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1 aula

Espectrofotometria e Fluorimetria II
Claudimir Lucio do Lago sala 1270

Transmitncia
Frao da luz no absorvida por um determinado corpo. Ela definida para um determinado comprimento de onda. Importncia da transmitncia em qumica: Ela est relacionada com a concentrao das substncias qumicas presentes no meio (quantificao). A dependncia com o comprimento de onda caracterstico de uma substncia (identificao).

T=

I I0

T=
ou

P P0

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Absorbncia
A = log(T )
1.5
a i c n 1.0 b r o s b A 0.5

curva analtica e curva de calibrao

ou

T A = log % 100

curva analtica: aquela obtida pela lei de Beer. A = bc curva (analtica) de calibrao : aquela obtida experimentalmente termos muitas vezes trocados

0.0 0 20 40 60
(

80
%
)

100

Propriedade aditiva da absorbncia


Se duas ou mais espcies absorventes estiverem presentes na soluo, a absorbncia ser a soma das contribuies individuais.
soluo contendo somente a ou b:
A = abca A = bbcb

a i c n t i m s n a r T

Determinao de ferro e cobre


Hexacianorrutenato (II), Ru(CN)62-, forma um complexo prpura com Fe3+ e verde com Cu2+. Quando uma amostra foi analisada em uma cela de 1,00 cm de caminho ptico, as absorbncias medidas foram 0,183 a 550 nm e 0,109 a 396 nm. Quais as concentraes molares de Fe3+ e Cu2+ ? 550 nm / M-1 cm-1 Fe3+ Cu2+ 9970 34 396 nm / M-1 cm-1 84 856

soluo contendo a e b: A = abca + bbcb soluo contendo vrias espcies:


A = i bci
i

Titulao fotomtrica

Titulao fotomtrica
analito + titulante produto

analito = 0 titulante > 0 produto = 0 volume do titulante

fonte de luz agitador magntico

fotodetector

5 C2O4H2 + 2 MnO4- + 6 H+

10 CO2 + 2 Mn2+ + 8 H2O

analito

titulante

produtos

Titulao fotomtrica
analito + titulante produto

Titulao fotomtrica
analito + titulante produto

A=

(Vam + vtit ) A
Vam

analito > 0 titulante = 0 produto = 0 volume do titulante A analito > 0 titulante > 0 produto = 0 volume do titulante

analito = 0 titulante = 0 produto > 0 volume do titulante

Titulao fotomtrica
analito + titulante produto

Desvios da lei de Beer

analito = 0 titulante > 0 produto > 0 titulante > produto analito = 0 titulante > 0 produto > 0 titulante < produto

volume do titulante A

volume do titulante

Desvios da Lei de Beer


Desvios reais (fundamentais)
Mudanas do ndice de refrao

Desvios fundamentais
Para concentraes elevadas:
H interaes entre as espcies que podem provocar mudanas de absortividade molar. Mudanas do ndice de refrao desvio de trajetria de feixe e frao de luz refletida
cubeta de face plana melhor

Desvios qumicos
Formao de dmeros Equilbrio cido-base Complexao

Desvios instrumentais
Radiao policromtica Luz espria

Formao de dmeros

Por que luz monocromtica?


detector T I '+ I " I 0 '+ I 0 " A absorbncia medida (Am) I '+ I " Am = log I 0 '+ I 0 "
A" = " bc

I0 ' I0"
T= I = 10 A I0

I' I"

Tm =

A' = ' bc

I ' = 10 A' I 0 '

I " = 10 A" I 0 "

I 0 '10 A' + I 0 "10 A" Am = log I 0 '+ I 0 "

I 0 '10 'bc + I 0 "10 "bc Am = log I 0 '+ I 0 "

Por que luz monocromtica?


I0 ' I0" I' I"

Monocromaticidade suficiente

detector

absorbncia medida (Am)

I 0 '10 'bc + I 0 "10 "bc Am = log I 0 '+ I 0 "

A lei de Beer ser vlida:


Quando I0 Quando 0

I 10 bc Am = log I

Am = ' bc

Se a intensidade em um segundo comprimento de onda for zero (I0 = 0 ) luz monocromtica Se na regio do espectro detectado a absortividade molar for constante ( = ) luz suficientemente monocromtica Se a concentrao for baixa (quando o erro da medida for maior que o desvio da lei de Beer!!)

Radiao eletromagntica e processos atmicos e moleculares

Espectro de Absoro
Ultravioleta Visvel
energia de dissociao de ligao qumica transies eletrnicas vibrao molecular rotao molecular

Absoro Atmica
Diagrama de energia para transies do eltron de valncia do tomo de sdio (sem interaes com visinhos) Espectro de absoro atmica

Molculas vibram e rodam


Estiramento simtrico Estiramento assimtrico Deformao simtrica no plano (scissoring)

absorbncia

Deformao assimtrica no plano (rocking)


285 330 590 comprimento de onda / nm

Deformao simtrica fora do plano (wagging)

Deformao assimtrica fora do plano (twisting)

linhas de absoro

Espectro molecular (fase gasosa e baixa presso)


transio eletrnica + vibracional + rotacional
10000

S2 250 nm

transio eletrnica

transio eletrnica + vibracional

a r o d e v r o s b a o a l u p o p

8000 6000 4000 2000 0 200

S1 350 nm
250 300 350 400

m n / a d n o e d o t n e m i r p m o c

S0
transio vibracional transio vibracional + rotacional

Quando os vizinhos no interferem...


