AULAS PRTICAS DE BIOQUMICA

I 1. Instrues gerais para laboratrio e testes para breve pesquisa 2. Solubilidade de compostos polares e inicos 3. Indicadores: acidez e basicidade 4. Curva de titulao dos cidos 5. Cromatografia em papel 6. Determinao do ponto isoeltrico da casena 7. Reaes de precipitao de protenas 8. Enzimologia 9. Caracterizao de uma enzima: Urease 10.Determinao de vitamina C em frutas frescas 11. Testes para caracterizao e identificao de carboidratos 12.Isolamento e caracterizao de um polissacardeo vegetal 13.Fermentao Alcolica 14.Caracterizao de lipdios

Docente: Profa. Dra. Lenita Brunetto Bruniera

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: INSTRUES GERAIS PARA LABORATRIO

O trabalho que se realiza em um curso prtico requer, ao lado de grande dedicao e interesse, muito cuidado e ateno. Para facilitar esse trabalho, daremos a seguir algumas instrues que, devidamente observadas, conduziro a melhores resultados. 1. Uma vez iniciada a explicao da professora, no ser mais permitida a entrada de alunos nas aulas prticas. 2. Vista o jaleco antes de entrar no laboratrio. Deixe seu material em local indicado,separe seu roteiro de aula prtica e no mximo seu estojo, procure rapidamente seu grupo de trabalho. 3. Quando a professora estiver explicando o assunto da aula, permanea em silncio para no se confundir durante a execuo das experincias. 4. As experincias devem ser estudadas antes de serem executadas. 5. No permitido fumar na aula prtica. 6. Deve-se trabalhar com quantidades indicadas das substncias. 7. Realize somente os experimentos indicados no roteiro. No permitido realizar aqueles no autorizados 8. Deve-se tomar o mximo cuidado para no contaminar os reagentes. Use sempre uma mesma pipeta para cada reagente. Evite trocas de rolhas. No troque os reagentes de uma mesa para outra. Leia 2 vezes o rtulo dos reagentes antes de uslos. 9. Cuidado ao aquecer o tubo de ensaio para que seu contedo no seja lanado fora. Terminado o uso do bico de bunsen, verifique se as torneiras do gs esto bem fechadas. No deixe lquidos inflamveis nas proximidades das chamas. 10. Todas as operaes onde houver desprendimento de gs devero ser executadas na CAPELA. 11. No leve o rosto diretamente sobre o frasco para verificar o odor das substncias. 12. No caso de acidente com substncias custicas, lave a parte atingida abundantemente com gua e comunique a professora. TCNICAS DE LABORATRIO OBJETIVOS: 1. Normas para uso do laboratrio 2. Apresentar os materiais comumente utilizados nos laboratrios de bioqumica. 3. Prtica de pipetagem, de titulao e testes para breve pesquisa. TCNICA: A) Em um tubo de ensaio pipetar 1 mL de soluo de nitrato de prata (AgNO3), acrescentar 1 mL de cloreto de potssio (KCl). Observar. Anotar o resultado. B) Em outro tubo de ensaio, pipetar 1 mL de soluo de iodeto de potssio (KI), acrescentar 1 mL de acetato de chumbo Pb(CH3COO)2. Observar. Anotar o resultado.

Principais vidrarias utilizadas no laboratrio de Bioqumica

Exemplos de utilizao de materiais no laboratrio

MEDIDA DO VOLUME DE SOLUES

Quando adicionamos solues aquosas em provetas, buretas e pipetas, observamos que: a superfcie de separao entre o lquido e o ar no plana, mas geralmente tem formato cncavo. Essa superfcie denominada menisco. O mesmo pode tambm ser observado na poro alongada de um balo volumtrico, quando completamos o volume da soluo. A leitura do volume em tais vidrarias deve ser realizada na parte inferior do menisco.

