:
Processo predefinido.
Processo.
Exige uma tomada de deciso.
Finalizador.
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Fluxograma 3 Triagem IE4aG Confirmatrio TM Legenda:
0 xxx
I xxx
II
III
IV
VI
Estgio Fiebig em que o ensaio positivo Estgio Fiebig em que o ensaio no apresenta reatividade xxx Amostras que no sero submetidas aos testes complementares/confirmatrios
Fundamentao
O Fluxograma 3 utiliza um IE4G como teste de triagem e um teste molecular como teste complementar para amostras reagentes na triagem e, a exemplo do Fluxograma 4 a seguir, aumenta a chance de podermos realizar um diagnstico de infeco recente pelo HIV. O emprego de um IE de triagem seguido por um teste molecular evita o uso de testes complementares do tipo WB, IB e IBR e elimina resultados negativos ou indeterminados desses testes. A principal limitao do teste molecular a possibilidade de ocorrerem resultados falso-positivos, quando utilizados para fins diagnsticos, tendo em vista que a especificidade varia de acordo com o conjunto diagnstico utilizado. Em sua maioria, resultados falso-positivos tendem a apresentar resultados muito prximos ao limite de deteco do ensaio. Esse perfil requer a repetio do teste para afastar a possibilidade de ocorrncia de resultados falso-positivos. O DDAHV sugere cautela para essas situaes e recomenda que, para fins diagnsticos, os testes moleculares quantitativos que apresentarem nmero de cpias inferior a 5.000 cp/mL, uma nova amostra seja coletada para repetio do ensaio. Uma situao que merece especial ateno aquela em que ocorre um resultado falso-positivo no IE de triagem, tendo como consequncia natural um teste molecular negativo. Trata-se de um padro de resultados semelhante ao que pode ocorrer com indivduos controladores de elite. Resultados falso-positivos no IE tendem a apresentar uma relao DO/COG baixa, enquanto que indivduos controladores de elite apresentam uma resposta imune humoral normal e uma relao DO/CO alta.
Procedimento
A amostra com resultado no reagente no IE de 4 gerao (IE4G) ser definida como: Amostra No Reagente para HIV. O laudo dever ser liberado com a seguinte ressalva: Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra. A amostra com resultado reagente no IE4G dever ser submetida ao teste molecular. A amostra com resultados reagente no IE4G e detectvel (no caso da utilizao de ensaio qualitativo) ou com nmero de cpias igual ou superior a 5.000 cpias/mL (para fins diagnsticos no caso da utilizao de ensaio quantitativo) ter seu resultado definido como: Amostra Reagente para HIV. O laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Para comprovao do diagnstico laboratorial, uma segunda amostra dever ser coletada e submetida ao primeiro teste do Fluxograma 3 para o Diagnstico Laboratorial da Infeco pelo HIV em Indivduos com Idade acima de 18 meses. Esta segunda amostra dever ser colhida o mais rapidamente possvel e dever ser testada preferencialmente no mesmo local em que se realizaram os testes com a primeira amostra. responsabilidade do profissional de sade que atender o indivduo solicitar e identificar o pedido do exame como segunda amostra, e do laboratrio ou do servio de sade registr-la como tal para a finalizao do diagnstico laboratorial da infeco pelo HIV em indivduos com idade acima de 18 meses. Quando o resultado do teste com a segunda amostra for reagente, o resultado dever ser liberado como: Amostra Reagente para o HIV. O laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Resultado definido com a segunda amostra, conforme estabelecido pela Portaria no 29 de 17 de dezembro de 2013.
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A amostra com resultado inferior a 5.000 cpias/mL ou indetectvel no ensaio molecular no ter o seu resultado definido. Em caso de suspeita de infeco pelo HIV-1, a amostra dever ser submetida ao ensaio de Western Blot, Imunoblot ou Imunoblot Rpido. A amostra com resultado reagente no Western Blot, Imunoblot ou Imunoblot Rpido ter seu resultado definido como Amostra Reagente para HIV. O laudo laboratorial dever reportar o resultado de todas as bandas reativas encontradas nos testes Western Blot, Imunoblot e Imunoblot Rpido e incluir a seguinte ressalva: Para comprovao do diagnstico laboratorial, uma segunda amostra dever ser coletada e submetida ao primeiro teste do Fluxograma 3 para o Diagnstico Laboratorial da Infeco pelo HIV em Indivduos com Idade acima de 18 meses. Esta segunda amostra dever ser colhida o mais rapidamente possvel e dever ser testada preferencialmente no mesmo local em que se realizaram os testes com a primeira amostra. responsabilidade do profissional de sade que atender o indivduo solicitar e identificar o pedido do exame como segunda amostra, e do laboratrio ou do servio de sade registr-la como tal para a finalizao do diagnstico laboratorial da infeco pelo HIV em indivduos com idade acima de 18 meses. Quando o resultado do teste com a segunda amostra for reagente, o resultado dever ser liberado como: Amostra Reagente para o HIV. O laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Resultado definido com a segunda amostra, conforme estabelecido pela Portaria no 29 de 17 de dezembro de 2013 . A amostra com resultado negativo ou indeterminado no Western Blot ou Imunoblot ou Imunoblot Rpido ter seu resultado definido como Amostra Indeterminada para HIV. obrigatria a liberao desse resultado e o laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Persistindo a suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra. A nova amostra dever ser colhida e submetida novamente ao fluxograma, preferencialmente no mesmo local em que se realizou o teste com a primeira amostra. Caso o resultado com a nova amostra permanea indeterminado, deve-se considerar a possibilidade de infeco pelo HIV-2. Nesse caso, o DDAHV dever ser contatado para orientar quanto aos procedimentos para o envio da amostra ao Laboratrio de Referncia Nacional para HIV-2, com vistas confirmao da infeco.
Laudos
Alm das informaes citadas anteriormente, os laudos devem conter os resultados de todos os testes realizados e devero ser expressos o resultado numrico da amostra, o ponto de corte (cut-off) e a unidade de medio do mtodo utilizado, quando os resultados forem reagentes ou indeterminados, excetuando-se os resultados obtidos por testes cuja leitura visual. Os testes moleculares quantitativos devem conter o nmero de cpias/mL e a escala logartmica em base 10.
Consideraes para a utilizao do Fluxograma 3

