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I 1. Instrues gerais para laboratrio e testes para breve pesquisa 2. Solubilidade de compostos polares e inicos 3. Indicadores: acidez e basicidade 4. Curva de titulao dos cidos 5. Cromatografia em papel 6. Determinao do ponto isoeltrico da casena 7. Reaes de precipitao de protenas 8. Enzimologia 9. Caracterizao de uma enzima: Urease 10.Determinao de vitamina C em frutas frescas 11. Testes para caracterizao e identificao de carboidratos 12.Isolamento e caracterizao de um polissacardeo vegetal 13.Fermentao Alcolica 14.Caracterizao de lipdios
CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA
Diferena entre diluio A:B e mistura na proporo A:B Para descrever o procedimento de obteno de uma soluo de uma determinada concentrao a partir da diluio de uma soluo de concentrao maior, duas expresses comumente usadas so diluio A:B e mistura na proporo A:B. Ambas tm a mesma representao grfica (A:B), o que causa uma certa confuso, mas significado qumico diferente (veja abaixo). Por isso, deve-se prestar bastante ateno na palavra que antecede a notao A:B. * Diluio A:B - Pegar um volume A e adicionar o solvente para obter o volume final B - Volume final = B * Mistura A:B - Pegar um volume A e adicionar um volume B - Volume final = A + B Exemplo 6:
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INDICADORES verde de bromocresol azul de bromofenol fenolftalena alaranjado de metila Papel indicador
Experimento 2: UTILIZAO DE INDICADOR PARA MOSTRAR UMA VIRAGEM, USANDO SUBSTNCIA VOLTIL. -Em um tubo de ensaio grande coloque 5 ml de gua destilada e adicione 2 gotas de hidrxido de amnio e 5 gotas do indicador fenolftalena. Homogeneize a soluo. Com auxlio de uma pipeta coloque algumas gotas desta soluo sobre um papel ou um tecido branco, espere alguns minutos e observe o resultado.
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FUNDAMENTO TERICO: Curvas de titulao so grficos construdos pelas medidas de pH de uma soluo de cido, a qual adicionamos volumes conhecidos de uma soluo padro de base (geralmente o NaOH) de concentrao tambm conhecida.
INFORMAES OBTIDAS PELA CURVA: A cada adio de base, os ons hidroxila adicionados combinam-se com os prtons livres do cido produzindo gua e forando, desta forma, o cido a dissociar-se ainda mais para manter o seu prprio equilbrio. No ponto mdio da titulao, onde metade da base foi adicionada, exatamente metade do cido original sofreu dissociao, de forma que a concentrao de CH3COOH igual concentrao de CH3COO - . Este ponto corresponde ao pK do cido. Neste ponto mdio, o pH da soluo exatamente igual ao pK do cido titulado. Por volta deste ponto observa-se um achatamento da curva de titulao que corresponde ZONA TAMPO. Continuando a titulao por mais adio de base, o restante do cido totalmente convertido em CH3COO -. H+ CH3COO
CH3COOH TCNICA:
1. Pipetar rigorosamente 10 mL de cido actico 0,1 M num becker, adicionar gua destilada, e com cuidado, uma barra magntica. 2. Calibrar o potencimetro com soluo tampo de pH conhecido (pH 4,0 e pH 7,0). 3. Mergulhar o eletrodo de vidro na soluo com cuidado. Proceder a primeira leitura. 4. Titular com NaOH 0,1 M, anotando os valores de pH para cada mL de base adicionado. CONCLUSO DA AULA: 1. Fazer um grfico em papel milimetrado, tendo na ordenada os valores de pH e na abcissa, mL de NaOH adicionados 2. Determinar graficamente o valor de pK do cido actico e comparar com o seu pK terico.