Diferena entre diluio A:B e mistura na proporo A:B Para descrever o procedimento de obteno de uma soluo de uma determinada concentrao a partir da diluio de uma soluo de concentrao maior, duas expresses comumente usadas so diluio A:B e mistura na proporo A:B. Ambas tm a mesma representao grfica (A:B), o que causa uma certa confuso, mas significado qumico diferente (veja abaixo). Por isso, deve-se prestar bastante ateno na palavra que antecede a notao A:B. * Diluio A:B - Pegar um volume A e adicionar o solvente para obter o volume final B - Volume final = B * Mistura A:B - Pegar um volume A e adicionar um volume B - Volume final = A + B Exemplo 6:

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: INDICADORES (ACIDEZ E BASICIDADE)

FUNDAMENTO TERICO: Os indicadores so cidos ou bases fracas que num pequeno intervalo de pH mudam de cor bruscamente. Devido sua natureza, necessrio adicion-lo em uma titulao em quantidades muito pequenas para que seus prprios ons H + ou OH - no interfiram no processo. MATERIAL NECESSRIO: Tubos de ensaio, pipetas de 1 e de 5 mL, gua destilada; 1. Reagentes: soluo de NaOH, HCl concentrado, NH4OH; 2. Indicadores: alaranjado de metila, verde de bromocresol, azul de bromofenol, fenolftalena, papel tornassol. PROCEDIMENTO: Experimento 1: ESTUDO DO COMPORTAMENTO DE ALGUNS INDICADORES EM RELAO AOS MEIOS CIDOS E BSICOS. Em um tubo de ensaio coloque 5 ml de gua destilada e 2 gotas de HCl. Homogeneize a soluo, identifique o tubo (CIDO); -Coloque 1,0 ml desta soluo em 4 tubos de ensaio diferentes. Identifique-os como A. Analogamente prepare uma soluo de NaOH ( 5ml de gua destilada em um tubo de ensaio e 2 gotas de NaOH). Agite e identifique o tubo (BASE); Coloque 1,0 ml desta soluo em 4 tubos de ensaio diferentes. Identifique-os como B. Em cada par de tubo de ensaio adicione indicadores diferentes (2 gotas de indicador em cada tubo). Anote as cores obtidas. CIDO BASE

INDICADORES verde de bromocresol azul de bromofenol fenolftalena alaranjado de metila Papel indicador

Experimento 2: UTILIZAO DE INDICADOR PARA MOSTRAR UMA VIRAGEM, USANDO SUBSTNCIA VOLTIL. -Em um tubo de ensaio grande coloque 5 ml de gua destilada e adicione 2 gotas de hidrxido de amnio e 5 gotas do indicador fenolftalena. Homogeneize a soluo. Com auxlio de uma pipeta coloque algumas gotas desta soluo sobre um papel ou um tecido branco, espere alguns minutos e observe o resultado.

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA- PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: CURVA DE TITULAO DOS CIDOS

FUNDAMENTO TERICO: Curvas de titulao so grficos construdos pelas medidas de pH de uma soluo de cido, a qual adicionamos volumes conhecidos de uma soluo padro de base (geralmente o NaOH) de concentrao tambm conhecida.

INFORMAES OBTIDAS PELA CURVA: A cada adio de base, os ons hidroxila adicionados combinam-se com os prtons livres do cido produzindo gua e forando, desta forma, o cido a dissociar-se ainda mais para manter o seu prprio equilbrio. No ponto mdio da titulao, onde metade da base foi adicionada, exatamente metade do cido original sofreu dissociao, de forma que a concentrao de CH3COOH igual concentrao de CH3COO - . Este ponto corresponde ao pK do cido. Neste ponto mdio, o pH da soluo exatamente igual ao pK do cido titulado. Por volta deste ponto observa-se um achatamento da curva de titulao que corresponde ZONA TAMPO. Continuando a titulao por mais adio de base, o restante do cido totalmente convertido em CH3COO -. H+ CH3COO

CH3COOH TCNICA:

1. Pipetar rigorosamente 10 mL de cido actico 0,1 M num becker, adicionar gua destilada, e com cuidado, uma barra magntica. 2. Calibrar o potencimetro com soluo tampo de pH conhecido (pH 4,0 e pH 7,0). 3. Mergulhar o eletrodo de vidro na soluo com cuidado. Proceder a primeira leitura. 4. Titular com NaOH 0,1 M, anotando os valores de pH para cada mL de base adicionado. CONCLUSO DA AULA: 1. Fazer um grfico em papel milimetrado, tendo na ordenada os valores de pH e na abcissa, mL de NaOH adicionados 2. Determinar graficamente o valor de pK do cido actico e comparar com o seu pK terico.

