UNMSM FM EAPMH BIOQUIMICA

PRCTICA FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

INTRODUCCION: La catlisis enzimtica es un fenmeno importante en la existencia de la vida tal como la conocemos. Por esto el estudio de las enzimas y de la catlisis enzimtica es de inters; en ausencia de una enzima apropiada, una gran cantidad de reacciones qumicas no slo ocurren muy lentamente sino que pueden no ocurrir del todo, esto indica que la presencia de la enzima es capaz de acelerar la velocidad de reaccin de una reaccin qumica especfica. La concentracin del catalizador es importante ya que al aumentar la cantidad de molculas de enzima presentes en la solucin aumenta la probabilidad de que los reactantes choquen con la enzima y ocurra as el evento cataltico. La forma en que la concentracin de un reactante afecta a la velocidad de reaccin se expresa a travs de lo que se conoce como orden de reaccin. Las enzimas son protenas que intervienen en las reacciones biolgicas, acelerando la velocidad de reaccin hasta alcanzar su punto de equilibrio. Diversos factores modifican la actividad enzimtica, tales como : 1) Concentracin de Substrato [S] 2) Concentracin de la Enzima [E] 3) pH del medio 4) Influencia de la temperatura 5) Tiempo de la reaccin. 6) Efecto de inhibidores y activadores La actividad enzimtica puede expresarse : a) Por la desaparicin del Substrato (S) b) Por la aparicin de Productos (P) c) Por modificacion de Cofactores (Co) El mecanismo de reaccin enzima-sustrato puede simbolizarse as: [E] + [S] C C [E] + [P]

Las enzimas por su carcter proteico, poseen una composicin especfica de cadenas laterales determinadas por la secuencia de aminocidos del polipptido. La presencia de grupos ionizables en esta estructura explica el hecho de que las enzimas sean sensibles al pH tanto en su estabilidad, como en su capacidad cataltica. La determinacin de la actividad enzimtica en un ensayo depende de la Energa Cintica de las molculas y de la estabilidad de la enzima presente en el medio. Cuando se aumenta la temperatura, ambas reacciones se aceleran, observndose dos respuestas diferentes, en una se produce un aumento de la velocidad de reaccin, intervalo en el cual la enzima permanece relativamente estable y en la otra hay disminucin de la velocidad; en ambos casos, la cantidad de productos acumulados o de enzima desnaturalizadas, depende a su vez del tiempo que se haya permitido transcurrir, la temperatura optima ser dependiente del tiempo de ensayo y de factores como la fuerza inica, pH.

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ENZIMAS: Son protenas, en su gran mayora, que intervienen en las reacciones biologicas acelerando la velocidad de reaccion hasta alcanzar su punto de equilibrio. SUSTRATO: Son sustancias sobre las que actuan las enzimas. En una reaccion bioquimica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reaccion aumenta la concentracion de los productos a expensas de la desaparicion de los correspondientes sustratos; en tanto que la enzima (E) no se modifica. La pepsina es un enzima proteoltico (proteasa cida) segregada por las clulas principales de las glndulas gstricas, tiene un peso molecular de 34 644 Da. Hidroliza los enlaces peptdicos, descomponiendo as las protenas en aminocidos. La pepsina solo realiza la protelisis en medio cido, acta a un pH bajo, por lo que es precisa la presencia de cido clorhdrico para la realizacin de la digestin gstrica de las protenas. Las clulas de las glndulas gstricas no producen directamente pepsina, sino que su producto es el pepsingeno, sustancia precursora sin capacidad digestiva que se convierte en pepsina en la luz de la glndula, al entrar en contacto con el cido clorhdrico y con la pepsina ya producida. La actividad enzimtica se medir por la desaparicin del substrato (disminucin de la turbidez en los tubos que contiene albmina), la cual se determinar mediante la medicin de la absorbancia (D.O.), con luz azul (420-460 nm). PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Competencias Al finalizar la prctica, el alumno: 1. Realiza la grfica de Michaelis-Menten y obtiene el Km en las dobles recprocas. 2. Demuestra el efecto de la concentracin, pH y temperatura sobre la actividad de la enzima. Materiales y Reactivos: 1. Gradillas y tubos de ensayo 2. Pipetas de vidrio 3. Espectrofotmetro. 4. Bao Mara 37C 5. Solucin de albmina 250mg/dL 6. Solucin de pepsina 0, 01g/dL 7. HCl, 1N y 0,01 N 8. Agua destilada EXPERIENCIA N 1 EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO OBJETIVO: Determinar el Km experimental de la pepsina para la albmina, apartir de una grfica de vi contra [S] (Ecuacin de Michaelis-Menten) y/o en una grfica de dobles reciprocas 1/vi contra 1/[S] (Ecuacin de Lineweaver-Burk) Preparar la siguiente batera de 8 tubos como se indica a continuacin: Tubos N ml agua destilada ml HCl 1N ml albmina ml pepsina 1 8 0,5 1 2 7 0,5 2 3 6 0,5 3 4 5 0,5 4 5 4 0,5 5 6 3 0,5 6 7 2 0,5 7 8 5

Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 en el espectrofotmetro. Considerar las absorbancias como Lectura Inicial. Luego, Incubar los ocho tubos a 37C por 5 min

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Aadir 0,5 ml de pepsina al primer tubo, MEZCLAR y mantenerlo en incubacin 37C, luego de 1 min aadir 0,5 mL de pepsina al segundo, MEZCLAR y llevarlo a incubar a 37C , despus de 1 min ms, al 3er tubo y as sucesivamente, llevando en cada vez a incubar a 37C EL TIEMPO DE REACCION SON 5 MINUTOS, transcurrido dicho tiempo, se debe sacar el tubo el bao mara y se le llevar a leer inmediatamente, al espectrofotmetro a 520 nm. Considerar las segundas absorbancias como Lectura Final. Hacer la diferencia: Actividad Enzimtica = Lectura Inicial - Lectura Final El resultado de sta diferencia se considerar como Actividad Enzimtica. Graficar en papel milimetrado: 1) Actividad Enzimtica en el eje Y versus [S] en el eje X 2) 1/Actividad Enzimtica en el eje Y versus 1/[S] en el eje X 3) Calcular el Km de la pepsina en cada una de las grficas

EXPERIENCIA N 2 EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA OBJETIVO: Demostrar que la velocidad de una reaccin enzimtica a concentraciones saturantes de substrato, dependen linealmente de la concentracin de la enzima. Preparar la siguiente batera de tubos: Tubo N ml agua destilada ml HCl 1N ml albmina ml pepsina 1 4,5 0,5 5,0 2 4,0 0,5 5,0 3 3,5 0,5 5,0 4 3,0 0,5 5,0 5 2,5 0,5 5,0 6 7,0

Preincubar a 37C por 5 min. Aadir la pepsina del tubo 6 a los tubos (del tubo 2 al 5) segn el siguiente esquema, DEJANDO ENTRE UNO Y OTRO TUBO UN MINUTO DE TIEMPO: Tubo N ml pepsina 1 2 0.5 3 1.0 4 1,5 5 2,0

Incubar a 37C por 5 min. Trascurrido el tiempo de reaccin llevar a leer INMEDIATAMENTE al espectrofotmetro, el tubo que cumple con el tiempo y leer la DO a 520 nm.. La diferencia de las absorbancias entre el tubo N 1 y las lecturas de los otros tubos nos indicar la actividad enzimtica para cada tubo. Graficar en papel milimetrado: 1) Actividad Enzimtica en el eje Y versus [E] en el eje X. EXPERIENCIA N 3 EFECTO DEL pH OBJETIVO: Determinar el pH ptimo en el cual la actividad enzimtica de la pepsina es mxima.