Existem trs situaes nas quais esse fluxograma necessita que testes adicionais sejam realizados para a definio do diagnstico: 1o Em indivduos controladores de elite que desenvolvem anticorpos normalmente, mas podem apresentar Carga Viral inferior a 5.000 cpias/mL, levando a um resultado falso-negativo; 2o Embora os IE4G detectem anticorpos anti-HIV-2, alguns testes moleculares no so desenvolvidos para detectar o cido nucleico do HIV-2. Portanto, havendo suspeita de infeco pelo HIV-2, o DDAHV dever ser contatado para encaminhar a resoluo do diagnstico; 3o Em amostras que apresentarem resultado falso positivo no teste 1 - teste de triagem.
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Fluxograma 4
Triagem com Imunoensaio de 3 Gerao e Teste Molecular como Teste Complementar/Confirmatrio. O Fluxograma 4 utiliza um imunoensaio de 3 gerao (IE3G) como teste de triagem e oferece a opo de utilizar um teste molecular como teste complementar/confirmatrio para amostras reagentes na triagem. Os Fluxogramas 3 e 4 diferem na gerao do IE utilizado na etapa inicial. O IE deve possuir alm de antgenos do HIV-1, tambm antgenos do HIV-1 grupo O e do HIV-2. Nesse fluxograma, o IE de triagem menos sensvel do que o teste molecular. Portanto, amostras reagentes no teste de triagem e detectveis (qualitativo) ou com contagem igual ou superior a 5.000 cpias/mL (quantitativo) no teste molecular, representam infeco pelo HIV. No entanto, uma amostra reagente no IE de triagem, mas negativa no teste molecular, pode representar infeco pelo HIV-2 ou indicar infeco em um indivduo com Carga Viral abaixo do limite de deteco. Esta ltima situao pode ocorrer em indivduos em tratamento com ARV ou em indivduos denominados controladores de elite. Figura 17 - Fluxograma 4: IE3aG + Teste Molecular.
FLUXOGRAMA 4 versao Leo
Realizar IE 3G (T1)
Resultado Reagente?
no
sim Realizar Teste Molecular (T2)
Resultado 5.000 cpias/ml sim Amostra Reagente para HIV
no
Realizar Teste WB ou IB ou IBR (T3)
Resultado Reagente?
no
Resultado No Reagente?
no
Resultado Indeterminado
sim Amostra No Reagente para HIV
sim
Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra. Coletar segunda amostra e repetir o IE de 3G para concluir o resultado.
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Fluxograma 4 Triagem IE3aG Confirmatrio TM Legenda:
0 xxx
I xxx
II xxx
III
IV
VI
Estgio Fiebig em que o ensaio positivo Estgio Fiebig em que o ensaio no apresenta reatividade xxx Amostras que no sero submetidas aos testes complementares/confirmatrios
Fundamentao
Esse fluxograma apresenta a opo de utilizar um teste molecular como teste complementar/confirmatrio, e tambm um ensaio de triagem, que detecta anticorpos das classes IgM e IgG e inclui antgenos do HIV-2 e HIV-1 grupo O. Esse fluxograma representa um avano para os laboratrios que realizam em sua rotina testes moleculares qualitativos ou quantitativos para a deteco/monitoramento da infeco pelo HIV. A principal vantagem do teste molecular nesse fluxograma, em relao ao Fluxograma 5 a seguir, o potencial de eliminar resultados negativos ou indeterminados de testes complementares do tipo WB, IB e IBR. A principal limitao do teste molecular a possibilidade de ocorrncia de resultados falso-positivos, quando utilizados para fins diagnsticos, tendo em vista que a especificidade varia de acordo com o conjunto diagnstico utilizado. Em sua maioria, os resultados falso-positivos tendem a apresentar resultados muito prximos ao limite de deteco do ensaio. Esse perfil requer a repetio do teste para afastar a possibilidade de resultado falso-positivo. O DDAHV sugere cautela para essas situaes e recomenda que, para fins diagnsticos, com a utilizao de testes moleculares quantitativos com nmero de cpias inferior a 5.000 cp/mL uma nova amostra seja coletada para repetio do ensaio. Uma situao que merece especial ateno aquela em que ocorre um resultado falso-positivo no IE de triagem, tendo como consequncia natural um teste molecular negativo. Trata-se de um padro de resultados semelhantes ao que pode ocorrer com indivduos controladores de elite. Resultados falso-positivos no IE tendem a apresentar uma relao DO/CO baixa, enquanto que indivduos controladores de elite apresentam uma resposta imune humoral normal e uma relao DO/CO alta.
Procedimento
A amostra com resultado no reagente no IE de 3 gerao (IE3G) ser definida como: Amostra No Reagente para HIV. O laudo dever ser liberado com a seguinte ressalva: Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra. A amostra com resultado reagente no IE3G dever ser submetida ao Teste Molecular. A amostra com resultado reagente no IE3G e detectvel (no caso da utilizao de ensaio qualitativo) ou com nmero de cpias igual ou superior a 5.000 cpias/mL (para fins diagnsticos no caso da utilizao de ensaio quantitativo) ter seu resultado definido como: Amostra Reagente para HIV. O laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Para comprovao do diagnstico laboratorial, uma segunda amostra dever ser coletada e submetida ao primeiro teste do Fluxograma 4 para o Diagnstico Laboratorial da Infeco pelo HIV em Indivduos com Idade acima de 18 meses. Esta segunda amostra dever ser colhida o mais rapidamente possvel e dever ser testada preferencialmente no mesmo local em que se realizaram os testes com a primeira amostra. responsabilidade do profissional de sade que atender o indivduo solicitar e identificar o pedido do exame como segunda amostra, e do laboratrio ou do servio de sade registr-la como tal para a finalizao do diagnstico laboratorial da infeco pelo HIV em indivduos com idade acima de 18 meses. Quando o resultado do teste com a segunda amostra for reagente, o resultado dever ser liberado como: Amostra Reagente para o HIV. O laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Resultado definido com a segunda amostra, conforme estabelecido pela Portaria no 29 de 17 de dezembro de 2013.
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A amostra com resultado inferior a 5.000 cpias/mL ou indetectvel no ensaio molecular no ter o seu resultado definido. Em caso de suspeita de infeco pelo HIV-1, a amostra dever ser submetida ao ensaio de Western Blot, Imunoblot ou Imunoblot Rpido. A amostra com resultado reagente no Western Blot, Imunoblot ou Imunoblot Rpido ter seu resultado definido como Amostra Reagente para HIV. O laudo laboratorial dever reportar o resultado de todas as bandas reativas encontradas nos testes Western Blot, Imunoblot e Imunoblot Rpido e incluir a seguinte ressalva: Para comprovao do diagnstico laboratorial, uma segunda amostra dever ser coletada e submetida ao primeiro teste do Fluxograma 4 para o Diagnstico Laboratorial da Infeco pelo HIV em Indivduos com Idade acima de 18 meses. Esta segunda amostra dever ser colhida o mais rapidamente possvel, e dever ser testada, preferencialmente no mesmo local em que se realizaram os testes com a primeira amostra. responsabilidade do profissional de sade que atender o indivduo solicitar e identificar o pedido do exame como segunda amostra, e do laboratrio ou do servio de sade registr-la como tal para a finalizao do diagnstico laboratorial da infeco pelo HIV em indivduos com idade acima de 18 meses. Quando o resultado do teste com a segunda amostra for reagente, o resultado dever ser liberado como: Amostra Reagente para o HIV. O laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Resultado definido com a segunda amostra, conforme estabelecido pela Portaria no 29 de 17 de dezembro de 2013. A amostra com resultado negativo ou indeterminado no Western blot ou Imunoblot ou Imunoblot Rpido ter seu resultado definido como Amostra Indeterminada para HIV. obrigatria a liberao desse resultado e o laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Persistindo a suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada, 30 dias aps a data da coleta desta amostra. A nova amostra dever ser colhida e submetida novamente ao fluxograma, preferencialmente no mesmo local em que se realizou o teste com a primeira amostra. Caso o resultado com a nova amostra permanea indeterminado, deve-se considerar a possibilidade de infeco pelo HIV-2. Nesse caso, o DDAHV dever ser contatado para orientar quanto aos procedimentos para o envio da amostra ao Laboratrio de Referncia Nacional para HIV-2, com vistas confirmao da infeco.
Laudos
Consideraes para a utilizao do Fluxograma 4