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: CROMATOGRAFIA EM PAPEL

OBJETIVO: 1. Apresentar uma tcnica analtica de separao de misturas 2. Demonstrar a cromatografia em papel e sua aplicabilidade na separao e identificao de aminocidos. MATERIAIS: Papel filtro, aplicadores, canetas ponta porosa, cuba de vidro, estufa a 80 / 90o C REATIVOS: Solvente: n-butanol / cido actico / gua Aminocidos: Alanina, cistena e histidina (0,1 M cada) Soluo reveladora: Ninhidrina FUNDAMENTO TERICO: A cromatografia um mtodo fsico de separao que se baseia na distribuio dos componentes de uma mistura em duas fases. Uma delas chamada FASE ESTACIONRIA, constituda por um material especial que pode ser slido ou lquido. A outra a FASE MVEL, que pode ser de natureza lquida ou gasosa e geralmente imiscvel com a fase estacionria. TCNICA: EXPERIMENTO 1 : Cromatografia para separao de pigmentos comerciais 1. Cortar o papel filtro de modo que atinja o solvente no fundo da cuba e tenha largura de 15 cm. 2. Marcar uma linha usando lpis aproximadamente 3 cm da borda inferior. Identificar tambm com lpis, os nomes dos componentes de seu grupo e sua turma , na parte superior do papel. 3. Aplicar de maneira equidistante, 4 cores diferentes de amostra no papel. 4. Colocar o papel na cuba. EXPERIMENTO 2: Cromatografia para separao de aminocidos 1. Cortar o papel filtro do mesmo tamanho daquele da experincia 1 2. Marcar uma linha usando lpis aproximadamente 3 cm da borda inferior. Marcar onde sero aplicadas as amostras de modo que fiquem com distncias semelhantes entre elas. Identificar tambm com lpis, os nomes dos componentes de seu grupo e sua turma , na parte superior do papel. 3. Aplicar uma alquota de cada amostra no local marcado. 4. Colocar o papel na cuba. 5. Interromper a corrida quando o solvente estiver a 1 cm da borda superior. Retirar o papel da cuba e marcar com lpis a linha de front do solvente 6. Levar estufa para secar por alguns minutos, esborrifar a soluo reveladora e levar estufa novamente 7. Calcular o Rf de cada aminocido utilizado Rf = distncia (em cm) percorrida pela amostra distncia (em cm) percorrida pelo solvente

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: DETERMINAO DO PONTO ISOELTRICO DA CASENA

A casena uma protena do leite que apresenta ponto isoeltrico no pH 4,7. Em meio cido a molcula proteica tende a aumentar o nmero de cargas positivas, e em meio alcalino, o de cargas negativas. Tanto em pH cido como em pH alcalino a solubilidade das protenas mxima porque molculas carregadas positivamente (meio cido) e negativamente (meio alcalino) repelem-se entre si aumentando a interao com o solvente. H um pH intermedirio que varia de protena para protena (pois depende dos radicais R dos aminocidos) em que h um equilbrio entre as cargas positivas e negativas. Este pH o ponto isoeltrico da protenas. Neste pH a protena apresenta uma solubilidade mnima, porque a carga lquida sendo nula fica diminuida a repulso entre as molculas, que se associam e precipitam. MATERIAL E REAGENTES . 9 tubos de ensaio . 3 pipetas de 1mL, 1 pipeta de 2mL, duas de 5 mL e duas de 10mL . gua destilada para cada grupo . cido actico 1 N ; 0,1 N e 0,01 N (em beckeres pequenos nas bancadas ) . Soluo de casena ( casena 0,5 g% em acetato de sdio 0,1 N) OBS.: a soluo de casena deve ser preparada no dia e filtrada para que fique completamente lmpida. TCNICA Numere os tubos de ensaio de 1 a 9. Pipete a gua destilada e o cido actico nas diferentes concentraes de acordo com a tabela abaixo Aps pipetar a gua destilada e o cido actico, pipetar em cada tubo 1 mL de soluo de casena. Agitar os tubos imediatamente Anotar a turbidez e a precipitao logo aps a agitao e, depois de 15 minutos, na escala de pH abaixo. tubos 1 H2O 8,3 destilada c. actico 0,6 0,01 N c. Actico ____ 0,1 N c. Actico 1N pH Observao (tempo 0) (tempo 15 min) ___ 2 7,7 1,2 ____ ___ 3 8,7 ___ 0,2 ___ 4 8,5 ___ 0,5 ___ 5 8,0 ___ 1,0 ___ 6 7,0 ___ 2,0 ___ 7 5,0 ___ 4,0 ___ 8 1,0 ___ 8,0 ___ 9 7,4 ___ ___ 1,6

