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INSTITUTO TECNOLGICO DE MORELIA Jos Mara Morelos y Pavn

TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA Qumica analtica II Eliel Rafael Romero Gracia

INGENIERA BIOQUMICA
5st SEMESTRE MARA CRISTINA VIEYRA BRAVO No control: 09120036 Mircoles 04 de Mayo del 2011

Contenido
INTRODUCCIN............................................................................................................................................................. 3 Cmo diferenciar la turbidimetra y la nefelometra? ............................................................................ 5 DEFINICIONES ............................................................................................................................................................... 6 Turbidimetra ............................................................................................................................................................ 6 Nefelometra .............................................................................................................................................................. 6 Eleccin entre turbidimetra y nefelometra ................................................................................................ 7 TURBIDIMETRA ........................................................................................................................................................... 8 Dispersin de la radiacin por partculas en disolucin ......................................................................... 8 Turbidimetra fundamento .................................................................................................................................. 8 Turbidmetros ........................................................................................................................................................... 9 NEFELOMETRA ......................................................................................................................................................... 10 Procedimiento analtico .......................................................................................................................................... 11 Relacin matemtica ........................................................................................................................................... 12 Nefelmetro ............................................................................................................................................................ 13 TURBIDIMETRA VS NEFELOMETRA .............................................................................................................. 14 Tamao de las partculas dispersantes........................................................................................................ 14 Seleccin de la longitud de onda..................................................................................................................... 14 Preparacin de la muestra ................................................................................................................................ 14 APLICACIN ................................................................................................................................................................. 15 Imunoprecipitacin.............................................................................................................................................. 15 Inmunodifusin radial ........................................................................................................................................ 15 Inmunodifusin doble o tcnica de Ouchterlony..................................................................................... 16 CONCLUSIN ............................................................................................................................................................... 17 REFERENCIAS ............................................................................................................................................................. 17

INTRODUCCIN
Los mtodos pticos de anlisis cubren un amplio campo de aplicaciones debido a su rapidez, a la gran gama de instrumentacin disponible y sus grandes posibilidades de automatizacin. Los mtodos no espectroscpicos son aquellos en los que no hay intercambio de energa, sino cambios en la direccin o en las propiedades fsicas de la radiacin electromagntica La dispersin de radiacin es un fenmeno fisicoqumico al incidir una radiacin sobre una superficie slida, lquida o gaseosa y ser dispersa en diferentes direcciones debido a la difraccin y reflexin de la radiacin por las distribucin y orientacin de las molculas sobre las cual inside la radiacin. Cuando un haz de luz choca con una partcula en suspensin parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersin de la luz depende de: la longitud de onda de la luz, del tamao de la partcula y del ndice de refraccin de la partcula en relacin con el medio que la rodea.

La dispersin de la luz se puede medir por turbidimetra o por nefelometra.

La turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una suspensin de partculas utilizando para ello un espectrofotmetro (detector en la misma direccin del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminucin de la luz transmitida) ejemplo:

Determinacin de protenas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las protenas precipiten con TCA o cido sulfosaliclico).

La nefelometra: mide la luz dispersada en direccin distinta a la luz emitida (generalmente con ngulos que oscilan entre 15 y 90). Utiliza como instrumento el nefelmetro en el que el detector se ubica con un ngulo que oscila entre 15 y 90 ejemplo:

A 90). Se suele utilizar para concentraciones ms diluidas.

La turbidimetra y la nefelometra tienen una gran variedad de aplicaciones y permite trabajar con muestras gaseosas, liquidas e incluso con slidos transparentes. La formacin de precipitados difciles de filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de tamao de partcula muy pequeo, suelen proporciona suspensiones ideales para la aplicacin de tcnicas basadas en la dispersin de la luz que sustituye a las tcnicas gravimtricas. Este tipo de aplicaciones son frecuentes en laboratorios analticos, laboratorios clnicos y en plantas de procesos. Uno de los principales campos de aplicacin reside en estudios de polucin de aire y agua, donde

las dos tcnicas se usan para determinar la transparencia y controlar el tratamiento de aguas potables, efluentes de plantas de tratamiento de aguas y otros tipos de aguas ambientales. Las medidas de dispersin de la luz se utilizan tambin para determinar la concentracin de humos, polvo, niebla, aerosoles, etc. A pesar de que los trminos turbidimetra y nefelometra suelen restringirse a aquellas aplicaciones en las que se mide la concentracin de partculas en suspensin existen tambin otros tipos de aplicaciones basados en las medidas de dispersin de la luz. Entre ellas podemos citar la determinacin de la forma y tamao de las partculas as como la de los pesos, moleculares (especialmente en el caso de polmeros).