Existem trs situaes nas quais esse fluxograma necessita que testes adicionais sejam realizados para a definio do diagnstico: 1o Em indivduos controladores de elite que desenvolvem anticorpos normalmente, mas podem apresentar Carga Viral indetectvel ou muito baixa, levando a um resultado falso-negativo; 2o Embora o IE3G detecte anticorpos anti-HIV-2, alguns testes moleculares no so desenvolvidos para detectar o cido nucleico do HIV-2. Portanto, havendo suspeita de infeco pelo HIV-2, o DDAHV dever ser contatado para encaminhar a resoluo do diagnstico; 3o Em amostras que apresentarem resultado falso positivo no teste 1 - teste de triagem.
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Fluxograma 5
Triagem com Imunoensaio de 3 Gerao e Western blot, Imunoblot ou Imunoblot Rpido como Teste Complementar/Confirmatrio. O Fluxograma 5 a representao do fluxograma convencional e atualmente no representa um avano no esforo de tornar o diagnstico do HIV mais precoce, preciso e com custo mais acessvel. O nico avano oferecido a indicao de que, quando possvel, seja realizado um teste molecular nas amostras que apresentarem resultado indeterminado ou discordante entre os testes. Esse fluxograma oferece a opo de utilizar um imunoensaio de 3 gerao como teste de triagem e um teste sorolgico complementar/confirmatrio do tipo WB/IB/IBR para amostras reativas na triagem. Cabe ressaltar que o IE de triagem mais sensvel do que os testes complementares (WB/IB/IBR). Figura 18 - Fluxograma 5: IE3aG + WB/IB/IBR. FLUXOGRAMA 5 - verso Leo
Realizar IE 3G (T1)
Resultado Reagente?
no
sim Realizar Teste WB ou IB ou IBR (T2)
Resultado Reagente?
no
Realizar Teste Molecular?
no
Amostra Indeterminada para HIV
sim Amostra Reagente para HIV
sim Resultado 5.000 cpias/ml? Amostra Indeterminada para HIV
no
sim
Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra. Emitir resultado indeterminado e coletar nova amostra aps 30 dias da data da coleta. Coletar segunda amostra e repetir o IE de 3G para concluir o resultado.
Legenda:
Processo predefinido.
Processo.
Exige uma tomada de deciso.
Finalizador.
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Fluxograma 5 Triagem Complementar Complementar Legenda:
Teste IE 3aG WB TM
0 xxx xxx
I xxx xxx
II xxx xxx
III
IV
VI
xxx
xxx
Estgio Fiebig em que o ensaio positivo Estgio Fiebig equivalente a WB indetermindado Estgio Fiebig em que o ensaio no apresenta reatividade xxx Amostras que no sero submetidas aos testes complementares/confirmatrios
Fundamentao
Diante dos avanos tecnolgicos, esse fluxograma apresenta limitaes, apesar de ter tido uma ampla utilizao. No entanto, se acrescido de um teste molecular para amostras negativas ou indeterminadas, torna o diagnstico mais precoce e preciso; porem, mais oneroso do que os fluxogramas anteriormente apresentados.
Procedimento
A amostra com resultado no reagente no IE de 3 gerao (IE3aG) ser definida como: Amostra No Reagente para HIV. O laudo dever ser liberado com a seguinte ressalva: Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra. A amostra com resultado reagente no IE3aG dever ser submetida ao Western Blot ou Imunoblot ou Imunoblot Rpido. A amostra com resultados reagentes no IE3aG e no WB/IB/IBR ter seu resultado definido como: Amostra Reagente para HIV. O laudo laboratorial dever reportar o resultado de todas as bandas reativas encontradas nos testes Western Blot, Imunoblot e Imunoblot Rpido e incluir a seguinte ressalva: Para comprovao do diagnstico laboratorial, uma segunda amostra dever ser coletada e submetida ao primeiro teste do Fluxograma 5 para o Diagnstico Laboratorial da Infeco pelo HIV em Indivduos com Idade acima de 18 meses. Esta segunda amostra dever ser colhida o mais rapidamente possvel, e dever ser testada, preferencialmente no mesmo local em que se realizaram os testes com a primeira amostra. Quando o resultado do teste com a segunda amostra for reagente, o resultado dever ser liberado como: Amostra Reagente para o HIV. O laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Resultado definido com a segunda amostra, conforme estabelecido pela Portaria no 29 de 17 de dezembro de 2013. No caso de ocorrer resultado indeterminado no IE3aG, deve-se solicitar uma nova amostra do pacienteG e reiniciar o fluxograma. Persistindo