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ASSUNTO: ENZIMOLOGIA
Fundamento Terico: Amilase salivar: a amilase salivar uma enzima que quebra as ligaes da molcula do amido. O amido um polissacardeo constitudo por vrias molculas de glicose unidas por ligaes 1-4 (frao linear) e ligaes 1-6 nos pontos de ramificao. A ao da amilase salivar libera a glicose, um acar redutor e fraes maiores da molcula do amido chamadas de dextrinas (onde h ramificaes da molculas: ligaes 1-6). Invertase: a invertase uma enzima que catalisa a hidrlise da molcula de sacarose. A sacarose um dissacardeo formado por D glicose e D frutose. Como ambas unidades de hexose esto unidas pelo grupo redutor, a sacarose um acar no redutor. A ao da invertase sobre a sacarose libera os monossacardeos constituintes, que so acares redutores. Preparo das solues: a.Amilase salivar: Coletar aproximadamente 3 mL de saliva e fazer uma diluio com soluo salina (NaCl 0,9%) na proporo de 1:10 (1 de saliva e 9 de soluo salina) b.Invertase: Misturar 50 g de levedura seca (fermento biolgico) com 150 mL de NaHCO3 0,1 M em um frasco de erlenmeyer de 1 litro. Fechar o frasco com algodo e coloc-lo em banho maria 40 a 45o C . Deixar a preparao autolisar 24 horas Centrifugar a 15.000 rpm. Decantar. Manter o sobrenadante em banho de gelo a 0 2o C durante todo o tempo de uso. c.Soluo de amido 1% : Pesar 1 g de amido e diluir em 100 mL de gua destilada. d.Soluo de sacarose 1%: Pesar 1 g de sacarose e diluir em 100 mL de gua destilada. 1. Especificidade Enzimtica: Hidrlise do Amido: Preparar 2 tubos de ensaio contendo cada um deles 2 ml de de amido 1% . Acrescentar ao primeiro tubo 2 mL de amilase salivar (TUBO TESTE A) e ao segundo(TUBO TESTE B), 2 mL de invertase. Incub-los a 37O C durante 15 minutos. Fazer as experincias para verificar a hidrlise do amido: Reao com lugol e teste de Benedict. Reao com lugol: Transferir 10 gotas do tubo A para tubo limpo e acrescentar 2 gotas de lugol. Observar. Teste de Benedict: Transferir 10 gotas do tubo A para tubo limpo e colocar 2,5 mL do reativo de Benedict. Aquecer em chama direta e observar.
sacarose 1% . Acrescentar 2 mL de invertase. Incubar a 37O C durante 15 minutos. Fazer o teste de Benedict.
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DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA
ASSUNTO: CARACTERIZAO DE UMA ENZIMA (UREASE) Fundamento Terico: A urease uma enzima que catalisa a hidrlise da uria em dixido de carbono e amnia. Reaes: H2N C=O CO2 + NH3 H2N
URIA
CIDO CARBNICO
H2CO3
2 NH4 OH
A atividade da enzima pode ser verificada pela formao do carbonato de amnio, que um sal de reao bsica e cuja presena pode ser revelada por meio de um indicador cido-bsico como o vermelho de fenol, por exemplo. A urease existe em algumas bactrias e plantas e pode ser extrada com facilidade da soja. I . EXTRAO: Pesar cerca de 15 g de farinha de soja e dissolver em 100 ml de gua destilada. Deixar agitando cerca de 30 minutos. Filtrar em algodo, desprezar o resduo. O filtrado contm a urease. Conservar em temperatura baixa.
II. CARACTERIZAO DA ENZIMA: Reativos: Soluo de urease, soluo de uria 1 %, soluo de tiouria 1% , soluo de vermelho de fenol, cido ntrico concentrado. 1. Reao de Heller: Esta reao baseia-se na precipitao de protenas por cido forte. Em um tubo de ensaio colocar: 5 gotas da soluo de urease, juntar 2mL de gua destilada. AGITAR. Manter o tubo inclinado e juntar pela parede do tubo 1 mL de cido ntrico concentrado, sem agitar, de modo que se formem duas fases. Observar se houve a formao de um anel branco na interfase. Concluir o resultado.
2. Teste de Atividade da Enzima : Neste teste utiliza-se o indicador vermelho de fenol, que passa da cor amarela em meio cido ou neutro, para cor vermelha em meio bsico. Tomar dois tubos de ensaio e marcar A e B. No tubo A colocar 3 mL da soluo de uria e 5 gotas de soluo de urease. No tubo B (prova em branco) colocar 3 mL da soluo de uria + 1 ml de gua destilada. A ambos os tubos adicionar 3 gotas da soluo de vermelho de fenol. Agitar e observar se ocorre mudana de cor nos prximos 5 minutos. Concluir o resultado.
3. Desnaturao da Enzima pelo CALOR : Em um tubo de ensaio colocar 5 gotas da soluo de urease, acrescentar 3 mL de gua destilada, agitar, ferver por 2 minutos em banho maria. Em outro tubo de ensaio colocar 3 mL da soluo de uria 1 %, adicionar 1 mL de urease fervida anteriormente e 1 gota de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 min. Observar se houve mudana de cor em relao ao teste 2.