Cmo diferenciar la turbidimetra y la nefelometra? Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia La turbidez es la propiedad ptica de una muestra que hace que la radiacin sea dispersada y absorbida ms que transmitida en lnea recta a travs de la muestra. La turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un lquido. Hay dos mtodos para medir la turbidez de una muestra, la turbidimetra y la nefelometra. Son dos tcnicas complementarias que se utilizan para el anlisis cuantitativo de disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo. En la turbidimetra se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega a la disolucin. En cambio, en la nefelometra la medida de la intensidad de luz se hace con un ngulo de 90 con respecto a la radiacin incidente. El instrumento usado en la nefelometra, el nefelmetro se asemeja al fluormetro. En cambio en turbidimetra se utiliza el turbidemetro que es un fotmetro de filtro.

DEFINICIONES
Turbidimetra Es un mtodo en el que se mide la disminucin de la potencia de la radiacin transmitida debido a la dispersin. Se mide en un espectofotmetro UV/Vis. Para determinar la concentracin del analito mediante este mtodo aplicamos:

En donde T es la transmitancia medida transmitida, relacin entre

, es la intensidad de la fuente de radiacin

es la intensidad de la radiacin de la fuente transmitida por un blanco. La y la concentracin de las partculas dispersas es similar a la proporcionada

por la ley de Beer:

Siendo volumen;

la concentracin de las partculas dispersantes expresada como masa por unidad de es la longitud del camino ptico y es una constante que depende de varios

factores: tamao, forma de las partculas dispersantes y la longitud de onda.

Nefelometra Es un mtodo para medir la intensidad de una radiacin dispersa en un ngulo de 90 C con respecto a la fuente. Se mide en un espectrofluormetro. Para determinar la concentracin de analito en este mtodo aplicamos:

Donde

es una constante emprica del sistema,

es la intensidad de la fuente de radiacin

incidente. El valor de

depende de una curva de calibracin preparada, usando una serie de

patrones de concentracin conocida.

Eleccin entre turbidimetra y nefelometra La eleccin entre turbidimetra y nefelometra viene dada por dos factores: Intensidad de la radiacin transmitida o dispersada con la intensidad de la radiacin procedente de la fuente. Cuando la concentracin de partculas dispersantes en la disolucin es pequea, ser muy similar a . Por lo que la mejor eleccin cuando la muestra contiene pocas partculas dispersantes es la nefelometra. La turbidimetra es una buena tcnica para cuando las muestras contienen grandes concentraciones de partculas dispersantes. Tamao de las partculas dispersantes. En la nefelometra la intensidad de la radiacin dispersada a 90C es mayor si las partculas son bastante pequeas para que se produzca una dispersin Rayleigh. Si las partculas son mayores la intensidad de la dispersin disminuir a 90C. En turbidimetra la seal consiste en la disminucin relativa de la radiacin transmitida, por lo que el tamao de las partculas dispersantes es menos importante. Generalmente, nefelometra y turbidimetra se utilizan en el anlisis de la calidad qumica del agua para determinar la claridad y para el control de los procesos de tratamiento. Tambin se utilizan para la determinacin de iones sulfato.

