FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES UNIVERSIDAD DE CONCEPCION

GUIA LABORATORIOS DE MICROBIOLOGIA

KATHERINE SOSSA

2011

INSTRUCCIONES GENERALES 1. Lea el prctico antes de llegar al laboratorio. Tome nota de las instrucciones que se den en el laboratorio y pregunte, si tiene dudas, para clarificar el procedimiento a seguir. 2. Todos Los estudiantes deben dejar sus pertenencias en los casilleros que estn afuera del Laboratorio, para lo cual deben traer su propio candado. 3. Se exige puntualidad, las personas que lleguen tarde no podrn entrar al laboratorio 4. Concurra al laboratorio con delantal, apuntes de prcticos, lpiz marcador de vidrio, indeleble al agua y fsforos. 5. Se formarn grupos de 4 o 5 estudiantes, que mantendrn siempre la misma ubicacin en el laboratorio 6. Todo elemento usado (pipetas, portaobjetos, tubos, etc.) debe considerarse contaminado y debe ser dejado en los recipientes destinados para este objeto, NO DEJE MATERIAL CONTAMINADO SOBRE EL MESON DE TRABAJO. 7. Trabaje ordenadamente y evite los descuidos. No se lleve las manos a la boca ni a los ojos y no saque fuera del laboratorio material contaminado o cultivos bacterianos. 8. Efecte las tinciones solamente en los lugares destinados especialmente para este objeto. 9. Cierre las llaves de agua y apague el mechero cuando no los est usando. 10. Al terminar el trabajo, deje el mesn limpio y todos los materiales en su lugar. Los microscopios deben quedar limpios. 11. Cualquier accidente, por mnimo que sea, debe ponerse en conocimiento del docente a cargo del prctico. 12. No usar sandalias, solo zapatos cerrados 13. Se debe trabajar en forma ordenada y concentrada. 14. Lavarse las manos antes y despus del laboratorio. 15. No se permite comer o ingerir cualquier lquido en el laboratorio, o maquillarse o peinarse.

16. Se debe utilizar adecuadamente las micropipetas, si no sabe debe preguntar a su instructor. 17. Abrir con cuidado los tubos y frascos 18. Las personas que usan pelo largo, deben tomarse el pelo. Se exige cumplir con todas estas recomendaciones por su propia seguridad.

LABORATORIO N1 DE MICROBIOLOGIA OBSERVACION MACRO Y MICROSCOPICA DE BACTERIAS

OBJETIVO Introducir al estudiante en el trabajo microbiolgico.

MATERIALES: - 6 cultivos bacterianos puros, 3 Gram positivo y 3 Gram negativo - 4 muestras microscpicas - Pipetas Pasteur - Cubre objetos - Mechero - Asas - set para tincin gram

ACTIVIDAD I.- INTRODUCCION AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA 1.- Se darn las explicaciones necesarias de las partes constitutivas del microscopio, con especial referencia a los mtodos que usa la bacteriologa. 2.- Se conocern cada uno de los materiales e instrumentos y su tcnica de uso. a) Asas de platino b) Pipetas, pipetas Pasteur. c) Placas de Petri d) Tubos de ensayo e) Material de tinciones f) Estufas de cultivo 3.- Se darn las nociones fundamentales acerca de la asepsia que requiere el trabajo bacteriolgico, tanto para evitar la contaminacin de los materiales en uso y de los cultivos, como para evitar la posible infeccin del operador.

ACTIVIDAD II: OBSERVACION MACROSCOPICA DE BACTERIAS Las bacterias pueden crecer sobre la superficie de medios de cultivo slido y originar una estructura macroscpica caracterstica. Esta se conoce con el nombre de "COLONIA BACTERIANA" y su forma y tamao es caracterstica de cada especie.

Se debe visualizar: -Presencia de colonias -Color de las colonias -Aspecto de la superficie de las colonias (hmeda, seca, viscosa, etc.) -Capacidad de invasividad -Otras caractersticas, por ejemplo fluorescencia. Trabajo prctico: Observe y anote las caractersticas macroscpicas de las colonias de distintas especies bacterianas que le han sido entregadas. Preguntas: Qu es un medio de cultivo? Cmo se podra saber si se ha desarrollado una cepa o ms de una cepa bacteriana? qu es una colonia bacteriana? cmo se forma?

