Técnicas de Histología Vegetal

TCNICAS DE
HISTOLOGA
VEGETAL
por
Jos Reig Armiana
Francisco Garca Breijo
Laboratorio de Histologa
Vegetal Julio Iranzo. Jardn
Botnico de Valencia
Departamento de Ecosistemas
Agroforestales. Universidad
Politcnica de Valencia

CONTENIDO
INTRODUCCIN ......................................................................................................................................................... 1
FIJACIN ................................................................................................................................................................... 1
INTRODUCCIN .............................................................................................................................................................. 1
EXAMEN EN FRESCO ........................................................................................................................................................ 1
CONCEPTO DE FIJACIN ................................................................................................................................................ 2
FIJADORES FSICOS ......................................................................................................................................................... 3
EL CALOR ........................................................................................................................................................................................ 3
EL FRO ............................................................................................................................................................................................ 3
LA CRIODESECACIN (LIOFILIZACIN) ............................................................................................................................................. 3
FIJADORES QUMICOS .............................................................................................................................................. 4
ACLARAMIENTO, HIDRATACION Y MACERACIN ................................................................................................... 7
ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO .................................................................................................................................... 7
HIDRATACIN ................................................................................................................................................................. 8
ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO .................................................................................................................................... 8
INCLUSIN ................................................................................................................................................................. 9
INCLUSIN EN HIELO ..................................................................................................................................................... 10
INCLUSIN EN PARAFINA .............................................................................................................................................. 11
CONFECCIN DE LOS BLOQUES ....................................................................................................................................................13
REALIZACION DE LOS CORTES .......................................................................................................................................................13
DESPARAFINACIN E HIDRATADO .................................................................................................................................................13
INCLUSIN EN RESINAS .......................................................................................................................................... 14
CONFECCIN DE LOS BLOQUES DE RESINA................................................................................................................ 14
TINCIONES Y RECONOCIMIENTOS HISTOQUIMICOS ............................................................................ 15
AZUL DE ANILINA (AZUL ALGODN) ............................................................................................................................ 15
AZUL DE LACTOFENOL................................................................................................................................................... 16
AZUL DE METILENO ........................................................................................................................................................ 16
AZUL DE METILENO-ALUMBRE-ROJO DE RUTENIO ........................................................................................................ 17

1

CARMN ACTICO.......................................................................................................................................................... 17
CARMN-VERDE IODO................................................................................................................................................... 18
FLOROGLUCINA ............................................................................................................................................................ 18
FUCSINA BSICA-VERDE DE METILO .............................................................................................................................. 18
FUCSINA BSICA-VERDE LUZ ........................................................................................................................................ 19
HEMALUM DE MAYER .................................................................................................................................................... 19
HEMATOXILINA FRRICA DE HEIDENHAIN ....................................................................................................................... 20
LUGOL .......................................................................................................................................................................... 20
ORCENA ACTICA ........................................................................................................................................................ 21
SAFRANINA-VERDE RPIDO .......................................................................................................................................... 21
SUDN III ...................................................................................................................................................................... 21
TIONINA FENICADA ....................................................................................................................................................... 22
VESUVINA ..................................................................................................................................................................... 22
PREPARACIN DE COLORANTES Y OTROS REACTIVOS ........................................................................ 23
ADHESIVOS Y MEDIOS DE MONTAJE ............................................................................................................................ 23
ACETATO MERCRICO ...................................................................................................................................................................23
ALBUMINA DE MAYER ....................................................................................................................................................................23
COLORANTES ................................................................................................................................................................ 23
AZUL DE ANILINA ...........................................................................................................................................................................23
AZUL DE LACTOFENOL ...................................................................................................................................................................23
AZUL DE METILENO ........................................................................................................................................................................24
AZUL DE METILENO-ALUMBRE ........................................................................................................................................................24
AZUL DE METILENO DE LOEFFLER ....................................................................................................................................................24
CARMIN ACETICO ..........................................................................................................................................................................25
CARMIN ALUMBRE DE GRENACHER ................................................................................................................................................25
CARMIN ALUMBRE .........................................................................................................................................................................25
FABRIL ...........................................................................................................................................................................................25
FLOROGLUCINA ............................................................................................................................................................................26
FUCSINA BASICA DE ZIEHL .............................................................................................................................................................26
GLICEROGELATINA. .......................................................................................................................................................................26

2

HEMALUN DE MAYER .....................................................................................................................................................................27
HEMATOXILINA FERRICA DE HEIDENHAIN ........................................................................................................................................27
LUGOL ..........................................................................................................................................................................................28
ORCEINA ACETICA.........................................................................................................................................................................28
PICROFUCSINA ..............................................................................................................................................................................28
ROJO DE RUTENIO.........................................................................................................................................................................28
SAFRANINA ...................................................................................................................................................................................29
SUDAN III ......................................................................................................................................................................................29
TIONINA FENICADA .......................................................................................................................................................................29
VERDE YODO ................................................................................................................................................................................29
VERDE LUZ .....................................................................................................................................................................................30
VERDE RAPIDO ..............................................................................................................................................................................30
VESUVINA O PARDO BISMARK .......................................................................................................................................................30
CARMN-ACTICO-HIDRATO DE CLORAL PARA FIJACIN Y TINCIN DE PRTALOS .......................................................................30
TINCIONES TEMPORALES .............................................................................................................. 31
PANORMICAS, RECOMENDADAS PARA LA TINCIN DE TALLOS, DE HOJAS, TALLOS Y RACES. ..................................................31
CLORO-IODURO DE ZINC: .............................................................................................................................................................31
ESPECFICAS. .............................................................................................................................................................31
ALMIDN ......................................................................................................................................................................................31
CROMOSOMAS ............................................................................................................................................................................31
TINCIONES Y PREPARACIONES PERMANENTES .................................................................................. 32
PANORMICAS, RECOMENDADAS PARA LA TINCIN DE TALLOS, DE HOJAS, TALLOS Y RACES. ..........................................................32
FABIL: ............................................................................................................................................................................................32
MTODO DE VAN GIESON O TINCIN CON PICROFUCSINA ........................................................................................................32
HEMATOXILINA PICROFUCSINA ..................................................................................................................................................33
RELACIN Y USO DE LOS COLORANTES MS FRECUENTES ................................................................... 33
ESTRUCTURAS VEGETALES DE LAS CUALES, PARA SU ESTUDIO, NO ES NECESARIO OBTENER CORTES ............ 34
OBTENCIN Y PREPARACIN PERMANENTE DE DIVERSOS TIPOS DE MATERIAL ........................................ 34
DIATOMEAS ........................................................................................................................................................................................34
ESPORANGIOS DE HELECHO ...............................................................................................................................................................35

3

ESPORAS DE HONGOS .......................................................................................................................................................................35
POLEN ................................................................................................................................................................................................35
TRICOMAS ..........................................................................................................................................................................................35
ESTOMAS ...........................................................................................................................................................................................36
MATERIALES VEGETALES A LOS QUE RECURRIR ................................................................................. 36
EPIDERMIS CUTINIZADA ..................................................................................................................................................................36
EPIDERMIS CERIFICADA...................................................................................................................................................................36
EPIDERMIS MINERALIZADA ..............................................................................................................................................................36
EPIDERMIS SUBERIFICADA ...............................................................................................................................................................37
PARNQUIMA CLOROFLICO ..........................................................................................................................................................37
COLNQUIMA ...............................................................................................................................................................................37
ESCLERNQUIMA ...........................................................................................................................................................................37
CLULAS PTREAS. .........................................................................................................................................................................37
VASOS CONDUCTORES. ................................................................................................................................................................37
CONDUCTOS RESINFEROS ............................................................................................................................................................38
CONDUCTOS ESENCIALES .............................................................................................................................................................38
BOLSAS DE ESENCIA ......................................................................................................................................................................38
GLNDULAS PELTADAS ..................................................................................................................................................................38
GLNDULAS SSILES ......................................................................................................................................................................38
CMARAS ESTOMTICAS ..............................................................................................................................................................38
LENTICELAS ....................................................................................................................................................................................38
ALMIDN ......................................................................................................................................................................................38
ALEURONA ....................................................................................................................................................................................38
INCLUSIONES CRISTALINAS ............................................................................................................................................................38
PUNTEADURAS ..............................................................................................................................................................................39
BIBLIOGRAFA ............................................................................................................................ 40

4

INTRODUCCIN
Este manual expone en forma clara, sencilla e inmediata las tcnicas que se siguen en el procesa-
miento histolgico para la elaboracin de preparaciones anatmicas, la observacin y el registro
de los tejidos vegetales. Las preparaciones permanentes para estudios microscpicos son indispen-
sables como fuente de informacin bsica, tanto en cualquier investigacin botnica formal como en
la enseanza, en un curso bsico de botnica o en cursos ms especializados o avanzados.
Todas las plantas estn formadas por los mismos tejidos -drmico, fundamental y vascular-, sin em-
bargo, la manera cmo estn organizadas sus clulas dentro de cada uno es muy variable, haciendo
que las diferencias estructurales entre las plantas sean notables y, por lo tanto, los mtodos histol-
gicos para procesarlas sean variados.

FIJACIN
INTRODUCCIN
Antes de entrar en los detalles ms significativos sobre los distintos mtodos que existen para la
fijacin de tejidos vegetales, es necesario resaltar que los mtodos ms sencillos y ms prcticos son
los que no necesitan de la fijacin, pero no siempre son posibles, ya que con frecuencia las muestras
se encuentran alejadas del laboratorio, la capacidad de trabajo tambin es limitada y por tanto
hay que recurrir a los mtodos de fijacin con mayor frecuencia de la que sera deseable.
EXAMEN EN FRESCO
Este mtodo tiene la ventaja de una gran simplicidad y por otra parte no produce alteracin alguna
en las muestras; en histologa animal se presentan grandes inconvenientes para su uso, puesto que
slo puede utilizarse, bien para organismos vivos de pequeo tamao o bien para piezas sumergi-
das durante un tiempo limitado en lquidos fisiolgicos (solucin de Ringer, solucin de Locke, solucin
de Tyrode, etc.). Los vegetales presentan ventajas sobre los animales, ya que se pueden fcilmente
cultivar en el laboratorio o bien llevarlos desde el campo al mismo sin que los procesos de lisis se
presenten con la rapidez que ocurren en los tejidos animales.
Aun teniendo estas ventajas sobre los tejidos animales, con mucha frecuencia debe recurrirse en his-
tologa vegetal al uso de fijadores, bien porque las muestras se recojan lejos del laboratorio durante
campaas botnicas ms o menos amplias o porque los trabajos se prolonguen excesivamente debido
a largos tratamientos, por lo que es necesario recurrir a la fijacin de las muestras a estudiar.
Tambin queremos llamar la atencin sobre las tcnicas de fijacin que se van a emplear y describir,
ya que se refieren nicamente a tcnicas para microscopa ptica, obviando las de microscopa elec-
trnica, tanto de barrido como de transmisin.