TURBIDIMETRA
Dispersin de la radiacin por partculas en disolucin. Cuando un haz de luz monocromtica, de longitud de onda no absorbible choca contra las partculas de una sustancia que est en suspensin, cambia la direccin de propagacin del haz de luz (en realidad slo cambian de direccin algunos fotones del haz). Este efecto es usado para determinar la presencia de un analito en suspensin ya que ese cambio de direccin del haz y de su intensidad depende de muchos factores que una vez relacionados y cuantificados permiten obtener los valores buscados. Cuando un haz de radiacin monocromtica de una longitud de onda determinada , es enfocada sobre un medio que contiene partculas de dimensiones menores a 3/2 , se observa dispersin de radiacin en todas las direcciones del espacio. Si la partcula presenta mayores tamaos, la radiacin puede ser reflejada o refractada. Existen dos tipos de dispersin: 1. Elstica: radiacin es absorbida por el analito y reemitida sin cambios en la energa de la radiacin. Es el caso de la dispersin Raileigh o las dispersiones de grandes partculas. 2. Inelstica: la radiacin es absorbida y reemitida con cambios en su energa.

Turbidimetra fundamento La turbidimetra puede realizarse en espectrofotmetros de visible o violeta. Cuando la concentracin de partculas en suspensin se mide por turbidimetra, la suspensin se pone en una cubeta similar a un tubo de ensayo, que permite realizar las medidas de las energa incidentes y transmitidas. La fuente de radiacin ms frecuentemente usadas es la lmpara de wolframio, pero pueden utilizarse otras fuentes de radiacin visible. Si ponemos en la cubeta suspensiones coloreadas se debe usar un filtro para evitar que influya sobre los resultados dando valores excesivamente altos. Los Turbidmetros pueden incorporar cualquier detector que sea sensible a la longitud de onda transmitida.

Existe una relacin matemtica determinada experimentalmente:

Donde: P: es la energa de la radiacin transmitida. P: es la energa de la radiacin incidente. b: espesor de la cubeta. C: concentracin de partculas disertantes por unidad de volumen. f : constante que depende del tamao partcula y longitud de onda.

Si aplicamos logaritmos, el trmino logaritmo se le denomina como deducido de la expresin anterior, y tomando

, es lo que se conoce como turbidez. Si a ese ; entonces, como una constante, tenemos que:

, sabiendo que T= It/Io=P/P`

Turbidmetros Casi todas las medidas turbidimetricas se realizan con colormetros o espectrofotmetros ordinarios. Tambin pueden usarse instrumentos visuales sencillos, tales como el trubidmetro Parr o el colormetro Duboscq. La presente imagen representa el esquema de un trubidmetro, el Du Pont Modelo 430. Este turbidmetro, que es mucho ms sensible que los Turbidmetros ordinarios para concentraciones bajas de materia en suspensin, se basa en el hecho de que la dispersin provoca un cambio en el plano de polarizacin de la luz.

Diagrama esquemtico de un trubidmetro Du Pont modelo 430.

El haz incidente se convierte en luz polarizada en un plano mediante el polarizador primario. Despus de atravesar la muestra el haz se divide en dos, mediante un espejo semi-plateado, y se detecta con dos fototubos separados. Cuando la disolucin de la muestra no tiene partculas en suspensin, la fotoclula 1 da una respuesta mxima y la fotoclula 2 da una respuesta mnima nula. La relacin entre la seal 2 y la seal 1 es una media de la concentracin de las partculas en suspensin. Al aumentar la concentracin de las partculas en suspensin en la muestra, aumenta la seal de la fotoclula 2 y disminuye la de la fotoclula 1 y por esto la razn de las dos seales permite una medida sensible de la turbidez. Este sistema de doble haz minimiza el problema debido a la absorcin por las partculas de la disolucin pero tiene el inconveniente de que no puede usarse cuando la disolucin contiene sustancias pticamente activas. Este instrumento puede usarse tanto para muestras individuales como para control en continuo de corrientes de fluidos.

NEFELOMETRA
Se basa en la deteccin de los complejos Ag-Ab, por la refraccin que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antgeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos lser y se establece una relacin entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados. La nefelometra es un procedimiento analtico que se basa en la dispersin de la radiacin que atraviesan las partculas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo. La intensidad depende de: el nmero de partculas suspendidas, su tamao, su forma, los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiacin dispersada. La relacin entre variables y es ms factible un tratamiento terico, pero debido a su complejidad raras veces se aplica a problemas analticos especficos.