4. Especificidade da Enzima : Tomar 2 tubos de ensaio e marcar 1 e 2 . No tubo 1 colocar 3 mL de soluo de uria e 5 gotas de urease. No tubo 2 juntar 3 mL de tiouria e 5 gotas de urease. A ambos adicionar 1 gota de soluo de vermelho de fenol. Agitar e observar se h mudana de cor nos prximos 5 minutos. A tiouria um composto com a seguinte estrutura: H2N C=S H2N
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DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA ASSUNTO: TESTES PARA CARACTERIZAO E IDENTIFICAO DE CARBOIDRATOS 1. Reao de Molish Tcnica: Tubo 1: Pipetar 2mL da soluo de glicose 1% Tubo 2: Pipetar 2 mL da soluo de sacarose 1% Tubo 3: Pipetar 2mL da soluo de amido 1% Tubo 4: Colocar no tubo de ensaio uma pequena poro de algodo (celulose). Aos 4 tubos de ensaio, adicionar 2 gotas do reativo de Molish. Misturar. Adicionar 2mL de H2SO4 concentrado, lentamente pela parede do tubo. Teste Positivo: Na interfase das solues aparecer um anel de colorao escura. 2. Reao de Seliwanoff Tcnica: Tubo 1: Pipetar 1 mL da soluo A (S Tubo 2: Pipetar 1 mL da soluo B Tubo 3: Pipetar 1 mL da soluo C Tubo 4: Pipetar 1 mL da soluo D Tubo 5: Pipetar 1 mL da soluo E Adicionar a cada tubo 5 mL do reativo de Seliwanoff. Colocar os tubos em um bequer contendo gua em ebulio, continuar aquecendo e observar o aparecimento de cor em cada tubo. Anotar o momento do aparecimento da cor nos tubos. 3. Reao de Benedict Tcnica: Tubo 1: Pipetar 2 mL da soluo A (B) Tubo 2: Pipetar 2 mL da soluo B Tubo 3: Pipetar 2 mL da soluo C Tubo 4: Pipetar 2 mL da soluo D Tubo 5: Pipetar 2 mL da soluo E a) Junte a cada tubo 2,5 mL do reativo de Benedict. Coloque os tubos em um bequer contendo gua em ebulio e continue aquecendo durante 3 minutos. Observe o que acontece e anote os resultados. b) Pipete em um tubo de ensaio 2 mL da soluo de sacarose a 4%, junte 2 gotas de HCl concentrado e aquea 2 minutos em banho de gua em ebulio. Deixe esfriar , junte 2 mL do reagente de Benedict e aquea novamente durante 5 minutos. Anote o resultado.
Explicao Terica: A) Reaes de Colorao em Meio cido: 1.REAO DE MOLISH Esta uma reao de identificao geral para carboidratos (mono, oligo ou polissacardeos). A ao desidratante do H2SO4 concentrado sobre as molculas dos monossacardeos, provoca a formao de FURFURAL (pentoses) e 5-HIDROXIMETIL FURFURAL (hexoses). Estes aldedos podem condensar com o alfa naftol formando um produto de condensao de cor escura (violeta). 2. REAO DE SELIWANOFF Esta reao utilizada para diferenciao entre aldoses e cetoses. As cetoses, por ao do HCl concentrado, originam um derivado furfrico que se condensa com o resorcinol produzindo um complexo de cor rosada. Com as aldoses, somente um aquecimento mais prolongado, que transforma parte da glicose em frutose, atravs de epimerizao, catalisada por HCl, pode simular um teste positivo. B) Reao de Reduo 3. REAO DE BENEDICT OU DE FEHLING As reaes de Benedict ou Fehling se baseiam na reduo de solues alcalinas de CuSO4 em presena de tartarato de sdio e potssio, com formao de um precipitado cor de tijolo de Cu2O. Reagentes: 1. Reativo de Molish: alfa naftol a 5% em etanol a 95%. 2. Reativo de Seliwanoff: 3,5 ml de resorcinol 0,5% + 12 ml de HCl conc. + 35 ml de gua destilada. 3. Reativo de Fehling: Composto por 2 solues: Soluo A : 138,6 g de CuSO. 5 H2O em H2O destilada (volume total: 2000 ml) Soluo B : 629 g de NaKC4H4O6 . 2H2O e 200 g de NaOH em H2O destilada (volume final: 2000 ml). Misture partes iguais das solues A e B imediatamente antes do uso.