1

CONCEPTO DE FIJACIN
Se entiende por fijacin toda manipulacin sobre un ser vivo, o bien sobre parte de l, que tiene
por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como qumica lo ms inalterada posible,
de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas caractersticas que cuando dicho
ser o tejido estaban vivos. Es claro que la mayora de la estructura celular se debe a la presencia
de protenas y, por tanto, todo proceso de fijacin debe tener en cuenta la naturaleza qumica de
stas, de forma que el fijador no reaccione con las mismas. Es cierto que existen componentes muy
distintos, ms o menos lbiles, que tambin se encuentran formando parte de la estructura celular,
pero son las protenas las que nos van a reflejar fundamentalmente si un fijador es o no bueno. Por
otra parte, un fijador prepara tambin de alguna forma el tejido o la clula para la posterior
manipulacin, bien en el proceso de inclusin, actuando como mordiente o como fijador del colorante
dependiendo de su naturaleza, por eso es importante la eleccin del fijador.
Por otra parte hay que distinguir bien entre fijador y conservador, ya que con frecuencia, y sobre
todo en histologa vegetal, se tienen conceptos errneos al respecto. Un conservador es aquella
sustancia, o bien fenmeno fsico, que evita la autolisis cadavrica, pero que una vez eliminada su
accin, la muestra o la clula, quedan a merced de sus propios enzimas lisgenos y son, por tanto,
susceptibles a la autodestruccin. Son conservadores: el fro, y ciertos lquidos como los de Petit, de
Ripert, etc. As pues, una pieza que se ha mantenido durante un tiempo en un conservador debe ser
fijada rpidamente antes de cualquier estudio o manipulacin, ya que de no hacerse se corre el
peligro de que sufra graves alteraciones. Un fijador, por el contrario, inmoviliza y estabiliza los
elementos celulares, bien sea por precipitacin de las protenas y dems sustancias celulares activas,
ya sea mediante un bloqueo qumico de su actividad, siendo estos fenmenos permanentes.
En resumen, un fijador tiene como misin:
Evitar la autolisis debida a los propios enzimas.
Proteger el corte o la pieza del ataque bacteriano.
Insolubilizar los componentes celulares que se desean estudiar.
Preparar a las distintas estructuras para posteriores tratamientos.
Evitar la disolucin de determinados compuestos en el fijador.
Conservar o provocar determinadas reacciones qumicas.
Mantener las propiedades fsicas.
Para la eleccin de un fijador hay que tener en cuenta, adems de lo sealado anteriormente, unas
caractersticas que son intrnsecas al mismo, como son la velocidad de penetracin, la velocidad de
fijacin y el coeficiente de endurecimiento, as como el efecto de retraccin. Estos factores son de gran
importancia a la hora de elegir un fijador; sobre todo, en histologa vegetal. Es muy importante el
coeficiente de endurecimiento y el efecto de retraccin, ya que de por s los tejidos vegetales son
frecuentemente duros y estos dos fenmenos contribuyen a una mayor elasticidad de los tejidos, con
el consiguiente posible perjuicio a la hora de manipularlos para obtener los cortes. Menos impor-
tancia tienen quizs el poder de penetracin y la velocidad de fijacin, ya que como se ha indicado
anteriormente los procesos de lisis en los tejidos vegetales son ms lentos en trminos generales que

2

en los tejidos animales; en cuanto a la velocidad de penetracin y de fijacin, son muy distintas, ya
que un fijador puede tener una gran velocidad de fijacin y un bajo poder o velocidad de pene-
tracin o viceversa. Por tanto la eleccin de un fijador es un problema de suma importancia en
histologa vegetal. Un fijador ideal sera aquel que tuviera una gran velocidad de penetracin y
fijacin y unos coeficientes de retraccin y endurecimiento lo ms bajos posibles.
Los fijadores que se usan para el tratamiento de los tejidos vegetales son prcticamente los mismos
que se utilizan en histologa animal; las clulas vegetales presentan, sobre todo en la pared celular,
una estructura celulsica o bien una impregnacin o sustitucin de sta por compuestos distintos como
la lignina, suberina, etc., que diferencia totalmente a los vegetales de los animales. El comporta-
miento de los fijadores al menos a este nivel es muy distinto; si a ello unimos que los estudios de los
efectos sobre las estructuras celulares vegetales son prcticamente nulos, nos encontramos con un
problema serio a la hora de elegir un fijador. En histologa animal se saben la mayora de los
efectos de retraccin, endurecimiento, etc., que presentan cada uno de los fijadores utilizados, cosa
que no se conoce cuando se trata de tejidos vegetales. nicamente la experiencia y los ligeros
conocimientos de qumica permiten al histlogo vegetal poder elegir un fijador que le ofrezca ciertas
garantas; desgraciadamente, estos conocimientos no estn reflejados en los textos de tcnicas his-
tolgicas ni en los de histologa vegetal.
Vamos a dar un listado de los fijadores ms frecuentes y a discutir brevemente sus distintas carac-
tersticas. Los fijadores se pueden clasificar en dos grupos: fijadores fsicos y fijadores qumicos.
FIJADORES FSICOS
Son varios los fijadores fsicos que usualmente se utilizan en histologa, sobre todo por su simplicidad,
pero la mayora de ellos debemos desecharlos, porque alteran gravemente la estructura de los
vegetales.
EL CALOR
Es el ms antiguo y ms utilizado de estos fijadores. Tanto en microbiologa, como en frotis de clulas ani-
males, la fijacin se hace a la llama, con lo que se obtiene una coagulacin rpida de las protenas y por
tanto su estabilizacin. Esta tcnica no es recomendable cuando de se trata de tejidos vegetales, puesto que
produce retracciones importantes y muy desiguales en la paredes celulares.
EL FRO
Como anteriormente hemos mencionado, el fro (congelacin), se ha tenido y se tiene como agente de fijacin,
pero es realmente un agente conservador y por tanto no debe utilizarse como tal.
LA CRIODESECACIN (LIOFI LIZACIN):
Se trata de congelar a una temperatura inferior a -50 C y eliminar el agua a una presin baja. Este mtodo
puede ser muy efectivo, si despus la pieza se incluye en parafina o plstico, pero es bastante complejo y
excesivamente caro; no produce deformaciones ni retracciones, ni tampoco endurecimientos de las muestras.

3

Su inconveniente es el precio y lo engorroso que puede resultar el que, al manipular la muestra, no se rehi-
drate posteriormente.
FIJADORES QUMICOS
Existen numerosos fijadores qumicos, unos simples, y otros que son mezclas de varias sustancias. Los ms
reseados en la bibliografa son:
Acetato mercrico
cido actico
cido crmico.
Etanol
Etanol-Glicerina-Agua (G.A.W.)
Formaldehido
Formaldehido-Alcohol
Formaldehido-Propinico-Alcohol (F.P.A.)
Formol-Actico-Alcohol (F.A.A.)
Mezcla Cromo-Actico-Formaldehido (C.R.A.F.)
Mezcla Cromo-Actico.
ACETATO MERCRICO
Produce mejor fijacin que el cido actico.
CIDO ACTICO
Conserva la cromatina. Retrae los tejidos Es ms un conservante que un fijador.
CIDO CRMICO
Se utiliza en soluciones al 2%. Hay que tener precaucin al usarlo, puesto que disuelve las lminas medias y
las celulosas. Despus de una fijacin de 1-2 horas, se debe sacar la muestra del mismo y pasarla a un
conservador. Es buen fijador si se toman las precauciones debidas.
ETANOL
El nico alcohol que se puede usar como fijador es el absoluto y con ciertas reservas el de 96. Se debe usar
junto con otros fijadores para potenciar la accin de los mismos, o como solucin de otros fijadores, pero no
solo, ya que tiene poco poder de penetracin, es un mal fijador de ncleos y mediocre de citoplasma, y
retrae excesivamente los tejidos. Ms que un verdadero fijador, el etanol a baja concentracin puede ser un
buen conservador.
ETANOL-GLICERINA-AGUA O ALCOHOL-GLICERINA-AGUA. (G.A.W.)
Alcohol 96 1/3
Glicerina 1/3
Agua destilada 1/3

4

Fijador lento y conservador perecedero, mximo dos aos de permanencia en la solucin. No endurece; para
cortar por congelacin debe lavarse la muestra en agua destilada un mnimo de cuatro horas.
FORMALDEHIDO
El formol se utiliza en concentraciones del 10% comercial. Es un fijador regular, prctico y fcil de manejar;
tiene el inconveniente de polimerizar los fenoles libres, que son muy frecuentes en los vegetales y que una
fijacin prolongada los endurece excesivamente. No debe ser usado o se debe usar con ciertas precauciones
en tejidos muy lignificados.
FORMOL-ACTICO-ALCOHOL (F.A.A.)
Alcohol etlico de 50-70 90 mL
cido actico glacial 5 mL
Formaldehido 40% 5 mL
Buen fijador general para tallos, races y hojas. Sirve como conservador. Endurece las muestras.
FORMALDEHIDO-ALCOHOL.
Alcohol etlico 96 15 mL
Agua destilada 10 mL
Fijador general y conservador para estudios anatmicos de material leoso. Endurece las muestras.
FORMALDEHIDO-PROPINICO-ALCOHOL (F.P.A.)
La misma frmula del F.A.A. sustituyendo el cido actico por propinico. Mezcla recomendada
para brifitos y pteridfitos. Produce endurecimiento de los tejidos.
MEZCLA CROMO-ACTICA.
a) Dbil:
Anhdrido crmico, solucin acuosa al l0 % 2.5 mL
cido actico al 10% 5 mL
Agua destilada hasta 100 mL
Fijador para algas filamentosas, hongos y briofitos.
b) Media:
Anhdrido crmico al 10% 7 mL
cido actico al 10% 10 mL
Agua destilada hasta 100 mL
Se recomienda aadir 0.5% de saponina para aumentar el poder de penetracin del fijador. Tras fijar el
material durante 24 horas, debe lavarse abundantemente en agua corriente y pasar a un conservador. Es un
buen fijador para pices.

5

MEZCLA CROMO-ACTICO-FORMALDEHIDO (C.R.A.F.)
Solucin a):
cido crmico 1 g
Solucin b):
Ambas soluciones se deben mezclar en partes iguales inmediatamente antes de su uso y, tras una fijacin de
12-24 horas, el material debe ser lavado en alcohol de 70.
GLUTARALDEHIDO-PARAFORMALDEHIDO AL 5%.
Se trata de una variacin del fijador de Karnovsky, ya que este es una mezcla de ambos componentes a una
concentracin del 2.5%.
En primer lugar hay que preparar el paraformaldehido disolviendo en agua la cantidad suficiente para que
resulte una concentracin del 10%, ello ha de hacerse en caliente y en agitacin continua mediante un agi-
tador magntico, procurando que la temperatura no sobrepase los 70C; para la correcta disolucin hay que
aadir unas gotas de KOH 1N. Al llegar a los 70C. Se observar que la disolucin, que antes era turbia, se
torna rpidamente transparente. Se realizar el proceso en campana de extraccin para no respirar los
vapores que resultan txicos.
Una vez fro el paraformaldehido se mezcla a un volumen igual de glutaraldehido al 10% en tampn, con lo
que la mezcla tendr una concentracin de ambos fijadores del 5%. La mezcla ha de guardarse en nevera
y puede mantenerse durante mucho tiempo.
Preparacin de 100 ml de fijador
1. Disolver 4 g de paraformaldehido en 50 mL de agua destilada, agitando y calentando a
60-70C. Se han de aadir 3-4 gotas de KOH 1N para aclarar la solucin.
2. Aadir 10 ml de glutaraldehido 50%
3. Verter a la solucin, hasta alcanzar los 100 ml tampn fosfato 0.1 M y pH 7.2
El fijador se lleva al campo tambin en nevera porttil para asegurarnos que no se sobrepasen los 4C.
Concentraciones menores de esta mezcla dan lugar a resultados deficientes para la observacin de cortes en
microscopa electrnica de transmisin. Ello se debe a que el contenido hdrico de las vacuolas es alto y al
penetrar el fijador, su concentracin intracelular desciende considerablemente. De este modo estructuras que
rpidamente degeneran, como las membranas, no se aprecian con nitidez, por una deficiente fijacin.
Hay otras razones por las que los tejidos vegetales no deben fijarse como los animales. Muchas veces las
plantas estn cubiertas de sustancias creas en sus cutculas que son hidrfobas e impiden la penetracin del
fijador. Por otra parte el bajo contenido proteico de las clulas vegetales, en comparacin con las animales,