o resultado indeterminado com a nova amostra, deve-se considerar a possibilidade da utilizao de um fluxograma que inclua a realizao de testes moleculares (RNA e/ou DNA), para auxiliar na definio do diagnstico. Amostra com resultado reagente no IE3aG e resultado indeterminado ou no reagente no WB/IB/IBR ter seu resultado definido como Amostra Indeterminada para HIV. Deve-se considerar a possibilidade da utilizao de um fluxograma que inclua a realizao de testes moleculares (RNA e/ou DNA), para auxiliar na definio desse diagnstico. Caso o teste molecular no possa ser realizado, devese liberar o resultado e o laudo laboratorial dever incluir a seguinte ressalva: Persistindo a suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada, 30 dias aps a data da coleta desta amostra. O IBR um teste rpido, e como todo teste rpido somente pode ter seu resultado interpretado se for vlido. Isso significa presena de linha na janela de leitura do controle (C). Caso se opte pela utilizao desse teste e ocorrer resultado invlido, deve-se repetir o teste com o mesmo conjunto diagnstico, se possvel com um lote distinto do que foi utilizado inicialmente. Persistindo o resultado invlido, uma nova amostra dever ser coletada para esclarecer o diagnstico.
Laudos
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9. Estratgias para identificao precoce da infeco pelo HIV em crianas menores de 18 meses
A identificao precoce da criana infectada verticalmente essencial para o incio da terapia antirretroviral, para a profilaxia das infeces oportunistas e para o manejo das intercorrncias infecciosas e dos distrbios nutricionais. A passagem transplacentria de anticorpos maternos do tipo IgG anti-HIV, principalmente no terceiro trimestre de gestao, interfere no diagnstico sorolgico da infeco vertical. Os anticorpos maternos podem persistir at os 18 meses de idade. Portanto, mtodos que realizam a deteco de anticorpos no so recomendados para o diagnstico em crianas menores de 18 meses de idade, sendo necessria a realizao de testes moleculares, como a quantificao do RNA viral (Carga Viral), disponibilizada pela DDAHV do Ministrio da Sade. A Carga Viral, para fins diagnsticos em crianas com idade inferior a 18 meses deve ser realizada considerando as indicaes a seguir relacionadas: 1. A primeira Carga Viral deve ser colhida com quatro (4) semanas de vida ou preferencialmente seis (6) semanas, se a criana tiver recebido profilaxia antirretroviral; 2. Em recm-nascidos sintomticos, a Carga Viral pode ser colhida em qualquer momento; 3. Deve-se realizar, imediatamente, a primeira Carga Viral em crianas que foram amamentadas; 4. Em crianas cuja primeira amostra tenha sido colhida em idade superior a quatro meses, a segunda coleta pode ser realizada com intervalo mnimo de um ms; 5. Caso a Carga Viral tenha um resultado detectvel, esta deve ser repetida com nova amostra assim que possvel. Se a segunda Carga Viral tambm for detectvel, considera-se a criana como infectada pelo HIV; 6. Caso a primeira Carga Viral tenha um resultado indetectvel, esta dever ser repetida aps o 4 ms de vida. Se a segunda Carga Viral tambm for indetectvel, considera-se a criana no infectada; 7. Resultados positivos com Carga Viral abaixo de 5.000 cpias/mL devem ser cuidadosamente analisados, devido possibilidade de um resultado falso-positivo; 8. A documentao da sororeverso da criana no infectada pelo HIV deve ser realizada com uma sorologia para HIV no reagente aps 18 meses. A proporo de crianas que sororevertem em at 12 meses de idade de 95%, ficando a critrio mdico a solicitao de sorologia nessa idade; 9. Em raras situaes, crianas no infectadas pelo HIV podem apresentar anticorpos maternos residuais at 24 meses de vida (sororevertores tardios). Essas crianas geralmente apresentam o IE reagente, mas o teste confirmatrio (WB, IB ou IBR) indeterminado. Nessas situaes, deve-se repetir a sorologia at a obteno de resultado no reagente. Para o manejo clnico de crianas confirmadamente infectadas e esclarecimento de outras dvidas quanto ao diagnstico infantil, devese consultar o Protocolo Clnico e Diretrizes Teraputicas para Pediatria, disponvel em www.aids.gov.br
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10. SITUAES ESPECIAIS DO DIAGNSTICO DA INFECO PELO HIV

