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Diagnstico imunolgico de infeces virais

Ronei Luciano Mamoni


Abril de 2009

Diagnstico laboratorial da infeco por HIV

Infeco por HIV


1983: HIV-1 1986: HIV-2 HIV-1: causa mais comum de AIDS 5 milhes de pessoas infectadas a cada ano

3 milhes de mortes/ano
No existe vacina ou cura

Transmisso
Contato sexual Sangue e hemoderivados Vertical: gestao, parto e aleitamento Transplante de rgos
Perodo de incubao: fase aguda, soroconverso
no h consenso

Nmero de indivduos infectados pelo HIV-1

Estrutura do HIV
Capsdeo p24 Matriz p17 RNA
Transcriptase reversa
Integrase

Camada bilipdica

Protease

gp41

gp120

gp160

HIV

Ciclo do HIV
Partcula viral

Receptor de quimiocina

gp120

CD4
Liberao de RNA Transcrio reversa Integrao ao DNA Protenas virais

Montagem de novos vrus

RNA viral

Principais sintomas da infeco aguda pelo HIV


Sintoma Febre Exantema lceras orais Artralgia Faringite Perda de apetite Perda de peso >2.5kg Indisposio Mialgia Febre e exantema Freqncia 80% 51% 37% 54% 44% 54% 32% 68% 49% 46%

Marcadores da infeco por HIV


ImunoInfeco Linfadenopatia Disfuno imune Defeitos crnica subclnica imunes da deficincia aguda pele e sistmica mucosas

1000 900

Vrus (antgeno p24)


Clulas T CD8

Concentrao de clulas T CD4

800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84

Anticorpo anti-HIV (gp120)

Clulas T CD4

Tempo (meses aps a infeco)

Depleo de linfcitos T CD4+


Efeito citoptico direto do vrus
Efeito citotxico de produtos virais como a gp120 Efeitos indiretos como ativao do mecanismo de apoptose ou lise por clulas T citotxicas

Resultado: grande aumento da suscetibilidade a infeces oportunistas, incidncia aumentada de tumores e encefalopatias

Infeco sintomtica - AIDS


Febre prolongada Diarria crnica

Perda de peso >10%


Sudorese noturna Astenia

Adenomegalia

Doenas oportunistas
Pneumocystis carinii Toxoplasma gondii Cryptosporidio / Microsporidio / Isosporidio Candida sp Coccidioides imitis Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Herpes simplex virus Varicela-zoster virus Citomegalovirus Mycobacterium tuberculosis Outras micobactrias Sarcoma de Kaposi (HHV-8)

Diagnstico laboratorial
Testes de triagem: Pesquisa de anticorpos
(ELISA - 3a gerao, MEIA, quimioluminescncia, teste rpido, teste simples) Antgenos: peptdeos sintticos como gp41 e p24

Alta sensibilidade e especificidade

Testes confirmatrios: Pesquisa de anticorpos


(Western blot, imunofluorescncia) e PCR

ELISA pesquisa p24 (antgeno)


Substrato Cromgeno

Estreptoavidina peroxidase
Anticorpo de deteco biotinilado

Antgeno (p24) na amostra

Anticorpo de captura

ELISA pesquisa de anticorpos


Substrato cromgeno

Estreptoavidina peroxidase

Anti-anticorpo biotinilado

Anticorpo anti-HIV da amostra Antgeno

Western-Blot / Imuno-Blot

Peroxidase Anticorpo secundrio

Anticorpo primrio

HIV Western Blot


gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41

p31

p24

P17

Positivo

Negativo

Duvidoso

Fluxograma para deteco de anticorpos anti-HIV em indivduos com idade acima de 2 anos Ministrio da Sade portaria No 59, 28 de janeiro de 2003
Amostra (soro ou plasma) EIA 1 (-) (+ / Ic)

Etapa 1

Amostra negativa para HIV EIA 2 ( - ) e IFI ( - ) ou IB ( - ) Amostra negativa para HIV EIA 2 ( - ) / (Ic) e IFI ( + ) / (I) ou IB ( + ) / (I)

EIA 2 e IFI ou IB

EIA 2 ( + ) / (Ic) e IFI ( - ) / (I) ou IB ( + ) / (I)

EIA 2 ( + ) e IFI ( + ) ou IB ( + ) Amostra positiva para HIV-1 / Coletar nova amostra repetir a etapa 1

Etapa 2

Western Blot (-) Amostra negativa para HIV-1 (I) Amostra indeterminada para HIV-1 (+) Amostra positiva para HIV-1