ACTIVIDAD III: OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS Se han generado una serie de tinciones para visualizar distintas estructuras bacterianas una de las ms usadas es la tincion Gram, de Ziehl-Neelsen, de flagelos y esporas. ACTIVIDAD III.1: OBSERVACION DE TINCIONES DE BACTERIAS Trabajo prctico: Observe y anote las caractersticas microscpicas de los portaobjetos con tinciones bacterianas que le han sido entregadas. Trate de establecer al exmen microscpico, presencia de esporas, la afinidad tintorial, las diferentes morfologas (formas esfricas, alargadas, etc.) y agrupaciones (en cadenas, en racimos, en pares, ttradas, etc.)

ACTIVIDAD III.2: REALIZAR TINCION GRAM DE DISTINTAS DE BACTERIAS Trabajo prctico: A partir de las colonias que se desarrollaron en las placas que le fueron entregados, realice tincin Gram diferencial a aquellas colonias que morfolgicamente son diferentes. Para esto proceda de la siguiente manera: a.- Prepare un frotis de cada una de las colonias diferentes.

b.- Someta todos los frotis a la tincin de Gram a) Prepare un FROTIS, que consiste en una delgada capa de bacterias distribudas en la superficie de un portaobjetos y fijado a l para que resista las diferentes etapas de la tincin (adicin de colorantes, lavados, etc.). La preparacin del frotis consiste en: 1.- Colocar una gota de cultivo lquido en un portaobjetos limpio o una gota de emulsin si se tiene un cultivo en medio slido (ver observacin a fresco). 2.- Extender este material cuidadosamente en una capa delgada. 3.- Dejar secar a temperatura ambiente o calentando suavemente a la llama del mechero. Evite sobrecalentamiento. 4.- Fijar la preparacin pasando rpidamente la cara del portaobjeto que lleva las bacterias dos o tres veces por la llama del mechero, evitando carbonizarlas por sobrecalentamiento. El frotis queda entonces listo para ser teido con la coloracin deseada. b) Procedimiento tincion Gram - Cubra el frotis violeta de genciana o cristal violeta durante 60 segundos. - Lave con agua. - Cubra la preparacin con lugol durante 60 segundos. - Lave con agua. - Decolore con alcohol 95% durante 30 segundos. La fase de decoloracin con alcohol constituye la etapa ms importante de esta tincin y en ella reside su carcter diferencial. - Lave con agua. - Cubra el frotis con el colorante de contraste safranina durante 20 segundos. - Lave con agua. - Seque con papel y completar el secado al calor suave. - Observe con objetivo de inmersin, colocando una gota d e ceite de inmersin sobre la preparacin. - Trate de establecer al exmen microscpico, la afinidad tintorial, las diferentes morfologas y agrupaciones.

Preguntas: Qu informacin le entrega esta tincin? Hay diferencias entre las bacterias teidas, porqu? Explique la accin de cada uno de los componentes de la tincin Gram.