6

vuelve al glutaraldehido menos efectivo en sus enlaces cruzados con la protena. Asimismo, la pared de las
clulas vegetales supone una barrera parcial a la penetracin del mismo.
El tiempo de fijacin en esta mezcla nunca debe ser inferior a 12 horas para las muestras que nosotros
manipulamos, aunque frecuentemente no se observa hundimiento de estas en el fijador hasta pasadas 20
horas. Podemos decir lo mismo que se indicaba para el fijador anterior en lo referente a la dificultad de
penetracin por la naturaleza de las flores y los pelos hidrfobos; es recomendable, sobre todo para las
flores con un grado de madurez elevado fijar al vaco, esto supone una dificultad aadida al tener que
mantener las muestras a baja temperatura en nevera; utilizamos para ello recipientes hermticos en los que
se hace el vaco con una bomba de vaco manual y luego pasamos a nevera.
Hay que lavar el fijador, como mximo, a las 24 horas, para evitar el excesivo endurecimiento. El lavado se
lleva a cabo en tampn fosfato 1 molar a pH 7.2. Se pasan las muestras a un frasco con abundante tampn
y se hacen 5 cambios de hora cada uno. En el tampn y en nevera podemos mantener las muestras durante
varios das sin que se aprecie ninguna alteracin.
Sobre todo, si pretendemos hacer preparaciones para microscopa electrnica de transmisin, llevaremos a
cabo una post-fijacin con tetrxido de osmio al 2% en tampn fosfato durante dos horas a temperatura
ambiente y en oscuridad total. Una de las caractersticas de la completa fijacin es la de que el lquido
adquiere una coloracin parecida al vino tinto, y el material est negro. El osmio torna de un color negro
todo contenido lipdico celular, resultando, adems de fijador, un elemento de contraste que delata la pre-
sencia de lpidos.
Procedemos a lavar, tras la post-fijacin, de nuevo con tampn fosfato, de modo anlogo al caso anterior.
Conviene pasar las muestras cuanto antes a alcohol de 70 y proceder lo ms pronto posible a la confeccin
de bloques.
ACLARAMIENTO, HIDRATACION Y MACERACIN
ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO
En histologa vegetal y sobre todo cuando se trata de estudiar la anatoma, es preciso destruir el
contenido celular para dejar nicamente la arquitectura de las paredes. Este tratamiento es conocido
con el nombre de aclaramiento y se realiza pasando los cortes por un bao de hipoclorito sdico o
potsico. Con frecuencia se utiliza leja comercial concentrada. El uso de leja debe descartarse si
querernos realizar un trabajo fino, ya que sta contiene gran cantidad de impurezas que puede
ms tarde interferir en los procesos de tincin. El tiempo que el corte debe permanecer en hipoclorito
depender de la naturaleza del mismo: cuando los tejidos sean delicados (meristemos, hojas jvenes,
etc.) el tiempo debe ser menor que cuando estos tejidos sean adultos y por tanto ms resistentes.
Nuestra experiencia nos dice que 20 minutos es un tiempo medio excelente para la realizacin del
aclaramiento.
La tcnica a seguir ser:
1. Aclarar en hipoclorito sdico 20 minutos.

7

2. Lavar con agua.
3. Neutralizar con cido actico al 20% durante 10 minutos.
4. Lavar varias veces con agua destilada.
Los cortes despus de aclarados estn ya en disposicin de ser teidos por cualquier mtodo.
HIDRATACIN
Siempre recomendamos que, a ser posible, se trabaje con material fresco o bien fijado, pero con
demasiada frecuencia hay que recurrir a material seco de herbario para trabajar. Es claro que una
vez prensado, el material vegetal sufre deformaciones que son irrecuperables, pero se puede estu-
diar rehidratndolo. Para rehidratar una muestra vegetal se coloca esta en una disolucin de hipo-
clorito sdico o potsico al 10 % a una temperatura ambiente o bien, si se desea una hidratacin
ms rpida, puede realizarse en la estufa a una temperatura de 60 C; el tiempo de hidratacin
ser muy variable dependiendo fundamentalmente de la naturaleza y tamao de la muestra. Es
muy importante controlar el tiempo para que los tejidos no se degraden por la accin del hipoclorito.
Otro mtodo de rehidratacin de muestras es utilizar una solucin saturada de hidrato de cloral, a
temperatura ambiente y durante un tiempo aproximado de 12 horas, aunque este tiempo tambin
es orientativo y depender como siempre del tamao y naturaleza de la muestra. El hidrato de
cloral tiene la ventaja de ser menos corrosivo que la leja y adems aclara muy bien los tejidos.
ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO
Para poder estudiar los distintos elementos de los tejidos vegetales como cutcula, vasos conductores
y tambin la morfologa de los elementos esquelticos de los vegetales, se puede recurrir a una
maceracin de los mismos, lo que nos permite su estudio aisladamente, esto unido al estudio anat-
mico de los cortes, tanto longitudinal como transversal, nos da una visin mucho ms real y completa
de los constituyentes celulares de un vegetal determinado. Para realizar dichas maceraciones pode-
mos recurrir a varios mtodos. Uno de los ms usados es el:
MTODO DE JEFFREY:
Se trata de someter el material de la muestra previamente troceado en una solucin a partes iguales de:
cido ntrico al 10%
cido crmico al 10%
Modo de empleo:
1. Se trocea el material; si es leoso se reduce a virutas de un grosor aproximado de 1-2 mm.
2. Calentar y enfriar varias veces el material para eliminar el aire que pueda contener.
3. Macerar en la mezcla de Jeffrey durante un tiempo variable: desde una noche hasta varios
das, segn la naturaleza de la muestra.
4. Lavar con abundante agua para eliminar las trazas de cido que pudieran enmascarar la

8

tincin posterior.
5. Sobre un tamiz muy fino se disgrega la muestra para individualizar los elementos, tomando la
precaucin de sumergir ste en agua.
6. Recoger el agua del tamizado en un tubo de centrfuga.
7. Centrifugar la suspensin para sedimentar el material y decantar el agua sobrante.
8. Tincin.
9. Lavados sucesivos, centrifugando y decantando cada vez.
10. Montar.
INCLUSIN
La observacin de los distintos tejidos, tanto vegetales como animales, con microscopio ptico viene
limitada por la opacidad de los mismos; para poder ver la estructura celular de un tejido y los
componentes de las mismas clulas es necesario por tanto obtener cortes que sean translcidos. Por
muy habilidosa que sea una persona, jams puede obtener a mano secciones tan finas como las que
se obtienen mediante aparatos especiales como son los microtomos.
La histologa vegetal se ha nutrido esencialmente de las experiencias realizadas en los tejidos ani-
males y frecuentemente no se ha tenido en cuenta la distinta naturaleza de estos tejidos. La presencia
de una pared celular rgida y la concatenacin general que ello supone, da a los tejidos vegetales
una particularidad a tener en cuenta a la hora de elegir un proceso de inclusin. Se utilizan en
general las mismas tcnicas en un caso y en otro, por lo que muchas veces los resultados no son, ni
con mucho, los deseables, puesto que la respuesta frente a un mismo tratamiento en uno u otro tipo
de tejido es muy diferente.
Para poder manejar los tejidos fcilmente y poder cortar con los distintos tipos de microtomos que
existen, es necesario que el tejido o la muestra a cortar tenga un soporte, y que ste sea homogneo,
por tanto es necesario no slo que dicho soporte envuelva a la muestra, sino que penetre en su
interior y que adems dicho soporte no obstaculice o interfiera lo mnimo posible en la arquitectura
de la clula y en la naturaleza qumica de la misma.
Los soportes que se utilizan estn en funcin de los
distintos microtomos y pueden ser simples y no inter-
ferir en absoluto en la muestra, como ocurre al utili-
zar el microtomo de mano o de Ranvier (Figura 1),
donde se utiliza como soporte de la muestra mdula
de saco, zanahoria o plsticos como el polispan,
pero no se trata en este caso de una verdadera in-
clusin, pues como ya se ha mencionado anterior-
mente una verdadera inclusin es aquella en la cual
el soporte penetra en el interior del tejido.
Los distintos medios y procesos de inclusin estn
descritos sobradamente en todos los manuales de tcnicas histolgicas por lo que nos limitaremos
Figura 1. Microtomo de mano (de Ranvier).

9

aqu nicamente a mencionarlos y comentar algunas variantes a los mtodos ya citados, as como a
una crtica de los mismos en lo referente a la histologa vegetal.
Existen varios mtodos de uso comn, pero los que se utilizan con ms frecuencia son:
Inclusin en hielo (Microtomo de congelacin)
Inclusin en parafinas o sustancias similares (Histosec, Paraplast, etc.)
Inclusin en resinas y plsticos (Microscopa de cortes semifinos)
Cada una de estas tcnicas presenta ventajas e inconvenientes. Por este motivo discutiremos cada
una de ellas.
INCLUSIN EN HIELO
Es la tcnica ms fcil y natural que podemos utilizar es histo-
loga vegetal (Figura 2); permite la observacin de las clulas
y de los tejidos sin que stos sufran prcticamente alteracin
alguna. Para ello, cuanto ms rpida sea la inclusin, mejores
resultados se obtienen, puesto que la formacin de cristales mi-
croscpicos altera mnimamente la estructura celular. Hay que
tener en cuenta, antes de congelar un tejido, que la cantidad
de agua que existe en el interior de los tejidos es siempre menor
que la que va a rodear externamente a dicho tejido en el blo-
que, lo que crea una diferencia muy importante de textura a la
hora de cortar; mientras el bloque de hielo es externamente
homogneo, los tejidos presentan una menor resistencia a la cu-
chilla y, por tanto, se corre el riesgo de que al cortar la muestra,
se desgarren los mismos. Se puede evitar esta diferencia en el
contenido de agua si previamente sometemos las muestras (ho-
jas, tallos, races, etc.) a una hidratacin, mantenindolos en
agua durante algn tiempo antes de cortar, dependiendo de la naturaleza y tamao de la muestra.
Un inconveniente que presentan los cortes por congelacin, es la variabilidad en el grosor de los
mismos, si no se dispone de un criotomo de precisin motorizado. El grosor de los cortes, por otra
parte, no es un obstculo en la histologa vegetal, por lo menos en un principio, ya que el tamao
de las clulas, mucho mayor que las animales, puede suplir esta desventaja.
Otra posible dificultad que puede surgir es la manipulacin posterior de los cortes, ya que obliga-
toriamente se deben recoger sobre agua. Se ha recomendado el uso de pequeos pinceles para
manipular los cortes. Nosotros desaconsejamos la utilizacin de los mismos, puesto que por mucha
delicadeza que se tenga, la naturaleza de la estructura vegetal (tramas de paredes) puede ser
destruida fcilmente al manipularla con el pincel. Es preferible, para el mejor manejo de los cortes,
el uso, de pequeos tamices sobre los que se recogen los cortes, utilizndose los mismos para todo
proceso de tincin o tratamiento que a los mismos se quiera dar, as la manipulacin de los mismos
Figura 2. Microtomo de congelacin