3p 3p 590 nm 3s 3p 590 nm 3s 3p 590 nm 3s

Quando os vizinhos interferem...


3p 3p 3p > 590 nm 3s < 590 nm 3s 3p 590 nm 3s

energia

590 nm 3s

energia

590 nm 3s

Todos os ftons envolvidos em processos de absoro possuem a mesma energia.

Processos de absoro de ftons de energia diferentes ().

Espectro molecular (efeito do ambiente)


10000

Mais que vizinhos...


1
a 400 r o d e v r o s b a 200 o a l u p o p
0 200 250 300 350

a r o d e v r o s b a o a l u p o p

vcuo

8000 6000 4000 2000 0 200

a 400 r o d e v r o s b a 200 o a l u p o p
0 200 250 300 350

250

300

350

400

400

400

a 200 r o d e v r o s b a 100 o a l u p o p
0 200 250 300 350

a r o 100 d e v r o s b a o 50 a l u p o p
0 200 250 300 350

100

a r o d e v r o s b a o a l u p o p

Os eltrons de valncia do on Cu2+ esto todos no mesmo nvel (d). Quando formado, por exemplo, o aquo-complexo Cu(H2O)62+, os orbitais so perturbados pelo complexante.

Qual a origem das bandas de absoro?


As ligaes qumicas envolvem a formao de orbitais moleculares com diferentes energias. Cada estado de energia tem estados vibracionais e rotacionais associados com energias ligeiramente diferentes. A vizinhana de outros tomos ou molculas perturbam estes estados.

m n / a d n o e d o t n e m i r p m o c
400

m n / a d n o e d o t n e m i r p m o c
80 60 40 20 0 200 400

m n / a d n o e d o t n e m i r p m o c
250 300 350 400

m n / a d n o e d o t n e m i r p m o c

m n / a d n o e d o t n e m i r p m o c

m n / a d n o e d o t n e m i r p m o c

CuSO45H2O

Fluorimetria

tetrazina

Processos de desativao

Cruzamento intersistemas, estado tripleto e Fosforescncia

singleto Converso interna transferncia de energia vibracional na mesma molcula. Converso externa transferncia de energia vibracional e rotacional para energia translacional (energia cintica) aumento de temperatura do meio

tripleto

Relaxao e Fluorescncia

Rendimento Quntico de Fluorescncia


Fluorescncia: S * S + h d S* = k F S * dt

[ ]

[ ]
F =

Processos no radiativos: S * S + Ek d S* = k nr S * dt

kF k F + knr

[ ]

[ ]

Favorecem a fluorescncia:
maior rigidez da molcula (diminuio da converso interna) lquidos de alta viscosidade ou meio slido (diminuio da converso externa)

10-15

10-11 10-10

10-5

tempo / segundos

Fluorescncia e Concentrao
S h fluorescncia, se um fton for absorvido. potncia absorvida:
PA = P0 P

Fluorescncia e Concentrao
circuito eletrnico
F = K ' P0 1 10 A

Fluorescncia no varia linearmente com a concentrao!

fluorescncia total: FT = F (P0 P ) fluorescncia detectada: F = pc F (P0 P ) P0 P

funo exponencial: e x =
n =0

xn x 2 x3 x 4 = 1+ x + + + +L n! 2! 3! 4!

10 z = e 2,3 z

onde F o rendimento quntico de fluorescncia (0,0 ... 1,0) pc a frao de cobertura do detector (0,0 ... 1,0)
T= P P0

( 2,3 A)2 ( 2,3 A)3 ( 2,3 A)4 L F = K ' P0 2,3 A 2! 3! 4!

Para valores baixos de absorbncia (A < 0,05):


F = K ' (P0 P )

lim F = 2,3K ' P0 A


A 0

P = P010 A

F = K ' P0 1 10

lim F = 2,3K ' P0bc


c0

T = 10 A

F = K c

Fluorescncia varia linearmente com concentrao somente para baixas concentraes!