10.1. Recomendao para Diagnstico de Infeco Aguda pelo HIV-1
Essa recomendao est indicada para os casos nos quais o mdico suspeita de infeco aguda pelo HIV. Nessas situaes, a deteco da infeco pelo HIV, imediatamente aps o perodo de eclipse, pode fornecer informao importante por permitir a imediata instituio da terapia antirretroviral e, potencialmente, evitar a disseminao do HIV. Havendo suspeita clnica de infeco aguda pelo HIV, a amostra deve ser submetida a um IE de 4a gerao. Em caso de resultado reagente no IE4G, a amostra deve ser submetida ao Fluxograma 3. Em caso de amostra no reagente no IE4G, a amostra deve ser submetida a um teste molecular. Os seguintes resultados podem ocorrer: a) Em caso de resultado igual ou superior a 5.000 cpias/mL (ensaio quantitativo) ou detectvel (ensaio qualitativo), o resultado dever ser confirmado em uma nova amostra, a ser obtida 30 dias aps a data da coleta da primeira amostra. A nova amostra deve ser testada com um ensaio capaz de detectar anticorpos (IE, WB, IB ou IBR), seguindo-se as recomendaes dos Fluxogramas 3, 4 ou 5. importante o acompanhamento do paciente at que ocorra a soroconverso para concluir o diagnstico. b) Em caso de resultado inferior a 5.000 cpias/mL (ensaio quantitativo) ou indetectvel (ensaio qualitativo), a amostra ser definida como: Amostra No Reagente para HIV. O laudo dever ser liberado com a seguinte ressalva: Em caso de suspeita de infeco pelo HIV, uma nova amostra dever ser coletada 30 dias aps a data da coleta desta amostra.
10.2. Recomendaes para Diagnstico da Infeco pelo HIV-2

