Instituto Superior Tcnico Mestrado Integrado em Engenharia do Ambiente e Mestrado Integrado em Engenharia Biolgica Disciplina de Bioqumica e Biologia Molecular

Trabalho Prtico n1

Anlise de protenas por electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Realizado por:
Ana Rita Silva n66244 Patrcia Ribeiro n66245 Sara Cipriano n66247

ndice
ndice.............2 Objectivos...3 Introduo Terica...3 Material......5 Reagentes e Auxiliares .....5 Procedimento Experimental.....6 Interpretao dos Resultados e/ou Questes Adicionais..5 Discusso dos resultados..7 Bibliografia.8

Objectivos
Preparao de geis de poliacrilamida para separao de protenas por electroforese.

Introduo Terica
As protenas constinuem uma vasta classe de biomolculas que desempenham diversas funes nos mais diversos organismos. Para analisar simultaneamente um to grande e variado grupo de compostos, necessrio recorrer a tcnicas que utilizem uma propriedade comum a todos esses compostos, mas que simultaneamente evidenciem pequenas variaes no seu comportamento, de modo a que as vrias molculas sejam diferenciadas. A electroforese uma tcnica bastante utilizada, j que se baseiam no facto de todas as protenas apresentarem uma carga elctrica global quanto colocadas num meio de pH diferente do seu pondo isoelctrico. Assenta ento na separao de macromolculas por aplicao de um campo elctrico. Quando o campo elctrico aplicado a uma soluo de protenas, estas molculas migram numa direco e com uma velocidade que reflectem a sua dimenso (massa molecular) e carga global. A separao de protenas tornou-se ento possvel com o desenvolvimento da electroforese em gel de poliacrilamida ou PAGE, em que s amostras a separar adicionado o detergente SDS, pelo que a que a tcnica habitualmente conhecida por SDS-PAGE. O detergente SDS usado para desnaturar protenas com vrias subunidades e para cobrir as molculas da protena com cargas negativas. Deste modo, a carga intrnseca protena alterada (se no for j negativa), e a razo carga/massa torna-se constante. Assim, as protenas so separadas em funo do seu tamanho, em que as amostras aplicadas no gel migram no sentido do elctrodo positivo. A mistura reaccional no gel inclui, para alm da acrilamida a polimerizar, bis-acrilamida que funciona como crosslinking, persulfato de amnio (PSA) usado como perxido iniciador, j que a reaco de polimerizao da acrilamida catalizada pela presena de radicais livres, e TEMED que actua como catalisador da reaco. Como o oxignio da atmosfera tem a capacidade de remover radicais livres, a mistura deve ser protegida desse factor, j que a reaco de polimeralizao pode ser inibida. Para isso junta-se mistura um pouco de isopropanol, que alm de impedir que esta esteja em contacto com o ar, garante a uniformidade do gel. A densidade da acrilamida nos gis determinar a velocidade de migrao e a capacidade de separao das protenas. A corrida simultnea de protenas de peso molecular conhecido (marcador de pesos moleculares), permite determinar para cada gel a relao entre peso molecular e distncia de migrao. Para protenas com pesos moleculares dentro da gama til possvel estabelecer uma relao linear entre o logaritmo do peso molecular e a distncia de migrao no gel. A separao de protenas por SDS-PAGE permite tambm determinar a abundncia relativa de protenas numa amostra, caso estas se encontrem bem separadas no gel. No entanto, a utilizao de apenas este mtodo no permite a identificao e quantificao de protenas em misturas mais. O fraccionamento de extractos proteicos por electroforese em gel pode tambm ser utilizado para separar protenas com o objectivo de determinar a sua actividade. Nesse caso, a escolha dos diversos tampes a

utilizar leva em conta a necessidade de manter a conformao nativa das protenas, ou seja, so usadas condies no desnaturantes. Evidentemente que o detergente SDS, como altera desnatura protenas, no pode ser utilizado, pelo que as velocidades de corrida no gel no so proporcionais dimenso da protena, dependendo tambm da sua carga e conformao.

Material
- Pipeta automtica; - Micropipetas; - Microtubos; - Ponteiras; - Centrfuga; - Papel de filtro; - Sistema de electroforese; - Larfilm; - Secador de gis; - Espaador; - Microondas; - Gelo; - Placas de vidro, slica e alumina.

Reagentes e Solues
- Tris base; - SDS; - Acrilamida; - Bisacrilamida; - Glicina; - Glicerol; - Tris.Cl; - Azul de Bromofenol; - DTT; - Coomassie blue R-250; - cido Actico; - Etanol; - gua destilada; - PSA (10%); - TEMED; - Mistura de protenas.