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: REAES DE PRECIPITAO DE PROTENAS

OBJETIVO: Verificar a influncia de sais, cidos e solventes orgnicos sobre solues de protenas. FUNDAMENTO TERICO: A maioria das protenas podem ser precipitadas de suas solues por adio de certos cidos como o cido tricloroactico, cido ntrico, etc, que formam sais de cidos insolveis com as formas catinicas das protenas. Quando adicionamos sais uma combinao e formao de precipitados insolveis com as formas aninicas das protenas. Os solventes orgnicos (etanol, acetona) pela sua ao desidratante, possuem propriedades de precipitar as protenas. Quando submetidas a diversos agentes (calor, cidos ou bases fortes, metais pesados, etanol) perdem a sua estrutura secundria e terciria, irreversivelmente precipitando-se. TCNICA Preparar 5 tubos de ensaio e pipetar em cada um deles 1mL de soluo de protenas (clara de ovo diluda). Adicionar ao 1tubo 1mL de soluo de cido tricloroactico 10%. Ao 2 tubo 1mL de HNO3 concentrado, lentamente pela parede do tubo Ao 3 tubo 1mL de HgCl2 5% Ao 4 tubo 1mL da soluo de AgNO3. Ao 5 tubo colocar lcool (etanol) at a formao de um precipitado. PRECIPITAO REVERSVEL DE PROTENAS A. SALTING IN: a solubilidade de protenas pela adio de um sal de fora inica baixa. TCNICA: Em um becker, pipetar 3mL de clara de ovo. Adicionar 10mL de gua destilada e agitar com basto de vidro at o aparecimento de um precipitado de globulinas. Em seguida, juntar a soluo de NaCl 1N at a redissoluo do precipitado. B. SALTING OUT: a precipitao reversvel de protenas pelo aumento da fora inica. TCNICA: Da soluo de clara obtida anteriormente (salting in), pipetar 3mL em um tubo de ensaio. Adicionar, em seguida, 3mL da soluo saturada de sulfato de amnio e observar a formao de precipitado. Juntar um pouco de gua destilada a fim de redissolver o precipitado de protenas.

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: ENZIMOLOGIA
Fundamento Terico: Amilase salivar: a amilase salivar uma enzima que quebra as ligaes da molcula do amido. O amido um polissacardeo constitudo por vrias molculas de glicose unidas por ligaes 1-4 (frao linear) e ligaes 1-6 nos pontos de ramificao. A ao da amilase salivar libera a glicose, um acar redutor e fraes maiores da molcula do amido chamadas de dextrinas (onde h ramificaes da molculas: ligaes 1-6). Invertase: a invertase uma enzima que catalisa a hidrlise da molcula de sacarose. A sacarose um dissacardeo formado por D glicose e D frutose. Como ambas unidades de hexose esto unidas pelo grupo redutor, a sacarose um acar no redutor. A ao da invertase sobre a sacarose libera os monossacardeos constituintes, que so acares redutores. Preparo das solues: a.Amilase salivar: Coletar aproximadamente 3 mL de saliva e fazer uma diluio com soluo salina (NaCl 0,9%) na proporo de 1:10 (1 de saliva e 9 de soluo salina) b.Invertase: Misturar 50 g de levedura seca (fermento biolgico) com 150 mL de NaHCO3 0,1 M em um frasco de erlenmeyer de 1 litro. Fechar o frasco com algodo e coloc-lo em banho maria 40 a 45o C . Deixar a preparao autolisar 24 horas Centrifugar a 15.000 rpm. Decantar. Manter o sobrenadante em banho de gelo a 0 2o C durante todo o tempo de uso. c.Soluo de amido 1% : Pesar 1 g de amido e diluir em 100 mL de gua destilada. d.Soluo de sacarose 1%: Pesar 1 g de sacarose e diluir em 100 mL de gua destilada. 1. Especificidade Enzimtica: Hidrlise do Amido: Preparar 2 tubos de ensaio contendo cada um deles 2 ml de de amido 1% . Acrescentar ao primeiro tubo 2 mL de amilase salivar (TUBO TESTE A) e ao segundo(TUBO TESTE B), 2 mL de invertase. Incub-los a 37O C durante 15 minutos. Fazer as experincias para verificar a hidrlise do amido: Reao com lugol e teste de Benedict. Reao com lugol: Transferir 10 gotas do tubo A para tubo limpo e acrescentar 2 gotas de lugol. Observar. Teste de Benedict: Transferir 10 gotas do tubo A para tubo limpo e colocar 2,5 mL do reativo de Benedict. Aquecer em chama direta e observar.