Etapa 3

Investigar soroconverso e/ou pesquisar HIV-2

Coletar nova amostra e repetir a etapa 1

Laudo da sorologia
O diagnstico sorolgico de infeco pelo HIV somente poder ser confirmado aps anlise de no

mnimo 02 (duas) amostras de sangue coletadas em


momentos diferentes Obs.: Deteco de anticorpos anti-HIV em crianas abaixo de 2 anos: utilizar testes complementares (transmisso placentria)

NAT (teste de cido nucleico)


Deteco de HIV e HCV em bancos de sangue
Mini pool: 16 a 24 doaes para sangue total

512 a 1200 doaes para plasma


algoritmo para identificar unidade infectada

Preo acessvel
Segurana no perodo da janela

Monitoramento da infeco pelo HIV


Objetivos: Indicao de terapia anti-retroviral Avaliao da terapia Carga viral Contagem de clulas T CD4+

Carga Viral e Nmero de Linfcitos T CD4+


1200 1100 1000

Infeco Primria

Possvel fase aguda com disseminao do vrus para orgos linfides

Morte Doenas Oportunistas


1:512

Linfcitos T CD4+

900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 3 6 9 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Carga Viral Plasmtica

Latncia Clnica

1:256 1:128 1:64

Sintomas

1:32 1:16 1:8 1:4 1:2 0

Semanas

Anos

Carga viral
Introduzida em 1996-1997 Mede a quantidade de HIV-RNA no sangue Correlao com o nmero de vrus (cpias/ml) Mtodos: RT-PCR, bDNA, NASBA

Carga viral mtodos de avaliao


Marca

Roche
RT-PCR

Bayer
b-DNA

Organon
NASBA HIV QT

Mtodo Sensibilidade

400 750.000 US: 50 75.000 2x maior b-DNA

100 500.000

40 10.000.000

Comparao Vantagens

50% PCR

PCR

Menos falsos+ que b-DNA

= para todos subtipos, simples

= para todos subtipos

Carga viral fatores interferentes

Vacinaes (aguardar 4 semanas) Infeces simultneas (ex. tuberculose)

Reao em cadeia da polimerase - PCR


3 5

cDNA
cDNA
5 Desnaturao 3 Desnaturao

Primer

Sntese
Anelamento

DNA novo

Ciclo 1

Primer

Ciclo 2
Extenso

etc

Transcrio Reversa

Transcrio Reversa
Transcriptase reversa

RNA mensageiro

dNTP

Primer (Oligo dT12-18)

Transcrio Reversa

Transcrio Reversa

Transcrio Reversa

Transcrio Reversa

Transcrio Reversa

Transcrio Reversa

Transcrio Reversa

Transcrio Reversa

DNA complementar

Reao de PCR

PCR
Taq DNA polimerase Primer anti-sense
5

DNA complementar

Primer sense

dNTP

PCR

PCR

DESNATURAO

PCR

ANELAMENTO

PCR

PCR

EXTENSO

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

Real-time PCR
Quantificao na fase exponencial
Efeito Plat Fase exponencial

Dois sistemas de deteco:


- agentes intercalantes de DNA - sondas fluorescentes

Real-time PCR
Sondas fluorescentes: seqncias de nucleotdeos marcados

Reporter
R Q

Quencher
R Q

Fluorescncia

Comprimento de onda

Fluorescncia

Comprimento de onda

Real-time PCR
Sondas fluorescentes: - propriedade de 5 exonuclease da Taq polimerase

DNA polimerase Sonda 5 3

Primer

3 5

Real-time PCR
Sondas fluorescentes: - propriedade de 5 exonuclease da Taq polimerase

5
Q R

Real-time PCR
Sondas fluorescentes: - propriedade de 5 exonuclease da Taq polimerase

5
Q R

Real-time PCR
Sondas fluorescentes: - propriedade de 5 exonuclease da Taq polimerase

5
Q R Q

Real-time PCR
Sondas fluorescentes: - propriedade de 5 exonuclease da Taq polimerase

Real-time PCR
Curva de amplificao

Real-time PCR
Quantificao:
- utilizao de curva de referncia

bDNA

Vrus

bDNA

Lise do vrus com liberao do DNA viral

bDNA
Reao da enzima com substrato (dioxetano)
Marcao dos Amplificadores amplificadores com fosfatase alcalina Pr-amplificador Pontas adesivas (iso C ou G) Sondas alvo

Sondas de captura se ligam ao DNA e placa

NASBA
5 3

RNA
Promotor T7

AMV-RT 3 Rnase H Primer 2 AMV-RT 5 3 T7 RNA polimerase

Primer 1 5 RNA-DNA

DNA 3 5

DNA-DNA

T7 RNA polimerase

AMV-RT

AMV-RT

Rnase H

Nmero de clulas T CD4+


Estima o risco individual para AIDS
> 400-500 cel CD4+/ml: baixo risco de doena severa
relacionada a AIDS