PRINCIPALES HERRAMIENTAS DE TRABAJO BACTERIOLGICO

1. Mechero En el laboratorio bacteriolgico es necesario trabajar siempre junto a un mechero para evitar contaminaciones externas. Permite flamear los tubos de ensayo, pipetas, portaobjetos y calentar al rojo las asas metlicas. 2. Placas de Petri Se utilizan para trabajar con medios de cultivos slidos, colocando un volumen tal que permita tener una capa de 4-5 mm de altura. Las placas se deben abrir slo mientras se realiza la siembra. 3. Pipetas Pasteur Estn fabricadas de varillas de vidrio de 5-6 mm de dimetro las cuales se han estirado y sellado en un extremo para tener un fino capilar. Se utilizan para trasladar lquidos de un medio a otro, o para efectuar siembras en medio slido. En este ltimo caso se puede acodar en el extremo o hacer un rastrillo, dependiendo del tipo de siembra que se requiera. Estas pipetas generalmente estn expuestas al ambiente, por lo tanto, se deben flamear en la llama del mechero antes de ser utilizadas. 4. Pipetas graduadas Son las pipetas de uso comn en qumica que se esterilizan al horno Pasteur envueltas en papel y taponadas con algodn. Al desenvolverlas para ser usadas, se debe tener precaucin de no tocar la zona que va a tener contacto con la muestra a trabajar. 5. Tubos de ensayo Se encuentran taponados con algodn no hidrfilo o con tapas metlicas o de plstico. Estn esterilizados al horno Pasteur. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de ser usado. 6. Matraces Se encuentran taponados con algodn hidrfobo y esterilizado al horno Pasteur. Debe flamearse la boca del matraz antes y despus de ser usado. 7. Asas Son los instrumentos de siembra ms utilizados en bacteriologa. En el extremo tienen nicrom en forma de aguja (asa recta) o en forma de un pequeo crculo (asa redonda o curva).

8. Microscopio En bacteriologa se emplea el objetivo 40 para observar preparaciones sin tincin (a fresco) y el objetivo 100, de inmersin, para preparaciones teidas, en este caso se debe colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. Se debe tener la precaucin de no dejar preparaciones en el microscopio y limpiar la platina y los objetivos despus de ser usado, para lo cual se puede utilizar un pao humedecido con xilol. 9. Estufa de cultivo El material sembrado se debe incubar en estufas que se encuentran a la temperatura apropiada. Esta temperatura va a depender de los microorganismos a estudiar.

LABORATORIO N2 DE MICROBIOLOGIA TECNICAS DE ASEPSIA Y DESINFECCIN Las tcnicas de asepsia son procedimientos utilizados para reducir o eliminar la presencia de microorganismos en un rea determinada, ya que estos son los causantes de enfermedades. En la prctica habitual existe una gran variedad de sustancias microbiocidas que permiten desinfectar y reducir la carga microbiana de utensilios, reas de trabajo e incluso nuestras manos. La eficacia de un microbiocida o microbiosttico es determinada con respecto a su habilidad para detener el crecimiento microbiano. Ms especficamente, la eficacia microbiocida de un qumico es a menudo determinado con respecto al fenol, lo que se conoce como el coeficiente fenlico (PC). El coeficiente fenlico es calculado dividiendo la dilucin ms alta del antimicrobiano de inters, qu da muerte a todos los organismos despus de una incubacin por 10 minutos pero que no de muerte a los 5 minutos, con la dilucin ms alta, del fenol con los mismos resultados. Los qumicos que tienen un coeficiente fenlico mayor que 1 indica que son ms eficaces que el fenol, y aqullos que tenga un coeficiente del fenol menos de 1 indica que son menos eficaces que el fenol. OBJETIVOS 1.- Determinar la eficacia microbiana de algunos desinfectantes. 2.- Calcular el coeficiente fenlico de un desinfectante comercial. MATERIALES Cultivo de Staphylococcus aureus Tubos con Caldo soya Placas de agar soya Tubos estriles Tubos con solucin fenlica (1/80, 1/90 y 1/100) Micropipetas Pipeta de 5mL Mechero de alcohol Asas Incubadora a 35C Gradilla para tubos Desinfectantes comerciales. Vortex. Puntas para micropipeta.

ACTIVIDAD 1: TECNICAS DE ASEPSIA. - En la mitad de una placa petri con medio de cultivo con agar soya tripticasa (TSA), coloque su huella dactilar sin lavar su mano, posteriormente lave su mano (con las prcticas habituales de limpieza) con jabn desinfectante y en la segunda mitad de la placa coloque otra vez su huella dactilar. Incube a 35 C por 24 horas.