A testagem para HIV-2 deve ser considerada sempre nos casos em que um indivduo apresente suspeita epidemiolgica de risco pelo HIV-2, como: a) Parcerias sexuais de pases onde o HIV-2 endmico; b) Parcerias sexuais sabidamente infectadas pelo HIV-2; c) Transfuso de sangue ou injees com agulhas no estreis em pases onde o HIV-2 endmico; d) Compartilhamento de agulhas com indivduos de um pas onde o HIV-2 endmico ou com uma pessoa conhecida por estar infectada com HIV-2; e) Filhos de mulheres que tm fatores de risco para o HIV-2. Tambm se deve suspeitar de infeco pelo HIV-2 nos seguintes casos: a) Suspeita clnica de aids, na ausncia de um teste positivo para anticorpos anti-HIV-1, ou um WB para HIV-1 com os padres indeterminados incomuns, tais como gag p55, p24 ou p17, mais bandas da polimerase p66, p51 (transcriptase reversa) ou p31 (integrase); b) Pacientes com Carga Viral indetectvel com sintomatologia ou contagem de linfcitos T CD4+ decrescente; c) Teste sorolgico de triagem positivo e WB ou teste molecular negativo, sempre que houver um elo epidemiolgico com pases endmicos para HIV-2; d) Testes sorolgicos que indiquem reatividade para a protena gp36 ou gp105 do HIV-2. Em qualquer um desses casos de suspeita de infeco pelo HIV-2, o DDAHV dever ser contatado para encaminhar a resoluo do diagnstico.
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PARA O DIAGNSTICO