< 200 cel CD4+/ml: alto risco de doena severa


relacionada a AIDS

Mtodo: Citometria de fluxo

Carga Viral e Nmero de Linfcitos T CD4+


1200 1100 1000

Infeco Primria

Possvel fase aguda com disseminao do vrus para orgos linfides

Morte Doenas Oportunistas


1:512

Linfcitos T CD4+

900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 3 6 9 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Carga Viral Plasmtica

Latncia Clnica

1:256 1:128 1:64

Sintomas

1:32 1:16 1:8 1:4 1:2 0

Semanas

Anos

Contagem de linfcitos CD4 e CD8 Imunofluorescncia direta

Controle Isotpico

Citometria de fluxo

Laser

Deteco da fluorescncia, tamanho e complexidade celular

Anlise do dados coletados em computador com software apropriado

Detector

Marcao linfitos CD4+ / CD8+


29,6% 3,0%

CD8 (PE)

42,7%

CD4 (FITC)

Mecanismo de atuao das drogas


HIV maduro

Inibidor de entrada
HIV

Inibidor de integrase

Inibidor de protease

Inibidor de TR

Drogas anti-retrovirais em uso


Inibidores de transcriptase reversa: Zidovudina (HividTM), (AZT), Didanosina (ZeritTM), (VidexTM), Lamivudina Zalcitabina (EpivirTM),

Staduvina

Abacavir (ZiagenTM)
Nevirapina (ViramuneTM), Delavirdina (RescriptorTM),

Efavirenz (SustivaTM) Inibidores de protease: Saquinavir (FortovaseTM/InviraseTM), Ritonavir (NorvirTM), Indinavir (CrixivanTM), Nelfinavir (ViraceptTM), Amprenavir (AgeneraseTM)

Carga Viral e Nmero de Linfcitos T CD4+


Fase aguda Fase crnica AIDS HAART

Clulas T CD4+

Valores relativos

Apoptose de linfcitos

Carga viral

Ativao imune

3
Meses

120

180

Inibidores de protease lipodistrofia

Diagnstico laboratorial da rubola

Vrus da rubola
Togavrus Vrus simples Um nico tipo antignico Inativado por agentes
membrana bilipdica ssRNA

RNA

de

fita

glicoprotena
nucleocapsdio

qumicos, pH baixo, UV temperatura

Patognese
Transmisso respiratria Replicao na nasofaringe e linfonodos regionais Viremia aps 5-7 dias aps exposio com disseminao para os tecidos

Placenta e feto podem ser infectados durante a


viremia

Aspectos clnicos
Perodo incubao: 12 a 23 dias
Linfadenomegalia 2a semana Exantema maculopapular: 14 - 17 dias aps exposio

Complicaes
Artralgia ou artrite:
Criana raro

Adulto sexo feminino at 70%


Prpura trombocitopnica 1/3000 casos Encefalite raro Neurite raro

Orquite raro

Sndrome da rubola congnita


Infeco pode afetar todos os rgos Morte do feto ou parto prematuro Infeco no incio da gestao (<12 sem): alto risco

Acometimento dos rgos: relacionado ao estgio


da gestao

Risco de infeco durante a gestao


Pr-concepo risco mnimo

0 - 12 semanas 100% risco de infeco


anomalias importantes aborto espontneo (20% dos casos) 13 - 16 semanas surdez e retinopatia (15% dos casos) Aps 16 semanas desenvolvimento normal

baixo risco de surdez e retinopatia

Rubola congnita
Surdez
Catarata

Alteraes cardacas
Microcefalia Retardo mental Alteraes sseas Alteraes hepticas e esplnicas

Diagnstico laboratorial
Isolamento do vrus de material clnico (orofaringe, urina)
Teste de inibio da hemaglutinao viral

Teste fixao de complemento em placa


Aumento significativo do ttulo de anticorpos especficos da

classe IgG
Avidez de IgG Deteco de anticorpos especficos da classe IgM (fator reumatide interfere, persistncia de IgM)

Inibio da hemaglutinao

Negativo

Positivo

Hemlise radial
Complemento Anticorpo da amostra

Complemento

Antgeno Hemcia

Antgeno Hemcia

Positivo

Negativo

Hemlise radial

positivo

controle

Rubola congnita - perfil sorolgico


256 Infeco Vrus da Rubola 128 IgG Materna IgG

Ttulo

64

IgM Fetal 32

IgM

3
Nasci-mento

Trimestre

Idade / Meses

Idade / Anos

Definio de caso
Aspectos clnicos Aparecimento do exantema maculopapular generalizado Temperatura >37.2o C Artralgias/Artrites ou linfadenomegalia ou conjuntivite] Critrios para diagnstico laboratorial Isolamento do vrus, ou Aumento significante ttulo de IgG especfica fase aguda

vs. convalescena, e/ou


Deteco de IgM especfica

Vacina para rubola


Composio: vrus vivo (cepa RA 27/3) Eficcia: 95% (90-97%) Durao da imunidade: vida toda Esquema: 1 dose > 12 meses de idade