Hidrlise da Sacarose: Preparar 1 tubo de ensaio contendo cada um deles 2 ml de de

sacarose 1% . Acrescentar 2 mL de invertase. Incubar a 37O C durante 15 minutos. Fazer o teste de Benedict.

Com os resultados obtidos, discutir a especificidade enzimtica.

2. Desnaturao Enzimtica: Colocar em um tubo de ensaio 2,5 ml de amilase salivar fervida por 1 0 minutos e resfriada. Acrescentar ao tubo 5 mL de soluo de amido, incubar 37o C por 10 minutos. Fazer os testes (tubos A e B). Tubo A: Retirar 2ml de soluo e transferir para tubo limpo. Fazer teste de lugol Tubo B: Retirar 2ml de soluo e transferir para tubo limpo. Fazer teste de Benedict Comparar os resultados e explicar

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: CARACTERIZAO DE UMA ENZIMA (UREASE) Fundamento Terico: A urease uma enzima que catalisa a hidrlise da uria em dixido de carbono e amnia. Reaes: H2N C=O CO2 + NH3 H2N
URIA

Em meio aquoso: CO2 + H2O H2CO3 2 NH3 + H2O 2 NH4 OH

HIDRXIDO DE AMNIO

CIDO CARBNICO

H2CO3

2 NH4 OH

(NH4) 2CO3 + 2 H2O

CARBONATO DE AM (SAL DE REAO BSICA)

A atividade da enzima pode ser verificada pela formao do carbonato de amnio, que um sal de reao bsica e cuja presena pode ser revelada por meio de um indicador cido-bsico como o vermelho de fenol, por exemplo. A urease existe em algumas bactrias e plantas e pode ser extrada com facilidade da soja. I . EXTRAO: Pesar cerca de 15 g de farinha de soja e dissolver em 100 ml de gua destilada. Deixar agitando cerca de 30 minutos. Filtrar em algodo, desprezar o resduo. O filtrado contm a urease. Conservar em temperatura baixa.

II. CARACTERIZAO DA ENZIMA: Reativos: Soluo de urease, soluo de uria 1 %, soluo de tiouria 1% , soluo de vermelho de fenol, cido ntrico concentrado. 1. Reao de Heller: Esta reao baseia-se na precipitao de protenas por cido forte. Em um tubo de ensaio colocar: 5 gotas da soluo de urease, juntar 2mL de gua destilada. AGITAR. Manter o tubo inclinado e juntar pela parede do tubo 1 mL de cido ntrico concentrado, sem agitar, de modo que se formem duas fases. Observar se houve a formao de um anel branco na interfase. Concluir o resultado.

2. Teste de Atividade da Enzima : Neste teste utiliza-se o indicador vermelho de fenol, que passa da cor amarela em meio cido ou neutro, para cor vermelha em meio bsico. Tomar dois tubos de ensaio e marcar A e B. No tubo A colocar 3 mL da soluo de uria e 5 gotas de soluo de urease. No tubo B (prova em branco) colocar 3 mL da soluo de uria + 1 ml de gua destilada. A ambos os tubos adicionar 3 gotas da soluo de vermelho de fenol. Agitar e observar se ocorre mudana de cor nos prximos 5 minutos. Concluir o resultado.

3. Desnaturao da Enzima pelo CALOR : Em um tubo de ensaio colocar 5 gotas da soluo de urease, acrescentar 3 mL de gua destilada, agitar, ferver por 2 minutos em banho maria. Em outro tubo de ensaio colocar 3 mL da soluo de uria 1 %, adicionar 1 mL de urease fervida anteriormente e 1 gota de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 min. Observar se houve mudana de cor em relao ao teste 2.