ACTIVIDAD 2: INHIBICION DE CRECIMIENTO BACTERIANO Colocar 5mL de desinfectante en un tubo estril (en algunos caso se debe diluirlo segn instrucciones del fabricante). Agregar en forma asptica 50L del cultivo de S.aureus y mezclar en vortex para homogeneizar. Transferir a intervalos de 1, 2, 5, 10 y 15 minutos, 100L de la mezcla que contiene a las bacterias, a un tubo con caldo soya estril. Inocular tambin un tubo con 100 L desde el cultivo de bacterias. Incubar los tubos durante 48 horas a 35C. Una vez completada la incubacin de los tubos, agitar y observar la presencia de crecimiento (turbidez) (+) y la ausencia de crecimiento (-). Presentar los resultados de los distintos desinfectantes en una tabla y discutir que representan. Preguntas: 1- Se observ algn efecto del jabn? Que hace el jabn? 2- Cual es el mejor desinfectante, porque? 3.- Cual es el componente activo y mecanismo de accin de cada desinfectante?

ACTIVIDAD 3: CALCULO DEL COEFICIENTE FENOLICO En el mesn tendr disponible 3 tubos con solucin de fenol (1/80, 1/90 y 1/100). Diluir el desinfectante en agua para obtener las siguientes concentraciones 1/400, 1/450, y 1/500. Teniendo un volumen final de 5mL en cada tubo. Marcar 18 tubos de caldo soya estril con el nombre del desinfectante (fenol y desinfectante comercial), dilucin e intervalo de tiempo (5,10 y 15 minutos para cada dilucin). Agregar a cada tubo de dilucin 500L del cultivo de S.aureus, agitar bien los tubos, para obtener una suspensin homognea que permita al desinfectante tener contacto con las bacterias. Transferir aspticamente una asada en intervalos de 5, 10 y 15 minutos a un tubo con caldo soya estril. Incubar los tubos durante 48 horas a 35C y observar la presencia y ausencia de crecimiento bacteriano. Calcular el coeficiente fenlico y concluir.

Ejemplo de clculo: si la dilucin 1/20 de fenol mat el S.aureus dentro de 10 minutos y el desinfectante lo elimin en la dilucin 1/300 dentro de los 10 minutos. El PC se calcula: (1/20) / (1/300) = 15. El desinfectante es 15 veces ms efectivo que el fenol para eliminar el S.aureus. Preguntas 1.- Cul es la diferencia entre un microbiocida y un microbiosttico? 2.- Cul es el efecto del fenol? 4.- Que factores son importantes al momento de elegir un desinfectante? 5.- Averige cul es la accin del desinfectante utilizado sobre los microorganismos.

LABORATORIO N3 DE MICROBIOLOGIA TCNICAS DE RECUENTO BACTERIANO Uno de los problemas que se presenta en bacteriologa es determinar o estimar el nmero de bacterias viables y recuperables en cultivo, presentes en una poblacin dada, sea ella la de un cultivo puro o la de una muestra de suelo, agua o alimento.

OBJETIVO Determinar el recuento bacteriano de las muestras entregadas mediante las siguientes tcnicas: 1.- METODO DE DILUCIN SERIADA EN PLACAS 2.- RECUENTO DIRECTO EN CAMARA DE NEUBAUER 3.- METODO INDIRECTO: TURBIDIMETRIA.

MATERIALES: - 2 cultivos bacterianos puros, uno Gram positivo y uno Gram negativo. - 8 placas con agar tripticasa por grupo - 18 tubos eppendorf con 900ul de suero fisiolgico - Micropipetas - Puntillas - Cubetas - Pipetas pasteur - Cmara de Neubuer - Cubre objetos - Espectrofotmetro - Mechero - Vortex

ACTIVIDAD I.- METODO DE DILUCIN SERIADA EN PLACAS 1) Diluciones seriadas en tubo: A partir de las 2 muestras entregadas efectu una serie de diluciones seriadas de 10 en 10 (desde la dilucin -1 a la -7) para cada bacteria, para esto: Tome 100 ul del cultivo original (sin dilucin) y agrguelo a un tubo eppendorf con 900 ul de suero fisiolgico, mezcle bien en vortex, elimine la punta contaminada, este tubo ser la dilucin -1 o 1/10