DA INFECO PELO HIV

MANUAL TCNICO PARA O DIAGNSTICO DA INFECO PELO HIV

Braslia, dezembro de 2013

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

Jarbas Barbosa da Silva Jnior Secretrio de Vigilncia em Sade

Fbio Mesquita Diretor do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

4.2. Testes Rpidos (TR)......................................................................................................................................25

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

MANUAL TCNICO PARA O DIAGNSTICO DA INFECO PELO HIV

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

p6 p9 p17 p24 *Genes regulatrios

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

PROTENAS MATRIZ p17

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

2.1. Classificao filogentica do HIV

2.2. Subtipos do HIV-1

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

B, B, F1, BF1 B, B, F1, BF1, C

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

3. INFECO E RESPOSTA IMUNE CONTRA O HIV

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

4. DIAGNSTICO DA INFECO PELO HIV

Concentrao dos marcadores no plasma

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

4.1. Imunoensaio de triagem

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

4.1.1. Primeira Gerao

Degradao do substrato Reao de cor: presena de anticorpos

Fonte: Adaptado de HIV Estratgias para Diagnstico no Brasil - Telelab/MS

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4.1.2. Segunda Gerao

4.1.3. Terceira Gerao

Degradao do substrato Reao de cor: presena de anticorpos

Fonte: Adaptado de HIV Estratgias para Diagnstico no Brasil - Telelab/MS

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

4.1.4. Quarta Gerao

Reao colorida indica a presena do antgeno ou do anticorpo

Conjugado (Conj) Anticorpo Anti-P24 + enzima

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

4.2. Testes Rpidos (TR)

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

Habilidades tcnicas Sem conhecimento requeridas laboratorial

4.3. Ensaios Complementares

Ministrio da Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

Manual Tcnico para o Diagnstico da Infeco pelo HIV

Figura 12 - Reao de Western blot.

gp 160 gp 120 gp 160 gp 120 p 66 p 55 gp 41 p 31 P 24 P 24 p 66 p 55 gp 41 p 31

Anticorpo IgG Anti-HIV (AC) Presente na amostra do indivduo

Anticorpo IgG humana + enzima

Substrato (S) Cromgeno + H2O2

Membrana de nitrocelulose com protenas do HIV

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4.4. Diagnstico por deteco direta do HIV

4.5. Diagnstico utilizando amostras de sangue seco em papel filtro

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5. SISTEMA DE ESTAGIAMENTO LABORATORIAL DA INFECO RECENTE PELO HIV: CLASSIFICAO DE FIEBIG