10

es mnima y, por tanto, tambin disminuye el riesgo de destruccin. Los cortes realizados por conge-
lacin tienen una gran importancia, sobre todo por la posibilidad de observar el tejido in vivo. Por
tanto, las dimensiones, disposicin, morfologa, etc. de las clulas y de los tejidos son las reales, cosa
que no ocurre despus de un proceso de inclusin en parafina, plstico u otro medio. No obstante,
para el estudio de un tejido es necesario utilizar ms de una tcnica. Por otra parte, los orgnulos
celulares, normalmente por rotura de la clula, se pierden; as difcilmente se pueden observar n-
cleos o vacuolas en clulas que se han cortado mediante congelacin, y mucho menos si los cortes
son finos.
Por otra parte la inclusin en hielo y los cortes realizados por congelacin nos dan la posibilidad de
estudiar aquellos productos metablicos solubles en los lquidos polares y apolares que son elimina-
dos de los tejidos cuando se utilizan otras tcnicas de inclusin, como son los lpidos, las clorofilas,
etc. Cuando se requiere informacin de tipo histoqumico el mejor mtodo es la obtencin de cortes
por congelacin.
INCLUSIN EN PARAFINA
Las parafinas son mezclas hidrocarburos saturados de cadenas que oscilan entre 22 y 28 tomos
de carbono. El punto de fusin depende del nmero de tomos de carbono y se encuentra entre 45
y 60 grados. Las mezclas de parafinas comerciales tienen un punto de fusin entre 54 y 56 C.
La tcnica de inclusin en parafina es una perfusin de la misma en los tejidos para crear un medio
homogneo, que permita la realizacin de los cortes de menor grosor con gran facilidad y una
precisin mayor que cuando los mismos se realizan por congelacin. Como toda tcnica, presenta
ventajas e inconvenientes; sobre todo es en esta modalidad de inclusin donde se pueden discutir
ciertos procesos que son vlidos en histologa animal pero que al aplicarlos a los tejidos vegetales
pueden originar alteraciones, a veces profundas, en las estructuras anatmicas e histolgicas; el
primer problema que nos encontramos al incluir en parafina un tejido es la apolaridad de la misma;
para poder incluir el tejido se han descrito varios mtodos de deshidratacin, pero en general se
sigue, como en histologa animal, la deshidratacin por alcohol etlico en graduaciones crecientes
hasta llegar a alcohol absoluto.
La parafina y el alcohol etlico absoluto tampoco son miscibles, por lo que hay que sustituir ste por
un lquido apolar miscible con aqulla. Hay varios lquidos apolares como benceno, cloroformo, xi-
leno, etc., que se han descrito en todas las tcnicas histolgicas, pero que deben usarse con muchas
reservas, por las grandes retracciones y deformaciones que producen en los tejidos vegetales, alte-
raciones que no son homogneas, puesto que cada uno de los distintos tejidos de una muestra a
cortar, reaccionan de forma muy distinta a la retraccin debido al distinto grosor y naturaleza de
la pared celular. Nosotros sustituimos el benceno, xileno, etc., por acetato de isoamilo o bien miristato
de isopropilo; ms frecuentemente el primero. Si la deshidratacin se ha realizado correctamente,
la pieza a incluir se hundir en el acetato. Si flotase sobre el mismo, hay que esperar 15 minutos y
si sigue flotando es que la deshidratacin no se ha realizado correctamente, debiendo ser introdu-
cida la muestra de nuevo en alcohol absoluto.

11

Los tiempos de deshidratacin ms habituales para una muestra que se va a incluir en
parafina son:
1. Alcohol etlico 96 1/2 hora
2. Alcohol etlico 96 1/2 hora
3. Alcohol etlico absoluto 1/2 hora
6. Acetato de isoamilo 1/2 hora
9. Parafina a 56-58 estufa el tiempo necesario en funcin del tipo de muestra
Despus de tres baos de acetato de isoamilo, la muestra puede ser incluida en parafina, Histosec,
Paraplast, etc. Este proceso es quiz el que merezca mayor atencin junto con el anteriormente
explicado. Los manuales de tcnicas y los distintos trabajos sobre histologa vegetal nos dan tiempos
muy dilatados de inclusin: mnimo de 6 horas. Los tejidos vegetales tienen una naturaleza muy
distinta a la de los animales, pero las tcnicas de inclusin que se describen en los distintos manuales
han sido aplicadas a partir de las experiencias sobre tejidos animales; en algn caso, esta expe-
riencia es til y sirve para el proceso de inclusin de vegetales, pero en la mayora de los casos no
lo es, y a cada muestra vegetal hay que darle un tratamiento muy distinto dependiendo de los
tejidos que presente y de la disposicin de los mismos. No se puede tratar de igual manera una
muestra que contenga tejidos lignificados o suberificados que otra que contenga grandes parnqui-
mas o grandes conductos aerferos. Por tanto, lo ms importante antes de realizar una inclusin es
conocer la naturaleza y la organizacin de la muestra a incluir, o por lo menos presuponerla. Los
cortes realizados con el microtomo de congelacin nos pueden dar la pauta a seguir en el caso de
que se desconozca la organizacin de un vegetal determinado.
El calor es uno de los enemigos ms importantes de los tejidos vegetales. La presencia de pared
celular y la distinta naturaleza que sta puede presentar es la causa de que el calor, los fijadores,
los compuestos hidratantes y deshidratantes, el xileno, benceno, etc., produzcan en las paredes ce-
lulares retracciones muy importantes y no constantes, que pueden distorsionar en gran manera la
estructura anatmica de un vegetal. Ante los mismos agentes, en una seccin, no todos los tejidos
responden igual: las deformaciones dependen entre otras cosas del grosor de la pared celular,
naturaleza de la misma, disposicin de los diferentes tejidos, tiempo de actuacin de los distintos
agentes, etc. Por tanto, si las deformaciones son variables, las interpretaciones que se dan son, con
frecuencia, errneas.
Por tanto, para incluir una muestra vegetal en parafina, o bien en sucedneos de la misma (Para-
plast, Histosec, etc.), es necesario calcular los tiempos mnimos, que pueden oscilar desde 35
minutos a varias horas.
Los tiempos de deshidratacin pueden ser ms o menos constantes para todos los tejidos, pero varan
mucho los tiempos de parafinacin. Un tallo macizo, con mucho tejido esqueltico (esclernquima), o
de proteccin (peridermis), puede necesitar varias horas. La prctica nos ir diciendo cuales son los
tiempos ms idneos para los rganos o partes de rganos que estemos utilizando.

12

Lo ms importante es comprender que no existen dos muestras vegetales o tejidos iguales y, por
ello, cada una se comportar de distinta forma. Con experiencia se calcula fcilmente los tiempos
que necesitan los distintos tejidos.
CONFECCIN DE LOS BLOQUES
Se realiza de la misma forma que en histologa animal: existen pinzas (Leukart) y recipientes especiales para
realizar bloques, pero lo ms barato es confeccionar recipientes, de papel satinado o de aluminio, ms o
menos cbicos o en forma de paraleleppedo, dependiendo de las caractersticas de la muestra a incluir. Lo
ms importante en la confeccin del bloque es la orientacin que se da a la muestra, porque de ello va a
depender que el corte sea bueno o malo.
REALIZACION DE LOS CORTES
Para obtener los cortes o secciones a partir de bloque de parafina, se pueden utilizar dos tipos de microtomos
muy distintos. Microtomos tipo Minot, (Figura 3) que se caracteriza por ser mvil el bloque y fija la cuchilla,
o bien microtomos de deslizamiento, en los cuales la cuchilla es mvil y orientable, mientras que el bloque es
fijo.
Los microtomos tipo Minot son prcticos nicamente cuando se trata de
realizar cortes en tejidos blandos y sin grandes complicaciones, pero
estos microtomos tipo guillotina no son muy efectivos cuando se trata
de tejidos duros, pues se suelen romper al intentar cortarlos; esto no
slo ocurre en histologa vegetal: ciertos tejidos duros, como los tejidos
seos de los animales, se cortan igualmente mal en este tipo de micro-
tomos. Para los tejidos duros o para aquellas muestras que presenten
gran variedad en los mismos, es mucho ms recomendable y prctico
el microtomo de deslizamiento aunque sea algo engorroso su manejo.
El grosor de los cortes que se obtienen con estos tipos de microtomos
oscila entre 10 y 20 micras, lo que se puede considerar fino, compa-
rndolo con la magnitud de las clulas.
Los cortes se recogen sobre agua a 36-40 C, en un bao de Mara,
de aqu se pescan" sobre los portaobjetos que, previamente, se han
impregnado con una ligera capa de albmina de Mayer, y se llevan a
la estufa, durante media hora a unos 58 C. De esta forma se logra el pegado de los cortes sobre el porta
y la mejor manipulacin de stos en los procesos de desparafinacin y tincin.
DESPARAFINACIN E HI DRATADO:
Una vez pegados los cortes pueden, o bien almacenarse indefinidamente, o bien pasar a la desparafinacin
y posterior hidratacin y teido de los mismos; para ello se utiliza el proceso inverso al realizado para la
inclusin con la variante de utilizar el xileno o el benceno para eliminar la parafina. En este punto del proceso
la utilizacin de xileno o benceno en los cortes no es tan importante como cuando se incluye en parafina, ya
que el corte se encuentra pegado sobre el porta.
Figura 3. Microtomo de parafina

13

El proceso a seguir ser el siguiente.
1. Xileno 1/2 hora
2. Xileno 1/2 hora
5. Alcohol etlico de 96 1/2 hora
6. Agua
Si los colorantes se encuentran en disolucin acuosa se realizarn todos los pasos. Es obvio que si los colorantes
a utilizar se hallan en disolucin alcohlica o en disolventes apolares (esencia de clavo, etc.) no se llegar a
la hidratacin.
Una vez hidratados, si conviene, se proceder con los cortes a la coloracin ms oportuna y de nuevo se
deshidratar para realizar el montaje permanente.
Los pasos a seguir son:
1. Tincin
2. Lavado con agua destilada
3. Deshidratacin mediante goteo de etlico absoluto
4. Aclarado con creosota, aceite de clavo, xilol, etc.
5. Montaje permanente con Blsamo de Canad, Entelln, Euparal, etc.
En algunas ocasiones puede darse la circunstancia de que no se desee pasar las secciones realizadas por
disolvente alguno como alcohol, xileno, etc., bien por la tincin o bien porque histoqumicamente no es acon-
sejable, y se quiera montar de forma permanente o semipermanente un corte, para ello es necesario recurrir
a la utilizacin la glicerogelatina o glicogelatina.
INCLUSIN EN RESINAS
CONFECCIN DE LOS BLOQUES DE RESINA
En el mercado existen muchas resinas pero, para incluir tejidos vegetales, no todas dan buenos resultados;
nosotros, despus de probar varias, hemos constatado que las ms adecuadas para nuestros intereses son la
LR White y la Spurr
Se trata de resinas que penetran muy bien, son miscibles con el etanol y no totalmente hidrfobas en el caso
de la LR White. Pero lo que las hacen idneas es la gran facilidad con que penetran los colorantes una vez
polimerizadas.
El proceso de inclusin en resina vara ligeramente segn se elija una u otra.
LR White: ver http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/14380lm.aspx
Spurr: ver http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/14300.aspx
Este proceso de inclusin puede hacerse al vaco, lo que permite, sobre todo en las muestras de tamao
grande, una infiltracin ms rpida y completa.
Los bloques se etiquetan y se guardan en un frasco de vidrio cerrado.