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Seguir el siguiente protocolo de trabajo: Tubo N ml H2O ml HCl 1N ml HCl 0,01N ml albmina pH 1 1 4,0 5 2 2 2,0 5 3 3,6 0,4 5 4 3,9 0,1 5 5 3,0 1,0 5 6 3,9 0,1 5 7 4,6 0,4 5 -

Incubar los tubos (del 1 al 6) por 5 min. A 37C. Aadir 1 ml de pepsina al tubo N 1, mezclar e incubar a 37 C. Transcurrido 1 minuto, agregue 1 ml de enzima al tubo 2, mezclar e incubar, seguir con el procedimiento para los tubos 3, 4, 5, y 6 (el tubo 7 no lleva enzima) y TRANSCIRRIDO EL TIEMPO DE REACCIN en cada tubo (10 MINUTOS A 37c) llvelos a leer inmediatamente en el espectrofotmetro a 520 nm. Restar a la lectura del tubo 7 cada una de las lecturas de c/u de los 6 tubos. La diferencia ser asumida como actividad enzimtica. Determinar: Los valores del pH final para cada uno de los tubos Graficar en papel milimetrado: 1) Calcule el pH en cada tubo 2) Grafique Actividad Enzimtica versus pH 3) Determine el pH ptimo en las condiciones de reaccin.

EXPERIENCIA N 4 EFECTO DE LA TEMPERATURA OBJETIVO: Determinar la temperatura ptima para la actividad de la pepsina. Preparar dos series de tubos: SERIE N 1 TUBOS N ml H2O ml HCl 1N ml albmina SERIE N 2 Tubos ml pepsina 1b 1,0 2b 1,0 3b 1,0 1 3,5 0,5 5,0 2 3,5 0,5 5,0 3a 3,5 0,5 5,0 B 4,0 5,0

Incubar los 6 tubos a 37C por 5 min segn el siguiente cuadro de temperaturas: TUBOS N Temperatura C 1a y 1b 4 (hielo) 2a y 2b 37 3a 37 3b 100

Agregar el contenido de los tubos 1b, 2b, y 3b a sus respectivos tubos 1a, 2a, y 3a. Luego incubar cada tubo a las correspondientes temperaturas 4 C (en agua con hielo), 37 C y 37 C respectivamente, por 5 min. Llevar a leer las absorbancias al espectrofotmetro INMEDIATAMENTE, a 520nm.

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La actividad enzimtica se encontrar restando la lectura del tubo blanco (B) menos lectura de los otros tres tubos (correspondiente a cada temperatura). Graficar en papel milimetrado: Actividad Enzimtica versus Temperatura CUESTIONARIO 1. Por qu la en la curva de la actividad (VS) concentracin de la enzima no se obtiene una lnea recta? 2. Por qu a menor temperatura existe menor actividad de la enzima. 3. En la prctica se ha observado la actividad de la enzima observando el sustrato, de ejemplo de determinaciones enzimticas en las que la medicin se realiza por: A) aparicin de producto B) modificacin de un cofactor C) por reacciones acopladas. 4. Exprese las concentraciones de sustrato y enzima de la prctica en unidades mol/L usando convenientemente (SI) 5. Visite http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-55832008000300003 y responda: a) Cul es el pH ptimo de la funcin de la pepsina b) Por qu razn se administr a un grupo experimental sangre de grado neutralizada? c) Que origina la administracin de ranitidina que afecta la actividad pptica? d) Que ventaja se origina a raz que la administracin del producto natural no vare el pH de la secrecin gstrica? 6. Obtenga el volumen de HCl 1N gastado en toda la prctica y en todas las mesas y grupos de prctica, Cmo preparara el reactivo si se desea tener el volumen necesario con un 10% mas, a partir de HCl Q.P. 36,5% puro con D=1,17 g/mL. 7. En el organismo existen enzimas con pH ptimos diferentes, cite ejemplos de esta condicin.

Prof. MIGUEL SANDOVAL VEGAS. Encargado del curso Bioqumica EAP Medicina Humana. FM-UNMSM

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