4. Especificidade da Enzima : Tomar 2 tubos de ensaio e marcar 1 e 2 . No tubo 1 colocar 3 mL de soluo de uria e 5 gotas de urease. No tubo 2 juntar 3 mL de tiouria e 5 gotas de urease. A ambos adicionar 1 gota de soluo de vermelho de fenol. Agitar e observar se h mudana de cor nos prximos 5 minutos. A tiouria um composto com a seguinte estrutura: H2N C=S H2N

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: DETERMINAO DE VITAMINA C EM SUCOS DE FRUTAS

PRINCPIO: O cido ascrbico reduz o corante 2,6 diclorofenolindofenol sua forma incolor. No ponto final da titulao o excesso de corante tem colorao rsea em soluo cida. A vitamina C deve ser extrada (quando necessrio) e titulada em soluo de cido oxlico 1% para manter o pH adequado `a reao e evitar a autoxidao da vitamina C. MATERIAL: Erlenmeyer de 125 mL, pipetas volumtricas de 2,5 e 10 mL, balo volumtrico de 100, 200 e 500 mL, bureta de 25 ou 50 mL, provetra de 50 mL, faca, peneira, becker de 500 ml. REAGENTES: a) Soluo de cido oxlico 1%: Preparar 1000 ml da soluo com cido oxlico.2H20 e guardar em frasco ambar. b) Soluo padro de cido ascrbico - 1 mg/ml : Pesar exatamente 100 mg de cido ascrbico e diluir para 100 mL em balo volumtrico com soluo de cido oxlico 1% imediatamente antes do ensaio. Pode ser 50 mg (0,05 g) para 50 mL. c) Soluo Titulante de 2,6 diclorofenol-indofenol.: Pesar 100 mg de 2,6 diclorofenol-indofenol sdico e 100 mg de NaHCO3 e transferir para balo volumtrico de 200 ml. Completar o volume com gua. PROCEDIMENTO: a) Amostras lquidas (sucos de frutas, polpas e nectares) Pesar 10 g de polpa ou pipetar 10 mL de suco, transferir para balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com soluo de cido oxlico 1%. b) Determinao Fazer uma tomada de amostra de 10 mL da soluo diluda (balo) e titular com soluo de 2,6 diclorofenol-indofenol at aparecimento da cor rsea. c) Titulao do padro Transferir 2 ml da soluo padro de cido ascrbico para um erlenmeyer de 125 ml, acrescentar 5 ml da soluo de cido oxlico 1 % e titular rapidamente com soluo de 2,6 diclorofenol-indofenol at aparecimento da cor rsea.

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA ASSUNTO: TESTES PARA CARACTERIZAO E IDENTIFICAO DE CARBOIDRATOS 1. Reao de Molish Tcnica: Tubo 1: Pipetar 2mL da soluo de glicose 1% Tubo 2: Pipetar 2 mL da soluo de sacarose 1% Tubo 3: Pipetar 2mL da soluo de amido 1% Tubo 4: Colocar no tubo de ensaio uma pequena poro de algodo (celulose). Aos 4 tubos de ensaio, adicionar 2 gotas do reativo de Molish. Misturar. Adicionar 2mL de H2SO4 concentrado, lentamente pela parede do tubo. Teste Positivo: Na interfase das solues aparecer um anel de colorao escura. 2. Reao de Seliwanoff Tcnica: Tubo 1: Pipetar 1 mL da soluo A (S Tubo 2: Pipetar 1 mL da soluo B Tubo 3: Pipetar 1 mL da soluo C Tubo 4: Pipetar 1 mL da soluo D Tubo 5: Pipetar 1 mL da soluo E Adicionar a cada tubo 5 mL do reativo de Seliwanoff. Colocar os tubos em um bequer contendo gua em ebulio, continuar aquecendo e observar o aparecimento de cor em cada tubo. Anotar o momento do aparecimento da cor nos tubos. 3. Reao de Benedict Tcnica: Tubo 1: Pipetar 2 mL da soluo A (B) Tubo 2: Pipetar 2 mL da soluo B Tubo 3: Pipetar 2 mL da soluo C Tubo 4: Pipetar 2 mL da soluo D Tubo 5: Pipetar 2 mL da soluo E a) Junte a cada tubo 2,5 mL do reativo de Benedict. Coloque os tubos em um bequer contendo gua em ebulio e continue aquecendo durante 3 minutos. Observe o que acontece e anote os resultados. b) Pipete em um tubo de ensaio 2 mL da soluo de sacarose a 4%, junte 2 gotas de HCl concentrado e aquea 2 minutos em banho de gua em ebulio. Deixe esfriar , junte 2 mL do reagente de Benedict e aquea novamente durante 5 minutos. Anote o resultado.