14

PARA LOS BLOQUES DE LR WHITE.

Con los bloques incluidos en plstico hay que utilizar un ultramicrotomo, con el que se consiguen tanto cortes
semi-finos (de 0.5 a 3 m de grosor) como cortes ultra-finos (de 30 a 100 nm de espesor). Los primeros para
microscopa ptica y los segundos para microscopa electrnica.
Para los cortes se deben utilizar cuchillas de vidrio o de diamante, las primeras son mucho ms econmicas
que las segundas, pero tienen una corta duracin (30 a 40 cortes).
Bajo el filo de la cuchillas se fija, con parafina fundida, una balsita plstica que se llena hasta el borde con
agua destilada y un tensioactivo (una o dos gotas de detergente por litro de agua) que sirve para recoger
los cortes que flotan sobre ella extendidos.
Haremos los cortes de 1 o 2 m de grosor, lo que nos permite tener
una sola capa de clulas cortada y ver su estructura y contenido con
nitidez.
De aqu se toman con una fina varilla de vidrio (Figura 4) de borde
romo y se pasan a una gota de agua destilada con tensioactivo que
hemos dejado sobre un porta. El agua que se coloca en el porta o
en la balsita se hace mediante una jeringuilla con filtro Millipore.
Si la operacin se efecta cuidadosamente el corte debe quedar
flotando sin arrugarse. En un mismo porta, convenientemente orde-
nados, podemos situar de 10 a 15 cortes seriados.
Una vez colocados los cortes pasamos el porta a una plancha de calor a 65, con ello logramos que se
evapore el agua y que los cortes queden pegados sobre el vidrio y puedan manipularse en la tincin. Si el
agua evapora a temperatura ambiente o a temperaturas inferiores a la indicada los cortes no quedan bien
pegados, y al manipularlos se desprenden. De igual modo, cortes de grosor superior a los 3 m no suelen
pegarse bien.
El material incluido en plstico no debe sufrir ms manipulacin. Normalmente las resinas que se utilizan no
interfieren en la visin microscpica de los tejidos, por lo que no hay que eliminarlas como ocurre con la
parafina.
TINCIONES Y RECONOCIMIENTOS HISTOQUIMICOS
A continuacin comentaremos algunas caractersticas de los colorantes ms usados en histologa ve-
getal.
AZUL DE ANILINA (AZUL ALGODN)
Este colorante se utiliza, como el azul de lactofenol, para poner de manifiesto las cribas de los
elementos de los tubos del floema, ya que tiene afinidad por la calosa. Nuestra experiencia nos
hace inclinamos ms por este procedimiento que por aquel por varias razones: en primer lugar
admite una doble coloracin de contraste, que puede ser la safranina; en segundo lugar se puede
Figura 4. Ultramicrotomo. Detalle de la
cuchilla de vidrio.

15

deshidratar y montar de forma permanente y los inconvenientes no son mayores que los que presenta
la coloracin del azul de lactofenol. Es ms fcil de manejar que aquel.
Modo de empleo:
1. Deshidratar el corte con unas gotas de alcohol de 96.
2. Teir durante 5 minutos con azul de anilina
3. Diferenciar durante 1 minuto con esencia de clavo, una o dos gotas sobre el corte.
4. Deshidratar haciendo gotear alcohol absoluto sobre el corte.
5. Aclarar.
6. Montar en blsamo de Canad o similar.
Se colorean en azul tanto la celulosa como la calosa, aunque el citoplasma de los tubos cribosos
puede tambin aparecer teido si nos excedemos en el tiempo de permanencia en azul de anilina.
AZUL DE LACTOFENOL
Este colorante tiene afinidad por la calosa, y se usa por tanto para poner de manifiesto aquellas
paredes celulares en las que se deposita la misma: placas cribosas del floema y paredes celulares
de ciertos hongos. No es una coloracin de resultados espectaculares ni mucho menos y es necesario
que la calosa se encuentre en cierta cantidad para que se ponga de manifiesto, por tanto ser difcil
poner de manifiesto cribas jvenes. Por otra parte se usa este colorante para preparaciones extem-
porneas que se desechan una vez observadas al microscopio.
Modo de empleo:
1. Cubrir con el colorante el corte durante 5-10 minutos.
2. Depositar sobre el colorante y el corte un cubreobjetos y observar al microscopio.
Si se desea una preparacin permanente aadir al cubre una gota de glicerogelatina y sellar con
laca o parafina.
AZUL DE METILENO
El azul de metileno en soluciones del 1% y 0.1% se utiliza con frecuencia para poner de manifiesto
las paredes celulares de naturaleza celulsica. Se utiliza sobre todo en preparaciones extempor-
neas. Es un colorante poco limpio y tie muy desigualmente, por esto se recomiendan las soluciones
ms diluidas.
Modo de empleo.
1. Colorear durante 5 minutos con la solucin de azul de metileno.
2. Lavar abundantemente para eliminar los precipitados.
3. Observar al microscopio.
Si se desea conservar, esta tincin acepta la deshidratacin y el montaje permanente. Tambin se

16

puede realizar una coloracin de contraste.
AZUL DE METILENO-ALUMBRE-ROJO DE RUTENIO
Es una de las coloraciones ms espectaculares, pues con tan solo dos colorantes aparecen cuatro
colores distintos en los cortes y se pueden apreciar diferencialmente distintos tejidos. Tiene el incon-
veniente de que el rojo de rutenio es un colorante no permanente; hay que prepararlo en el momento
de usarlo, dura pocos das y es relativamente caro.
Modo de empleo:
1. Tincin con azul de metileno-alumbre durante 5-10 minutos.
2. Lavar con agua abundante para eliminar el resto de colorante y los precipitados.
3. Tincin con rojo de rutenio 5-10 minutos.
4. Lavar ligeramente con agua.
5. Deshidratar con alcohol absoluto.
6. Aclarar.
Con esta doble coloracin, el floema aparece teido de verde, el esclernquima en violeta, el xilema
en azul y los parnquimas ms o menos rosados.
CARMN ACTICO
Este colorante se utiliza sobre todo para la observacin de mitosis.
Modo de empleo:
1. Hidrlisis enzimtica o bien cida de las lminas medias y paredes celulares de los meriste-
mos, anteras, etc.
a) La hidrlisis enzimtica se realiza utilizando hemicelulasa y celulasas a una tempe-
ratura de 27-30 C durante un tiempo variable, dependiendo de la concentracin
del enzima y de la naturaleza del rgano.
b) La hidrlisis mediante cidos inorgnicos diluidos, se realiza mediante cido clorh-
drico 0.1 N en caliente (60 C) durante una hora.

2. Lavar abundantemente con agua destilada.
3. Teir con carmn actico las races durante media hora en un crisol a la estufa (a 60 C).
4. Aplastar las races sobre un porta mediante una presin realizada con el cubre, hasta lograr
una capa lo ms fina y homognea posible.
5. Si se quiere conservar durante un cierto perodo, levantar con mucho cuidado el porta y
poner sobre l una o dos gotas de glicerogelatina y volverlo a dejar sobre la preparacin.
6. Sellar con laca.

17

CARMN-VERDE IODO
Una coloracin clsica de histologa vegetal, que da tambin buenos resultados, aunque su prepa-
racin es ms engorrosa y los resultados comparables a los que se han reseado para la safranina-
verde rpido; tiene la ventaja de que la tincin es permanente.
Modo de empleo:
1. Teir, al menos durante 1 hora en carmn de Grenacher.
2. Lavar rpida y abundantemente en agua.
3. Teir con verde iodo previamente diluido en agua destilada.
4. Lavar ligeramente.
6. Aclarar.
Los elementos lignificados se colorean en un azul verdoso y el resto de los tejidos en rojo carmn.
FLOROGLUCINA
La floroglucina es un mtodo de reconocimiento para la lignina, por tanto se utilizar en aquellos
tejidos que la presentan: el xilema y el esclernquima. Se conoce esta coloracin con el nombre
de test de la lignina y se realiza de manera extempornea. Existen dos formas de hacerlo.
Modo de empleo:
a) Sistema 1
1. Poner sobre el corte uno o dos cristalitos de floroglucina.
2. Cubrir el corte con unas gotas de alcohol de 96 y dejar que se disuelva la floroglucina.
3. Aadir unas gotas de cido clorhdrico a una concentracin del 50%
b) Sistema 2
1. Cubrir el corte con una solucin alcohlica de floroglucina previamente preparada.
2. Aadir unas gotas de cido clorhdrico al 50%
Los tejidos lignificados toman una coloracin rojo cereza.
FUCSINA BSICA-VERDE DE METILO
Verde de metilo, sol. acuosa al 0.5% 4 partes
Fucsina bsica, sol. acuosa al 5% 1 parte

18

Modo de empleo:
1. Tincin de los cortes en la mezcla, durante 8-10 min.
2. Lavar alternativamente varias veces con agua y alcohol de 96 hasta que las paredes ligni-
ficadas tomen color violceo y las otras azul verdoso.
3. Deshidratar y montar.
FUCSINA BSICA-VERDE LUZ
Esta doble tincin, que es menos usada en histologa vegetal; tiene la ventaja de colorear bien la
cutcula y los pelos de la epidermis.
Modo de empleo:
1. Colorear 10 minutos con fucsina bsica de Ziehl.
2. Lavar con agua abundantemente para eliminar el exceso de colorante y los precipi-
tados.
3. Colorear con verde luz; si la disolucin es alcohlica, tomar la precaucin de poner
sobre el corte antes de la coloracin unas gotas de alcohol de 96.
4. Lavar con agua.
5. Deshidratar con alcohol etlico absoluto.
6. Aclarar.
HEMALUM DE MAYER
Es un colorante clsico; se ha utilizado con frecuencia para teir en histologa vegetal. Colorea la
celulosa y los ncleos, debe utilizarse sobre todo en tejidos jvenes y como coloracin de contraste
la safranina.
Modo de empleo:
1. Teir durante 20 minutos en Hemalum de Mayer.
2. Virar mediante carbonato de litio; si el agua del laboratorio es suficientemente dura
puede virar en agua corriente.
3. Si la coloracin es muy intensa, se diferencia con alcohol cido, virando de nuevo,
como anteriormente, hasta conseguir la intensidad de color deseada.
4. Dar coloracin de contraste.
5. Deshidratar.
6. Aclarar.
El Hemalum de Mayer colorea de azul-morado la celulosa.