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DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA ASSUNTO: ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE POLISSACARDEO VEGETAL I. MATERIAIS E REAGENTES: Uma batata de tamanho mdio , liquidificador, Becker de 100 ml, Gaze, papel de filtro, Microscpio, Lminas e lamnulas de vidro, Tubos de ensaio /pipetas, Soluo de lugol, Soluo de naoh 4%, hcl concentrado, Reativo de Benedict e Pipetas Pasteur II. ISOLAMENTO DO AMIDO DA BATATA: Homogeneizar uma batata de tamanho mdio com 100 mL de gua destilada, em liquidificador. Separe os resduos, espremendo a suspenso em gaze dobrada, coletndo o lquido em um becker. Suspenda o resduo em 50 mL de gua destilada e repita o processo. Deixe o amido depositar no fundo do becker durante 15 minutos. Decante o sobrenadante cuidadosamente. Retire uma pequena amostra do resduo para exame microscpico dos grnulos de amido.
III. CARACTERIZAO DO AMIDO: Exame Microscpico dos grnulos de amido: retire uma pequena amostra do amido com auxlio de uma pipeta Pasteur e deposite sobre uma lmina, coloque a lamnula e observe ao microscpio. Observe a forma e as estrias dos grnulos, faa um desenho. Repita o processo com uma outra lmina, s que antes de colocar a lamnula, coloque uma gota de lugol sobre a gota de amido. Observe. Preparao da soluo de amido: (Para todos os grupos) Ao resduo de amido, juntar lentamente, 250 mL de gua fervente. Resfrie e utilize na experincias seguintes. Pesquisa do Amido: a) Em um tubo de ensaio colocar 2 mL da soluo de amido e acrescentar 20 gotas da soluo de lugol. Colocar gua destilada, com auxlio de um piset, aproximadamente at o meio do tubo Observar e anotar a cor. b) Aquea o tubo da experincia anterior cuidadosamente (chama direta). Observe o resultado. Anote. c) Adicione ao tubo 5 gotas de NaOH 4%. Observe e anote o resultado. Coloque algumas gotas de HCl concentrado e observe novamente. Precipitao do Amido: Coloque em um tubo de ensaio 2 mL da soluo de amido, adicione 8 mL de etanol. Filtre. Aps o processo de filtrao, coloque uma gota de lugol no precipitado retido no papel filtro e outra gota de lugol no filtrado. Observe e anote resultado.
Hidrlise do amido: Em um erlenmeyer, adicionar 50 mL da soluo de amido e acrescentar 2 mL de HCl concentrado. Ferver durante 30 minutos em chama fraca, mantendo constante o nvel de soluo de amido (adicionando se necessrio, gua destilada quente na mesma). Acompanhe a hidrlise do amido, retirando a cada 5 minutos, uma gota da soluo, colocando-a sobre um azulejo e pingando sobre ela uma gota de lugol. Pesquisa do hidrolisado de amido: Em um tubo de ensaio, pipetar 2 mL do reativo de Benedict e acrescentar 10 gotas da soluo hidrolisada (experincia 5). Aquecer em chama direta. Explicar o resultado.
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DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA
Verificao da presena de CO2 Presena de precipitado branco no interior do tubo de ensaio com Ca(OH) 2 CO2 + Ca(OH)2 ------- CaCO3 + H2O Procedimento: Destilao do fermentado: 1) Filtrar o material fermentado com o auxlio de uma peneira 2) Transferir o material fermentado para um balo de fundo chato, com o auxlio de uma conexo de vidro acoplar o balo a um condensador 3) Iniciar o aquecimento recolhendo o material destilado na extremidade do condensador Procedimento: identificao da presena de lcool
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DISCIPLINA: BIOQUMICA I - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA
Aps adicionar os solventes, agitar e observar, anotando o resultado na tabela acima. 2. SAPONIFICAO DE TRIACILGLICERIS (Hidrlise Alcalina) a. Hidrlise Alcalina Tcnica: Em um tubo de ensaio colocar 15 gotas de leo vegetal, 2,5 mL de NaOH 40% (ou KOH 40%) e 2,5 mL de etanol. Aquecer em Banho Maria fervente durante aproximadamente 30 minutos, ou at obter uma soluo opalescente de sais de cido graxo (sabo). b. Propriedade dos Sabes Tcnica: Repartir o sabo formado em 4 tubos de ensaio acrescentar um pouco de gua destilada cada um deles e realizar os seguintes testes: B1) Abaixamento da tenso superficial: Agitar a soluo de sabo e verificar a formao de espuma. B2) Precipitao de cidos Graxos: No segundo tubo, adicionar gota a gota cido Actico Glacial, at notar o aparecimento de um precipitado branco de cidos graxos. B3) Precipitao de sabes de clcio: Ao terceiro tubo adicionar gotas de uma soluo de cloreto de clcio a 10% e observar a precipitao de sabes de clcio. B4)Precipitao por excesso de eletrlitos: Ao quarto tubo, adicionar soluo de NaCL saturada at ocorrer precipitao.