Explicao Terica: A) Reaes de Colorao em Meio cido: 1.REAO DE MOLISH Esta uma reao de identificao geral para carboidratos (mono, oligo ou polissacardeos). A ao desidratante do H2SO4 concentrado sobre as molculas dos monossacardeos, provoca a formao de FURFURAL (pentoses) e 5-HIDROXIMETIL FURFURAL (hexoses). Estes aldedos podem condensar com o alfa naftol formando um produto de condensao de cor escura (violeta). 2. REAO DE SELIWANOFF Esta reao utilizada para diferenciao entre aldoses e cetoses. As cetoses, por ao do HCl concentrado, originam um derivado furfrico que se condensa com o resorcinol produzindo um complexo de cor rosada. Com as aldoses, somente um aquecimento mais prolongado, que transforma parte da glicose em frutose, atravs de epimerizao, catalisada por HCl, pode simular um teste positivo. B) Reao de Reduo 3. REAO DE BENEDICT OU DE FEHLING As reaes de Benedict ou Fehling se baseiam na reduo de solues alcalinas de CuSO4 em presena de tartarato de sdio e potssio, com formao de um precipitado cor de tijolo de Cu2O. Reagentes: 1. Reativo de Molish: alfa naftol a 5% em etanol a 95%. 2. Reativo de Seliwanoff: 3,5 ml de resorcinol 0,5% + 12 ml de HCl conc. + 35 ml de gua destilada. 3. Reativo de Fehling: Composto por 2 solues: Soluo A : 138,6 g de CuSO. 5 H2O em H2O destilada (volume total: 2000 ml) Soluo B : 629 g de NaKC4H4O6 . 2H2O e 200 g de NaOH em H2O destilada (volume final: 2000 ml). Misture partes iguais das solues A e B imediatamente antes do uso.

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA ASSUNTO: ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE POLISSACARDEO VEGETAL I. MATERIAIS E REAGENTES: Uma batata de tamanho mdio , liquidificador, Becker de 100 ml, Gaze, papel de filtro, Microscpio, Lminas e lamnulas de vidro, Tubos de ensaio /pipetas, Soluo de lugol, Soluo de naoh 4%, hcl concentrado, Reativo de Benedict e Pipetas Pasteur II. ISOLAMENTO DO AMIDO DA BATATA: Homogeneizar uma batata de tamanho mdio com 100 mL de gua destilada, em liquidificador. Separe os resduos, espremendo a suspenso em gaze dobrada, coletndo o lquido em um becker. Suspenda o resduo em 50 mL de gua destilada e repita o processo. Deixe o amido depositar no fundo do becker durante 15 minutos. Decante o sobrenadante cuidadosamente. Retire uma pequena amostra do resduo para exame microscpico dos grnulos de amido.

III. CARACTERIZAO DO AMIDO: Exame Microscpico dos grnulos de amido: retire uma pequena amostra do amido com auxlio de uma pipeta Pasteur e deposite sobre uma lmina, coloque a lamnula e observe ao microscpio. Observe a forma e as estrias dos grnulos, faa um desenho. Repita o processo com uma outra lmina, s que antes de colocar a lamnula, coloque uma gota de lugol sobre a gota de amido. Observe. Preparao da soluo de amido: (Para todos os grupos) Ao resduo de amido, juntar lentamente, 250 mL de gua fervente. Resfrie e utilize na experincias seguintes. Pesquisa do Amido: a) Em um tubo de ensaio colocar 2 mL da soluo de amido e acrescentar 20 gotas da soluo de lugol. Colocar gua destilada, com auxlio de um piset, aproximadamente at o meio do tubo Observar e anotar a cor. b) Aquea o tubo da experincia anterior cuidadosamente (chama direta). Observe o resultado. Anote. c) Adicione ao tubo 5 gotas de NaOH 4%. Observe e anote o resultado. Coloque algumas gotas de HCl concentrado e observe novamente. Precipitao do Amido: Coloque em um tubo de ensaio 2 mL da soluo de amido, adicione 8 mL de etanol. Filtre. Aps o processo de filtrao, coloque uma gota de lugol no precipitado retido no papel filtro e outra gota de lugol no filtrado. Observe e anote resultado.