Enseguida tome 100 ul del tubo de dilucin -1 bien mezclado usando una punta nueva y agrguelo a un tubo eppendorf con 900 ul de suero fisiolgico, mezcle bien en vortex, elimine la punta contaminada, este tubo ser la dilucin -2 1/100 Luego tome 100 ul del tubo de dilucin -2 bien mezclado usando una punta nueva y agrguelo a un tubo eppendorf con 900 ul de suero fisiolgico, mezcle bien en vortex, elimine la punta contaminada, este tubo ser la dilucin -3 o 1/1000 Realice estas diluciones seriadas hasta la dilucin -7. Recuerde rotular bien cada tubo, con el nmero de la muestra y la dilucin 2) Siembra en placas de agar tripticasa: siembre las ultimas 4 diluciones, es decir, desde la dilucin -4 a la -7, de la siguiente forma: Partiendo de la dilucin -7 mezclada en vortex, siembre poniendo sobre la placa de agar 3 gotas de 10 ul de la suspensin, e incline la placa dejando escurrir, como su instructor le indique. Realice esta misma siembra par las diluciones -6, -5 y -4. Puede usar la misma punta, si siembra desde la ms diluida a la ms concentrada y adems si la punta utilizada no ha tocado ninguna superficie, si no es as cambie la punta Las placas deben ser bien rotuladas con el nmero de grupo, cepa y dilucin, djelas en incubacin a 30 C por 24-48 horas. Seleccione la dilucin cuya placa presente entre 30 - 300 colonias en cada una de las gotas. Cuente cuidadosamente el nmero de colonias, realice el recuento bacteriano, aplicando la siguiente formula: Recuento: n de colonias x factor de dilucin x volumen total (ul) / volumen sembrado en la gota (ul) Luego calcule el promedio y la desviacin estndar, para expresar el recuento en unidades formadoras de colonias (UFC) por ml del cultivo: promedio del recuento desv. Standard UFC / ml. Debe realizar esto para cada bacteria

ACTIVIDAD II.-RECUENTO DIRECTO EN CAMARA DE NEUBAUER Coloque sobre la cmara de Neubauer un cubre objeto Tome con una pipeta pasteur solucin de la dilucin -1, y coloque cuidadosamente la suspensin de la muestra -1 en la canaleta que da a la cavidad cuadriculada, dejar que la solucin escurra por capilaridad, sin presionar, siguiendo las recomendaciones de su instructor. Ponga la cmara en el microscopio, enfoque con el objetivo menor hasta ver la zona de la cavidad cuadriculada, luego observe con el objetivo mayor (60X o 100X en aceite), cuente las bacterias por cada cuadrado mas pequeo, usando cuadrados al azar y sin repetir hasta haber contado unas 10 cuadrculas. La cavidad cuadriculada tiene dimensiones conocidas, donde se conoce el rea de las cuadrculas y la altura de la cmara de recuento y el volumen ocupado por la suspensin en cada cuadrcula, lo que esta expresado en un factor. Para obtener el nmero de bacterias por mililitro de suspensin, usted debe multiplicar el nmero de clulas de cada cuadricula por el factor de la cmara de neubauer. Luego calcule el promedio y la desviacin estndar, para expresar el recuento en numero de clulas por ml del cultivo: promedio del recuento desv. Standard clulas / ml Debe realizar esto para cada bacteria Este atento a las instrucciones que le indique el instructor. Compare estos recuentos con los de la actividad I.

ACTIVIDAD III.- METODO INDIRECTO: TURBIDIMETRIA. Realice diluciones -1, -2 y -3 de cada cultivo Tome 1 ml de caldo tripticasa estril y colquelo en una cubetas de plstico, lleve esto al espectrofotmetro y lea a 600 nm de longitud de onda , lleve a blanco, este ser su blanco Tome 1 ml del cultivo sin diluir y colquelo en una cubeta de plstico, lleve esto al espectrofotmetro y lea a 600 nm de longitud de onda. Ahora tome 1 ml de suero fisiolgico estril y colquelo en una cubeta de plstico, lleve esto al espectrofotmetro y lea a 600 nm de longitud de onda , lleve a blanco, este ser su blanco

Tome 900 ul de las diluciones -1, -2 y -3, y colquelas en cubetas de plstico, lleve esto al espectrofotmetro y lea a 600 nm de longitud de onda para cada dilucin. Calcule el nmero de clulas a cada absorbancia leda, usando los resultados de las actividades anteriores.