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El procedimiento generalmente es emprico y slo se consideran 3 factores: 1. La concentracin: Mayor sea el nmero de partculas, mayor es la dispersin. 2. Tamao de la partcula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentracin de los reactivos, duracin del estado de reposo y la fuerza inica. 3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si estn coloreadas, se debe escoger una porcin del espectro electromagntico en la que la absorcin del medio se reduzca al mnimo. En las muestras se agregan agentes tensoactivos (como gelatina), para prevenir la coagulacin del coloide. Slo se obtienen datos confiables si se controlan escrupulosamente las variables que afectan el tamao de partculas.

Procedimiento analtico Se basa en la dispersin de la radiacin que atraviesan las partculas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo. La intensidad depende de: el nmero de partculas sus pendidas, su tamao, su forma, los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiacin dispersada. Cuando la concentracin de una suspensin de partcula es baja es preferible medirla por este mtodo. En este caso la suspensin se coloca en una cubeta colocada como se muestra en la figura siguiente.

Fuente

Filtro

Cubeta

Detecto r

El instrumento permite la medida de la intensidad de la dispersin S, la cual est relacionada con la concentracin. Las fuentes de radiacin que se utilizan son de lser helio-nen, lmparas de halgenos y lmparas de xenn, siendo el ms frecuente el primero.

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Este consiste en un tubo largo y estrecho en el cual se introduce una mezcla de gas formada por 7 partes de helio y 1 parte de nen al que se le aplica un voltaje para producir una descarga elctrica. Relacin matemtica La relacin matemtica entre la intensidad de dispersin, S y la concentracin de partculas suspendidas es raramente utilizada es suficiente con saber que existe una relacin lineal entre ellas a bajas concentraciones. Sin embargo la relacin matemtica que cumplen es

Donde: C: es la concentracin en% : es la radiacin dispersada : es la radicacin de la fuente incidente : es una constante | Fuente C Cu S Tf C: filtro Cu: cubeta (v. superior) Cr: colector de radiaciones negro Tf: tubo fotomultiplicador El valor del ngulo oscila entre 30 y 70, su valor depende de la aplicacin especfica seleccionada. P ngulo Cr

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Nefelmetro Un nefelmetro es un instrumento para medir partculas suspendidas en un lquido. Esto lo hace empleando una fotocelda colocada en un ngulo de 90 con respecto a una fuente luminosa. La densidad de partculas es entonces una funcin de la luz reflejada por las partculas a la fotocelda. Cuanta ms luz se refleje en una determinada densidad de partculas depende de las propiedades de las partculas como su forma, color y reflectividad. Estableciendo a una correlacin de trabajo entre turbidez y slidos suspendidos (que ms til, pero generalmente una ms difcil de cuantificacin de partculas) debe ser establecido independientemente para cada situacin. A los nefelmetros usados en las pruebas de calidad del agua, comnmente se les llaman turbidmetros. Sin embargo, pueden haber diferencias entre los modelos de turbidmetros, dependiendo del arreglo geomtrico de la fuente luminosa con respecto a la fotocelda. Un turbmetro nefelomtrico siempre monitorea la luz reflejada por las partculas y no la atenuacin debida a la turbidez.

Nefelmetro C-102 Este nefelmetro realiza un anlisis de agua casi completo: cloro libre y total, bromo, pH, hierro, yodo y cido cianrico. En el modo de medicin de turbiedad puede elegir entre los valores de calibracin dados o los valores definidos por el usuario. Por medio del reloj de tiempo real integrado puede recuperar presionando la tecla los ltimos datos de calibracin. En el rango de medicin de turbiedad se puede poner un punto de calibracin libre entre 0,0 y 50,0 NTU (NTU Nephelometric Turbidity Unit = FTU Formazin Turbidity Unit / Ratio 1:1). La turbiedad se mide con el mtodo USEPA.