Limite de Deteco
a menor concentrao (ou quantidade de matria) que pode ser detectada por um procedimento analtico com certeza razovel. Relao sinal rudo (S/N ou SNR): valor do sinal sobre o desvio padro do rudo. Limite de deteco: Qual a concentrao cujo sinal resultaria em SNR = 3?
Probabilidade de falsa deteco: ~ 0,1%
sinal

Limite de Deteco
Limite de deteco: Qual a concentrao cujo sinal resultaria em SNR = 3? Desvio padro do sinal:
sinal
tempo sinal

tempo

Desvio padro da concentrao:


c = sinal / m

curva de calibrao sinal = mc


sinal

Limite de Deteco:
3 c

Limite de Quantificao: SNR = 10


A partir da, podemos falar em concentrao do analito
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

concentrao

Aumento de Sensibilidade da Fluorimetria


Quanto maior a potncia do feixe de excitao, maior a sensibilidade da tcnica. Quanto maior a sensibilidade do detector, maior a sensibilidade da tcnica.
Espectrofotometria: Fluorimetria:

Fototubo
No Fototubo, aproveita-se os eltrons gerados pelo efeito fotoeltrico para se registrar a intensidade luminosa.

nodo ctodo (metal alcalino) invlucro de vidro ou quartzo sob vcuo radiao eamplificador

P T= = 10 bc P0

F = 2,3 pc F P0bc

Fonte de Luz: Fluorescncia Induzida por Laser (LIF) Fotodetector: Fotomultiplicadora


+ 90 V

anodo catodo radiao einvlucro de vidro ou quartzo sob vcuo


amplificador

Fototubo
fton

Fotomultiplicadora
ctodo fton -270 Volts

90 V

+ eA
-90 Volts

-180 Volts dinodo

e-

+ eA edinodo nodo 0 Volts

corrente eltrica na proporo de 4 eltrons para cada fton

Fluormetro

Espectrofluormetro

Fluorescncia direta

Aplicaes
Fluorimetria

S2

S1 2

3 S0 3 1

Exemplo de Aplicao de Fluorimetria


= 470 nm

Supresso de fluorescncia
R- =
= 470 nm

= 500 nm

AlR2+ =
detector

= 500 nm

detector

AlR2+ + 3F- = AlF3 + R-

Excesso controlado de complexante. A tcnica tambm conhecida por quenching

Exemplos de aplicao

Exemplos de aplicao
classe aminocidos aromticos vitaminas compostos fenilalanina tirosina triptofano A B2 B6 B12 E cido flico catecolaminas dopamina norepinefrina poluentes drogas classe compostos quinina cido saliclico morfina barbituratos LSD hidrocarbonetos aromticos policclicos: pireno e benzopireno pesticidas organotiofosforosos

Por que usar a fluorimetria?


Nem toda molcula que absorve fluoresce. Fluorimetria uma tcnica mais seletiva que a fotometria.

Por que usar a fluorimetria?


Maior Sensibilidade que a fotometria
Laser Fotomultiplicadoras

Maior Seletividade
espcies que absorvem

espcies que fluorescem

conjunto das espcies qumicas

Estrutura, Absoro e Fluorescncia

Estrutura e Absoro

clorofila a

clorofila c1

fitol

Estrutura e Absoro

Estrutura e Absoro
max = 184 nm max = 185 nm fenolftalena
O O

-caroteno

max = 217 nm max = 250 nm


HO

O H+ +

OH

HO

Cl2

esqualano
incolor violeta

violeta cristal

Betabloqueadores

Esmolol
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 200 250 300 350 400

sotalol

adrenalina

Desenvolvimento e validao de mtodos analticos enantiosseletivos para separao e determinao do esmolol e sotalol Michele B. Pallastrelli PG em Frmaco e Medicamentos FCF USP 2012

esmolol

pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11

Sotalol
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 200 250 300 350 400

Esmolol
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 200 250 300 350 400

pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11

pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11

10

Sotalol
OH H N O S

Estrutura e Fluorescncia
NO

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 200 250 300 350 400

pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11
O S N H O OH H N

H+

pH
H+
OH H2+ N O

molculas aromticas no-fluorescentes

molculas aromticas fluorescentes

S O N H

importncia da rigidez da molcula

Reviso Geral
Lei de Beer vlida sob certas condies: Baixa concentrao Luz suficientemente monocromtica Cuidados com desvios qumicos A absorbncia uma propriedade aditiva. Fluorimetria mais seletiva que a espectrofotometria (nem tudo que absorve fluoresce). A intensidade de fluorescncia proporcional concentrao somente quando a absorbncia baixa. Fluorescncia tende a resultar em mtodos mais sensveis e seletivos.

Reviso Geral
Duplas ligaes conjugadas tendem a aumentar a intensidade e aumentar o comprimento de onda de absoro. Aumento da rigidez da molcula aumenta o rendimento quntico de fluorescncia. Viscosidade do meio tem influncia sobre o F. Portanto, a temperatura um fator importante. Absoro e fluorescncia podem estar relacionadas a apenas uma poro de uma molcula (cromforos e fluorforos).

Livros
Holler, Skoog, Crouch, Princpios de Anlise Instrumental, 6 edio, captulos:
6, 7, 13, 14, 15

Skoog, West, Holler, Crouch, Fundamentos de Qumica Analtica, 8 edio, captulos:


24, 25, 26, 27

Harris, Anlise Qumica Quantitativa, 6 edio, captulos:


18, 19, 20

Fosforescncia e quimiluminescncia esto fora.

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