PREGUNTAS: 1. Cal es la sensibilidad de cada una de estas tcnicas? 2. Cul cree usted que es la ventaja y desventaja de usar cada una de estas tcnicas? 3.- Por qu le dan recuentos distintos si es el mismo cultivo? 4.- Compare entre las 2 cepas los recuentos obtenidos en cada uno de los mtodos. A qu se debe la diferencia? 5.- Qu es una unidad formadora de colonia?

LABORATORIO N4 DE MICROBIOLOGIA

RECUENTO BACTERIANO DE MUESTRAS VEGETALES. OBJETIVOS 1.- Recuento bacteriano de muestras vegetales, hojas y races. MATERIALES Muestras vegetales (hojas y races). 2 Bolsas Ziploc 10 Placas de vidrio con medio de cultivo agar tripticasa soya (TSA). 6 Tubos eppendorf Puntas Micropipetas Vortex Estufa o Incubadora a 30C Buffer fosfato salino Mechero

ACTIVIDAD 1: TECNICA DE AISLAMIENTO BACTERIANO DESDE MUESTRAS VEGETALES. Procedimiento A cada grupo se le asignaron diferentes muestras de races y hojas de especies arbreas. Con cada una de ellas por separado debe realizar lo siguiente: 1.- Coloque 10 g aproximadamente de hoja o raz dentro de una bolsa Ziploc por separado, tenga cuidado de no tocar directamente la muestra procese todo con guantes. 2.- Adicione 100 ml de buffer fosfato, cierre bien la bolsa, evitando que la suspensin salga. Agtela horizontalmente por 10 minutos, esta ser su muestra sin diluir, luego realice diluciones seriadas. 3.- Tome 100 ul con una micropipeta y depostelo en un tubo eppendorf que contiene 900ul de buffer fosfato, esta ser la dilucin -1 y as sucesivamente realice las diluciones -2 y -3, hasta la -5

4.- Desde las diluciones, siembre 3 gotas de 10 ul en placas con agar tripticasa, posteriormente incline para que escurra la gota e incube por 24 horas a 30C. 5.- Realizar el recuento bacteriano. Seleccione la dilucin cuya placa presente entre 30 - 300 colonias en cada una de las gotas. Aplique la siguiente frmula: Recuento= n de colonias x factor de dilucin x volumen total (ul) / volumen sembrado en la gota (ul) 6.- Desde las placas de recuento observe la diversidad de colonias, registrando las observaciones macroscpicas como forma, tamao, color etc.

PREGUNTAS 1.- Compare los recuentos obtenidos entre muestras de hoja y raz. A qu se puede deber esta diferencia? 2.- Compare los resultados con los de sus compaeros, observando que planta tiene mayor y menor recuento y diversidad de colonias bacterianas en hojas y en raz.

BIBLIOGRAFIA BROCK: BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS M.T., Madigan, J.M. Martinko & J. Parker. Prentice Hall, Madrid. 1998. Collins and Lynes MICROBIOLOGICAL METHODS C.H. Colins, P.M. Lyne J.M. Grauge. Six edition. 1989. Butterworth & Co. (Publisher)Ltda., U.S.A BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY Varios editores. Volumen 1 (1985), 2 (1986); 3 (1989) y 4 (1989) Williams & Wikins, U.S.A MOLECULAR GENETIC OF BACTERIA J.W. Dale. 2t edition. 2003. John Wiley & Sons Ltd. MICROBIOLOGY : CONCEPS AND APPLICATIONS M.Pelczar Jr.; E.C.S. Chan and N. Krieg 1st Edition, 1993. McGraw Hill Companies, Inc CELLULLAR MICROBIOLOGY Pascale Cossart. 2 Ed. Washington 2005