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TURBIDIMETRA VS NEFELOMETRA
Tamao de las partculas dispersantes Para nefelometra, la intensidad de la radicacin dispersada a 90 ser mayor cuanto menos sea el tamao de las partculas. Para partculas mayores, la intensidad de la dispersin a 90 disminuye. Cuando se usa una fuente de radicacin de UV/VIS, el tamao de partcula optimo para nefelometra es de 0.1 a 1 m. para turbidimetra, fenmeno menos dependiente de la , en cambio el tamao de las partculas es menos importante; en este caso la seal es la disminucin relativa de la radiacin trasmitida. De hecho, las medidas turbidimetricas son aun posibles cuando el tamao de las partculas dispersantes producen un aumento de la reflexin y refraccin (aunque la relacin lineal entre la seal y la concentracin de las partculas dispersantes no puede mantenerse mucho ms).

Seleccin de la longitud de onda Con esta seleccin se minimiza las posibles interferencias 1. Turbidimetria: como se mide la radiacin trasmitida a travs de la muestra, es necesario evitar la absorcin de la radiacin por la muestra. 2. Nefelometra: la absorcin de la radiacin incidente no es un problema excepto su induce fluorescencia en la muestra. Sin una muestra fluorescente no hay necesidad de seleccin de , y puede usarse una fuente de luz blanca.

Preparacin de la muestra La intensidad de la radiacin dispersada est influenciada por la forma y tamao de las partculas. Para un anlisis cuantitativo es necesario, por lo tanto mantener la distribucin de las partculas uniformemente en la muestra y los patrones. La mayora de los mtodos de turbidimetra y nefelometra depende de la formacin de partculas por precipitacin.

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APLICACIN
Imunoprecipitacin La imunoprecipitacin cuantificada por turbidimetra o nefelometra se emplea hoy en ls laboratorios de autoinmunidad para determinar el factor reumtide. Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partculas que produzcan una dispersin de luz no deseada ej. lipoprotenas, quilomicrones Tambin puede interferir la suciedad. La intensidad de la luz dispersada. Las protenas suelen tener un pico de absorcin en el ultravioleta y los cromgenos del suero entre 400-425nm; por todo ello se suele trabajar a frecuencias que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm. Muy frecuentemente, para cuantificar protenas concretas, se utilizan anticuerpos que reaccionan con dichas protenas de la muestra, en este caso se habla de inmunoturbidimetra e inmunonefelometra. Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac especfico contra ese antgeno ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rpidamente pero, existe una segunda fase de crecimiento de complejos ms lenta y, es precisamente en sta fase en la que aparece la dispersin de la luz. As, en la inmunoturbidimetra e inmunonefelometra se mide la dispersin de la luz provocada por los complejos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a bolitas de ltex para aumentar el tamao de los complejos (inmuno-anlisis potenciados). La inmunoprecipitacion, se utilizan partculas de ltex recubiertas con IgG. Existen muchos equipos comerciales para como analizadores automticos de bioqumica o nefelmetros automticos, y sus mtodos estn estandarizados con calibradores que se basan en preparaciones de referencia.

Inmunodifusin radial En este caso se aade un antisuero especfico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estndares de protenas y problemas (antgenos). El antgeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. En la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitacin

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Inmunodifusin doble o tcnica de Ouchterlony Se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrn de roseta. Sedepositan antisueros especficos en los pozos centrales y los estndares de protenas y los problemas en los pozos circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antgeno alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posicin y forma de la banda se determinan segn la concentracin del antgeno y del anticuerpo, y sus tamaos. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antgeno presente. Determinacin de protenas en orina y de anticuerpos en suero

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CONCLUSIN
Los mtodos pticos de anlisis cubren un amplio campo de aplicaciones dentro de las Tcnicas basadas en la dispersin de radiacin tenemos la turbidimetra y la nefelometra. Las cueles nos regularmente utilizadas en control de calidad, pero gracias al avances de diversas maquinarias, nos es posible poder aplicar estos mtodos de anlisis dentro de otras ramas cientficas, ya sean salud o investigacin. Estas dos tcnicas estn basadas generalmente en la formacin de un precipitado, del cual se parte para el anlisis. Ambas tcnicas permiten la descripcin y anlisis ptico una muestra. Y el uso de estas tcnicas de investigacin depende de las necesidades del investigador. Las diferencias entre las dos tcnicas son especificas y permiten le anlisis desde dos campo de la ptica muy importante dentro de los laboratorios. La turbidimetra y la nefelometra se acoplan para un mejor enfoque del anlisis.

REFERENCIAS
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