Deve ser administrada com vacina de sarampo


e caxumba (MMR)

Vacina para rubola


500

Casos confirmados

Introduo da vacina MMR


400

300

200

100

0 1984

1985

1986

1987

1988

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

Contra-indicaes e precaues

Reao alrgica severa constatada anteriormente Gestao

Imunossupresso
Doena aguda severa ou moderada

Diagnstico laboratorial da infeco por citomegalovrus

Citomegalovrus
Vrus de DNA - famlia Herpesviridae
60% da populao infectada eventualmente 95% da populao em pases subdesenvolvidos Infeco primria geralmente assintomtica Latncia (integrao no cromossoma da clula

hospedeira) e reativao
Transmisso via saliva, contato sexual, sangue,

placenta e leite materno, transplante de rgos

Citomegalovrus

nucleocapsdio tegumento genoma membrana Complexo gp1 Complexo gp2

Infeco por CMV


Infeco adquirida geralmente assintomtica ou sintomas brandos
Causa mais comum de infeco congnita no homem (0,3 a 1% dos nascimentos) Doena grave em indivduos imunossuprimidos

Infeco no paciente imunocompetente


Geralmente assintomtica Sintomas brandos: febre, fraqueza, sudorese, hepato-esplenomegalia, Linfadenomegalia cervical: rara no adulto, presente em 90% dos casos em crianas

Diagnstico laboratorial
Hemograma: atpicos linfocitose relativa, linfcitos

Enzimas hepticas (ALT e AST) moderadamente elevadas Sorologia: IgG e IgM


Avidez IgG

Infeco adquirida sorologia


Pesquisa de IgG e IgM especfica IgM: interferncia do fator reumatide Tcnica de captura Persistncia de IgM

ELISA de captura para IgM


Substrato Cromgeno

Estreptoavidina peroxidase

Anticorpo de deteco biotinilado

Antgeno

IgM da Amostra

Anticorpo de captura

ELISA Avidez de IgG

Substrato Cromgeno

Substrato Cromgeno

Substrato Cromgeno

Estreptoavidina peroxidase
Anticorpo de deteco biotinilado

Estreptoavidina peroxidase Anticorpo de deteco biotinilado

Estreptoavidina peroxidase Anticorpo de deteco biotinilado

Anticorpo da amostra Antgeno

Anticorpo da amostra Antgeno

Anticorpo da amostra Antgeno

Controle

Alta avidez

Baixa avidez

Infeco congnita - Transmisso


Aps infeco infeco primria ou recorrente
Aps infeco primria: 40% chance Pode ser transferida ao feto durante todos os estgios da gestao. Pior efeito no incio

Transmisso perinatal ou pelo leite materno


No tem efeito teratognico, os danos ao feto so resultantes da destruio da clula alvo, a medida em que se infectam

Infeco congnita
Infeco assintomtica at formas graves Segunda causa mais comum de deficincia mental

Danos mais severos que rubola


Anticorpos da me no protegem feto da infeco Isolamento do vrus da saliva ou urina at 3 semanas aps nascimento

Infeco congnita
SNC: microcefalia, periventricular retardo mental, epilepsia, calcificao Olhos: coriorretinite, atrofia tica

Ouvidos: surdez Pulmes: pneumonites


Fgado: hepatite, (hepatoesplenomegalia e ictercia Corao: miocardites Prpura trombocitopnica Anemia Hemoltica

Seqela tardia em indivduos assintomticos ao nascer: defeitos de audio e inteligncia reduzida

Conduta - Infeco primria


Considerar interrupo da gestao 40% chance feto ser infectado 10% chance do RN ser sintomtico ou desenvolver seqela tardia

... portanto, 4% chance (1 em 25) de nascer uma


criana afetada

Conduta - Infeco recorrente


Interrupo da gestao no recomendada, baixo risco para o feto

Screening pr natal: impraticvel


Vacinao: ainda no disponvel

Diagnstico da infeco por CMV na gravidez


Deteco do vrus no sangue Soroconverso
Nenhum teste adicional requerido Sorologia Ag

Vir

DNA
Positivo

IEmRNA

Deteco de IgM Avidez de IgG IgM positivo IgM indefinido IA baixo Infeco primria IA intermedirio

Diagnstico (Confirmao ou definio da sorologia)