19

HEMATOXILINA FRRICA DE HEIDENHAIN
Se utiliza sobre todo en histologa vegetal para teir meristemos y es una buena coloracin para
la observacin de mitosis en los mismos. Tambin se pueden observar mitocondrias. Es una tincin
muy engorrosa y difcil de realizar pero una vez dominada puede dar excelentes resultados. Se
puede realizar una coloracin de contraste con safranina o verde Luz.
Modo de empleo:
1. Introducir los cortes en el mordiente durante 30 minutos.
2. Lavar rpidamente en agua destilada.
3. Colorear durante 20-30 minutos en la solucin de hematoxilina; la preparacin debe
tomar una coloracin negro tinta china. Se puede acelerar la coloracin a una tem-
peratura de 50 C.
4. Lavar rpidamente con agua destilada.
5. Diferenciar en alumbre de hierro al 1%; se puede utilizar el mordiente rebajando la
disolucin. El tiempo de diferenciacin lo da la experiencia; se deben sacar los cortes,
lavar, observar y si la diferenciacin no es la deseada se introduce de nuevo en el
mordiente; as hasta que la coloracin sea la idnea. Los tiempos de permanencia en
el mordiente deben controlarse, puesto que se corre el peligro de decolorar total-
mente los cortes.
6. Lavar con agua destilada.
7. Dar coloracin de contraste si se desea.
9. Aclarar.
10. Montar en blsamo de Canad.
LUGOL
Se utiliza de forma extempornea para el reconocimiento del almidn, que toma una coloracin
azul-morada intensa. Tambin se puede utilizar para teir los tejidos lignificados de forma perma-
nente; stos se colorean de amarillo intenso.
Modo de empleo:
Para observar granos de almidn es suficiente con recubrir de Lugol el corte, poner un cubreobjetos
sobre el mismo y observar al microscopio. Los granos de almidn se almacenan en distintos tejidos
en la planta (colnquima, distintos parnquimas, periciclo, clulas oclusivas, etc.), siendo de gran
inters para el reconocimiento de distintas especies, puesto que dentro de un mismo gnero, cada
una de las especies puede almacenar el almidn de forma distinta.
Como mtodo de tincin:
1. Teir varios minutos con Lugol.

20

2. Lavar con agua.
4. Aclarar.
5. Montar con blsamo de Canad o similar.
Los tejidos lignificados y suberificados se tien de un amarillo intenso, mientras que los tejidos celu-
lsicos aparecen coloreados de amarillo plido.
ORCENA ACTICA
Se utiliza como el carmn actico para la tincin de cromosomas por aplastamiento. Da mejores
resultados que ste y es ms fcil de preparar.
Modo de empleo:
El mismo que el carmn-actico.
SAFRANINA- VERDE RPIDO
Esta doble coloracin es muy sencilla de realizar y de muy claro contraste, pues la safranina, que
tiene afinidad muy marcada por la lignina y algo menor por la suberina, tie de rojo intenso los
tejidos que presentan lignina, como es el xilema y las distintas clulas que forman los tejidos esque-
lticos de la planta, mientras que el verde rpido colorea el resto de los tejidos de un verde a un
verde-azulado o bien azul, dependiendo del tratamiento que se le haya dado al corte anteriormente.
Modo de empleo:
1. Tincin con safranina 1-2 minutos.
2. Lavar con agua abundante.
3. Si existe un exceso de coloracin, diferenciar con alcohol cido y lavar despus de
nuevo con agua.
4. Deshidratar el corte con unas gotas de alcohol de 96 antes de la segunda tincin.
5. Tincin con verde rpido 1 minuto.
6. Deshidratar con alcohol etlico absoluto.
7. Aclarar.
Esta doble tincin presenta el inconveniente de que se decolora a lo largo del tiempo, sobre todo el
color del verde rpido; su duracin como mximo es de 3 a 4 aos. Esta decoloracin puede evitarse
en parte si las preparaciones se mantienen al abrigo de la luz y a temperatura adecuada.
SUDN III
Es un colorante que tiene afinidad por los compuestos lipdicos, por lo cual se utiliza fundamental-
mente para colorear la cutina y la suberina.

21

Mtodo de empleo:
1. Lavar los cortes obtenidos por congelacin con alcohol de 70.
2. Poner varias gotas del colorante sobre el corte que se desea teir durante 15 minutos.
3. Lavar con alcohol de 70.
4. Montar en glicerogelatina.
No es una preparacin permanente; no montar en blsamo ya que se decolora. El Sudan III tie de
rojo-anaranjado la cutcula y las partes lipfilas de los cortes. Puede completarse la coloracin con
otro colorante de contraste.
TIONINA FENICADA
Es un colorante poco utilizado en histologa vegetal, aunque los resultados son muy satisfactorios; se
puede realizar una buena coloracin de contraste con rojo de rutenio.
Modo de empleo:
1. Teir durante 10 minutos con tionina.
3. Aclarar.
Los tejidos lignificados se tien de un color azul morado intenso, mientras que los no lignificados
aparecen de color prpura o rojo; no es una tincin permanente ya que despus de montadas, las
preparaciones se decoloran con el tiempo.
VESUVINA
Tie de color pardo-amarillento la celulosa. Es una coloracin delicada, pero sucia si no se tiene la
precaucin de lavar abundantemente en agua. Se puede utilizar como tincin de contraste tanto
safranina como el verde luz, que teirn las partes lignificadas del corte. Es una tincin excelente
por si sola para colorear la epidermis.
Modo de empleo:
1. Teir de 10 a 20 minutos en el colorante.
2. Lavar abundantemente en agua para eliminar los precipitados.
3. Dar coloracin de contraste.
4. Deshidratar.
5. Aclarar.

22

PREPARACIN DE COLORANTES Y OTROS REACTIVOS
ADHESIVOS Y MEDIOS DE MONTAJE
ACETATO MERCRICO, LQUIDO
Composicin:
Acetato mercrico 1 g
cido actico 5 mL
ALBUMINA DE MAYER
Composicin:
Clara de huevo batida 50 mL
Glicerina 50 mL
Timol o Fenol unos cristales
Se toman dos o tres huevos y se separa la yema cuidadosamente. Las claras se baten a punto de nieve; una
vez llevadas hasta el punto de nieve se filtra durante varias horas. Se mezcla a partes iguales con glicerina
y se le aade unos cristales de timol o fenol para evitar el ataque bacteriano. Agtese bien la mezcla antes
de usarse.
COLORANTES
AZUL DE ANI LI NA
Composicin:
Esencia de clavo 100 mL
Alcohol etlico absoluto 100 mL
Azul de anilina (C.I. 42755) 1 g
Preparar en fro.
AZUL DE LACT0FEN0L
Composicin:
Fenol 0.1 g
cido lctico 8 mL
Glicerina 20 mL

23

Azul de anilina (C.I. 42755) 0.5 g
Se disuelve calentando ligeramente el fenol, el cido lctico, el agua destilada y la glicerina; se deja enfriar
y se aade el azul de anilina. Se deja reposar durante 24 horas. Se filtra y guarda en botella de color
topacio.
AZUL DE METI LENO
El azul de metileno se prepara en fro a distintas concentraciones dependiendo del uso que se quiera dar.
Las dos ms frecuentes son:
Composicin:
Azul de Metileno (C.I. 52015) 1 g
O bien:
Azul de Metileno (C.I. 52015) 1 g
Agua destilada. 100 mL
AZUL DE METI LENO-ALUMBRE
Composicin:
Sulfato alumnico potsico 10 g
Azul de metileno (C.I. 52015) 1 g
Disolver primeramente en fro el alumbre potsico en agua destilada. Una vez disuelto el alumbre se aade
el azul de metileno.
AZUL DE METI LENO DE LOEFFLER
Composicin:
Azul de metileno (C.I. 52015) 0.5 g
Solucin al 1% de KOH 1 mL
Alcohol de 96 30 mL
Disolver al Azul de Metileno en el agua calentada a 50C; posteriormente, aadir los otros ingredientes.
Filtrar.

24

CARMIN ACETICO
Composicin:
Carmn (C.I. 75470) 4-5 g
cido actico 45 mL
Se disuelve el carmn en cido actico al 45% y la disolucin se calienta hasta ebullicin durante una hora,
teniendo la precaucin de refrigerar continuamente los vapores para no variar la concentracin; esto se
consigue calentando la mezcla en un Erlenmeyer cerrado mediante un tapn de goma perforado a travs
del cual se pasa un serpentn de refrigeracin.
CARMIN ALUMBRE DE GRENACHER
Frmula 1 (Langeron, 1947; Martoja, 1970; Gabe, 1968)
Composicin:
Carmn (C.I. 75470) 1 g
Se disuelve en caliente el alumbre en agua se aade el carmn y se mantiene en caliente sin llegar a ebullicin
durante una hora, para lo cual es necesario colocar sobre Erlenmeyer un refrigerante, para evitar que vare
la concentracin. En cualquier caso se enrasa hasta el volumen primitivo con agua destilada.
CARMIN ALUMBRE
Frmula 2 (Johansen)
Composicin:
Sulfato alumnico amnico 4 g
Carmn (C.I. 75470) 1 g
Se procede para su preparacin como en la frmula anterior. Por la bibliografa consultada, y por los resul-
tados obtenidos despus de utilizar ambos, nosotros nos inclinarnos por el uso del primero.
FABRIL
Composicin:
a) SOLUCIN A
Azul de anilina 0.5 g
Lactofenol 100 mL

25

b) SOLUCIN B
Fucsina bsica 0.5 g
Lactofenol 100 mL
c) SOLUCIN C
Yodo 0.3 g
Yoduro potsico 0.6 g
Lactofenol 100 mL
Se mezclan:
Solucin A: 80 mL
Solucin B: 20 mL
Solucin C: 100 mL
(la conservacin es indefinida)
FLOROGLUCINA
Composicin:
Floroglucina 8 g
Alcohol 96 100 mL
FUCSINA BASICA DE ZIEHL
Composicin:
Fucsina. bsica 1 g
cido fnico 5 g
Mezclar en un mortero hasta conseguir un homogeneizado completo; una vez logrado, aadir lentamente:
Existen en el mercado formulaciones de Fucsina bsica segn Ziehl que evitan su preparacin en laboratorio.
GLICEROGELATINA.
Composicin:
Gelatina 7 g
Glicerina 50 mL
cido fnico 1 g
Calentar a bao Mara la gelatina, el agua destilada y la glicerina, hasta conseguir una disolucin homog-
nea; aadir seguidamente el cido fnico y filtrar. Siempre que se use debe ser calentada a bao Mara y

26

mantenerla en caliente, ya que se solidifica a temperatura ambiente.
HEMALUN DE MAYER
Composicin:
Hematoxilina crist. (C.I. 75290) 1 g
Iodato de sodio ~ 0,2 g
Se disuelve el sulfato alumnico potsico (alumbre potsico) en 1 litro de agua destilada a temperatura
ordinaria; una vez disuelto, se le aade la Hematoxilina y el iodato sdico. Este ltimo se utiliza para la
maduracin rpida, pues es un oxidante que pasa la Hematoxilina a hematina. Este colorante presenta un
color violceo intenso cuando est maduro.
Una variante de esta frmula es el Hemalun cido. Para obtenerlo se aade a la frmula anterior:
Hidrato de cloral 50 g
cido ctrico 1 g
El Hemalun cido da una coloracin nuclear ms precisa y se conserva mucho mejor.
HEMATOXILINA FERRICA DE HEIDENHAIN
Preparar los dos reactivos siguientes:
Mordiente:
Sulfato amnico frrico 3 g
El sulfato amnico frrico presenta una coloracin violeta claro; no confundir con el sulfato ferroso amnico o
sal de Mohr, que presenta cristales verdes, ni tampoco utilizar los cristales alterados de sulfato alumnico
frrico (cuando ste se ha alterado y presenta cristales amarillentos); seleccionar cuidadosamente los cristales
que presenten una coloracin violeta plido.
Colorante:
Hematoxilina 1 g
Alcohol de 90 10 mL
Una vez disuelta la Hematoxilina en el alcohol de 90 aadir agua destilada hasta completar 100 mL de
colorante.