Hidrlise do amido: Em um erlenmeyer, adicionar 50 mL da soluo de amido e acrescentar 2 mL de HCl concentrado. Ferver durante 30 minutos em chama fraca, mantendo constante o nvel de soluo de amido (adicionando se necessrio, gua destilada quente na mesma). Acompanhe a hidrlise do amido, retirando a cada 5 minutos, uma gota da soluo, colocando-a sobre um azulejo e pingando sobre ela uma gota de lugol. Pesquisa do hidrolisado de amido: Em um tubo de ensaio, pipetar 2 mL do reativo de Benedict e acrescentar 10 gotas da soluo hidrolisada (experincia 5). Aquecer em chama direta. Explicar o resultado.

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: FERMENTAO ALCOLICA

Material: suco de fruta, fermento liofilizado, kitassato, tubo de ensaio, condensador, balo de fundo chato, bquer (200 mL e 500 mL), mangueira de ltex, xido de clcio, e liquidificador. Procedimento: fermentao do suco de fruta 1) Cortar as frutas em pequenos pedaos e homogeneizar em liquidificador com gua destilada obtendo 200 mL de suco de fruta 2) Filtrar o suco com o auxlio de uma peneira e aquece-lo em um bquer em temperaturas entre 60C e 70C por 15 minutos 3) Resfriar o suco da fruta em gua fria e transferir o volume para um kitassato 4) Adicionar ao suco de fruta 3 gramas de fermento liofilizado ou fresco 5) Tampar o aparato e acoplar uma mangueira de ltex na sada lateral do kitassato 6) Utilizando fita adesiva anexar um tubo de ensaio junto s paredes laterais do kitassato 7) Introduzir a extremidade da mangueira em uma soluo de hidrxido de clcio contida no tubo de ensaio impedindo a entrada de gases no interior do kitassato

Verificao da presena de CO2 Presena de precipitado branco no interior do tubo de ensaio com Ca(OH) 2 CO2 + Ca(OH)2 ------- CaCO3 + H2O Procedimento: Destilao do fermentado: 1) Filtrar o material fermentado com o auxlio de uma peneira 2) Transferir o material fermentado para um balo de fundo chato, com o auxlio de uma conexo de vidro acoplar o balo a um condensador 3) Iniciar o aquecimento recolhendo o material destilado na extremidade do condensador Procedimento: identificao da presena de lcool

Verificando a presena de lcool

Adicionar 3 gotas do lcool obtido da fermentao em um vidro de relgio e queimar.

CURSO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BIOQUMICA I - PRTICA DOCENTE: LENITA BRUNETTO BRUNIERA

ASSUNTO: CARACTERIZAO DE LIPDIOS

1. SOLUBILIDADE Preparar uma srie de 7 tubos de ensaio. Colocar em cada um deles 0,5 mL (10 gotas) de leo vegetal. Acrescentar os reagentes de acordo com a tabela seguinte:
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 gua HCl 0,5 N NaOH 0,5 N lcool etlico Clorofrmio ter etlico Acetona Solventes (2 mL) Resultado (solvel ou insolvel)

Aps adicionar os solventes, agitar e observar, anotando o resultado na tabela acima. 2. SAPONIFICAO DE TRIACILGLICERIS (Hidrlise Alcalina) a. Hidrlise Alcalina Tcnica: Em um tubo de ensaio colocar 15 gotas de leo vegetal, 2,5 mL de NaOH 40% (ou KOH 40%) e 2,5 mL de etanol. Aquecer em Banho Maria fervente durante aproximadamente 30 minutos, ou at obter uma soluo opalescente de sais de cido graxo (sabo). b. Propriedade dos Sabes Tcnica: Repartir o sabo formado em 4 tubos de ensaio acrescentar um pouco de gua destilada cada um deles e realizar os seguintes testes: B1) Abaixamento da tenso superficial: Agitar a soluo de sabo e verificar a formao de espuma. B2) Precipitao de cidos Graxos: No segundo tubo, adicionar gota a gota cido Actico Glacial, at notar o aparecimento de um precipitado branco de cidos graxos. B3) Precipitao de sabes de clcio: Ao terceiro tubo adicionar gotas de uma soluo de cloreto de clcio a 10% e observar a precipitao de sabes de clcio. B4)Precipitao por excesso de eletrlitos: Ao quarto tubo, adicionar soluo de NaCL saturada at ocorrer precipitao.