IA alto

Diagnstico

No definido

Infeco antiga

Presena de Ac. NT
Ausncia de Ac NT

No auxilia
Diagnstico

Teste de avidez para confirmao

Tentar NT

NT

Recm nascido - diagnstico


Isolamento do vrus da urina ou saliva Presena de IgM especfica para CMV

(cerca de 30% negativo) Antigenemia

PCR
Deteco DNA viral (leuccitos, soro, plasma, urina,

LCR, bipsias)
Diagnstico rpido

Resultado + no diferencia vrus latente ou em


replicao

Resultado negativo: exclui infeco


Resultado + em paciente soronegativo: indica

infeco 1aria

Diagnstico imunolgico das hepatites virais

Hepatites virais - histrico


Infecciosa

A
No-A / No B

Transmisso fecal-oral

E C

Hepatites virais

Transmisso parenteral
Outras

Soro

Casos confirmados de hepatites virais 1996 a 2000 - FUNASA


B 25%

A 43%

C 12% Ignorado 17% Outras 3%

Hepatite aguda - caractersticas


Anticorpo Exposio
Elevao de aminotransferase Replicao viral

Elevao bilirrubina

Sintomas

Perodo de incubao

Prictrico

Fase Ictrica

Convalescncia

Diagnstico imunolgico da hepatite B

Vrus da Hepatite B - HBV


HBsAg

dsDNA

DNA polimerase

HBcAg

Formas circulantes

Famlia Hepadnaviridae

HBV - genoma

Vrus da hepatite B

Distribuio geogrfica dos casos de hepatite B

HBsAg Prevalence Prevalncia HBsAg >8% 8% - Alta - High 2-7% - Intermediate 2 7% - Intermediria <2% - Low < 2% - Baixa

Hepatite B
Transmisso: sangue ou hemoderivados (agulhas,

dilise, transfuso ou ferimentos), contato sexual,


perinatal (gravidez ou nascimento)

Infeco aguda dura 4 a 8 semanas (sintomas


similares a hepatite A) 10% dos casos evoluem para infeco crnica, desses 1/3 hepatite crnica ativa, cirrose heptica e/ou

carcinoma hepatocelular

HBV

HBV Ciclo

Reciclagem

Entrada do HBV
Core + HBsAg

Core

Montagem

Traduo

Transcrio
cccDNA

Reparo

Hepatite B - Imunopatologia

HBV

DNA do HBV

MHC classe I TCR Peptdeos

RNA do HBV

T CD8+
CD8

do HBV HBsAg

cores do HBV

Hepatcito infectado

Hepatite B - Imunopatologia

Aspectos clnicos
Perodo de incubao 60-90 dias (45-180) Ictercia: < 5 anos <10% > 5 anos 30 - 50% Casos agudos fatais 0.5 - 1% Infeco crnica < 5 anos 30 - 90% > 5 anos 2 - 10% Mortalidade da infeco crnica 15 - 25%

Hepatite B
Marcadores sorolgicos:

HBsAg e anti-HBs
anti-HBc IgM e anti-HBc total

HBeAg e anti-Hbe
Testes laboratoriais:
ELISA (IgG e IgM)
PCR deteco de genoma viral (DNA)

Dosagem de ALT

Vrus da Hepatite B - HBV


Circulao
Antgeno HBsAg HBeAg
HBcAg

Anticorpo Anti-HBs Anti-HBc Anti-HBe

Hepatite B - Perfil Sorolgico


Tempo de Incubao 4-12 Semanas
Infeco Aguda Infeco Aguda Recente 2-12 Semanas 2-16 Semanas

Recuperao Anos

Janela Imunolgica

Sintomas
Anti-HBc- Total

Concentrao Relativa

HBeAg HBsAg Anti-HBe Anti-HBs Anti-HBc IgM

Tempo

Hepatite B crnica- perfil sorolgico


Tempo de Incubao 4-12 Semanas Infeco Aguda 6 meses Infeco Crnica Anos

Concentrao Relativa

Anti-HBc- Total
HBeAg Anti-HBc IgM HBsAg

Tempo

Hepatite B crnica - perfil sorolgico (soro-converso tardia)


Tempo de Incubao 4-12 Semanas Infeco Aguda 6 meses Infeco Crnica Anos

Anti-HBc- Total
Concentrao Relativa HBeAg Anti-HBe HBsAg

Anti-HBc IgM

Tempo

Hepatite B - Preveno
Triagem banco de sangue
Vacina para hepatite B: Protena recombinante (HBsAg) 3 doses Produo de anti-HBs (acima de 100 mU/ml)

Imunoglobulina (ps-exposio)

Diagnstico laboratorial da hepatite C

Hepatite C
Hepatite no-A no-B associada transfuso
Choo et al, 1989: isolamento HCV