27

LUGOL
Composicin:
Ioduro potsico (aprox.) 1.5 g
Iodo 0.5 g
Los 0.5 g de Iodo se disuelven en unas gotas de alcohol; todo ello es llevado hasta 25 mL con agua destilada,
a la que se aade yoduro potsico hasta saturacin. Este reactivo se halla comercializado en el mercado a
concentraciones variables.
ORCEINA ACETICA
Composicin:
Orcena 1-2 g
cido actico 45 mL
Se disuelve la orcena en caliente a 60 C en cido actico, tomando las mismas precauciones que en el
proceso de preparacin del carmn, para evitar la evaporacin del actico. Una vez enfriada la disolucin,
aadir:
PICROFUCSINA
Fucsina cida al 1.1 % en agua destilada 10 mL
cido pcrico en solucin acuosa saturada 100 mL
(Tiene una duracin de 8 a 10 meses)
ROJO DE RUTENIO
Composicin:
Rojo de rutenio 1 g
Amoniaco 1 mL
Esta solucin, como se ha dicho anteriormente, hay que prepararla inmediatamente antes de su uso, dado
que es inestable.

28

SAFRANINA
Composicin:
Alcohol etlico de 50 C 100 mL
Safranina (C.I. 50240) 1 g
La preparacin se realiza en fro.
En manuales, tanto de histologa animal como vegetal, figuran preparados con frmulas distintas, tanto en las
concentraciones de colorante como en la de disolventes (Martoja, 1970; Purvis-Collier-Walls 1966; Johansen
1968; Gabe, 1968; etc.). Nuestra experiencia es que, a concentraciones mayores de colorante, ste precipita
fcilmente, siendo poco limpias las tinciones; y el exceso de colorante conlleva tambin un exceso de colora-
cin.
SUDAN III
Composicin:
Sudn III (C.I. 26100) 2-3 g
Se trata de una solucin saturada de Sudn III en alcohol de 70, ya que ste es insoluble en agua. La solucin
se prepara en caliente.
TIONI NA FENICADA
Composicin:
Tionina 1 g
Fenol 2.5 g
Preparar en fro.
VERDE YODO
Composicin:
Verde de yodo (C.I. 42556) 1 g
Preparar en fro.

29

VERDE LUZ
Se puede preparar tanto en disolucin acuosa como alcohlica.
Composicin:
Verde luz (C.I. 42095) 0.5 g
Sustituir el agua destilada por alcohol etlico de 96 para la solucin alcohlica.
VERDE RAPIDO
Composicin:
Alcohol etlico absoluto 50 mL
Esencia de clavo 50 mL
Verde Rpido (C.I. 42053) 1 g
VESUVINA O PARDO BI SMARK
Composicin:
Vesuvina (C.I. 21010) 1 g
Fenol cristalizado 0.5 g
Tras dejar reposar la disolucin durante 1 hora se filtra.
CARMN-ACTICO-HIDRATO DE CLORAL PARA FIJACIN Y TINCIN DE PRTALOS
Preparacin:
1. Aadir 100 mL de agua destilada a 100 mL de cido actico glacial.
2. Disolver 2 g de carmn en 1 (hervir suavemente durante 5 minutos en campana de gases).
3. Preparar el mordiente (sulfato frrico al 5%):
a. 0.5 g de sulfato frrico.
b. 10 mL de agua destilada (0.5 mL de agua destilada + 5 mL de cido actico gla-
cial).
4. Dejar enfriar 2.
5. Aadir mordiente 3 a 2.
6. Filtrar.
7. Aadir 320 g de hidrato de cloral (16 g/10 mL).
8. Guardar en la nevera.

30

TINCIONES TEMPORALES

PANORMICAS, RECOMENDADAS PARA LA TINCIN DE TALLOS, DE HOJAS, TALLOS
Y RA CES.
CLORO-IODURO DE ZINC:

1. Se sumerge la muestra durante10 min en una solucin de cloro-yoduro de zinc.
2. Se montan los cortes en una gota del mismo colorante, o bien en una gota de agua destilada
3. Resultado:
Celulosa............... azul violeta
Lignina................. amarilla
Almidn............... azul oscuro

ESPECFICAS.

ALMIDN

Tincin sobre cortes de patata o raspados de sta.

Dejamos actuar el Lugol sobre el corte, en el porta (tincin progresiva) hasta que los cortes adquieran
una tonalidad violcea. Se lava con agua destilada y se monta con una gota de agua.

La observacin de raspados montados en agua, sin tincin previa, jugando con el diafragma se
observa muy bien el hilio y las lneas de crecimiento. Lo mismo sucede al observarlos con luz polari-
zada, lo que da unos resultados muy espectaculares.

Pueden hacerse raspados de semillas de diversas leguminosas.

CROMOSOMAS

Los pices de cebolla, ajo, o habas secas puestas a germinar, son un buen material para observar
los cromosomas de las clulas en mitosis de los meristemas.

1. Previamente se deben introducir los pices (de 2 mm de longitud) en una solucin de HCl 0.1
M.
a. Esta solucin con los pices se pasa a la estufa a unos 60C durante 10 o 15 min.
Con ello conseguimos eliminar la lmina media de las paredes celulares para que se
desagreguen con facilidad.
2. Lavamos sumergiendo en agua destilada tres cambios de 0.5 min cada uno.
3. Pasamos los pices a orcena actica reciente, y los introducimos con el colorante en la estufa
a 60 durante 4 o 5 min.

31

4. Se pasa el pice a un porta, con una gota del mismo colorante, se tapa con el cubre y se
presiona este con el dedo para aplastar el pice y disgregar las clulas del mismo (Squash).
5. Esta preparacin puede hacerse permanente, para ello se congela durante un 4 o 5 das, se
saca del congelador y, estando la muestra congelada, se separa el porta del cubre, con
precaucin. Se vierte alcohol absoluto, para deshidratar; se cubre con xileno y se tapa con
el cubre al que se le ha agregado una gota de blsamo de Canad o similar.

TINCIONES Y PREPARACIONES PERMANENTES

PANORMICAS, RECOMENDADAS PARA LA TINCIN DE TALLOS, DE HOJAS, TALLOS
Y RA CES.

FABIL:

1. Cubrir la preparacin de 10 a 20 min en lquido de Fabil
2. Lavar con agua destilada abundantemente
3. Montar en gota de glicerina
4. Cimentar el cubreobjetos con laca
Resultados:
Celulosa Azul
Lignina Rojo
Ncleos y cloroplastos Rojo
Almidn Azul
La preparacin pierde color con el tiempo, hay que preservarla de la luz.
MTODO DE VAN GIESON O TINCIN CON PI CROFUCSINA
1. Se tien las muestras 15 min en picrofucsina (sobretincin)
2. 3 o 4 lavados de 5 min con alcohol de 96 hasta que salga limpio
3. 5 a 10 min en alcohol absoluto
4. 10 a 15 min en esencia (creosota, aceite de clavo, de laurel...)
5. 5 min en xilol
6. Montaje en una gota de blsamo o cualquier otro medio de montaje.
Resultados:
Celulosa Rojo
Lignina Amarillo
Ncleo y cloroplastos Rojo

32

HEMATOXILINA PICROFUCSINA (DE DELAFI ELD O DE FRIELANDER)
1. Se lava 10 min en agua corriente ya que las sales, especialmente el litio, del agua corriente
hacen virar la hematoxilina a un color violeta.
2. Se pasa 10 min a picrofucsina
3. Se lava 3 o 4 veces en alcohol de 96, hasta que salga limpio.
4. Se deshidrata con alcohol absoluto.
5. Se aclara con xileno y se monta con cualquier medio de montaje.
Resultados:
Celulosa Azul
Lignina Amarillo
Ncleos Azul
Cloroplastos Rojo

RELACIN Y USO DE LOS COLORANTES MS FRECUENTES
Azul de algodn: calosa.
Azul de lactofenol: calosa.
Azul de metileno: taninos, paredes celulsicas (regular).
Azul de metileno-alumbre: xilema, esclernquima y sber.
Carmn-actico: cromosomas.
Carmn-alumbre: paredes no lignificadas.
Fucsina amoniacal: xilema, esclernquima, sber y cutina.
Floroglucina clorhdrica: xilema, gomas, inulina (coloracin fugaz).
Hemalum Mayer: celulosa, ncleos.
Hematoxilina de Heidenhain: meristemos.
Lugol: almidn, xilema, esclernquima y sber.
Rojo Congo: azulea con los cidos; celulosa; colorante vital.
Rojo de Rutenio: compuestos pcticos.
Safranina: xilema, esclernquima y sber.
Sudn III: colorea selectivamente, el xilema, cutina, grasas, resinas, aceites, ceras,
Verde Iodo: xilema, esclernquima y sber.
Verde de metilo: xilema, esclernquima y sber.
Verde luz: xilema, sber, esclernquima.
Vesuvina: epidermis y formaciones epidrmicas.

33

ESTRUCTURAS VEGETALES DE LAS CUALES, PARA SU ESTUDIO, NO ES
NECESARIO OBTENER CORTES
Material tal como algas unicelulares o filamentosas, esporangios de helechos, hongos y setas, granos
de polen, tricomas, epidermis arrancadas de hojas, etc. Pueden observarse directamente al micros-
copio ponindolos con una gota de agua entre porta y cubre. Algunas de las estructuras comentadas
tienen una coloracin propia (esporas, polen, tricomas) que permite verlas fcilmente. A las otras
(diatomeas y diversas algas unicelulares, etc.) ser conveniente darles el mximo contraste posible,
mediante el cierre del diafragma y haciendo, en algunos casos una iluminacin oblicua.
Tambin es interesante la observacin, en vivo, de algunos orgnulos celulares; son materiales pro-
picios para la observacin de cloroplastos, los pelos estaminales de Tradescantia o bien las hojas de
Elodea, en las cuales, al ser puestas entre porta y cubre con una gota de agua, se pueden observar
los movimientos de ciclosis de los cloroplastos, arrastrados por corrientes citoplasmticas.
Si se desea obtener preparaciones permanentes de este tipo de materiales, en algunos casos hay
que proceder a una fijacin previa mediante alcohol etlico de 70 o de formol al 6%, y seguida-
mente escoger el tipo de montaje:
1. Poner el material en una gota de glicerina, de albmina glicerinadaentre porta y cubre,
y sellar ste con esmalte de uas.
2. Poner una gota de goma arbiga en el porta con el material que se desea montar, dejar
secar, y poner seguidamente una gota de blsamo de Canad y el cubreobjetos
3. Deshidratar el material, es decir dejarlo:
de 5 a 10 min en etanol de 70
de 5 a 10 min en etanol de 90
de 5 a 10 min en etanol absoluto.
de 10 a 15min en esencia (eucaliptus, creosota, aceite de clavo.)
5 min en xilol
montarlo en una gota de blsamo de Canad, Euparal, D.P.X., etc.