Procedimento experimental
Separao electrofortica de protenas por SDS-PAGE
Preparao do sistema para fazer o gel. Preparar o gel de resoluo (12.5% de acrilamida), juntando 1.25 ml de soluo I, 2.08 ml de soluo de acrilamida, 1.64 ml de gua destilada, 8 l de TEMED e 33 l de persulfato de amnia 10%. Misturar cuidadosamente e pipetar imediatamente a soluo entre as placas de vidro e slica at uma altura de aproximadamente 6 cm. Colocar uma camada de 1 ml de isopropanol de forma a obter uma superfcie plana. Deixar polimerizar. Aps a polimerizao remover o isopropanol com papel absorvente. Preparar o gel de concentrao (6% acrilamida) juntanto 0.4 ml de soluo II, 0.4 ml de soluo de acrilamida, 1.2 ml de gua destilada, 4 l de TEMED e 12 l de persulfato de amnia 10%. Misturar cuidadosamente, encher as placas com esta soluo e colocar o pente. Deixar polimerizar. Montar o sistema de electroforese e preencher os tanques com tampes de electroforese 1x. Preparar as amostras para aplicao no gel, juntando 20 l de cada uma das fraces de polimerizao com 5 l de tampo da amostra. Ferver durante 5 minutos. Proceder electroforese aplicando uma voltagem constante de 150 volts durante 1 hora. Retirar o gel e coloc-lo numa soluo corante. Levar ao microondas 30 segundos e agitar 10 minutos. Colocar o gel numa soluo descorante. Levar ao microondas 30 segundos e agitar 10 minutos. Findo este tempo devem-se ver as bandas de protenas.

Preparao e aplicao da amostra no gel

Adicionar a cada amostra de protena um volume idntico de tampo de amostra. Ferver 2 minutos e colocar em gelo at aplicao no gel. Com a ajuda da pipeta automtica, aplicar as amostras e padres no gel que foi j previamente preparado. Colocar a soluo de electroforese nas tinas superior e inferior do aparelho de electroforese. Colocar a tampa da camada de electroforese, fazendo a conexo dos elctrodos. Ligar os elctrodos fonte de electroforese, tendo em ateno a respectiva polaridade. As protenas iro migrar para o plo positivo. Colocar o boto que regula a voltagem no mximo, de forma a esta no ser limitante. Regular o boto de intensidade de corrente para um valor correspondente a 20 mA por gel. Deixar que a migrao do azul de bromofenol atinja o fim do gel de resoluo.

Desligar a fonte de energia, desligar os elctrodos, remover a tampa da cmara, despejar a soluo de electroforese, e remover a sanduche retirando as respectivas molas . Com o auxlio de um espaador, separar as duas placas, a de vidro e a de alumnio.

Colorir as protenas no gel

Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo soluo corante com azul de Coomassie. Deixar a corar durante 15-20 minutos. Retirar o gel para uma caixa contendo gua destilada. Escorrer a gua e lavar novamente com gua destilada. Escorrer a gua e adicionar soluo descorante. Agitar durante 5-10 minutos. Repetir o ponto anterior at observar nitidamente as bandas correspondentes s vrias protenas. Colocar o gel sobre um pedao de papel de filtro grosso (3MM), cubrir com Larfilm e secar no secador de gis.

Resultados

Fotografia do gel com as protenas coradas

Protenas padro

Distncia origem (pixeis) Phosphorylase B Bovine Serum Albumin Ovalbumin Carbonic Anhydrase Soybean Trypsin Inhibitor Lysozyme 36 64 89 125 148 164

Valores tabelados (Daltons) 97,400 66,200 45,000 31,000 21,500 14,400

Valores tabelados (log PM) 1,989 1,821 1,653 1,491 1,332 1,158

Grfico Distncia vs Log. do Peso Molecular

2,5

Log do Peso Molecular

2 1,5 y = -0,0062x + 2,217 1 0,5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Distncia (Pixeis)

A partir dos valores-padro fornecidos no laboratrio conseguimos fazer um grfico com duas variveis: o logaritmo do peso molecular e a distncia percorrida pelas protenas no gel. Ajustou-se uma recta ao grfico obtido e a equao da recta permitir-nos- estimar o peso molecular de protenas desconhecidas. Obteve-se a seguinte equao para a recta: y = - 0,0062x + 2,217

Clculo dos pesos moleculares das protenas: Frmulas: y = -0,0062x + 2,217 y = log (PM) x a distncia em pixis PM = 10y Protena 1: Distncia percorrida: 62 Pixeis Valor do Logaritmo do peso molecular: 1,8326 Valor do peso molecular: 68,0143 daltons Protena 2: Distncia percorrida: 109 Pixeis Valor do Logaritmo do peso molecular: 1,5412 Valor do peso molecular: 34,6696 daltons Protena 3: Distncia percorrida: 117 Pixeis Valor do Logaritmo do peso molecular: 1,4916 Valor do peso molecular: 31,0170 daltons Protena 4: Distncia percorrida: 130 Pixeis Valor do Logaritmo do peso molecular: 1,411 Valor do peso molecular: 25,7632 daltons Protena 5: Distncia percorrida: 159 Pixeis Valor do Logaritmo do peso molecular: 1,2312 Valor do peso molecular: 17,0294 daltons

Discusso de resultados
Os resultados obtidos correspondem ao esperado, visto que as protenas com menor peso molecular chegaram mais longe no gel.

Bibliografia
Internet:
http://www.quiprocura.net/prot.htm

http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=246&ordem=2 Livros: "Organikum", Becker et al, 1997, 2 Ed., Fundao Calouste Gulbenkian Protocolos das aulas de laboratrio de Bioqumica e Biologia Molecular Bioqumica, Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer, 2002, 5 Ed., W. H. Freeman and Company