Vrus de RNA (9.000 nucleotdeos)


Famlia Flaviviridae Genoma codifica uma nica poliprotena de 3000 aa

Vrus da hepatite C
Protena E1 Protena E2

Protena C (Capsdio)
Genoma (RNA) Famlia Flaviviridae

Vrus da hepatite C

Genoma do HCV
estrutural no estrutural
5NC

E1

E2/NS1

NS2

NS3

NS4
b a

NS5
b

3NC

5-1-1

NS5

c22-3 gp33 gp70

c33c

c100-3

c200 1 1000 2000 3000 aa

Gentipos HCV

Distribuio geogrfica dos casos de hepatite C

<1% 1 2,4% 2,5 4,9% 5 - 10% > 10% Sem dados

Caractersticas clnicas da hepatite C


Perodo de incubao mdia 6 - 7 sem. (2 26) Doena aguda: Ictercia moderada (<20%) Casos fatais raro Infeco crnica 60 85% (maioria assintomtico) Cirrose < 5 20% Carcinoma hepatocelular 1 4%

Evoluo Fatores de risco


Mulheres jovens no momento da infeco
> 30 anos

Taxa de progresso Lenta Rpida

Fgado normal

Infeco aguda

Infeco crnica 80% dos casos

Hepatite crnica

Cirrose em 20% dos casos

Risco de carcinoma 1-4% por ano

< 20 anos

Uso de lcool, co-infeco

Fatores associados a infeco por HCV


Uso de drogas injetveis
Transfuso ou transplante de rgos

Exposio ocupacional a sangue contaminado


Principalmente agulhas

Iatrognico (injees no seguras)


Nascimento de me infectada

Sexo com parceiro contaminado


Promiscuidade

Diagnstico laboratorial
Testes sorolgicos
ELISA Imunoblot: RIBA

Bipsia heptica
Dosagem peridica de ALT

ELISA
estrutural no estrutural
5NC

E1

E2/NS1

NS2

NS3

NS4
b a

NS5
b

3NC

Teste 1a gerao

ano 1990

antgeno c100-3 (NS5)

soroconverso 16 sem

2a gerao

1992

Ag core + NS3

10 sem

3a gerao

1995

NS5, core, NS3, NS4

7-8 sem

Hepatite C - infeco aguda


Sintomas

HCV - Infeco Aguda

ALT

Anti-HCV

12

Meses Aps Exposio

Anos Aps Exposio

Hepatite C - infeco crnica


HCV - Infeco Crnica
Sintomas
ALT
Sintomas

Sintomas

Anti-HCV

Bipsia: hepatite crnica ativa


3 6 9 12 2 3 4

Bipsia: cirrose

Meses Aps Exposio

Anos Aps Exposio

Teste suplementar ou confirmatrio


RIBA

Identificam Acs contra Ags individuais do HCV

Utiliza mesmos Ags do ELISA Mais especfico, menos sensvel que o ELISA

Bipsia de fgado - Evoluo


A B

Testes moleculares
Deteco do genoma viral (RT-PCR)
Confirmao diagnstica

Melhor marcador de viremia, infectividade e


atividade da doena

padro

ouro

(discrimina

entre

infeco

passada e atual)

Testes moleculares
Carga viral Avalia atividade da doena, Prognstico de resposta teraputica, Tipo de abordagem teraputica preconizada

para determinada carga viral


Resultados expressos em cpias/ml ou UI/ml

Transcrio Reversa
5 3

Seqncia Alvo do RNA Primer

3 5
Transcriptase reversa

Sequncia Alvo do RNA Primer

5 3

3
5

Seqncia Alvo do RNA cDNA

Reao em cadeia da polimerase - PCR


3 5

cDNA
cDNA
5 Desnaturao 3 Desnaturao

Primer

Sntese
Anelamento

DNA novo

Ciclo 1

Primer

Ciclo 2
Extenso

etc

bDNA
Reao da enzima com substrato (dioxetano)
Marcao dos Amplificadores amplificadores com fosfatase alcalina Pr-amplificador Pontas adesivas (iso C ou G) Sondas alvo

Sondas de captura se ligam ao DNA e placa

NASBA
5 3

RNA
Promotor T7

AMV-RT 3 Rnase H Primer 2 AMV-RT 5 3 T7 RNA polimerase

Primer 1 5 RNA-DNA

DNA 3 5

DNA-DNA

T7 RNA polimerase

AMV-RT

AMV-RT

Rnase H

Testes moleculares
Determinao do gentipo

Amplificao de determinada regio do genoma e


seqenciamento.