OBTENCIN Y PREPARACIN PERMANENTE DE DIVERSOS TIPOS DE
MATERIAL
DIATOMEAS
Podemos partir de una gota de agua dulce o marina, que tras ser observada directamente, nos
haya permitido ver que tena algas de este tipo, o bien muestras de fitoplancton, obtenidas con res,
que previamente se eluirn en una gota de agua.
Se deja secar sobre el porta, y cuando se haya secado completamente se aade una gota de
blsamo.
Otra fuente de obtencin de diatomeas es la diatomita, o tierra de diatomeas. En este caso, el
material ya seco se cubre directamente con el blsamo.

34

ESPORANGIOS DE HELECHO

Raspamos delicadamente los soros de un helecho tierno o seco sobre una gota de goma arbiga.
Esparcimos el material con una aguja enmangada.
Se deja secar la goma arbiga y se coloca una gota de blsamo de Canad para cubrir, acto
seguido con el cubre.
Al hacer la observacin microscpica, veremos esporangios: Unos enteros, los otros rotos; as como
esporas dentro de los esporangios o bien libres. Estas ltimas hay que verlas a grandes aumentos.
ESPORAS DE HONGOS

Si el material es fresco, es necesario disgregar las laminillas sobre un portaobjetos, dentro de una
gota de goma arbiga, y seguir la tcnica descrita.
Si el material es seco, hay que dejar los trozos de lminas dentro de amonaco durante unos minutos
(5 o 10), con ello se hinchan. Seguidamente se lavan con agua abundante y se procede a montarlos
como en el caso anterior.
POLEN
Para el estudio del polen, este debe ser previamente acetolizado previamente (Erdtman, 1969), as
se consigue eliminar el contenido celular y la intina del grano de polen, lo que hace fcil la obser-
vacin de la esporodermis. Esta tcnica se lleva a cabo sobre portaobjetos segn el protocolo si-
guiente:
1. Se desmenuzan las anteras sobre el pota.
2. Se dejan los granos de polen y se retira el material detrtico.
3. Se agrega la mezcla acetoltica (anhdrido actico-cido sulfrico 9:1) en caliente, utilizando
la llama de un mechero.
4. Se lava y se monta con glicerogelatina.

Los granos de polen suelen tener una pigmentacin variable de la exina por lo que no es necesario
teirlos.
Es recomendable la observacin de granos de polen de pino por los flotadores que tiene, as como
los de calabaza, por su morfologa y la observacin de los poros germinativos operculados.
TRICOMAS

Los tallos y las hojas estn cubiertas, a menudo, de pelos, ms o menos abundantes, extraordinaria-
mente polimorfos, con un gran valor en taxonoma. Pueden ser pelos peltados, estrellados, escuami-
formes, etc.
Su estudio nos permite comprobar, una vez ms el elevado grado de polimorfismo celular.

35

Cabe escoger, como material de estudio, plantas pubescentes, velludas; Sus hojas y tallos se rascan
suavemente, y se puede hacer un montaje al aire o con el mtodo de la goma arbiga y el blsamo
de Canad, antes citado.
No suele ser necesaria la fijacin, ya que los tricomas suelen estar formados por clulas muertas.
Son especialmente curiosos los tricomas de Eleagnus angustifolia, Olea europaea, Quercus
sp., Lavandula sp., Cistus clusii, C. albidus...
ESTOMAS

Es particularmente interesante el estudio de las epidermis foliares. Para ello basta con arrancar con
cuidado la epidermis de las hojas; las paralelinervias (monocotiledneas) nos permiten hacerlo bas-
tante bien, tambin es fcil arrancar la epidermis de las hojas de lechuga en su zona central.

1. La epidermis arrancada se pasa a etanol de 70 para su fijacin, su delgadez hace que
basten 10 min para completar el proceso.
2. Conviene teir, en vidrio de reloj con hematoxilina al 1%, azul de metileno al 1%, violeta de
genciana al 1.5 %, o cualquier otro colorante nuclear y de la celulosa, durante 5 min.
3. Se lava sumergiendo en un tubo con agua destilada durante 5 min.
4. Se contrasta tiendo con eosina 5 min, y se vuelve a lavar durante otros 5 min.
5. Pasamos la muestra extendida al porta y cubrimos con etanol absoluto, dos veces, para
deshidratar. Se cubre inmediatamente con xileno y se coloca el cubreobjetos con una gota
de blsamo de Canad.

Resulta especialmente interesante la observacin de los estomas de Agave americana y de plantas
semejantes.

MATERIALES VEGETALES A LOS QUE RECURRIR
EPIDERMIS CUTINIZADA
Hojas: Nerium, Eucaliptus
Tallos: Ruscus, Olea.
EPIDERMIS CERIFI CADA
Hojas: Ficus, Dianthus
Tallos: Claveles, rosales
EPIDERMIS MINERALI ZADA
Hojas: Equisetum, gramneas

36

EPIDERMIS SUBERIFI CADA
Tallos: Cualquiera que presente crecimiento secundario.
Patata: Casi todas. La patata es especialmente interesante.
Hojas: Nunca tienen.
PARNQUI MA CLOROFLI CO
Hojas:
o En el haz, parnquima en empalizada.
o En el envs, parnquima de clulas redondeadas
Tallos: Normalmente bajo la epidermis hay una o dos capas de colnquima, y todo seguido
viene el parnquima cloroflico de clulas redondas.
COLNQUIMA
Hojas: Poco frecuente, aunque se puede ver en los nervios centrales de Ficus y Rhamnus.
Tallos: Muy frecuente, acostumbra a situarse bajo la epidermis formando una o dos capas.
Los tallos festoneados suelen presentar en cada saliente acmulos de colnquima de tipo
perifrico o de tipo angular. Son buenos los tallos de perejil, apio, ortiga...
ESCLERNQUI MA
Hojas: Casi nunca; en la hoja de pino, bajo la epidermis, hay una capa de esclernquima
bien desarrollada. Tambin hay entre la epidermis y los haces conductores de las monocoti-
ledneas en general. En el nervio central de la hoja de magnolio encontramos un magnfico
anillo de esclernquima envolviendo a los haces vasculares.

Tallos: Muy frecuente bajo la epidermis (hinojo) o bien entre los vasos leosos, donde constitu-
yen una franja continua (vid). En general podemos afirmar que los haces vasculares de la
mayora de los vegetales suelen ir acompaados de tejidos esquelticos protectores: coln-
quima y esclernquima.
CLULAS PTREAS.
Hojas: No suele ser frecuente, podemos verlas en Camelia japnica, Cephalotaxus, y en frutos
carnosos tales como la pera y el membrillo.
Observando detenidamente de las paredes y contrastando con el diafragma, es fcil ob-
servar los plasmodesmos de estas clulas petrosas.
VASOS CONDUCTORES.
Hojas, tallos y races.
o Son interesantes las secciones transversales de plantas de hojas no paralelinervias ya
que nos permiten ver en el mismo corte cortes longitudinales y transversales de los vasos.

37

o Los cortes longitudinales de los tallos y peciolos, especialmente los de las cucurbitceas,
son muy interesantes para ver la morfologa de los vasos del xilema (espiralados, ani-
llados, punteados, escalariformes, etc.), as como para poder ver las cribas de los vasos
de floema, sobre todo al teirlos con el azul de anilina o el azul de lactofenol.
CONDUCTOS RESINFEROS
Hojas y tallos de Pinus sp. y Abies sp.
CONDUCTOS ESENCI ALES
Tallos y hojas de plantas aromticas (Rosmarinus sp., Lavandula sp., Petroselium sativum ...)
BOLSAS DE ESENCI A
Hojas de naranjo, limonero, eucaliptus...
GLNDULAS PELTADAS
Epidermis de hojas y tallos jvenes de Rosmarinus sp., Lavandula sp., Cistus clusii, etc.
GLNDULAS SSI LES
Epidermis de hojas y tallos jvenes de Rosmarinus sp, Pelargonium sp....
CMARAS ESTOMTI CAS
Cortes transversales de hojas de Cycas revoluta, Nerium oleander.
LENTI CELAS
Epidermis suberificada de tallos, especialmente rosales y patata.
ALMI DN
Tubrculos y otros rganos de reserva: patata, zanahoria, pltano...
ALEURONA
Simientes de ricino
INCLUSIONES CRISTALINAS
Cistolitos: Cortes de hojas de Ficus sp., Parietaria officinalis, Urtica dioica...
Drusas de carbonato y oxalato clcico: Hojas, tallos y races de Magnolia sp., Lonicera sp.,
Vitis sp., Cistus sp., Rhamnus alaternus...
Rafidios: Hojas, tallos y races de Vitis vinifera, Ophris sp.

38

PUNTEADURAS

En las paredes celulares de la mdula de sauco (Sambucus nigra), de Ruscus aculeatus, etc.) Encon-
traremos las punteaduras simples. Para observar las areoladas, hay que recurrir a los cortes de
madera de conferas en donde son especialmente abundantes.

39

BIBLIOGRAFA

1. Brcherl, W. (1972). Introduo s tcnicas microscpicas. Edit. Smbolo. Sao Paulo.

2. Esau, K. (1985). Anatoma vegetal. Edit. Omega. Barcelona.

3. Cutler, D.F. (1978). Anatoma vegetal aplicada. Librera Agropecuaria, S.A., Buenos Aires.

4. Fahn. A. (1985). Anatoma vegetal. Edit. Pirmide.

5. Font Quer, P. (1977). Diccionario de Botnica. Ed. Labor. Barcelona.

6. Gabe M. (1968). Techniques histologiques. Edit. Masson. Paris.

7. Johansen, D.A. (1940). Plant microtechnique. Edit. Mc Graw Hill. Londres.

8. Langeron, M. (1949). Prcis de microscopie. Technique-Experimentation-Diagnostic. Edit.
Masson. Paris.

9. Locquin, M. & M. Langeron. (1985). Manual de Microscopa. Edit. Labor. Barcelona.

10. Martoja, R. & M. Martoja-Pierson. (1970). Tcnicas de histologa animal. Edit. Toray-Masson.
Barcelona.

11. Pujiula, J. (1931). Citologa. Edit. Tipologa Catlica Casals. Barcelona.

12. Purvis, M.J. D.C. Collier & D. Walls. (1966). Laboratory techniques in Botany. Edit. Butter-
worths. Londres.

13. Roland, J.C. (1980). Biologie vegetale. Organisation des plantes a fleurs. Edit. Masson. Paris.

14. Roland, J.C. et Vian, B. 1981. Biologie vgtale. Organisation des plantes sans fleurs. Edit.
Masson. Paris.

15. Ruzin, S.E (1999). Plant microtechnique and microscopy. Oxford University Press Inc.

16. Sandoval, E. (2005) Tcnicas aplicadas al estudio de la anatoma vegetal. Ed. UNAM.

17. Santamarina, M.P., Rosell Caselles, J. & Garca Breijo, F.J. (2009). Atlas de Anatoma Ve-
getal. Editorial U.P.V. Valencia.

18. Sass, J.E. (1968). Botanical microtechnique. Iowa State Univ. Press. Iowa.

19. Strasburger. E. (1902). Das Botanischa prakticum. G. Fisher. Jena.

40

Técnicas de Histología Vegetal

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Técnicas de Histología Vegetal

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

TCNICAS DE

Você também pode gostar