Gentipos: tipos 1 a 6; subtipos: a, b, c


6 tipos principais e 11 subtipos: 1a, 1b, 1c; 2a, 2b,

2c; 3a, 3b; 4a; 5a; 6a


Brasil maior freqncia 1b, seguido de 1a,2a,2b,3a

PCR com primer biotinilado


3 5

cDNA
cDNA
5 3 Desnaturao

biotina

Desnaturao

Sntese
Anelamento

Ciclo 1

Ciclo 2
Extenso

etc

Hibridizao reversa
Cromgeno (NBT/BCIP)
Fosfatase alcalina

Estreptoavidina Biotina
Alvo amplificado

Sondas de DNA

Tira de nitrocelulose

Hibridizao reversa Resultados / interpretao


Linha marcao 1 - Conj. controle 2 - Ampl. controle 31 451a 61b 781a/1b 92 10 11 2a/2c 12 2b 13 14 3 15 16 17 4 18 19 5a 20 21 6a

Fluxograma para diagnstico HCV


Anti-HCV (ELISA)

Reativo
Confirmao AntiHCV (RIBA)

1. Dosagem ALT
Se elevado considerar bipsia de fgado

Reativo

Indeterminado HCV-RNA

No-reativo

Genotipagem Detectado Considerar tratamento No detectado Acompanhar paciente

Hepatite C crnica
Genotipagem do HCV Genotipo 2 ou 3 Genotipo 1 (e 4, 5 ou 6) Bipsia do fgado >A2F2 Peginterferon + 1000-1200mg ribavirina 48 semanas Quantificao do RNA-HCV no incio e na semana 12 (genotipo 1) <A1F1 Seguimento sem tratamento

Peginterferon + 800 mg ribavirina 24 semanas


Deteco do RNA-HCV no final do tratamento e 24 semanas depois (limite de deteco do ensaio <50 IU/mL Resposta virolgica de final de tratamento Permanncia da resposta virolgica Deteco do RNA do HCV no final do tratamento e 24 semanas depois (limite de deteco do ensaio <50 IU/mL

Diminuio > 2 log na quantidade de RNAHCV ou negativao na 12 semana Continuao at a 48 semana

Diminuio < 2 log na quantidade de RNA do HCV na 12 semana Parada do tratamento Incluso em testes com outras terapias

Resposta virolgica de final de tratamento Permanncia da resposta virolgica

NAT (teste de cido nucleico)


Deteco de HIV e HCV em bancos de sangue
Mini pool: 16 a 24 doaes para sangue total

512 a 1200 doaes para plasma


algoritmo para identificar unidade infectada

Preo acessvel
Diminui a janela de 59 para 10-30 dias

Fluxograma para o diagnstico diferencial de hepatites agudas

Suspeita de hepatite aguda baseado em: Histria, exame fsico, epidemiologia Atividade de aminotransferase elevada (ALT/AST) Fazer sorologia: - Anti-HAV (igM) - HBsAg e anti-HBc (igM) - Anti-HCV (ELISA e RIBA) IgM Anti-HBc + c/ ou s/ HBsAg Diagnstico: Hepatite B aguda

IgM anti-HAV

Anti-HCV + Diagnstico: Hepatite C aguda ou exacerbao de infeo crnica

Sorologias negativas Considerar outras etiologias no virais: isquemia, toxinas; ou outras etiologias: CMV, EBV

Diagnstico: Hepatite A aguda

Suspeita de co-infeco por HDV baseada em: Fatores de risco (usurio de drogas) Sinais clnicos de hepatite severa Checar Anti-HDV Anti-HDV positivo Diagnstico: Co-infeco HBV/HDV

Testar HBsAg e ALT/AST dentro de 6-9 meses

HBsAg + c/ ou s/ aminotransferase anormais Diagnstico: Infeco por HBV crnica

Considerar possibilidade de infeco por HEV em pessoas com procedncia recente a regies endmicas Testar novamente para anti-HCV em 3-6 meses

Quadro resumo das hepatites virais


Caractersticas Famlia Tamanho, forma, genoma Envelope Antgenos HAV Picornaviridae 27 nm icosahdrico ssRNA (7,5 kb) no Antgeno HAV Anti-HAV (IgG e IgM) Fecal-oral (raro parenteral) Contato pessoal, alimento, sexual 30 dias (15-50) > adultos, < crianas Nunca Nenhum Vacinao IG (ps-exposio) ELISA, ALT HBV Hepadnaviridae 42 nm esfrico Parc. dsDNA (3,2 kb) no HBsAg, HBeAg, HBcAg Anti-HBs, -HBe, HBc (IgG e IgM) Parenteral Sexual, sangunea (DI, transfuso), perinatal 75 dias (45-180) > adultos, < crianas Adultos < 10% Crianas 30 90% Interferon- , lamivudina Vacinao (rHBsAg) IG (ps-exposio) ELISA, PCR, ALT HCV Flaviviridae 55 nm esfrico ssRNA (10 kb) no Env (NS1, E1, E2); core (C22C, NS3/C33C, NS4, C100-3, NS4/5-1-1, N55/Pol) Anti-C22C, -C33C, -C100-3, -5-1-1, -NS5) Parenteral Sangunea (DI, transfuso), Sexual, perinatal 6 7 semanas (2 26) Raramente Frequente > 70% Interferon- , ribavirina Nenhuma ELISA, RT-PCR, bDNA, hibridizao reversa, bipsia, ALT HDV Viriide 35 nm esfrico ssRNA (1,7 kb) no (HBsAg) Antgeno HDV HEV No classificado * 32 nm icosahdrico ssRNA (7,5 kb) no Antgeno HEV

Anticorpos
Modo de transmisso Rotas de transmisso Incubao Infeco aguda (Ictercia) Evoluo para estado crnico Tratamento Profilaxia Testes diagnsticos mais comuns

Anti-HDV (IgG e IgM)


Parenteral Sexual, sangunea (DI, transfuso), perinatal No determinado Superinfeco Co-infeco raro Superinfeco comum Interferon lamivudina Superinfeco (orientar portadores HBV) ELISA, RT-PCR, ALT

Anti-HEV (IgG e IgM)


Fecal-oral Alimento e gua contaminada 40 dias (15 60) > adultos, < crianas Nunca Nenhum Nenhuma

ELISA, ALT

* Anteriormente HEV classificado na famlia Caliciviridae, DI: drogas injetveis, IG: imunoglobulina

Diagnstico laboratorial da infeco por rotavrus

Rotavrus
Famlia Reoviridae Rotavrus infantil. So responsveis por cerca de 50% de todos os causam gastroenterite humana

casos de diarria em crianas que necessitam


de hospitalizao devido a desidratao.

Rotavrus ME

Rotavrus - Estrutura
Morfologia icosadrica, com capsdeo de protena de dupla

camada, ausncia de envoltrio e genoma segmentado.


O capsdeo externo constitudo de protenas estruturais que circundam um cerne de nucleocapsdeo que inclui as enzimas para a sntese de RNA e 11 segmentos genmicos de RNA diferentes de filamento duplo.

Rotavrus Estrutura

Classificao e propriedades antignicas


Possuem antgenos localizados na maioria das protenas
estruturais. Os antgenos tipo-especficos localizam-se no capsdeo externo. 9 sorotipos de rotavrus humanos. 5 sorotipos de rotavrus isolados em animais Vrus associados gastroenterite humana so classificados

como rotavrus do grupo A.

Manifestaes clnicas
Responsvel pela grande proporo de casos de doena

diarrica em lactentes e crianas.


Perodo de incubao 1 - 4 dias. Sintomas: Diarria, febre, dor abdominal e vmitos.

(desidrataoacidosechoquemorte)
Ocorre infeces assintomticas, com soroconverso.

Epidemiologia e imunidade
Causa isolada mais importante no mundo de
gastroenterite em crianas de pouca idade.
50-60% dos casos de gastroenterite aguda de

crianas hospitalizadas em todo o mundo.


Transmisso: via oro-fecal.

Fatores de proteo IgA secretria

Epidemiologia e imunidade
Aos 3 anos de idade 90% apresentam anticorpos sricos contra
um ou mais tipos.
Infeces sintomticas so mais comuns entre 6 meses e 2 anos

de idade
Lactentes c/ menos de 6 meses so protegidos por anticorpos maternos IgA (leite materno)

Patogenia
Infectam as clulas das microvilosidades do I.D.
Codifica uma protena (NSP4) enterotoxina.

Descamao das clulas lesadas liberao de


vrus que aparecem nas fezes (at 10 partculas / grama).

H substituio de clulas lesadas por clulas imaturas


da cripta.

Diagnstico laboratorial
Demonstrao do vrus em amostra de fezes colhidas no

estgio inicial da doena.


Testes como ELISA p/ detectar elevaes nos ttulos de anticorpos Teste de aglutinao indireta (ltex) desenvolvido pela Fiocruz

Tratamento e controle
Reposio de lquido e restaurao do equilbrio
eletroltico por via intravenosa ou oral

Medidas de controle: o tratamento dos dejetos e a melhora das condies sanitrias.

Tratamento e controle
Vacinas orais de vrus vivos atenuados esto disponveis para
aplicao -1 dose: - Deve ser aplicada aos 2 meses de idade 1 ms e 15 dias a 3 meses e 7
dias de vida)

- 2 dose: - Deve ser aplicada aos 4 meses de idade 3 meses e 7 dias de vida a 5
meses e 15 dias de vida